Yöntem makalesi

Drosophila melanogaster'de Nöral Devrelerin Optogenetik Manipülasyonu için Davranışsal Testler

DOI:

10.3791/67964

⸱

7 Şubat 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Neuroscience, Virginia Tech, 2Academy of Integrated Science, Virginia Tech, 3Fairfax County Public Schools, Westfield High School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, belirli nöronları aktive etmek ve susturmak için CsChrimson ve GtACR2 kullanarak Drosophila melanogaster'de optogenetik manipülasyon yöntemlerini sunmaktadır. Termotaktik ve tat davranışlarını keşfetmek için optogenetiği kullanmak ve bu süreçleri yöneten altta yatan nöral mekanizmalar hakkında bilgi sağlamak için dört deney tanımlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetik, sinirbilimde temel bir teknik haline gelmiştir ve ışık stimülasyonu yoluyla nöronal aktivitenin hassas kontrolünü sağlar. Bu çalışma, Drosophila melanogaster'de optogenetik yöntemlerin uygulanması için uygulaması kolay kurulumları tanıtmaktadır. İki optogenetik araç, kırmızı ışıkla aktive edilen bir katyon kanalı olan CsChrimson ve mavi ışıkla aktive edilen bir anyon kanalı olan GtACR2, dört deneysel yaklaşımda kullanıldı. Bu yaklaşımlardan üçü tek sinek deneylerini içerir: (1) sıcaklığa duyarlı ısıtma hücrelerini hedefleyen mavi ışıklı optogenetik termotaktik konumsal tercih testi, (2) acı algılama nöronlarını aktive eden kırmızı ışıklı optogenetik konumsal tercih testi ve (3) tatlı algılayan nöronları aktive eden bir hortum uzatma yanıtı testi. Dördüncü yaklaşım (4), birden fazla sinek kullanarak kaçınma davranışlarını değerlendirmek için bir sinek labirenti kurulumudur. Nöral aktiviteyi zamansal ve mekansal olarak manipüle etme yeteneği, duyusal işleme ve karar verme konusunda güçlü içgörüler sunar ve optogenetiğin nöral işlev bilgimizi ilerletme potansiyelinin altını çizer. Bu yöntemler, belirli nöral yolların ve bunların davranışsal sonuçlarının anlaşılmasını geliştirmek için sinirbilimde gelecekteki araştırmalar için erişilebilir ve sağlam bir çerçeve sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetik, sinirbilimde optik ve genetiği birleştiren, ışık stimülasyonu yoluyla nöral aktivite üzerinde hassas, invaziv olmayan kontrol sağlayan güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır1. Yaygın olarak kullanılan bir model organizma olan Drosophila melanogaster'de, optogenetik araçlar, belirli nöronların aktivasyonunu ve inhibisyonunu sağlayarak araştırmacıların nöral devreleri modüle etmesine olanak tanır. Kullanılan araçlar arasında CsChrimson ve GtACR (Guillardia theta anyon kanal rhodopsins) nöronal hedefleme için tamamlayıcı yaklaşımlar sağlar. Yeşil alglerden kırmızı ışığa duyarlı bir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Suşlar, sinek yetiştirme ve sinek aspiratörü

  1. Suşlar ve bakım
    1. Deneylerde kullanılan suşlar arasında HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stok Merkezi (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136) bulunur. Arka, 12 saatlik ışık: 12 saatlik karanlık döngü altında standart bir mısır unu ortamında 25 ° C'de uçar.
      NOT: 1 L mısır unu ortamı 1 L dH2O, 79 g dekstroz, 7.5 g agar, 24 g pul maya, 57 g mı....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek sinek mavi ışık optogenetik termotaktik pozisyonel tercih testi
Dört koşul test edildi: ATR takviyesi olmayan oda lambası (oda lambası, ATR -), ATR takviyesi olan oda lambası (oda lambası, ATR +), ATR takviyesi olmayan mavi ışık (mavi, ATR -) ve ATR takviyesi olan mavi ışık (mavi, ATR +). İlk üç koşul kontrol görevi gördü. Kontrol deneylerinde, sinekler 31 °C tarafından kaçındı. ATR takviyesi ile mavi ışıkta, sinekler 25 ° C ile 31 ° C arasında bir tercih göstermedi, bu da HC nöronlarının GtACR2 a.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetik manipülasyon, nöral devrelerin uzay-zamansal doğrulukla hassas kontrolünü sağlayarak sinirbilim alanını dönüştürmüştür27. Bir nöral devre, aktivasyon üzerine belirli işlevleri yerine getiren, sinapslarla birbirine bağlı nöron popülasyonlarını içerir. Drosophila tüm beyin konektomu tamamlandı ve Drosophila beynindeki sinaptik yollar hakkında kapsamlı bilgiler sunuyor28,29. Kone.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu makalenin yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Tüm yazarlar olası çatışmaları açıklamış ve bu çalışmada sunulan çalışmayı etkileyebilecek hiçbir finansal veya kişisel ilişkileri olmadığını teyit etmişlerdir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm şekiller için şematik diyagramlar Biorender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) tarafından L.N.'ye desteklenmiştir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayın kararında veya makale hazırlamada hiçbir rolü yoktu.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1000 mA LED sürücüLuxeon Star3021-D-E-1000
5 mL VWR Kültür Tüpleri, Plastik, Çift Konumlu KapaklıVWR60818-664
780 Uzun Geçiren Filtre / IR 780 nm 100 mm x 100 mmLee FiltrelerBH #LE8744Yaklaşık 47 x 100'e kadar kesin, plastik kapağa sığdırın
Agfabric, 6,5 ft x 15 ft. Bitkileri, Sebzeleri, Çiçekleri, MeyveleriKorumak için Böcek Böcek Ağı Bahçe AğıThe Home DepotEIBNW6515
Tüm trans retinalSigma-Aldrich116-31-4
Alüminyum Plaka (30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm)Amazon'dansatın alındı
Siyah Plastik KutuLI-COR929-97101
KALSİYUM KLORÜR ANHYDRO 25GRThermo Fisher Scientific 
CX405 Exmor R CMOS sensörlü HandycamSONYHDR-CX405
Elmer' s “ Okul Tutkalı"Elmer
Etil alkol, Saf (200 Kanıt)Sigma-AldrichE7023
Fisherbrand Isotemp Sıcak Plaka KarıştırıcıFisher ScientificSP88850200
Sinek hattı: Gr5a-Gal4Bloomington Drosophila Stok Merkezi57592
Sinek hattı: Gr66a-Gal4Bloomington Drosophila Stok Merkezi57670
Sinek hattı: HC-Gal4 (II)Dr. Marco Gallio LabNazik bir hediye
Uçuş hattı: UAS-CsChrimsonBloomington Drosophila Stok Merkezi55136
Sinek hattı: UAS-GtACR2/TM6BDr. Quentin Gaudry LabNazik bir hediye
Flystuff 62-101 Sarı mısır unu (11,3 kg), sarı, 11,3 kg/birimGenesee Scientific62-101
Flystuff 62-107 Aktif Olmayan Kuru Maya, 10 Kg, Besleyici Pul, 10 Kg/BirimGenesee Scientific62-107
Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 Mesh, 5 Kg (11.02 lbs)/BirimGenesee Scientific66-103
FreeMascot OD 8+ 190 nm– 420 nm / 600 nm / ndash; 1100 nm Dalga Boyu Menekşe / Kırmızı / Kızılötesi Lazer Güvenlik Gözlükleri ÜcretsizMaskot B08LGMQ65SAmazon
GoPro Hero8 BlackGoPro'danalındı 6365359
LEE Filtreleri 100 kez; 100 mm Kızılötesi #87 Kızılötesi Polyester FiltreB & H FotoğrafLE8744
Uzun Geçiren Filtre, Renkli Cam, 50,8 x 50,8 mm, 830 nm Cut-on, RG830NewportFSQ-RG830
Metil 4-hidroksibenzoat, %99, Thermo Scientific ChemicalsThermo Fisher Scientific 
MicroWell Mini Tepsi 60 Kuyulu, Düşük Profilli NS PSThermal Scientific NUNC 439225Kapaklar "plastik kapak" olarak
kullanılırOlympus Plastics 24-160RS, 1000 & L Olympus Ergonomik Pipet Uçları Düşük Ciltli, Raflı, Steril, 8 Raf 96 Uç/BirimEppendorf24-160RS
Parafilm M SızdırmazlıkFilmi Heathrow ScientificHS234526B4 inç x 125 fit
Potasyum klorür, ACS, %99,0-100,5, Thermo Fisher Bilimsel 
PrismGraphPadSürüm 9veri analiz yazılımı
Samco Dereceli Transfer PipetleriThermo Fisher Scientific 2253 mL
SlaytlarFisher Scientific12-544-2  5 mm x 75 mm x 1.0 mm
Stereo mikroskopOLYMPUSCZ61
Strafor kutu (27 cm yükseklik ve süreler; 22 cm genişlik ve süreler; 16 cm uzunluk)
SucroseFisher Scientific225911
Yüzey sıcaklık probuFluke80PK-3A
ŞırıngaBD Integra305270
Tate & Lyle 457 Dekstroz, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dekstroz, Tate & Lyle, Toz, 50 lbs / BirimGenesee Scientific62-113
İzlenebilir Kalibre Edilmiş Büyük Haneli Termokupl Termometrecple-parmer  ile izlenebilir; UX-91210-07Fisherbrand İzlenebilir BigDigit K Tipi Termometre
Üçlü mavi LED sancakLED'leriEk07007-PB000-D470 nm
Üçlü kırmızı LED sancakLED'leriEk07007-PD000-F627 nm
Tygon PVC Şeffaf Boru 1/4" ID, 3/8" OD, 5 ft. Uzunluk McMaster Carr Tedarik Şirketi 6516T21 
Univivi IR Aydınlatıcı, 850nm 12 LED Gece Görüşü için Geniş Açılı IR IşıkUnivivi4331910725
Wakefield Termal 25.4 mm Yuvarlak Soğutucu Yıldız LED Kartı - 882-100ABWakefield-Vette882-100AB
Kablosuz SunucuDinoFire StoreB01410YNAMAmazon'dan satın alındı
AC297150250 satın 126960025AA1159530

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  2. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  3. Mauss, A. S., Busch, C., Borst....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CsChrimson AktivasyonuGtACR2 nhibisyonuKonumsal Tercih DeneyiProbosis Uzatma TepkisiSinek Labirenti DeneyiDuyusal leme

İlgili makaleler