Yöntem makalesi

Otomatik Virüs Titri Nic Ification için Empedans kullanarak Etiketsiz Gerçek Zamanlı 50% Doku Kültürü Enfeksif Doz (TCID50) Testi

1.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67956

⸱

9 Ocak 2026

 ,  ,  ,  , 
1Agilent Technologies, Inc.

Bu makalede

Özet

Burada bildirilen TCID50 testi, etiketsiz gerçek zamanlı empedans ölçümlerini ve sistemin Viroloji modülünü kullanarak virüsle tetiklenen sitopatik etkileri (CPE) gerçek zamanlı olarak objektif olarak izler. Bu sade test, yüksek verimlilikte, nicel kinetik CPE ölçümlerini desteklerken uygulamalı zamanı önemli ölçüde azaltır ve otomatik, gerçek zamanlı TCID50 hesaplamalarını mümkün kılar.

Özet

Bir virüsün örnekteki konsantrasyonu olan viral titrenin ölçülmesi, viroloji araştırmalarında temel bir prosedürdür. Önemli olsa da, plak testi ve TCID50 testi gibi geleneksel yöntemler zaman alıcı olabilir, boyama veya etiketleme reaktifleri gerektirir ve özellikle sitopatik etkiler (CPE) görüntüleme yoluyla hassas veya nicelendirilmesi zor olduğunda genellikle öznel yorumlama gerektirir. Örneğin, TCID50 testleri MTT veya MTS gibi canlılık boyaları kullanabilirken, plak testleri viral plakları görselleştirmek için görüntüleme ve boyamaya dayanır; bu da değişkenlik yaratabilir. Ayrıca, bu geleneksel yöntemler sadece viral enfektifliğin statik bir anlık görüntüsünü sunar ve virüsler ile izin veren hücreler arasındaki dinamik etkileşimleri yakalama yeteneğini sınırlar. Virüs titresi ölçümindeki mevcut sınırlamaları aşmak için, empedans tabanlı teknoloji kullanılarak CPE'yi objektif, invaziv olmayan ve gerçek zamanlı olarak ölçen sade bir TCID50 testi geliştirildi ve etiket ihtiyacını ortadan kaldırdı. Bu çalışmada, empedans-TCID50 testini doğrulamak için iki virüs geçirimli hücre modeli kullanıldı: HEK293A hücrelerinde GFP etiketli adenovirüs (Adv-GFP) ve MDCK hücrelerinde grip A virüsü (IAV). İş akışı basittir ve hücre tohumlama, virüs aşılama, gerçek zamanlı izleme ve yazılım tarafından TCID50'nin otomatik analizini kapsar. Enfeksiyon boyunca, TCID50 değerleri sistemin yazılımı tarafından Reed-Muench formülü kullanılarak tüm kaydedilen zaman noktalarında otomatik olarak hesaplanıyordu. Empedans okumalarıyla elde edilen TCID50 IAV değerleri, geleneksel kristal mor boyama tabanlı TCID50 testiyle üretilenlerle karşılaştırılabilirdi. Bu sonuçlar, virüs niceleme yönteminin sistem yazılımındaki Viroloji Modülü ile empedans ölçümü kullanılarak hassas ve verimli şekilde gerçekleştirilebileceğini göstermektedir. Yeni test, geleneksel yöntemleri kolaylaştırırken viral dinamiklere dair daha fazla içgörü sağlar, böylece ileri virolojik araştırmaları destekler ve potansiyel klinik uygulamaları genişletir.

Giriş

Viroloji araştırmaları hızla gelişirken, viral enfektifiyetin doğru nicel ölçülmesi, viral mekanizmaları anlamak, antiviral tedaviler geliştirmek ve aşı etkinliğini değerlendirmek için kritik olmaya devam etmektedir. En önemli yöntemlerden biri, bir numunedeki viral parçacıkların konsantrasyonu olan viral titreyi ölçmektir. Aşılanan hücrelerin %50'sinde CPE üretmek için gereken enfeksîyonel virüs parçacıklarının sayısını niceleyen TCID50 testi, fonksiyonel viral titre belirlemede en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yaygın kullanılan son nokta testi, plak oluşturmayan virüsler için özellikle değerlidir ve plak testi1'e alternatif olarak hizmet edebilir.

Genel olarak, TCID50 testi virüs ve izin veren hücrelere bağlı olarak 2-14 gün sürer. CPE, hücre çoğalması, morfolojisi ve canlılıktaki değişiklikler dahil olmak üzere, reaktiflerin eklendikten sonra (1) kolorimetrik ölçümle, örneğin MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromid) testi ve MTS (3-(4,5-dimetilttiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sülfefenil)-2H-tetrazolyum) testi ile plaka okuyucu2 kullanılarak değerlendirilir, veya (2) optik görüntüleme platformları kullanılarak morfolojik veya kültürle ilgili değişikliklerin görsel değerlendirilmesi — örneğin, CPE'nin %3 birleşmesi ölçülmesiyle değerlendirilmesi veya (3) virüsle işlenmiş kuyuların formalin veya paraformaldehit (PFA) ile sabitlenmesi sonrası kristal mor boyama ile CPE'nin görsel tespiti. Her viral seyreltmede CPE-pozitif tekrarlanan sayısından elde edilen pozitif viral enfeksiyon oranı, TCID50 hesaplamasının temelini oluşturur. Kültürlerin %50'sinin CPE gösterdiği seyreltme, Reed-Muench, Spearman-Karber ve Improved-Karber gibi yerleşikformüller 4 kullanılarak istatistiksel olarak hesaplanır ve sonuç mililitre başına TCID50 (TCID50/mL) olarak rapor edilir.

Geleneksel TCID50 ve plak testleri, fonksiyonel viral nicelik için altın standart olarak yaygın olarak kabul edilir ve paha biçilmez bilgiler sunabilir. Ancak, bu testler genellikle zahmetli, zaman alıcı ve CPE'yi görselleştirmek için manuel boyama gerektirir; bu da düşük verimlilik, artan insan hatası riski ve öznellik anlamına gelir. Oldukça bulaşıcı veya ölümcül virüsler için, virüslere maruz kalma süresini en aza indirmek ve lekeleme gibi ek adımlardan kaynaklanan virüs içeren atıkları azaltmak biyogüvenliği iyileştirmek için önemli önem taşır. Etiketsiz görüntüleme tabanlı TCID50 testi hariç, çoğu TCID50 ve plak testi aynı zamanda son nokta testleridir; bu da titre değerlendirmesi için optimal olmayan zamanlamaya yol açabilir ve virüsler ile konak hücreler arasındaki dinamik etkileşimleri gözlemleme yeteneğini sınırlayabilir. Bu sınırlamaları aşmak için, sade bir TCID50 testi geliştirildi ve kuruldu. Kavramsal olarak geleneksel TCID50 testine benzer olsa da, yeni yöntem, RTCA MP sistemi tarafından yakalanan ve analiz edilen hücresel empedans okumalarını kullanarak enfeksiyonu zaman içinde objektif ve sürekli olarak izlemektedir.

Empedans tabanlı biyosensörün, hücre sayısı, morfolojisi ve hücre-substrat bağlanma gücünün etiketsiz, invaziv olmayan bir şekilde niteliksel ve nicel bileşik okuması sağladığı gösterilmiş ve doğrulanmıştır 5,6. Önceki çalışmalar, virüs kaynaklı CPE'nin RTCA empedansölçümleri 7,8,9 kullanılarak gerçek zamanlı doğru şekilde nicelendirilebileceğini göstermiştir. Sistemler, ham empedans değerlerini raporlamak yerine, hücresel olaylar nedeniyle empedanstaki değişiklikleri yansıtmak için Hücre İndeksi (CI) adlı birimsiz bir parametre kullanır. Örneğin, hücreler kuyunun dibine yapışırken, yayılır ve büyürken, CI artar. Buna karşılık, hücreler ölür, küçülürse veya ayrılırsa, örneğin viral enfeksiyon sırasında CI azalır.

CPE'yi ölçmek için empedans kullanan umut vadeden raporları göz önünde bulundurarak, bu çalışma empedans tabanlı TCID50 testinin geleneksel viral niceleme için güvenilir ve doğru bir alternatif olduğunu göstermeyi amaçladı. Sistemin yazılımındaki Virünoloji modülü, tüm gerçek zamanlı CPE ölçümü boyunca otomatik TCID50 hesaplamasını mümkün kılarak, test sürecini kolaylaştırıp kısaltırken virüs çoğaltma kinetiği ve izin veren hücrelerle etkileşimi hakkında değerli bilgiler sunar.

Protokol

Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Empedans tabanlı TCID50 testi

NOT: Şekil 1'in gösterdiği gibi, empedans tabanlı TCID50 testi dört aşamadan oluşur; bunlar arasında biyosensör plakasında izinli hücre tohumlama, virüs seyreltme hazırlığı ve aşılama, sistemde CPE ölçümü ve son olarak sistemin yazılımının Viroloji modülü kullanılarak veri analizi ve TCID50 hesaplaması yer alır.

  1. Analiz hazırlığı: canlandırma ve alt kültür izin veren hücreler
    NOT: Bu adım testten bir hafta önce yapılmalıdır. Deneyler arasında varyasyonu en aza indirmek için, aynı geçiş sayısında izin veren hücrelerden oluşan bir hücre bankasının testte kullanılmak üzere hazırlanması şiddetle tavsiye edilir. Hücre sağlayıcısından satın aldıktan sonra 15 pasajdan büyük hücreleri kullanmayın.
    1. Kriyokonserve verilen hücreleri eritmek
      1. En az 30 dakika boyunca 37 °C su banyosunda sıcak hücre büyüme ortamı yapın. Örneğin, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin ile takviye edilmiş, HEK293A kültürü için kullanılmıştır.
      2. TCID50 testleri için hücre bankasından kriyokonserve edilen bir hücre şişesini, birkaç buz kristali bulunana kadar 37 °C su banyosunda 1-2 dakika nazikçe dönerek eritin; Kapağı batırmayın. Şişeyi %70 etanol ile silin ve laminar bir kapağa yerleştirin.
      3. Hücreleri nazikçe yeni 50 mL konik bir tüpe aktarın ve hücrelere 9 mL ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin.
      4. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 300 x g ile santrifüj yapın.
      5. Süpernatantı atın ve hücreleri 15 mL ısıtılmış büyüme ortamına yeniden süskü bırakın. Onları yeni bir T75 şişesine aktarın.
      6. Hücreleri %80-90 birleşimle 37 °C inkübatörde %5CO2 ile yetiştirin.
    2. İzin veren hücrelerin alt kültürü.
      1. Hücreleri %80-90 birleşimine ulaşana kadar izleyin.
      2. Termostan serum içeren ortamı çıkarın ve hücre monotabakasını Mg- ve Ca-free Dulbecco'nun fosfat-tamponlu tuzlu suyu (DPBS) ile nazikçe durulayın.
      3. Hücreleri T75 şişesine 2 mL %0,05 Tripsin/EDTA çözeltisi eşit dağıtarak ve termosu 37 °C inkübatörde 1-3 dakika boyunca bırakarak tripzinize edin.
        NOT: Hücreleri aşırı tripsize etmeyin, çünkü bu hücrelere zarar verebilir.
      4. Orijinal tripsin hacmini en az beş kat seyreltmek için 8 mL serum içeren ortam ekleyerek tripsinasyonu durdurun. Hücre süspansiyonundan 2,5 mL yeni bir T75 şişesine aktarın, ardından 8 mL kültür ortamı ekleyin.
        NOT: TCID50 testi için yeni çözülmüş izin veren hücreleri kullanmaktan kaçının. Bunun yerine, kültürlenmiş hücreleri %80-%90 birleşimde kullanın. Deneyler arası değişkenliği azaltmak için, canlandırılan hücreler eridikten sonra en fazla iki hafta boyunca korunmalıdır. İki haftalık kültür sırasında yüksek hücre canlılığı ve çoğalmayı sağlamak için: (1) haftada en az iki kez büyüme ortamı değiştirmek; (2) alt kültür hücreleri %80-%90 birleşime ulaştığında. İki haftadan fazla uzatılmış bakım için doğrulama gereklidir.
  2. Viral titre
    NOT: Bu adım 1. günde yapılmalıdır.
    1. Biyosensör plaka arka planının ölçümü
      1. Her kuyuya çok kanallı pipet kullanarak dikkatlice 50 μL önceden ısıtılmış ortam aktarın; ters pipetleme tekniği kullanılarak kabarcık oluşumunu en aza indirin ve hacim dağıtımının tutarlı olmasını sağlasın.
      2. Plakayı plaka istasyonuna yerleştir; deneye başlamadan önce sistemin yazılımını açıp Viroloji modülünü seçin. İlgili notları Exp Notes sekmesine girin ve ilgili kuyrukları seçtikten sonra Layout sekmesinin Cell alt sekmesine hücre adı ve numarası dahil hücre bilgilerini girin. Alternatif olarak, tohumlama sonrası hücre bilgileri girilebilir.
        NOT: Plaka arka plan ölçümü, hücreleri levhanın kuyularına eklemeden önce yapılmalıdır. Tüm kuyular için arka plan okumaları -0.063 ile 0.063 arasında olmalıdır.
      3. Schedule sekmesinde, plaka arka plan ölçümü için belirlenmiş Step 1'i eklemek için Add a Step butonuna tıklayın. Sonra, Başlat butonuna tıklayarak kaydı başlatın.
      4. Plakayı istasyondan çıkarın ve hücre tohumlaması için tekrar kapüşe koyun.
    2. 96 kuyulu biyosensör plakasına izinli hücre tohumlaması
      1. T75 masasından gelen izin verici hücreleri tripsine edin.
      2. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu istenen konsantrasyona ayarlayın. Bu çalışmada HEK293A konsantrasyonu 60.000 hücre/mL idi.
      3. Plakanın her kuyusuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
        NOT: Doğru hücre yoğunluğu çok önemlidir. Optimal olmayan tohumlama yoğunluğu deneysel bir artefakta yol açabilir. Bu nedenle, TCID50 testi yapılmadan önce tohumlama yoğunluğu optimize edilmelidir.
      4. Hücre eklendikten sonra plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakın, böylece hücreler kuyunun dibine eşit şekilde dağılsın.
        NOT: Bu adımın yapılmaması büyük kuyudan kuyuya varyasyonlara yol açabilir.
      5. Plakayı, %5CO2 içeren 37 °C'lik kuluçka makinesine yerleştiril.
      6. Yazılımın Schedule sekmesine gidin ve varsayılan kayıt ayarlarıyla Step 2'yi ekleyin: 100 Sweep ve 15 dakikalık bir Aralık. Bu, her 15 dakikada bir empedans/CI izlemesini başlatacak ve virüs aşılanmasından önce hücre kalite kontrolü (QC) adımı olarak hücre bağlanması ve çoğalmasının gerçek zamanlı değerlendirmesini sağlar.
        NOT: Gün 2 - Deneyler arasında test tekrarlanabilirliğini ve tutarlılığını en üst düzeye çıkarmak için, bir sonraki adıma geçmeden önce sistemdeki hücre performansını değerlendirmek kritik öneme sahiptir. CI, hücre bağlanmasını ve büyümesini yansıttığından, tohumlama sonrası 20-28 saat içindeki CI değerleri önemli bir kalite kontrol parametresi olarak hizmet eder. CI'nin hem değeri hem de kinetiği hücreye özgeldir. Bu çalışmada, kuyu başına 6.000 hücre tohumlanıp 20-28 saat kültürlenen HEK293A hücre için CI 2'yi aşmalıdır. Eğer CI, tohumlamadan 20-28 saat içinde 2'ye ulaşmazsa, HEK293A hücre kültürü kalite kontrolünü (QC) başarısız sayır ve sonraki TCID50 testi yapılmaz. Bu kriter deneysel sonuçların yüksek tekrarlanabilirliğini sağlar.
    3. Virüs seri seyreltmelerinin hazırlanması
      1. Sulandırmaları hazırlamak için gereken ortamın toplam hacmini (DMEM + %2 FBS + %1 penisilin / streptomisin) hesaplayın ve 37 °C su banyosunda 30 dakika ısıtın. Bu medyum deneyin geri kalanında kullanılacak.
      2. Aliquoted virüs stokundan oluşan bir şişeni, 37 °C'lik su banyosunda 1-2 dakika boyunca hızla eriterek tüm buz kristalleri eriyip eritin.
      3. Her adımda 180 μL önceden ısıtılmış bir ortam içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 20 μL virüs stokuna aktararak 10 kat seri seyreltilmiş virüsler hazırlanır. Medium ile virüsün iyice karışmasını sağlamak için pipet yukarı aşağı yapın.
        NOT: Pipet ucunu viral çözeltinin içine çok derin daldırmayın, böylece aşırı viral partikül kalıntısı uç dışına taşınmasın ve bu da yanlış seyreltmelere yol açabilir.
      4. Soğuk algınlığı virüsü örneklerinin eklenmesiyle oluşan empedans okumalarında dalgalanmaları önlemek için, virüs seyreltmelerini inkülatörlükten önce %5CO2 ile 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübatörde dengeleyin.
    4. Virüs tedavi bilgilerini Layout sekmesine girin
      1. Yazılımın plaka düzeni sekmesinde; viral titre tedavisi için kuyrukları seçin; Treatment alt sekmesine tıklayın ve bu deneyde örneğin 0.001 (10-3) gibi ilk Seyreltme girin; 10'u "Sulandırma Faktörü" olarak girin; bu durumda soldan sağa seyreltme yönünü seçin. Viral seyreltme, plaka yerleşim girişine göre otomatik olarak hesaplanacak ve ilgili her kuyrukta gösterilecektir.
      2. Sonra, Virüs Aşılama Volume sayfasına girin ve tüm tedavi bilgilerini kaydetmek için Uygula butonuna tıklayın. Bu adım, veri analizi sırasında TCID50/mL'nin doğru hesaplanması için gereklidir.
      3. Virüsle tedavi edilmeyen kuyuları negatif kontrol olarak atayarak uygun kuyuları seçin ve ardından Tedavi sekmesinde Kuyu Tipi altında Negatif Ctrl'yi işaretleyin.
        NOT: Negatif kontrol kuyrukları belirlenmeli ve Yerleşim sayfasına eklenmelidir; bu eksiklik TCID50 hesaplamasını engeller.
    5. Virüs aşısı
      1. Hazır olunca, yazılımda Duraklatma tuşuna basarak veri edinmesini durdurun. Plakayı İstasyondan çıkarın ve laminar başlığa yerleştirin.
      2. Çok kanallı pipet kullanarak tabaktaki kuyulardan kültür ortamını dikkatlice çıkarın.
      3. Hücre monotabakasının üstüne çok kanallı pipet kullanarak nazikçe 50 μL viral seyreltme ekleyin, böylece hücre kültürünün bozulmasını önleyin.
      4. Plakayı tekrar İstasyona yerleştirin ve varsayılan kayıt ayarlarını (100 Sweep ve 15 dakikalık aralık) kullanarak Schedule sekmesine 3. Adım ekleyin; böylece her 15 dakikada bir 2 saat boyunca kayıt empedansını sürdürür ve virüsün hücrelere bağlanmasını sağlar.
      5. Virüs aşısının 2 saatinden sonra kaydı durdurun ve plakayı istasyondan laminar kapüşona çıkarın.
      6. Çok kanallı pipet kullanarak kuyulara yavaşça 150 μL önceden ısıtılmış ortam ekle, hücre monotabakasının bozulmasını önleyin; Plakayı İstasyona geri gönder.
      7. Schedule sekmesindeki Başlat'a tıklayarak Step 3'e devam edin. Empedans sinyalleri, aşılama süresi boyunca her 15 dakikada bir sürekli olarak ölçülür.
    6. TCID50'nin TCID50 testi tamamlanırken veya sonrasında hesaplanması
      1. Veri Analizi sekmesinde, testte kullanılan tüm kuyular harita şeğesine ekleyin. Grafikin y ekseni, Y Ekseni açılır menüsünden seçilen seçeneğe göre belirlenir.
      2. Parametre bölümüne gidin. TCID50 hesaplamasını başlatmak için Parametre açılır menüsünden TCID50'yi seçin.
      3. TCID50 hesaplaması için belirli bir zaman noktasında Bar Grafik seçin veya aşılama sırasında istenen bir süre boyunca TCID50 zaman akışını oluşturmak için Zamana Bağlı TCID50'yi seçin. TCID50/mL, uygulama butonuna tıklandıktan sonra hesaplanır ve görüntülenir.

2. Crystal Violet-TCID50 testi

  1. Tohum izin veren hücreler, empedans tabanlı TCID50 testinde (1-2. adımlar) tarif edildiği gibi optimal tohumlama yoğunluğunda 96 kuyruklu bir mikroplakada alın.
  2. Virüs seri seyreltme hazırlığı ve aşılamasını empedans tabanlı TCID50 testinde belirtildiği şekilde gerçekleştirin.
  3. Sabitleme ve boyama
    1. Analiz tamamlandıktan sonra, her kuyidan süpernatantı nazikçe atın ve hücreleri sabitlemek için %4 formaldehit 100 μL ekleyin.
    2. 4 °C'de 1 saat kuluçka yapın, sonra fiksanti çıkarın.
    3. Sabit hücreleri, PBS ile hazırlanmış %0,5 Crystal Violet ile boyan. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın.
    4. Plakayı musluk suyla yıkayıp arka plan temizlenene kadar. Zümle yapmadan önce plakanın tamamen hava ile kurumasına izin verin.
      NOT: Kristal mor atığı hem RCRA hem de Kaliforniya Yönetmelikler Kodu (CCR 66261.24) kapsamında tehlikeli kabul edilir. Tüm harcanmış kristal mor çözeltilerini, kirlenmiş malzemeleri (örneğin kağıt havlu, eldiven) toplayın ve atıkları belirlenmiş tehlikeli atık konteynerinde durulayın. Atıkları, kurumunuzun Çevre Sağlığı ve Güvenliği (EH&S) veya lisanslı tehlikeli atık bertaraf yüklenicisi aracılığıyla bertaraf edin.
  4. Puanlama ve TCID50 hesaplaması
    1. Her kuyuyu CPE açısından görsel olarak inceleyin. Pozitif bir kuyu kısmi veya tam tek katmanlı yıkım ve daha hafif lekelenme gösterir. Negatif kuyyu, koyu mor boyalı sağlam bir tek katmanı korur.
    2. Her seyreltme için pozitif ve negatif kuyu sayısını sayın.
    3. 150 μL aşılama hacmine dayanarak Reed-Muench yöntemiyle TCID50/mL'yi manuel olarak hesaplayın.

Sonuçlar

Virüs aracılı CPE'nin empedans kullanarak etiketsiz, gerçek zamanlı, dinamik izlenmesi
Virüs kaynaklı CPE'nin empedansla güvenilir ve nicel olarak ölçülebileceğini doğrulamak için, Adv-GFP enfeksiyonundan sonra HEK293A hücrelerde hücresel değişiklikleri, aynı hücre popülasyonundan empedansı ölçen ve aynı hücre popülasyonundan canlı hücre görüntülerini yakalayan RTCA eSight sistemi kullanarak ilk olarak kaydettik; bu sistem aynı anda empedansı ölçer ve hücre davranışı hakkında derin bilgiler sağlar. HEK293A hücreler, 24 saat boyunca 6.000 hücre/kuyu tohumlama yoğunluğunda 96 kuyu uzunluğunda bir biyosensör plakasına tohumlanmış, ardından10,4 IFU/mL ile Adv-GFP ile enfekte edilmiştir. Aşılama sonrası 250 saat boyunca empedans ve canlı hücre görüntülemesi kaydedildi (Şekil 2A). Hücre tohumlanmasındaki farklılıklardan kaynaklanan değişkenliği en aza indirmek ve tedavi sonrası göreceli değişiklikleri ortaya çıkarmak için, Normalize Hücre İndeksi (NCI) hücre büyümesi, bağlanma ve canlılıktaki kolektif değişiklikleri zaman içinde temsil etmek için kullanıldı. NCI, belirli bir zaman noktasındaki CI'nin normalleşme zaman noktasındaki (aşı öncesi zaman) CI'ye bölünmesiyle hesaplanır. Enfekte olmayan kontrolün NCI kinetik izi (Şekil 2A, siyah iz) ilk 48 saat içinde kademeli bir artış göstermekte olup, sürekli hücre çoğalmasını gösterir. Testin sonunda bir plato izlenir; bu da hücrelerin birleşip altın biyosensörlerin tüm yüzey alanını kapladığını gösterir. Buna karşılık, virüsle enfekte olan kuyulardan kaynaklanan NCI kinetik aşılamadan 50 saat sonra kontrol seviyesinin altına düştü ve 100 saatte sıfıra ulaşana kadar kademeli olarak azaldı.

Aynı hücre popülasyonundan alınan canlı hücre görüntülemesi, empedans sinyalinin izin veren hücrelerin tüm CPE sürekliliği boyunca ilerlerken fiziksel durumunu güvenilir şekilde yansıttığını görsel olarak doğruladı. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, enfekte HEK293A hücrelerde viral GFP ekspresyonu arasında ters bir korelasyon vardır; bu ilişki izinli hücrelerin tam lizisinden önceki ilk 100 saat içinde gözlemlenmiştir. Ayrıca, belirtilen zaman noktalarında kaydedilen canlı hücre görüntüleri (Şekil 2B), viral enfeksiyon sırasında izin veren hücre durumunu daha da göstermektedir. Enfeksiyondan sonraki ilk 48 saat boyunca hücre büyümesi devam ederken, virüs parçacıkları hücreler içinde düşük seviyelerde kaldı. Ancak, virüs çoğalması ve enfeksiyon ilerledikçe, hücre ölümü başladı; bu, konak hücrelerde azalan birleşme ve artan GFP sinyaliyle kanıtlanmıştır. Aşılamadan yaklaşık 100 saat sonra, viral GFP ekspresyonu, canlı izin veren hücrelerin önemli kaybı nedeniyle azalmaya başladı. Bu entegre yaklaşım, virüs kaynaklı CPE'nin empedansla tespit edilmesinin güvenilirliğini pekiştirir ve empedans tabanlı TCID50 testi için sağlam bir temel oluşturur.

Empedans okumasından türetilen TCID50'nin otomatik hesaplaması
Pozitif CPE kuyruklarının doğru şekilde tanımlanması, güvenilir TCID50 hesaplaması için çok önemlidir. Empedans tabanlı TCID50 testinin, sistemin yazılımının Viroloji modülünün desteğiyle pozitif ve negatif CPE'yi kesin ve objektif olarak ayırt edip edemeyeceğini değerlendirmek için, HEK293A hücre aşılamadan önce 24 saat boyunca 6.000 hücre/kuyu aralığında tohumlanmış, her seyreltme için sekiz replikat (kuyruk) kullanılarak Adv-GFP'nin on kat seyreltilmesi serisi ile işlenmiştir. Adv kaynaklı CPE, RTCA sisteminde gerçek zamanlı olarak kaydedildi. Şekil 3A'da, NCI olarak sunulan empedans kinetik izleri kaydedilmiş ve deney boyunca otomatik olarak çizilmiştir. Aşılama sonrası NCI'deki azalma, eklenen virüs miktarı ile empedans sinyalinin azalma hızı arasındaki güçlü korelasyonla açıkça doza bağlı bir CPE olduğunu ortaya koymaktadır. Yüksek viral yüklere maruz kalan hücreler, 10-3 ile 10-7 seyreltme arasında, NCI'de keskin ve tutarlı düşüşler gösterdi; bu da çoğaltma kuyularında sağlam ve uniform CPE'yi yansıttı. Buna karşılık, 10-8 virüs seyreltmesinde kinetik iz başlangıçtan itibaren büyük değişkenlik gösterdi ve özellikle aşıdan 100 saat sonra NCI standart sapmalarının önemli ölçüde artmasına yol açtı. Viral yük, enfeksiyona neden olacak eşik için gereken eşiğin altına daha da düşürüldüğünde, bu durumda 10-10 seyreltme ile NCI negatif kontrollerden ayırt edilemez hale geldi. Bu veriler, 10-8 seyreltme durumunda, 1) virüsün benzer kinetikteki tüm tekrarlanan kuyularda CPE indükleyemeyeceğini; 2) bu seyreltme, tüm tekrarlarda CPE'ye neden olan konsantrasyonlar ile sadece bazı veya hiçbirinde CPE tetikleyen konsantrasyonlar arasında bir bölünme çizgisi olurdu; Bu ikili sonuç, enfekte (CPE kaynaklı CI değişiklikleriyle belirtilir) veya enfekte olmayan (CI değişikliği yoktur), sistem yazılımında istatistiksel yöntemlerle TCID50 hesaplamasının temelini oluşturur. Bu nedenle, belirli virüs konsantrasyonlarında gözlemlenen derin NCI varyasyonu, kısmi enfeksiyonun meydana gelmesini belirleyecek kritik bir göstergedir ve TCID50'nin hesaplanması için gereken ekstrapolasyon için kritik olabilir.

Klasik TCID50 testi gibi, yerleşik yazılımın CPE-pozitif kuyrukları otomatik olarak tanımlayabilmesi için pozitif CPE eşiği tanımlanmalıdır. Farklı virüsler ve izin veren hücre modelleri farklı eşikler gerektirebileceğinden, yazılım kullanıcıların bu kriterleri Viviroloji modülü içinde yapılandırıp iyileştirmesine olanak tanır. Ampirik verilere dayanarak, yazılımın pozitif CPE için varsayılan eşiği uygulanmıştır; bu değer, virüsle tedavi edilen iyi halin NCI değeri, negatif (aşılanmamış) kontrollerin ortalama NCI'sinin üçten fazla altında olması olarak tanımlanmıştır; yani NCIvirüsüyle tedavi edilmiş < (NCI-3 X SD) negatif ctrl. Bireysel kuyular daha sonra pozitif (+) veya negatif (-) olarak puanlandırıldı (Şekil 3B). Bu durumda, Adv-GFP'nin TCID50/mL'si, yazılımda yer alan formüllerden biri olan Reed-Muench formülü kullanılarak hesaplandı. Pozitif CPE için kriterler seçmek veya tanımlamak dışında, TCID50 hesaplaması için manuel işlem gerekmiyordu; çünkü yazılım süreci tamamen otomatikleştiriyordu.

Virüs enfeksiyonu sırasında TCID50'nin dinamik takibi
TCID50 testinin uygun süresini belirlemek için, Adv-GFP TCID50 değerleri enfeksiyon sonrası istenen zaman noktalarında, 30 saatten başlayıp 30 saatlik aralıklarla 240 saate kadar devam ederek çıkarıldı. Adenovirüs replikasyonunun yaklaşık 30saat 10 sürdüğü bildirildiğinden 30 saatlik bir artış kasıtlı olarak seçilmiştir. Adv-GFP TCID50 değerleri zamanın fonksiyonu olarak çizilmiştir (Şekil 4). Dikkate değer bir gözlem, TCID50 değerlerinin kademeli olarak artmasıdır; bu artış aşıdan yaklaşık 150 saat sonra da devam eder. Bu noktanın ötesinde, sitopatik etkilerin muhtemelen doygunluğa ulaştığı bir denge noktası ortaya çıkar. Zamana bağlı artış ve ardından stabilizasyon, tipik bir viral çoğalma eğrisini gösterir. Başlangıç aşaması, aktif viral yayılma ile karakterize edilir ve verilen deneysel koşullarda maksimum sitopatik etkiyi yansıtan bir zirveyle sonuçlanır. TCID50'nin plato fazı, viral enfeksiyon sürecinin izin veren hücrelerin çoğunu ele geçirdiği, önemli hücre ölümüne yol açtığı ve virüs çoğalmasının durdurulduğu biyolojik bir tavanı yansıtabilir. TCID50 kinetik zaman kursu, adenovirürüs-HEK293A modeli için aşılamadan altı ila yedi gün sonra testin sonlandırılabileceğini göstermektedir; çünkü TCID50'nin sabit değeri 8.9 ×10.9 TCID50/mL olarak 150 saat kadar erken gözlemlenmiştir.

Empedans tabanlı TCID50 testiyle grip A virüsü titresinin nicelendirilmesi
Empedans tabanlı TCID50 testinin diğer virüs konakçı modellerine genişletilip genişletilemeyeceğini araştırmak için, IAV ile enfekte edilmiş MDCK hücrelerinde bir TCID50 testi gerçekleştirildi. IAV'ye özgü enfeksiyon ortamındaki küçük değişikliklere izin verilmiş olsa da, temel test prosedürü adenovirüs için belirlenenle tutarlı kaldı. Şekil 5A, 1 x 10-2 ile 5 x 10-9 arasında değişen IAV seyreltmeleriyle aşılandıktan sonra MDCK hücrelerinin zaman içindeki NCI'sini göstermektedir. Adv enfekte HEK293 A hücrelerinde gözlemlenen sonuçlara benzer şekilde, enfekte olmamış/negatif kontrol kuyrukları çoğaltmalar arasında istikrarlı ve tutarlı NCI sergilemiştir. Ancak, virüsle enfekte olan kuyular doz bağımlı bir NCI değişikliği ortaya koydu. Düşük dozlarda, 6.4 ve 1.3 x 10-7 seyreltilerde, büyük bir standart sapma gözlemlendi. Bu, bu seyrelmelerde virüsün konsantrasyonunun TCID50'ye yaklaştığını gösteriyor.

CPE-pozitif kuyular Adv-HEK293A modelinde uygulanan aynı kriterler ve eşik kullanılarak tanımlandı; özellikle, negatif kontrol kuyularının ortalamasının üç kat altında bir standart sapma bulundu. IAV için empedans tabanlı TCID50 değerleri de aşılamadan sonraki çeşitli zaman noktalarında belirlenmiştir. Şekil 5B , iki bağımsız deneyden alınan ortalama TCID50 değerlerini göstermektedir. 60 saat erken zaman noktası hariç, enfeksiyon sonrası 90-150 saat arasındaki TCID50 değerleri iyi bir stabilite ve tutarlılık gösterdi; bu da IAV için empedans tabanlı TCID50 testinin beş gün yerine dört günde güvenilir şekilde tamamlanabileceğini gösteriyor. Bu tutarlılık, empedans tabanlı yöntemin sağlamlığını pekiştirir ve farklı viral patojenler üzerinde uyum sağlar ve güvenilirliğini doğrular.

Geleneksel TCID50 yöntemiyle empedans tabanlı TCID50 testinin doğrulanması
Empedanstan türetilen TCID50'nin IAV konsantrasyon ölçümü için doğrulanması amacıyla, TCID50 testleri paralel olarak iki alternatif yaklaşımla gerçekleştirildi: etiketsiz görüntüleme ve kristal mor boyama. Kısa süreliğine, MDCK hücreleri hazırlanıp 96 delikli mikrotiter plakalarına tohumlanmıştır. Ertesi gün, hücreler 5 gün boyunca bir dizi IAV seyreltmesiyle aşılandı. Görüntüleme tabanlı TCID50 testi için, canlı hücre görüntülemesi her 4 saatte bir alındı. Doğrulama çalışmasında on IAV örneğinin konsantrasyonları değerlendirildi. Virüsle tedavi edilen kuyuların hücre birleşimi, sistemin yazılımını kullanan negatif ve enfekte olmayan kuyularla karşılaştırıldı. Ancak, MDCK hücreleri için görüntüleme analizi özellikle zorlayıcıydı; bu durum Şekil 6A'da gösterilmiştir. Hücreler ile boş alanlar arasındaki doğru ayırt edilme, MDCK hücrelerinin düz morfolojisi ve kötü tanımlanmış kenarları nedeniyle zordu; bu da görüntüleme tabanlı analiz yoluyla CPE-pozitif kuyrukların güvenilir tanımlanmasını tehlikeye attı. Daha gelişmiş ve gelişmiş görüntüleme analiz yazılımlarının kullanılması, bu tür durumlarda TCID50 hesaplamalarının doğruluğunu artırabilir11. Bu durumda, etiketsiz görüntüleme tabanlı TCID50 değerlendirmesi mevcut sistem yazılımı kullanılarak başarısız oldu. Kristal mor boyama-TCID50 testi için, hücreler protokol bölümünde açıklandığı gibi aşılamadan sonraki 5. gün sabitlenip boyandı. Şekil 6B , empedans tabanlı ve kristal mor boyama tabanlı TCID50 değerleri arasında güçlü doğrusal bir korelasyon göstermektedir; regresyon denklemi y = 0.9582x ve R² = 0.9979 denklemi vardır. Bu karşılaştırmalı analiz, viral titer ölçümü için empedans tabanlı yöntemin güvenilirliğini ve TCID50 testleri için uygunluğunu vurgulamaktadır.

figure-results-1
Şekil 1: Empedans tabanlı TCID50 testi iş akışı. Adım 1: Biyosensör plakasında izinli hücre tohumlaması. İzin veren hücreleri optimal tohumlama yoğunluğunda bir tabağa ekin. Hücre büyümesi, hücre kalite kontrolü (QC) prosedürünün bir parçası olarak sistemde izlenir. Adım 2: Virüs hazırlığı ve aşılama. Kullanıcı tarafından tanımlanan bir seyreltme faktörü kullanarak seri olarak seyreltilmiş virüs stokları hazırlayın. Plakayı sistemden çıkarın ve virüsleri laminar bir başlıkta plakanın kuyularına ekleyin. Adım 3: Viroloji modülü yazılımı kullanılarak CPE-pozitif kuyular için CPE ölçümü ve puanlanması. Plakayı sisteme geri getirin ve virüs kaynaklı CPE'nin gerçek zamanlı kaydına devam edin. Yazılım, CPE algılama için kullanıcı tanımladığı eşik setine göre CPE-pozitif kuyrukları otomatik olarak tanımlar. Adım 4: TCID50 hesaplaması. Virüs aşılanması üzerinde CPE-pozitif kuyular gerçek zamanlı puanlanmasıyla, Virüoloji modülü yazılımı, test boyunca herhangi bir zaman noktasında TCID50 değerlerini hesaplayabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Adenovirüs kaynaklı CPE, hem empedans tabanlı hem de görüntüleme tabanlı yöntemlerle değerlendirildi (A) Adv-GFP enfeksiyonu sonrası HEK293A hücrelerde empedans (sol y ekseni) ve yeşil floresans (sağ y ekseni) dinamik profillenmesi. Adenovirüs enfekte hücreler (NCI Adv enfekte, kırmızı çizgi), negatif kontrol hücreleri (NCI NC, siyah çizgi) ve GFP toplam entegre yoğunluğu (GFP Adv enfekte, yeşil çizgi) için Normalize Hücre İndeksi zaman fonksiyonu olarak çizilmiştir. Toplam entegre GFP yoğunluğu, izin veren hücrelerde GFP ekspresyonunu yansıtır ve viral enfeksiyonun bir göstergesi olarak hizmet eder. Normalize Hücre İndeksi boyunca (1-6) numaralar, enfeksiyon sürecindeki belirli zaman noktalarına karşılık gelir. Veriler ortalama SD ± (N = 8) olarak sunulur. (B) Adenovirus-GFP enfeksiyonundan önce ve sonra HEK293A hücrelerin ardışık görüntüleri. (1) Başlangıç görüntüsü (0 saat) sonrasında enfeksiyon sonrası 48 saat (2), 72 saat (3), 96 saat (4), 120 saat (5) ve 200 saat (6) anlık görüntüler alınır; bu görüntüler hücre büyümesi, canlılık ve adenovirüs-GFP floresansındaki değişimi zamanla gösterir. Ölçek çubukları = 160 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Empedansla ölçülen HEK293A hücrelerde adenovirüs-GFP'nin doza bağlı CPE'si. (A) HEK293A hücre, 6.000 hücre/kuyu yoğunluğunda bir biyosensör plakasına tohumlanmış, 24 saat sonra ise 10 kat seyreltilmiş adenovirüs-GFP serisi ile enfekte edilmiştir. Veriler ortalama SD ± (N = 8) olarak sunulur. İç Detay: Adenovirüs-GFP ile enfekte olan kuyunun 10-8 seyreltme derecesinde normalize hücre indeksi. 10-9, 10-11 ve 10-12 seyreltme verileri netlik için çıkarılmıştır. (B) Her virüs seyreltmesinde bireysel kuyular/çoğaltmalar ya CPE-pozitif (+) ya da CPE-negatif (-) olarak puanlandı. Plakanın her sütunu farklı bir virüs seyreltmesiyle işlendi; seyreltme gradyanı 1. sütundaki en düşükten 10. sütunda en yükseke kadar değişti. 11. ve 12. sütunlar negatif kontrol kuyularıydı ve virüs tedavisi yoktu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Adenovirüs-GFP ile enfekte edildikten sonra HEK293 hücrelerinde CPE'nin empedans ölçümlerinden türetilen TCID50 değerlerinin zaman süreci. Adenovirüs-GFP'nin TCID50/mL'si, beş deneyden Viroloji modülü kullanılarak belirli zaman noktalarında hesaplandı. Virüoloji modülü üç TCID50 hesaplama formülü sağlasa da, TCID50 hesaplaması için Reed-Muench formülü seçilmiştir. Veriler ortalama SD ± (N = 5) olarak sunulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Empedans tabanlı TCID50 testi kullanılarak grip A virüsü titre değerlendirmesi. (A) MDCK hücrelerinde doz bağımlı IAV CPE'si empedansla ölçüldü. MDCK hücreleri, 8.000 hücre/kuyu hızında bir biyosensör plakasına yerleştirildi ve 24 saat sonra grip virüsünün beş kat seri seyreltilmesi ile enfekte edildi. Veriler ortalama SD ± (N = 8) olarak gösterilir. 2.6 × 10⁻⁸ seyreltme verileri netlik için çıkarılmıştır. (B) IAV enfekte MDCK hücrelerinde empedans ölçümlerinden elde edilen TCID50 değerlerinin zaman süreci. TCID50 hesaplamasında Reed-Muench yöntemi kullanılmıştır. Veriler ortalama SD ± (N = 2) olarak sunulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Empedans tabanlı ve kristal mor boyama tabanlı TCID50 testleri arasındaki korelasyon. (A) IAV ile aşılanmış MDCK hücrelerinin görüntüsü. Ölçek çubuğu = 160 μm. (B) Empedans tabanlı ve kristal mor boyama tabanlı yöntemlerle elde edilen TCID50/mL değerlerinin karşılaştırılması, on IAV örneği kullanılarak gerçekleştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Sistemin Virüoloji modülü yazılımının temsilci arayüzleri. Yazılım, empedans tabanlı TCID50 test sürecini kolaylaştırıyor. (1) Deney tasarımının kaydedilmesi için plaka düzeni; (2) Virüs aşısı sırasında yazılım tarafından otomatik olarak çizilmiş ve gösterilmiştir; (3) yazılım, TCID50 hesaplama formülü için pozitif CPE kriterleri ve seçimleri belirlemede esneklik sağlar; (4) TCID50/mL, test sırasında herhangi bir zaman noktasında belirlenebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmada, adenovirüs-HEK293A ve grip A virüsü-MDCK modelleri kullanılarak enfeksiyonun viral titre belirlenmesi için empedansın uygulanabilirliği gösterilmiştir. Diğerleri ayrıca, ortopoksivirüs12, Batı Nil Virüsü (WNV) ve St. Louis ensefalit virüsü (SLEV)13, chikungunya virüsü14, enfeksif bursalvirüsü 8, kimerik sarı humma dengue15, hepatit A virüsü16, SARS-CoV-217 ve denguevirüsü 9 dahil olmak üzere çok çeşitli virüslerde virüs kaynaklı CPE'nin sağlam ve güvenilir tespitini doğrulamıştır.

Empedans yoluyla gerçek zamanlı CPE kaydı, bazı virüs izin veren hücre modellerinde virüse özgü zamana bağlı CI değer düşüşlerinin keşfedilmesini sağlar. Fang ve ark. ilk olarak, flavivirüs kaynaklı CPE'yi karakterize eden kinetik parametre olan CIT50'nin—hücre empedansında %50 azalma süresi olarak tanımlanan—belirli bir aralıkta viral enfeksiyon dozuyla ters orantılı olduğunu göstermiştir. Ayrıca CIT50'nin, nötralize edici antikortitri 13'ün karşılıklı orantılı olduğunu gösterdiler. O zamandan beri, Sanofi Pasteur'daki Charretier ve arkadaşları, kimerik sarı humma-dengue (CYD) aşı ürünü ve süreci15'in geliştirilmesi sırasında viral enfeksiyon titrelerini belirlemek için bu empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) yöntemini araştırmıştır. Charretier ve ark.15 , bu empedans tabanlı hücre kültürü enfeksif dozu %50 (CCID50) immünboyama tabanlı CCID50 testiyle daha da doğrulamıştır. Empedans tabanlı RTCA yönteminin, endüstriyel ortamda standart CCID50 testinden yaklaşık 5 kat daha az emek yoğun ve 3,5 kat daha maliyet etkin olduğunu gösterdiler. Çalışmamızda, empedans tabanlı TCID50'nin geleneksel Crystal Violet TCID50 testine karşı doğrulanması IAV kaynaklı CPE için gösterilmiştir. Ayrıca, RTCA yazılımındaki Viroloji yazılım modülü kullanılmıştır. CPE-pozitif kuyular yazılımda kullanıcı tarafından tanımlanan CPE-pozitif kuyular kriterlerine göre otomatik olarak tanımlandı; bizim durumumuzda, CI derecesi negatif kontrollere kıyasla düşüyor. TCID50, yazılım tarafından buna uygun şekilde hesaplanarak, CIT50'ye güvenmeden veya test örneğinin optimal aralığın dışına çıkma riski olmadan doğru titer belirlenmesini sağladı. CPE-pozitif kuyular için uygun bir eşik belirlemek çok önemlidir çünkü bu, testin hassasiyetini ve özgüllüğünü doğrudan etkiler. Kullanıcıların, Cell Index değişikliklerini doğrulanmış geleneksel yöntemlerinin sonuçlarıyla karşılaştırarak virüse özgü kriterleri belirlemeleri önerilir. Bu ampirik olarak türetilen eşikler daha sonra yazılımın Viviroloji modülü içinde yapılandırılabilir ve geliştirilebilir.

Diğer hücre tabanlı testler gibi, empedans tabanlı TCID50 testlerinde kullanılan izin veren hücrelerin durumu, testin başarısını ve sonuçların kalitesini belirlemede kritiktir. Yüksek hücre proliferasyonu ve canlılığı sağlamak için taze, düşük geçişli hücreler önerilir. Ayrıca, aynı geçişte izin veren hücrelerden oluşan bir hücre bankası oluşturmak, deneyler arasında tekrarlanabilirliği artırabilir. Şekil 3A'da belirtildiği üzere, izin veren hücreler optimal koşullardayken, tüm test boyunca enfekte edilmemiş kontrollerde stabil ve tutarlı empedans sinyalleri üretirler. CPE-pozitif kuyular için bir eşik belirlemek için güvenilir bir temel referans sağladı ve bu da kesin bir viral titre belirlenmesine yol açtı. Ayrıca, empedans tabanlı TCID50 testi, viral titer değerlendirmesinden önce izin veren hücreler üzerinde kalite kontrolünü benzersiz şekilde gerçekleştirebilmektedir. Sağlıklı izin veren hücrelerin karakteristik kinetik CI profili, güvenilir bir kalite kontrol ölçütü olarak hizmet eder; sadece canlı ve tutarlı hücre popülasyonlarının viral nicelik için kullanılmasını sağlar ve böylece testin tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu artırır.

Her yeni virüs için, uygulanmadan önce empedans-TCID50 testi optimizasyonu ve doğrulaması da yapılmalıdır. Hücre kültürü koşulları gibi temel faktörler, bazal ortam ve FBS konsantrasyonu dahil, tekrarlanabilir hücresel empedans verilerinin elde edilmesinde ve CPE algısının hassasiyetinin artırılmasında kritik öneme sahiptir; önceki çalışmalar 6,16 tarafından vurgulanmıştır. Bu bağlamda, etiketsiz, gerçek zamanlı empedans tabanlı teknoloji, analiz geliştirme sırasında hücre kültürü koşullarını optimize etmek için basit, verimli ve değerli bir araç olduğunukanıtlamıştır 16.

Empedans-TCID50 testinin bir sınırlaması, CPE'ye neden olmayan virüslerde ortaya çıkar; çünkü test, empedans okumasında değişiklikler oluşturmak için CPE'ye dayanır ve bu da TCID50 hesaplamasının temelini oluşturur. Bu tür durumlarda, virüs kaynaklı CPE gösterebilecek alternatif bir izin veren hücre modeli belirlemek veya belirli virüs antijenine karşı uygun bir antikor mevcut olduğu sürece bağışıklık boyama yöntemi benimsemek gerekebilir. Buna rağmen, bu çalışma RTCA MP sisteminin doza bağlı CPE'yi yakalayabilme ve enfekte ile enfekte olmayan hücre popülasyonlarını objektif ve hassas empedans okuması yoluyla etkili şekilde ayırt etme yeteneğini göstermiştir.

TCID50 zamana bağlı analizinin tanıtılması, geleneksel uç nokta ölçümlerine kıyasla önemli bir ilerleme niteliğindedir. TCID50 testi optimizasyon sürecini basitleştirir; çünkü viral titreyi hesaplamak ve raporlamak için en uygun zaman noktası tek bir gerçek zamanlı testle kolayca elde edilebilir. Görüntüleme tabanlı etiketsiz TCID50 testleri de zaman çözünçüsüyle belirlenmiş TCID50 değerleri sağlayabilirken, uygulanabilirlikleri, görüntüleme yazılımı algoritmaları tarafından tanınabilen CPE gösteren virüs hücresi modelleriyle sınırlıdır; IAV-MDCK modelinde gösterilmiştir (Şekil 6A). Ayrıca, CPE algılamasında etiketsiz empedans kullanmak, çeşitli reaktifler ve çok adımlı iş akışlarının insan hatalarıyla ilişkili riskleri potansiyel olarak artırmasının karmaşıklığını ortadan kaldırır. İş akışını basitleştirmenin yanı sıra, sistemin yazılımındaki Viroloji modülü testi de kolaylaştırır. İlk olarak, otomatik sistem kontrollü kayıt için kolay bir deney programı kurulumuyla başlar. Her ölçümden sonra gerçek zamanlı, kendiliğinden CPE-pozitif puanlama yapılır ve enfeksîyonel virüs parçacıklarının doğrudan nicelendirilmesi için otomatik TCID50 hesaplaması ile sona erer (Şekil 7). Bu otomasyon, özellikle yüksek derecede bulaşıcı virüslerle başa çıkılırken uygulamalı zamanı önemli ölçüde azaltıyor; bu da kritik bir gelişmedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,05 Tripsin 0,53 mM EDTA  (1x )Corning25-052-CI
12 Kanal reaktif rezervuarlarıVistaLab Teknolojileri3054-1011
Adenovirus-GFPVector Biolabs 1060
DMEM ortamıATCC30-2002
E-Plaka VIEW 96Çevik300601020
Fetal sığır serumuAvantor97068-085
Hek293A hücresiThermo Fisher Scientific   R70507
Penisillin-Streptomisin çözeltisiHyCloneSV30010
Fosfat tamponu tuzlu su (1x)HyCloneSH30256.01
Seaplaque agaroseLonza50101
xCELLigence RTCA eSight sistemiÇevikS2833AA
xCELLigence RTCA MP sistemiÇevik380601040

Kaynaklar

  1. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. J Virol Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  2. Pourianfar, H. R., Javadi, A., Grollo, L. A colorimetric-based accurate method for the determination of enterovirus 71 titer. Indian J Virol. 23 (3), 303-310 (2012).
  3. Hochdorfer, D., Businger, R., Hotter, D., Seifried, C., Solzin, J. Automated, label-free TCID50 assay to determine the infectious titer of virus-based therapeutics. J Virol Methods. 299, 114318(2022).
  4. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the Calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virol Sin. 36 (1), 141-144 (2021).
  5. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  6. Atienza, J. M., et al. Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system. Assay Drug Dev Technol. 4 (5), 597-607 (2006).
  7. Cheung, C. Y., Leung, C. K., Peiris, J. S. Potential of the real-time and label-free cell sensor impedance technology to transform cell-based infectivity assays for influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 5 (Suppl 1), 151-154 (2011).
  8. Ebersohn, K., Coetzee, P., Venter, E. H. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 199, 25-28 (2014).
  9. Goh, V. S. L., et al. Evaluation of three alternative methods to the plaque reduction neutralizing assay for measuring neutralizing antibodies to dengue virus serotype 2. Virology J. 21 (1), (2024).
  10. Crisostomo, L., Soriano, A. M., Mendez, M., Graves, D., Pelka, P. Temporal dynamics of adenovirus 5 gene expression in normal human cells. PLOS One. 14 (1), e0211192(2019).
  11. Wang, T. E., et al. Differentiation of cytopathic effects (CPE) induced by influenza virus infection using deep convolutional neural networks (CNN). PLoS Comput Biol. 16 (5), e1007883(2020).
  12. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochem Biophys Res Commun. 401 (1), 37-41 (2010).
  13. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. J Virol Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  14. Marlina, S., Shu, M. -H., Abubakar, S., Zandi, K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8 (1), (2015).
  15. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 252, 57-64 (2018).
  16. Lebourgeois, S., et al. Development of a real-time cell analysis (RTCA) method as a fast and accurate method for detecting infectious particles of the adapted strain of Hepatitis A virus. Front Cell Infect Microbiol. 8, (2018).
  17. Suryadevara, N., et al. Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 3 (2), 101387(2022).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Empedans ÖlçümüGerçek Zamanlı İzlemeSitopatik Etkiİşaretsiz AnalizVirüs Seri DilüsyonuOtomatik Viral KantifikasyonHEK293A HücreleriMDCK Hücreleri
Otomatik Virüs Titri Nic Ification için Empedans kullanarak Etiketsiz Gerçek Zamanlı 50% Doku Kültürü Enfeksif Doz (TCID50) Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.