Yöntem makalesi

Kateter İlişkili İdrar Yolu Enfeksiyonunun İn Vitro Mesane Modeli

DOI:

10.3791/67966

⸱

24 Haziran 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, simüle edilmiş kateterle ilişkili idrar yolu enfeksiyonlarında hem planktonik hem de biyofilm ile ilişkili bakteri hücre popülasyonlarını incelemek için kullanılabilen kateterize idrar yolunun in vitro bir modelini detaylandırır. Bu model, idrar yolu enfeksiyonlarını kontrol etmeyi amaçlayan antimikrobiyal ürünlerin etkinliğini incelemek için daha fazla kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kateter ilişkili idrar yolu enfeksiyonları (ÜSE) en sık görülen sağlık hizmeti ilişkili enfeksiyonlar arasındadır. Üriner kateterlerde biyofilm oluşumu bu enfeksiyonların patogenezinde önemli bir unsurdur ve sıklıkla kateterlerin tıkanmasına ve piyelonefrit ve septisemi gibi ciddi komplikasyonlara yol açar. Bu ortamda biyofilm oluşumunu modellemeye ve incelemeye yönelik yaklaşımlar, hem ÜSE patogenezini destekleyen mekanizmaların temel bir anlayışı hem de ÜSE ve kateter tıkanıklığını kontrol etmek için etkili terapötik stratejilerin geliştirilmesi ve sağlam klinik öncesi değerlendirmesi için gereklidir. Bu protokol, klinik uygulamada kullanıldığı şekliyle kateter kapalı drenaj sistemini kopyalayan, temsili koşullar altında CAUTI ve kateter biyofilm oluşumunun incelenmesini kolaylaştıran, kateterize idrar yolunun in vitro bir modelini tanımlar. Ayrıca, bu protokol, şu anda NHS tedarik zincirinde mevcut olan ürünler de dahil olmak üzere antimikrobiyal kateter bakım ürünlerinin etkinliğini değerlendirmek için in vitro mesane modelinin uygulanmasını detaylandırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üriner kateterler, akut bakım tesislerinde tahmini %19 prevalansı ile en sık kullanılan tıbbi cihazlar arasındadır 1,2,3. Kateterler öncelikle mesane disfonksiyonu durumlarında idrar çıkış yönetimine yardımcı olmak için kullanılır ve doğrudan mesaneye yerleştirilir ve idrarın merkezi bir lümen 2,3 aracılığıyla mesaneden boşalmasına izin verir. Üriner kateterler, idrarı boşaltmak için periyodik olarak mesaneye yerleştirildikleri aralıklı olarak kullanılabilir veya idrarı sürekli olarak boşaltmak için kateterlerin mesanede yerinde bırakıldığı kalıcı kateterler kullanılabilir 3,4. Yaygın kullanımlarına rağmen, üriner kateterler, sağlık hizmetleriyle ilişkili enfeksiyonların tahmini beşte birini oluşturan idrar yolu enfeksiyonlarının (İYE) gelişimi için en büyük risk faktörüdür 5,6. Gerçekten de, kateterin kendisi genellikle mikrobiyal kolonizasyonun ilk bölgesi olarak işlev görür ve üropatojenlerin idrar yolunayapışması ve daha fazla kolonize etmesi için bir yüzey sağlar 1,6,7,8. Uzun süreli sürekli kateterizasyon uygulanan hemen hemen tüm hastalarda (kateterin ≥28 gün) bakteriüri görülecektir ve kateterin yerinde olduğu her gün için risk ~%5 oranında artmaktadır 2,9,10,11. Orantılı olarak, İYE'lerin yaklaşık% 80'i üriner kateter kullanımı ile ilişkilidir6.

Kateterle ilişkili üriner sistem enfeksiyonları (ÜSE'ler) sağlık hizmetleri için önemli bir yük oluşturur ve genellikle komplike olmayan İYE'lere göre daha ciddi üst İYE semptomları (üreterit ve piyelonefrit gibi) ve ayrıca ikincil kan dolaşımı enfeksiyonu riskinde artış ile ilişkilidir 1,7,12,13,14 . ÜSE'ler için standart tedaviler antibiyotik tedavisini içerir, ancak bu enfeksiyonlar genellikle kateter yüzeyinde karmaşık biyofilm topluluklarının gelişmesinin bir sonucu olarak antimikrobiyal tedaviye karşı inatçıdır 15,16,17,18,19,20. Gerçekten de, CAUTI'lerin ~%80'inin biyofilm oluşturan idrar yolu patojenlerinden kaynaklandığı tahmin edilmektedir19. Biyofilm oluşumu, bakteri hücrelerinin kateter yüzeylerine bağlanması ve geniş bir hücre dışı polimerik maddeler matrisine (EPS) gömülü toplulukların gelişmesi ile karakterize edilir21,22,23,24. EPS'nin üretimi, biyofilm topluluklarının tanımlayıcı bir özelliğidir ve antimikrobiyal ajanlara karşı yüksek direnç ve bağışıklık klerensi gibi biyofilmle ilişkili hücreler tarafından sergilenen ortaya çıkan özelliklerin çoğundan sorumludur 21,22,24. EPS, hücreleri fiziksel olarak koruyarak ve onları antimikrobiyallerden veya immün efektörlerden koruyarak ve ayrıca biyofilmin fizikokimyasal mikro çevresi ve kalıcı hücrelerin oluşumu gibi biyofilm topluluklarının daha geniş yönlerinin gelişimini kolaylaştırarak dolaylı olarak bu fenotiplerde doğrudan bir rol oynayabilir 23,24,25,26. Ayrıca, CAUTI'lerin ~% 11'ini oluşturan Proteus spp. dahil olmak üzere bazı üropatojenler, idrarda bulunan üreayı hidrolize etmelerini sağlayan ve idrar pH'ında genel bir artışa neden olan güçlü üreaz enzimlerine sahiptir 2,27,28,29,30. Bu pH artışına, büyüyen biyofilme dahil edilebilen kalsiyum ve magnezyum fosfat kristallerinin çökelmesi eşlik eder, bu da biyomineralizasyona ve kateterleri bloke edebilen yoğun kristalin biyofilm yapılarının oluşumuna neden olur. Bu kristalin biyofilmler sadece tedaviyi sorunlu hale getirmekle kalmaz, aynı zamanda piyelonefrit ve septisemi gibi ciddi komplikasyonları da başlatabilir 2,28,31,32,33,34.

Kateterize üriner yoldaki karmaşık çevresel niş ve bu enfeksiyonlarda biyofilm oluşumunun önemli rolü, CAUTI patogenezinin çalışmasında özel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. 96 oyuklu plaka bazlı tahliller gibi biyofilm oluşumunu incelemek ve ölçmek için basit ve yaygın olarak kullanılan laboratuvar modelleri, CATUI'de biyofilm oluşumunun, özellikle kristalin biyofilmlerin incelenmesi için yetersizdir. Örneğin, bu tür modeller, idrar tarafından sağlanan karmaşık besin ortamı, kateter yüzeyinin yapışmayı ve müteakip biyofilm üretimini nasıl etkilediği ve idrar ortamının sürekli akışı gibi CAUTI nişinin temel yönlerini hesaba katmaz 35,36,37,38,39,40. Ek olarak, üropatojenlerin antimikrobiyal duyarlılığını belirlemek için kullanılan standart testler genellikle gerçek dünyadaki klinik duyarlılığı yansıtmaz. Minimum inhibitör konsantrasyon testleri ve mikrobiyal süspansiyon testleri, CAUTI patojenlerinin antimikrobiyal duyarlılığını anlamak için sıklıkla kullanılır, ancak tipik olarak, bir üriner kateterin varlığının ve müteakip herhangi bir biyofilm oluşumunun antimikrobiyal duyarlılık üzerindeki etkisi gibi CAUTI ortamının önemli değişkenlerini simüle etmez 41,42,43.

Bu çalışma, kateterize idrar yolunun ortamını simüle eden ve ilk olarak 1999'da Stickler ve ark.44 tarafından tanımlanan klinik uygulamada kullanılan standart bir kateter kapalı drenaj sistemini kopyalayan bir in vitro mesane modelinin kurulumunu ve çalışmasını detaylandırmaktadır (Şekil 1). Bu model, CAUTI ve biyofilm oluşumunu simüle etmek için daha önce Nzakizwanayo ve ark.45tarafından tanımlandığı gibi standart boyutlu Foley kateterleri (şu anda NHS tedarik zincirinde mevcuttur) ve yapay idrar ortamını (AUM) kullanır. İn vitro mesane modeli, "mesane" görevi gören ve merkezi cam hazneye bir Foley kateterinin yerleştirilebileceği bir çıkışa sahip çift duvarlı bir cam odadan oluşur. Merkezi cam haznenin üst kısmında, peristaltik bir pompa kullanılarak biyolojik olarak uygun bir akış hızında AUM'nin "mesaneye" verilebileceği bir giriş vardır ve bu giriş kateterden drenaj göz delikleri yoluyla bir atık torbasına akacaktır. Ek olarak, dış hazne, modellerin sabit bir sıcaklıkta tutulmasını sağlayan bir su banyosu devresine bağlanır. İn vitro mesane modeli, merkezi oda yoluyla aşılanabilir ve bu da CAUTI patojenlerinin biyolojik olarak temsili bir niş içinde incelenmesine olanak tanır. Ayrıca, modeller kateterize edildiğinden ve sürekli olarak taze AUM ile beslendiğinden, hem planktonik hem de biyofilm ile ilişkili hücrelerin büyümesi ve popülasyon dinamikleri incelenebilir.

Geçmiş çalışmalar, Proteus mirabilis ve Escherichia coli 43,45,46,47,48,49 dahil olmak üzere önde gelen CAUTI patojenlerinde biyofilm oluşumunun temel çalışması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için in vitro mesane modellerini kullanmıştır. Ek olarak, CAUTI'yi kontrol etmeyi veya tıkanmayı önlemeyi amaçlayan ürünlerin etkinliğini değerlendirmek için in vitro model kullanılmıştır50,51,52. Daha yakın zamanlarda, AMR ile bağlantılı adaptasyonların ve mutasyonların biyofilm oluşumunu ve CAUTI patogenezini etkileyip etkilemediğini belirlemek için modeller kullanılmıştır. P. mirabilis43,46. İn vitro mesane modeli, yeni formüle edilmiş teranostik kateter kaplamaları ve faj tedavisi tedavileri47,48 dahil olmak üzere CAUTI'yi tedavi etmeyi amaçlayan yeni antimikrobiyal tedavileri incelemek için de kullanılmıştır. Bu protokol, in vitro mesane modellerinin kurulumunu ve çalıştırılmasını, sırasıyla modelden ve üriner kateter yüzeyinden canlı planktonik ve biyofilm ile ilişkili hücrelerin sayımını ve üreaz üretimini izlemek için idrar pH'ının ölçümünü kapsar. Protokoller ayrıca, şu anda NHS tedarik zincirinde mevcut olan mesane irrigasyon solüsyonları ve antimikrobiyal yağlayıcı jeller dahil olmak üzere CAUTI'yi tedavi etmeyi veya önlemeyi amaçlayan antimikrobiyal ürünlerin değerlendirilmesi için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vitro mesane modeli kurulumunun şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir. İn vitro mesane modelleri standart Foley kateterler ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1'de gösterilen boyutlar standart boy 14 Fransız kateterleri ile uyumludur). Tüm in vitro mesane modeli ekipmanlarını sterilize edin ve cl kullanmadan önce kullanılan herhangi bir silikon boruyu medya devresine yerleştirin. İn vitro modellerin kurulumu boyunca aseptik tekniğe sıkı sıkıya bağlı kalınması gerekir ve modelin steril koşullar altında (yani kategori II mikrobiyal güvenlik kabini veya laminer akış başlığı) monte edilmesi önerilir. İn vitro mesane modeli deneyleri için istatistiksel anlamlılığı belirlemek için en az n = 5 kopya önerilir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Suni idrar ortamının hazırlanması

NOT: Yapay idrar ortamının (AUM), deney için gereken yüksek hacimli ortamlar ve insan idrar örnekleriyle ilişkili değişkenlik nedeniyle in vitro mesane modellerinde kullanılması önerilir. Bu protokol, daha önce tarif edildiği gibi AUM'un hazırlanmasını detaylandırır ve Nzakizwanayo ve arkadaşları tarafından in vitro mesane modelinde kullanım için optimize edilmiştir. (5 L son hacim) 43,45,46,48,53,54.

  1. AUM çözümünü hazırlayın 1
    1. Aşağıdaki bileşikleri tartın ve 850 mL deiyonize su ile doldurulmuş 1 L'lik bir borosilikat şişeye ekleyin: 3.25 g magnezyum klorür heksahidrat (MgCl2.6H 2O), 23 g sodyum klorür (NaCl), 11.5 g susuz sodyum sülfat (Na2S04), 3.25 g trisodyum sitrat (Na3C6H5O7), 0.1 g sodyum oksalat (Na2C2O4), 14 g monopotasyum fosfat (KH2PO4), 8 g potasyum klorür (KCl), 5 g amonyum klorür (NH4Cl), 25 g jelatin ve 5 g tripton soya suyu.
  2. AUM çözeltisini karıştırırken, bir pH metre kullanarak pH'ı ölçün ve uygun şekilde 3 M NaOH veya HCl ekleyerek 5,75'e (± 0,02) ayarlayın.
    NOT: pH ayarlaması için NaOH / HCl, çözeltiden tuz çökelmesini önlemek için AUM'ye damla damla eklenmelidir.
  3. AUM pH ayarlandıktan sonra, çözeltiyi deiyonize su ile 1 L'lik son hacme kadar doldurun ve otoklavda sterilize edin.
    NOT: Steril olduktan sonra, çözelti oda sıcaklığında üç aya kadar saklanabilir (yağış veya bulanıklık gözlenirse AUM çözeltisi 1 atılmalıdır).
  4. Ayrı olarak, steril 500 mL'lik bir beherde 400 mL steril, deiyonize suya 125 g üre (CH4N2O) ve 2.45 g kalsiyum klorür (CaCl2) ekleyerek AUM çözeltisi 2'yi hazırlayın.
    NOT: Kalsiyum üre çözeltisi 2'nin hazırlanması endotermik bir reaksiyona neden olur, bu nedenle, donmayı önlemek için bileşikler çözülürken AUM çözeltisi 2'nin karıştırılması ve sıcak bir plaka/manyetik karıştırıcı üzerinde ~ 50 °C'ye ısıtılması önerilir.
  5. Üre ve kalsiyum klorür çözüldükten sonra, bir vakum pompası ve 0.45 μM nitroselüloz filtre üniteleri kullanarak çözelti 2'yi steril, 500 mL'lik bir cam şişeye filtreleyin. Sterilize edildikten sonra, çözelti 2 4 ° C'de üç ay veya oda sıcaklığında bir ay boyunca stabildir
    NOT: Yağış veya bulutluluk gözlenirse AUM çözeltisi 2 atılmalıdır.
  6. Laminer akış başlığında veya Kategori II mikrobiyolojik güvenlik kabininde, AUM solüsyonları 1 ve 2'yi steril, 5 L'lik bir cam aspiratör şişesinde 3,6 L steril deiyonize su ile aseptik olarak birleştirin. AUM soluk sarı renkte ve şeffaf olmalıdır.
  7. Serolojik bir pipet kullanarak, toplam AUM hacminden 50 mL'yi çıkarın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne alın ve daha sonra kullanmak üzere ayırın.
  8. Aspiratör şişesini lastik bir çubuk veya alüminyum folyo kullanarak kapatın ve in vitro modeller monte edilene kadar oda sıcaklığında bırakın.
  9. 50 mL alikottan 10 mL AUM'u aseptik olarak çıkarın ve çözeltinin geri kalanını aşı hazırlığı için ayırın. Bir pH metre kullanarak, ~pH 6.1 (±0.2) olması gereken 10 mL AUM alikotunun pH'ını ölçün. Hazırlanan AUM, oda sıcaklığında yaklaşık bir ay boyunca stabildir ve yağış veya bulanıklık meydana gelirse atılmalıdır.

2. İn vitro mesane modeli kurulumu

  1. İn vitro mesane modelinin merkezi cam odasına bir Foley kateteri yerleştirin ( şema Şekil 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Sağlanan steril su şırıngası ile balonu şişirerek kateteri yerine sabitleyin ve atık torbasını kateter portuna takın.
  2. İn vitro mesane modeli cihazı45 bağlantı borusu aracılığıyla AUM rezervuarına bağlayın. Medya devresi borusunu üreticinin talimatlarına göre peristaltik pompaya bağlayın ve borunun gerilmeden yeterli gerginliğe sahip olduğundan emin olun.
  3. Standları sıkıştırmak için in vitro mesane modellerini takın ve modellerden yerçekimi yoluyla akışı sağlamak için atık torbalarını modellerin altındaki standlara sabitleyin.
  4. Mesane modelinin dış haznesini silikon boru ile dolaşan bir su banyosuna bağlayın (Şekil 1B). Su banyosunu 37 °C'ye ısıtacak şekilde ayarlayın ve tank sirkülatörlerini açın.
    1. Sıcaklığın 37 °C'de sabit kalmasını sağlamak için in vitro mesane modellerini aşılamadan önce 30 dakika boyunca su banyoları yapın ve deney süresince su banyosunun uygun su seviyesine kadar dolu kaldığından emin olun.
  5. Ortam borusundan tüm kelepçeleri çıkarın ve insan idrar üretimini (~ 1080 mL / gün) çoğaltmak için peristaltik pompaları yaklaşık 0.75 mL / dk'da çalışacak şekilde ayarlayın. Gerçek akış hızları deney sırasında hesaplanacaktır.
  6. Ortam akışının tutarlı bir hızda olduğunu ve steril drenaj sisteminin sağlam olduğunu doğrulamak için AUM'yi aşılamadan önce 30 dakika boyunca peristaltik pompa aracılığıyla in vitro mesane modellerinden geçirin.
  7. Deneyden önce biriken ortamları atık torbasından boşaltın. Kesin akış hızlarını hesaplamak için ortamın hacmi ölçülebilir (4. adımda ayrıntılı olarak açıklanmıştır).

3. İn vitro mesane modellerinin aşılanması

  1. Katı agar üzerinde yetiştirilen bir ilmek dolusu bakteri kolonisini 10 mL LB et suyuna süspanse ederek in vitro mesane modelleri için gece boyunca kültürler hazırlayın. Gece boyunca 37 ° C'de çalkalama ile inkübe edin.
    NOT: İn vitro mesane modeli, Proteus mirabilis gibi üreaz pozitif suşlar dahil olmak üzere çeşitli CAUTI patojenlerini incelemek için kullanılabilir ve kullanılan büyüme ortamı buna göre değiştirilebilir.
  2. Gece boyunca kültürün tüm hacmini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti 10 mL AUM'de yeniden süspanse edin ve bir spektrometre kullanarak OD595 nm'de absorbansı ölçün.
  3. Aşağıdaki denklemi kullanarak yeniden askıya alınan kültürleri AUM'de OD595 nm'lik 1.0'a ve son hacim 10 mL'ye normalleştirin:
    figure-protocol-1
    burada, A1 , gece kültürünün OD600 nm'deki absorbanstır, A2 , inokulumun OD600 nm'sinde istenen absorbanstır (1.0), V2 , inokulumun istenen hacmidir (10 mL) ve V1 , normalizasyon için gerekli gece kültürü hacmidir.
    NOT: 10 mL'lik bir OD595 nm 1.0 süspansiyonu, modellerin çoğu bakteri suşunun yaklaşık 1010 CFU ile aşılanmasını sağlayacaktır ( Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus için onaylanmıştır), yerleşik bir enfeksiyonu çoğaltır. Başlangıç aşısı, kullanılan türe veya modellenen enfeksiyon aşamasına bağlı olarak değiştirilebilir (yani, erken evre enfeksiyonu simüle etmek için daha düşük bir aşı yoğunluğu kullanılabilir)47.
  4. İn vitro mesane modellerini p etanol kullanarak sterilize edin ve iç hazneye erişilebilecek şekilde durdurucuyu (ortam girişi) çıkarın. Serolojik bir pipet kullanarak mesane modelinin içindeki hacimden 10 mL AUM'u çıkarın.
    NOT: Merkezi hazneden in vitro modelleri aşılarken ve numune alırken, işin hızlı ve aseptik olduğundan emin olun, her zaman uygun KKD giyin ve eldivenleri ve yüzeyleri düzenli olarak p etanol ile dekontamine edin.
  5. Normalleştirilmiş 10 mL süspansiyonun tamamını kullanarak in vitro mesane modellerini merkezi hazneden aşılayın ve serolojik bir pipetle iyice karıştırın. Daha sonra CFU / mL hesaplamaları ve pH ölçümü için serolojik bir pipet ve alikot kullanarak in vitro mesane modellerinin merkezi odasından 10 mL'yi 15 mL'lik bir üniversal olarak çıkarın.
  6. Mesane modelinin ve tıpasının dış yüzeylerini p etanol ile iyice dekontamine edin ve durdurucuyu değiştirin. Akışı durdurmadan önce merkezi odadaki AUM seviyesinin göz deliğine ulaştığından emin olmak için ortam akışına kısa bir süre devam edin.
  7. Peristaltik pompa aracılığıyla ~ 0.75 mL / dk'da ortam akışını açmadan önce kültürlerin mesane modelinde 1 saat birikmesine izin verin.
  8. Aşı kurulurken, merkezi odadan alınan numuneden seyreltmeler hazırlayın.
    1. 100 μL numuneyi 900 μL steril PBS içinde numune 10-7 ° C'ye seyreltilene kadar seri olarak seyreltin. Seyreltmelerin 10 μL'lik lekelerini uygun katı ortamda üç kopya halinde plakalayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. İnkübasyondan sonra, her bir seyreltme plakasındaki kolonileri sayın ve ilk inokulumun tam CFU / mL'sini hesaplayın.
      NOT: Sürü halinde olan türler, yani Proteus mirabilis kullanılıyorsa, tuzsuz MacConkey agar kullanın (pepton 20.0 g/L, laktoz 10.0 g/L, safra tuzları 5.0 g/L, nötr kırmızı 0.075 g/L ve agar 12.0 g/L) sayma kolaylığı için tek kolonilerin hala görünür olmasını sağlamak için.
  9. 1 saatlik inkübasyondan sonra, in vitro mesane modellerini çalıştırmaya başlamak için peristaltik pompa aracılığıyla ortam akışını açın ve modellerin açıldığı zamanı not edin.

4. İn vitro mesane modeli akış hızının hesaplanması

  1. İn vitro modeller aşılandıktan ve ortam akışı başlatıldıktan sonra, modellerin 4 saat çalışmasına izin verin. Ortam akışını kısa bir süreliğine duraklatın ve atık torbasından kalan AUM'un tüm hacmini drenaj portu aracılığıyla hacimsel bir şişede toplayın. Toplanan hacmi not edin.
    NOT: Akış hızı, adım 2.7'de toplanan ortamın hacminden hesaplanabilir, ancak modellerin daha uzun süre çalıştırılmasıyla (yani önerilen 4 saat) daha doğru akış hızları elde edilebilir, çünkü bu, ortam devresi borusunda hesaplanan akış hızını etkileyen artık hava olasılığını azaltır.
  2. Steril bir drenaj sistemi sağlamak için atık torbası drenaj portunun kapalı olduğundan emin olarak peristaltik pompa aracılığıyla medya akışına devam edin.
  3. In vitro modellerin gerçek akış hızını hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
    figure-protocol-2
    NOT: İnsan idrar üretimini çoğaltmak için 0.55-1.0 mL/dk aralığındaki akış hızları önerilir.
  4. Ortam akış hızı kabul edilebilir aralığın dışında hesaplanırsa, kopyayı atın ve peristaltik pompadaki rpm'yi kabul edilebilir aralığa sığacak şekilde ayarlayın.

5. İn vitro mesane modelinden planktonik hücrelerin örneklenmesi

NOT: İn vitro mesane modelleri, popülasyon dinamiklerini izlemek için deney boyunca rutin olarak örneklenmelidir. Tüm modeller, aşılamadan hemen sonra, AUM akış aktivasyonu noktasında, aşılamadan 4 saat sonra (akış hızı hesaplandığında) örneklenmelidir ve bu noktada modeller sonlandırılmalıdır (blokaj veya önceden belirlenmiş bir son nokta). Modeller >24 saat boyunca çalıştırılıyorsa, CFU/mL'yi izlemek için her 24 saatte bir numune alınması önerilir ve kullanıcıların gerektirdiği şekilde ek numuneler alınabilir.

  1. Mesane modeli durdurucuyu p etanol ile dekontamine edin ve merkezi hazneye erişmek için çıkarın.
  2. Kateter ucu ve balondan kaçınarak, serolojik bir pipet kullanarak merkezi haznenin içeriğini nazikçe karıştırın.
  3. Serolojik bir pipet kullanarak, hazneden 10 mL'lik bir numune alın ve steril bir tüpe aktarın. Durdurucuyu hemen% 70 etanol ile dekontamine edin ve steril, kapalı drenaj devresini tamamlayarak değiştirin.
  4. Bir pipet kullanarak numuneden 1 mL çıkarın ve seri dilüsyonlar için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne alın.
  5. Kalan numunenin pH'ını bir pH metre kullanarak ölçün, numunenin iyice karıştırıldığından ve pH metrenin kullanımdan önce kalibre edildiğinden emin olun.
  6. Numuneden ayrılmış 1 mL alikotu seri olarak seyreltin ve daha önce adım 3.8'de açıklandığı gibi uygun katı ortam üzerine plakalayın ve tüm seyreltmeleri kaplayın.
    NOT: Mesane modelinden alınan planktonik örnekler, genomik veya moleküler biyoloji uygulamaları (isteğe bağlı) dahil olmak üzere diğer analizler için uygundur.

6. İn vitro mesane modelinden biyofilm ile ilişkili hücrelerin örneklenmesi

  1. Kateterin çıkarılması ve hazırlanması
    NOT: İn vitro mesane modellerinin biyofilm örneklemesi, modellerin devre dışı bırakılmasını ve işlem için kateterlerin çıkarılmasını gerektiren bir son nokta analizidir.
    1. Atık torbasını kateterden ayırın ve balonu söndürerek modelde kalan idrarı boşaltın. Steril forseps kullanarak kateteri modelin altından çıkarın.
    2. Çıkarılan kateteri steril bir levha üzerine yerleştirin ve steril bir neşter kullanarak kateteri kesit almak için gerekli noktalardan kesin ( Şekil 2'de özetlenmiştir).
    3. Lümeni ortaya çıkarmak için kateter bölümlerinin uzunlamasına kesildiğinden emin olun; daha sonra steril forseps kullanarak, yapışık olmayan hücreleri çıkarmak için kateter bölümünü 3 kez steril PBS'ye batırın.
      NOT: Kateter bölümlerini aşağı yönde görüntülüyorsanız, yani SEM kullanıyorsanız, 1 cm'lik bölümleri sağlam bırakın (uzunlamasına kesmeyin) ve bunun yerine sabitlemeden önce steril bir kağıt havluyla lümendeki fazla nemi alın.
  2. CFU/mL sayımı için biyofilmin bozulması
    NOT: Biyofilm ile ilişkili hücrelerin bozulmasını detaylandıran protokoller, biyofilmler yoğun şekilde kristal veya mukoid ise daha fazla optimizasyon gerektirebilir.
    1. Hazırlanan kateter bölümünü 37 ° C'de% 0.25 tripsin içinde 30 dakika inkübe edin. Kullanılan tripsin hacmi, kateteri kaplamak için gereken minimum miktar olmalıdır; örneğin dik olarak kesilen 1 cm'lik bir kateter kesiti için 1 mL %0.25 tripsin yeterlidir.
    2. İnkübasyondan sonra, kateteri içeren çözeltiyi 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Kateter bölümü daha sonra çıkarılabilir ve atılabilir. Tripsini devre dışı bırakmak için, hücre çözeltisi derhal steril PBS içinde seyreltilmeli ve daha önce adım 3.8'de açıklandığı gibi uygun katı ortamda CFU sayıları için kaplanmalıdır.
  3. Kristal viyole boyama ile kateter biyofilm miktar tayini
    1. Hazırlanan kateter bölümlerini uygun büyüklükte düz tabanlı bir kuyu plakasındaki kuyucuklara ekleyin. Kateter bölümünü tamamen daldırmak için uygun hacimde% 0.1 kristal viyole solüsyon kullanın ve oda sıcaklığında 15 dakika statik olarak inkübe edin. Arka plan kontrolü olarak steril bir kateter bölümünün de dahil edildiğinden emin olun.
    2. Kateter bölümlerini plakadan çıkarın ve yeni bir plakaya aktarın. Her kateter bölümünü damıtılmış suda iki kez yıkayın.
    3. Durulamadan sonra, kateter bölümlerini yeni bir plakaya aktarın ve% 33 asetik asit ile kaplayın. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
    4. Kateter bölümünü plakadan çıkarın ve ardından bir plaka okuyucu kullanarak, steril kateter bölümlerini içeren kuyucukları arka plan kontrolleri olarak kullanarak her kopya için OD595 nm ölçün.

7. İn vitro mesane modelinde antimikrobiyal duyarlılık testi

NOT: Kateterle ilişkili idrar yolu enfeksiyonunu kontrol etmeyi amaçlayan çoğu terapötik, standart Foley kateterleri ile uyumludur, in vitro mesane modeli deneylerine başlamadan önce uyumluluğu kontrol edin.

  1. Antimikrobiyal kayganlaştırıcı jeller
    NOT: Kateter yerleştirilmesinde yağlama maddelerinin kullanımını simüle etmek için bu adım, Foley kateterinin yerleştirilmesinden hemen önce adım 2.1 sırasında gerçekleştirilmelidir. Kateteri yerleştirdikten sonra, model hemen bağlanmalı ve adım 2.6. Aşılamadan önce jelin seyreltilmemesi ve boşaltılmaması için ihmal edilmelidir. Aşılama, kateter yerleştirme ile aynı gün yapılmalıdır. Kateterlerle kullanılmak üzere tasarlanmış yağlama maddeleri, 6 mL veya 11 mL hacimli bireysel, steril, tek kullanımlık şırıngalar olarak paketlenir. Yaklaşık 5 mL kayganlaştırıcı, hem mesane modelinin boynunu doldurmak hem de modelin tabanını kaplamak için yeterlidir.
    1. Aseptik tekniği kullanarak, yağlama maddesini içeren şırınganın ucunu mesane modelinin boynuna yerleştirin ve boynu doldurmak ve odanın tabanına girmek için 5 mL jel yerleştirin.
    2. Modeli, taban jel ile eşit şekilde kaplanacak şekilde döndürün, ardından kateter ucunu jelin içinden iterek modele bir Foley kateteri yerleştirin ve balonu normal şekilde doldurarak sabitleyin.
    3. Modeli kurulumun geri kalanına bağlayın, ardından model lümenini boşalmaya başlayana kadar idrarla doldurun. İdrar kateter göz deliğinden akmaya başlar başlamaz, aşılamadan önce jel kaybını önlemek için pompayı durdurun.
      1. İdrarın 37 ° C'ye ulaşmasını sağlamak için modelleri 30 dakika inkübe edin, ardından jel bileşenlerinin idrar hacmine difüzyon süresinin homojenliğini sağlamak için modelleri daha önce tarif edildiği gibi aşılayın.
    4. Modeli adım 3.5'te açıklandığı gibi aşılayın ve peristaltik pompaları çalıştırmadan önce 1 saat inkübe etmeye bırakın. Pompayı açma noktasında, 1 mL'lik bir planktonik numune alın ve adım 3.8'de açıklandığı gibi CFU sayıları için seyreltmeleri plakalayın.
  2. Sulama çözümleri
    NOT: Sulama çözeltileri genellikle toplu olarak veya bireysel, steril, tek kullanımlık "torbalar" halinde mevcuttur. Bireysel solüsyonlar kullanılıyorsa, deneyden önce kullanılacak kateterlerin drenaj portları ile uyumlu olduklarından emin olun. Toplu sulama solüsyonları kullanılıyorsa, üç lümenli kateterlerin kullanıldığından ve ürün uygulamasının hacmini/zaman çerçevesini belirlemek için üreticinin talimatlarına uyulduğundan emin olun.
    1. Tedaviden önce, biyofilm ile ilişkili toplulukların kurulması için yeterli zamana sahip olduğundan emin olmak için en az 4 saat boyunca in vitro modelleri çalıştırın. Modeller 4 saat çalıştıktan sonra, ortam akışını duraklatın ve 5. adımda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi in vitro modellerin iç haznesinden bir ön işlem numunesi alın.
      NOT: Toplu sulama çözümleri kullanıyorsanız, adım 7.2.5'e geçin.
    2. Ayrı bir sulama "poşeti" kullanıyorsanız, atık torbasını kateterden ayırın ve atık torbasını kapatmak için poşetle birlikte verilen kapağı kullanın. Sulama solüsyonu poşetini hemen katetere takın ve hafif basınç kullanarak ürünü merkezi lümene sıkın. Üreticinin talimatlarına göre uygulayın (yani 15 dakikalık uygulama).
    3. Önerilen tedavi tamamlandıktan sonra, kalan solüsyonun kateter göz deliği yoluyla iç hazneden sulama poşetine akmasına izin verin, ardından poşetin bağlantısını kesin. Torbanın geri kalan içeriği atılabilir veya daha sonraki sonraki uygulamalar için kullanılabilir.
    4. Kateter drenaj portunu ve atık torbası bağlantı portunu p etanol ile sterilize edin ve steril, kapalı bir drenaj sistemini tamamlayarak yeniden bağlayın.
      NOT: Sulama torbaları kullanılıyorsa adım 7.2.7'ye devam edin.
    5. Üçlü lümenli bir kateter kullanıyorsanız, sulama lümeni portunu p etanol ile dezenfekte edin ve üreticinin talimatlarına göre steril bir şırınga kullanarak hemen sulamaya başlayın.
      NOT: Sulamadan önce atık torbasında kalan idrar hacmini ölçün, böylece bu, herhangi bir aşağı akış tıkanma süresi veya akış hızı hesaplamasında hesaba katılabilir.
    6. Sulama tamamlandıktan sonra, şırıngayı ve atık torbasında kalan artık sulama solüsyonunu atın.
    7. Adım 5'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi in vitro mesane modeli merkezi odadan bir tedavi sonrası numune alın ve deneye devam etmek için peristaltik pompa aracılığıyla AUM akışına devam edin.

8. İn vitro mesane modeli deneyinin sonlandırılması

NOT: P. mirabilis gibi üreaz pozitif organizmalar, kristalin biyofilm oluşumu yoluyla üriner kateterlerin tıkanmasına neden olabilir. Bu nedenle tıkanıklık, in vitro mesane modelleri için biyolojik olarak ilgili bir son nokta olarak kullanılabilir ve kateter göz deliklerinin kristalin biyofilmlerle tamamen tıkanması ve cam "mesanenin" merkezi odasındaki AUM hacminde bir artış ile görünür şekilde tanımlanır (Şekil 3).

  1. İn vitro mesane modelleri, bir tıkanıklık veya tanımlanmış bir çalışma zamanı olabilecek önceden belirlenmiş uç noktaya ulaştıktan sonra, peristaltik pompa aracılığıyla AUM akışını kapatın ve 5. adımda açıklandığı gibi merkezi odadan bir uç nokta örneği alın.
  2. Su banyosu akışını kapatın ve ortam devresini ve su banyosu devresi borularını in vitro mesane modellerinden ayırın.
  3. Tıpaları in vitro mesane modellerinden çıkarın ve serolojik bir pipet kullanarak kalan idrarın tamamını çıkarın. Kirlenmiş ortamları uygun şekilde atın (yani otoklavda sterilize edin).
  4. Atık torbalarını boşaltın ve kalan ortamları atın. Kateter atık torbalarını kateter portundan ayırın ve atın.
  5. Bir şırınga kullanarak, kateterleri modellerden çıkarmadan önce kateter balonlarını yavaşça söndürün.
    NOT: Üreaz pozitif bakteri türleri kullanılıyorsa, kateterler in vitro modellerin cam duvarlarına "yapışabilir". Kateterlere büyük miktarda kuvvet uygulamaktan kaçının ve bunun yerine adım 8.6'ya geçin.
  6. İn vitro modelleri gece boyunca %5 antimikrobiyal temizleme solüsyonunda (Malzeme Tablosuna bakınız) bekletin, ardından kalan dezenfektanın çıkarıldığından emin olmak için suyla iyice yıkayın. Sterilize etmek için otoklav.
    NOT: Üreaz pozitif türler kullanılıyorsa, merkezi odadaki herhangi bir biyomineralizasyonun çözülmesine yardımcı olmak için dezenfektan çözeltisine% 5 w / v sitrik asit ekleyin. Bu asidik çözelti aynı zamanda kristalin biyofilm birikintilerini parçalayarak modellere yapışan kateterlerin serbest bırakılmasına yardımcı olacaktır.
  7. Ortam devresi borusunu AUM rezervuarından ayırın ve kalan ortamları atın. Kalan AUM ve otoklavı çıkarmak için boruyu suyla yıkayın.
  8. Tam tıkanma süresini hesaplamak için, atık torbasındaki son hacmi not edin ve tıkanma süresini belirlemek için adım 4.4'teki denklemi ve önceden hesaplanan akış hızını kullanın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vitro mesane modelinin başarılı bir şekilde çalışması, iyi bir aseptik tekniğin uygulanmasına ve deney boyunca ortam bulanıklığının dikkatli bir şekilde gözlemlenmesine bağlıdır (Şekil 3). Aşılamadan önce, steril AUM, in vitro mesane modeli merkezi odasında soluk sarı renkte ve şeffaftı (Şekil 3A). Meydana gelen herhangi bir bulanıklık değişikliği, çözeltiden tuzların çökeldiğini veya ortamın kirlenmesini gösterebileceğinden, ortam rezervuarındaki AUM, deney boyunca açık kalmalıdır. Ortam haznesindeki veya ortam devresi borusundaki AUM bulanıklaşırsa veya renkte ciddi bir değişiklik gösteriyorsa, kopyalar atılmalı ve tekrarlanmalıdır. Aşılamadan sonra, in vitro mesane modeli merkezi odacıkta AUM'nin bulanıklığında bir artış açıkça görülebilir (Şekil 3B). Bulanıklıktaki değişiklikler genellikle P. mirabilis gibi üreaz pozitif organizmalarda daha belirgindir, ancak üreaz negatif organizmalarda aşılama sonrası hala görünür olmalıdır. AUM akışı başlatıldıktan sonra, planktonik hücreler yıkandıkça AUM bulanıklığında bir azalma sıklıkla gözlenir ve modelde canlı hücre eksikliğini göstermez. Merkezi odadaki ortam seviyesinin gözlemlenmesi, üreaz pozitif organizmalar kullanılıyorsa tıkanma süresini belirlemek için de kullanılabilir (Şekil 3C). Modeller çalışırken, atık torbalarına uygun drenajı belirtmek için kateter göz deliği ve ucu tamamen görünür olmalıdır. Tıkanma üzerine, merkezi odadaki AUM seviyesi, kateter göz deliklerinin ve ucunun üzerine çıkacak ve bu da deneyin herhangi bir son nokta okuması ve sonlandırma için hazır olduğunu gösterecektir. Deney sırasında, in vitro mesane modeli medya devresindeki basınç etkileri, modellerin tıkalı görünmesine neden olabilir. Bir tıkanıklıktan şüpheleniliyorsa, testi sonlandırmadan önce AUM devresinin, kateterin ve atık torbası hortumunun gergin olduğunu kontrol edin, çünkü tüpteki herhangi bir olası hava kabarcığı veya bükülme "hava kilitlerine" neden olabilir ve kateterin boşalmasını engelleyebilir.

İn vitro mesane modeli deneyleri sırasında, planktonik örnekleme, model içindeki büyüme dinamiklerinin yanı sıra CAUTI'nin ilerlemesi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Hücre büyümesi, pH ve biyofilm oluşumu, modellerin sonlandırılmasını gerektirmeden deney boyunca izlenebilir (Şekil 4). Üreaz pozitif organizmalar kullanılıyorsa, blokaj süresi hesaplamaları biyofilm oluşum hızının bir ölçüsü olarak kullanılabilir ve farklı bakteri suşlarının özelliklerini karşılaştırmak için kullanılabilir (Şekil 4). Yabani tip bir P. mirabilis suşunun ve bir LPS mutantının karşılaştırılması (mini-tn5'in waaC'ye yerleştirilmesi), blokaja kadar geçen sürenin uzadığını ve böylece mutantta biyofilm oluşumunu azalttığını göstermiştir (Şekil 4). Üreaz negatif organizmalar tipik olarak in vitro mesane modellerini bloke etmez ve bu nedenle deneyden önce belirlenmiş bir son noktanın belirlenmesi önerilir. Bazı durumlarda, üreaz negatif organizmalar kateter tıkanıklığına neden olabilir. Örneğin, Klebsiella pneumoniae'nin üreaz negatif suşları geniş, mukoid biyofilmler üretebilir, ancak bunlar tipik olarak drenajı bloke etmek için üreaz pozitif biyofilmlerden çok daha uzun sürer, bu nedenle belirli bir son nokta hala önerilir.

Mesane modeli deneyi boyunca pH ölçümü, suşlar arası farklılıkların yanı sıra CAUTI'nin ilerlemesi hakkında da bilgi sağlayabilir. Üreaz negatif organizmalar kullanılırsa, in vitro mesane modeli merkezi odasındaki pH, deney boyunca büyük ölçüde sabit kalmalıdır, ancak deney boyunca popülasyon dinamikleri değiştikçe pH'da küçük dalgalanmalar beklenir. İn vitro modellerin üreaz pozitif organizmalarla aşılanması, zaman içinde önemli bir pH artışına neden olur, en yüksek pH genellikle ~8-9'a kadar yüksek pH okumalarının gözlemlenebildiği blokaj anında gözlenir (Şekil 4B).

Planktonik CFU/mL sayımı, in vitro mesane modellemesinin önemli bir bileşenidir ve operatörlerin aşılamanın başarılı olup olmadığını değerlendirmesine ve deneyin ilerlemesini izlemesine olanak tanır. Deneyin sonunda CFU / mL'nin ölçülmesi, farklı bakteri suşları arasındaki mesane kolonizasyonundaki herhangi bir farkı vurgulayabilir. Mini-Tn5 mutant suşu karşılaştırıldığında P. mirabilis vahşi tiple, blokaj anında CFU / mL'de önemli bir azalma gözlenmiştir (Şekil 4C). Ayrıca, kateter yüzeyindeki biyofilmlerden CFU'ların sayımı ve biyofilm biyokütlesinin miktar tayini, farklı patojenlerin kateterize idrar yolunu kolonize etme yeteneği hakkında fikir verebilir. Yabani tip bir P. mirabilis suşu HI4320 ile klorheksidin içinde geçen izolatlar arasındaki biyofilm oluşumundaki farklılıkları belirlemek için kristal viyole lekeleri kullanıldı (Şekil 5). 595 nm'de optik yoğunluk ölçümleri, klorheksidin içinde geçen izolatların, klorheksidin yokluğunda geçilen vahşi tip ve kontrollere kıyasla biyofilm oluşumunda bir azalma gösterdiğini göstermiştir.

İn vitro mesane modelinin amacı, CAUTI nişini doğru bir şekilde kopyalamak olduğundan, modeller, CAUTI'yi klinik olarak ilgili bir ortamda tedavi etmeyi amaçlayan antimikrobiyal terapötiklerin etkilerini incelemek için de kullanılabilir. Üreaz pozitif organizmalar için, tedavi edilen modellerin blokaj sürelerini tedavi edilmeyen modellerle karşılaştırmak, tedavinin etkinliği hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir. P. mirabilis ile aşılanmış in vitro mesane modellerinin %0.02 klorheksidin mesane irrigasyon solüsyonu ile tedavisi, tedavi edilmeyen veya %0.9 salin ile tedavi edilen modellere kıyasla tıkanma süresini önemli ölçüde uzatmıştır (Şekil 6A). Ayrıca, in vitro mesane modeli, antimikrobiyal terapötiklerin bakterisidal aktivitesini incelemek için kullanılabilir. Antimikrobiyal tedaviyi takiben planktonik ve biyofilm ile ilişkili hücrelerin CFU / mL'sindeki değişikliklerin izlenmesi, tedavilerin etkili olup olmadığını gösterebilir. P. mirabilis ile aşılanmış in vitro mesane modellerinin tedavisi, üreticinin talimatlarına göre uygulandığında, tedavi edilmemiş ve% 0.9 tuzlu sulanan modellere kıyasla, tedaviden hemen sonra planktonik CFU / mL'de >7 log'luk bir azalma göstermiştir (Şekil 6B).

figure-results-1
Şekil 1: İn vitro mesane modelinin ana bileşenlerinin şeması. (A) Mesane modeli (kapalı drenaj sistemi): (1) mesaneyi simüle eden çift cidarlı cam hazne (2) medya girişi, AU peristaltik pompa ile mesane modeli iç hazneye verilir (3) dış hazneye sirkülasyonlu su banyosu ile sağlanan su girişi (4) su çıkışı (5) İç hazneye yerleştirilen Foley kateter (6) drenaj lümen bağlantı noktası; Atık torbası/sulama torbaları için bağlantı noktası (7) idrar çıkışını toplayan drenaj torbası. (B) İn vitro mesane modelinin kurulumunu ve model boyunca ortam ve su akış yönünü gösteren şematik. Yapay idrar, oda sıcaklığında bir ortam rezervuarında (1) saklanır ve deney süresince ~ 0.75 mL min-1 sabit akış hızında peristaltik bir pompa (2) aracılığıyla modele verilir. Ortam, mesaneyi (3) temsil eden çift duvarlı cam kabın merkezi odasına akar ve bir Foley kateterinin (4) göz deliğinden bir drenaj torbasına (5) dışarı akar ve steril kapalı drenaj sistemini tamamlar. İn vitro mesane modeli, çift cidarlı cam kabın dış haznesinden akan bir sirkülasyonlu su banyosu (6) aracılığıyla 37 °C'lik sabit bir sıcaklıkta tutulur. Kesikli çizgiler silikon boruyu temsil eder ve oklar akış yönünü temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Biyofilm ile ilişkili hücreleri işlemek için üriner kateterlerin kesitlendirilmesi. Aşağı akış biyofilm kantifikasyonu için diseksiyon için bir üriner kateter üzerindeki örnek noktalar. (A) Kateterler ilk olarak uç/göz deliklerinin proksimalinde (çoğu biyofilm oluşumunun gözlendiği yer) 8 cm'lik bölgede enlemsel olarak kesilir. 1 cm'lik kesitler bistüri ile çıkarılır, işlem tekrarlanabilirliğindeki zorluklar nedeniyle genellikle sönmüş kateter balonunun bulunduğu bölgeden kaçınılır (1-3). (B) Kateterler başlangıçta 1 cm'lik parçalar halinde ayrıldıktan sonra, daha fazla biyofilm kantitizasyonu, yani kristal viyole boyamanın CFU / mL sayımı için mevcut herhangi bir biyofilmi ortaya çıkarmak için merkezi lümenden aşağı doğru başka bir uzunlamasına kesim yapılır. Kesikli çizgiler diseksiyon noktalarını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Bir in vitro mesane modeli deneyinin aşamaları. Deneyin farklı aşamaları boyunca in vitro mesane modeli merkezi odasının görüntüleri. (A) Aşılamadan önce in vitro mesane modeli merkezi odasında AUM. Merkezi haznedeki ortam tamamen şeffaftır, bu da başarılı bir sterilizasyonu gösterir ve kateter ucu ve göz delikleri, kateterin başarılı bir şekilde boşaltıldığını gösteren ortam çizgisinin üzerinde görünür. (B) P. mirabilis ile aşılamayı takiben in vitro mesane modeli merkezi odadaki ortam (aşılamadan 4 saat sonra). Başarılı aşılama, ortamın artan bulanıklığı ile gösterilir. Kateter ucunun ve göz deliklerinin görünürlüğü, AUM'nin kateterden başarılı bir şekilde boşaldığını ve tıkanıklık oluşmadığını gösterir. (C) Tıkalı bir in vitro mesane modeli örneği. P. mirabilis ile aşılama ve bunu takiben biyofilm oluşumu ve mineralizasyon, kateter göz deliklerinin tıkanmasına, drenajın önlenmesine ve merkezi odadaki ortam seviyesinin kateter ucunun üzerine çıkmasına neden olmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Bir in vitro mesane modeli için uç nokta ölçümleri tıkanıklığa kadar çalıştırılır. Klinik bir P. mirabilis, RS47 (WT) suşu ve zayıflatılmış biyofilm oluşumuna sahip bir mutant suş, RS47-2 (Mutant) ile aşılanmış bir in vitro mesane modelinden blokaj sırasında örnek son nokta ölçümleri. (A) WT'nin blokaj süresi (h) ve P. mirabilis'in mutant suşları. (B) Tıkanma anında in vitro mesane modellerinin pH'ı. (C) Tıkanma anında in vitro mesane model odasındaki planktonik hücrelerin CFU / mL'si. Tüm veriler beş biyolojik kopyanın ortalamasını temsil eder. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını gösterir. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. Bu rakam Clarke ve ark.46'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: İn vitro mesane modelinden biyofilm ile ilişkili hücre ölçümleri. P. mirabilis biyofilm oluşumunun miktarının belirlenmesi, vahşi tip HI4320'nin kristal viyole boyama yoluyla klorheksidin (CHD) ile veya klorheksidin olmadan geçen uyarlanmış popülasyonlarla karşılaştırılması ve 595 nm'de optik yoğunluğun (OD) ölçülmesi. Ağırlık: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: KKH maruziyeti olmayan geçiş kontrolleri; 2, 4, 6: HI4320, 4 μg / mL CHD'de geçti. Tüm veriler beş biyolojik kopyanın ortalamasını temsil eder. Hata çubukları SEM'i gösterir. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Antimikrobiyal tedaviyi takiben in vitro mesane modellerinden alınan ölçümler. Planktonik örnekler, %0.02 klorheksidin antimikrobiyal solüsyon (100 mL) veya %0.9 tuzlu su kontrolü ile irrigasyonu takiben P. mirabilis ile aşılanmış bir in vitro mesane modelinden alındı. (A) İrrigasyonu takiben in vitro mesane modellerinin tıkanma süresi. (B) Sulama işleminden hemen sonra planktonik CFU / mL. Tüm veriler beş biyolojik kopyanın ortalamasını temsil eder. Hata çubukları SEM'i gösterir. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; *p ≤ 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kateterize idrar yolu, laboratuvar ortamında çoğaltılması zor olabilen karmaşık bir biyolojik nişi temsil eder. İn vitro mesane modeli, CAUTI'yi simüle etmek amacıyla tasarlanmıştır ve klinik uygulamada kullanılan steril, kapalı drenaj sistemini kopyalamak için standart üriner kateterleri kullanır. Kateterize idrar yolu, CAUTI 6,55 gelişimi için en büyük risk faktörü olan üriner kateterlerin kanıtladığı gibi, enfeksiyona karşı oldukça hassastır. Orantılı olarak, dikkatli aseptik teknik, in vitro mesane modellerinin çalıştırılmasının başarısı için kritik öneme sahiptir. AUM'un bulanıklığı, sterilitenin açık bir göstergesidir, çünkü kontamine olmuş veya son kullanma tarihi geçmiş ortamlar zamanla bulanıklaşacak ve tüm kopyaların atılmasını gerektirecektir. İn vitro mesane modelini aşılarken ve numune alırken dikkatli aseptik teknik de kullanılmalıdır, çünkü hazırlanan inokuluma eklemek için merkezi haznenin açılması steril, kapalı drenaj sistemini kırar ve in vitro mesane modelini kontaminasyona duyarlı hale getirir. Merkezi haznenin kontaminasyonunu önlemek için, planktonik hücre popülasyonunu örneklemek için üç lümenli kateterler kullanılabilir (atık lümeni sıkıştırarak ve ek lümen yoluyla boşaltarak). 4 saatlik zaman noktasında bir miktar yıkama beklenir, ancak bu noktada canlı planktonik hücreler numaralandırılmazsa sorun giderme gerekebilir. 4 saat sonra hiçbir canlı hücre sayılmazsa, bakteri kolonizasyonunu daha iyi desteklemek için kullanılan aşı yoğunluğunun veya AUM formülasyonunun optimize edilmesi gerekebilir. Ek olarak, aşının yıkanması, ortam devresinde bir sorun olduğunu gösterebilir; Boru içindeki bükülmeler yeterli drenajı önleyebilir, bu da bakteri üremesini engelleyebilecek toksik metabolitlerin birikmesine neden olabilirken, ortam borularından yıkamak için kullanılan herhangi bir artık dezenfektan bakterisidal bir etkiye sahip olabilir.

Bu protokol, daha önce Proteus mirabilis ve Escherichia coli 43,45,46,48 dahil olmak üzere belirgin CAUTI patojenleri ile in vitro mesane modelinde kullanım için doğrulandığından, daha önce Nzakizwanayo ve ark. tarafından tarif edildiği gibi AUM'un hazırlanmasını detaylandırır.. Bununla birlikte, diğer patojenlerin büyümesini seçmek için protokolde kullanılan AUM formülasyonunu değiştirme kapsamı vardır. Çok sayıda farklı AUM formülasyonu yayınlanmıştır ve bunun yerine 28,56,57,58,59,60 medya devresinde kullanılabilir. Ek olarak, medya rezervuarındaki AUM, belirli patojenlerin büyümesini seçmek için besinler veya antibiyotiklerle desteklenebilir. Tarihsel olarak, in vitro mesane modellerine havuzlanmış insan idrarı da sağlanmıştır, ancak bir in vitro mesane modeli replikasını çalıştırmak için gereken büyük hacimli ortamlar, insan örneklerinin toplanmasını pratik olmayan hale getirebilir53,54. Ayrıca, insan idrarının bileşimi hasta numuneleri arasında büyük ölçüde değişebilir ve bu da deney tekrarlanabilirliğini etkiler, çünkü hormonların, tuzların ve proteinlerin konsantrasyonundaki farklılıkların yanı sıra hidrasyon durumunun bakteri üremesini ve biyofilm oluşumunu etkilediği gösterilmiştir 38,39,61,62.

Yukarıdaki protokol, in vitro mesane modelinin ~ 1010 CFU / mL replike eden geç evre CAUTI ile aşılanmasını detaylandırmaktadır. Bununla birlikte, in vitro mesane modelinin aşılama bölgesi, CAUTI'nin daha erken aşamalarını, yani üriner kateterin ilk kolonizasyonunu ve mesaneye yükselişi daha iyi çoğaltmak için gelecekteki deneylerde değiştirilebilir. İn vitro modellerin kurulumundan önce Foley kateterlerinin bilinen bir bakteri aşısı ile manuel olarak kontamine edilmesi, CAUTI'nin erken aşamaları hakkında bilgi sağlayabilir. Gerçekten de, aşı yoğunluğu önceki çalışmalarda daha erken evre enfeksiyonu çoğaltmak için değiştirilmiştir; örneğin, Nzakizwanayo ve ark. daha düşük başlangıç CFU / mL (ca. 103 CFU/mL) erken evre enfeksiyonu çoğaltmak için47. Bununla birlikte, aşı yoğunluğunun değiştirilmesinin tıkanma süresinin uzamasına neden olabileceğini ve deneyden önce ek doğrulama gerektirdiğini belirtmekte fayda var.

Ek olarak, protokol in vitro modelin bakteriyel monokültür ile aşılanmasını detaylandırırken, modelleri mantar patojenleri ile aşılamak için kapsam vardır. Geçmiş çalışmalar, CAUTI'lerin% 8'ine kadarının, genellikle antifungal tedaviye karşı inatçı olan biyofilmler üretebilen Candida spp. enfeksiyonundan kaynaklandığını göstermiştir27,63. Ayrıca, in vitro mesane modeli, polimikrobiyal CAUTI çalışmasına uyum sağlamak için değiştirilebilir. Gerçekten de, ÜSE'lerin %86'sının polimikrobiyal olduğu ve bu enfeksiyonların genellikle monotür enfeksiyonundan daha şiddetli semptomlar ve daha yüksek mortalite oranı ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür 27,64,65,69. İn vitro modeller, polimikrobiyal biyofilmlerin oluşumunu ve CAUTI'nin ilerlemesini incelemek için birden fazla türle aşılanabilir, ancak aşılamadan önce polimikrobiyal toplulukların dikkatli bir şekilde doğrulanması ve aşı yoğunluğunun modifikasyonu yapılmalıdır. Önceki çalışmalar, tek tür P. mirabilis CAUTI'de biyofilm oluşumundaki farklılıkları izlemek için in vitro mesane modelini kullanmış ve E. faecalis ile çift tür CAUTI ile karşılaştırıldığında, suşlar arasındaki metabolik etkileşimi vurgulamış, bu da tek tür enfeksiyonu ile karşılaştırıldığında biyofilm oluşumunun artmasına neden olmuştur70.

CAUTI'yi incelemek için in vitro mesane modelini kullanmanın önemli bir avantajı, standart bir üriner kateterin yüzeyinde biyofilm oluşumunu gözlemleme yeteneğidir. CAUTI'de biyofilm oluşumu genellikle, çoğalmadan ve olgun biyofilmler oluşturmadan önce, üropatojenlerin yapışabileceği organik idrar bileşenlerinden oluşan kateter lümeni üzerinde koşullandırma filmlerinin oluşumu ile başlatılır 2,18,71,72,73. Biyofilm oluşumunu incelemek için kullanılan standart tahliller genellikle AUM yerine standart bakteri üreme ortamını kullanır ve genellikle polistiren mikroplakalara veya mandallara, yani Calgary cihazına yapışmaya dayanır; bununla birlikte, geçmiş çalışmalar, sistemin besin ortamı, pH ve oksijen seviyelerinin yanı sıra akış ve yüzey yapısındaki farklılık (silikon ve plastikler) gibi fiziksel özelliklerin biyofilm oluşumunu etkileyebileceğini göstermiştir 36,37,74,75,76,77,78. Ek olarak, P. mirabilis gibi geniş üreaz aktivitesine sahip bakterilerin AUM'de kapalı bir sistemde kültürlenmesi, hücre ölümüne neden olabilen toksik metabolitlerin birikmesine neden olabilir78,79. Bu, in vitro mesane modelinde hafifletilir, çünkü merkezi odadaki AUM, medya devresi aracılığıyla sürekli olarak yeni medya ile değiştirilir ve CAUTI biyofilmlerinin klinik olarak daha ilgili koşullar altında çalışılmasına olanak tanır45. İn vitro mesane modelinin günlük çalışması ve modeller için seçilen son nokta, büyük ölçüde modellerin üreaz pozitif veya negatif organizmalarla aşılanıp aşılanmadığına bağlıdır. Teorik olarak, in vitro modeller, yeterli hacimde AUM ile sağlanırsa ve modelin sterilitesi korunursa süresiz olarak çalışabilir; Bununla birlikte, denemeden önce bir tıkanıklık veya rastgele bir gün sayısı olsun, bir uç noktanın seçilmesi önerilir. Genel olarak, üreaz negatif organizmalarla aşılanmış in vitro modellerin, klinik ortamı simüle etmek için ≤7 gün boyunca çalıştırılması önerilir, çünkü bu, çoğu organizmada biyofilm oluşumunu gözlemlemek için tipik olarak yeterlidir, ancak klinik müdahalelerle uyumlu kalırken, standart en iyi uygulama, kateterlerin gözle görülür şekilde enfekte olduktan sonra değiştirilmesi gerektiğini gösterir 1,2, 3,47,48. Üreaz pozitif organizmaların kristalin biyofilmler üretme olasılığı yüksek olsa da, üreaz pozitif suşlar arasında in vitro mesane modeli tıkanıklığına kadar geçen sürede büyük farklılıklar vardır, bazı Proteus mirabilis suşları 10 saatin altında kateter tıkanıklığına neden olur ve diğerleri 30 saatten fazla sürerve 39,46. Standart bir üreaz testi, modellerin blokaja mı yoksa önceden tanımlanmış bir uç nokta80'e mi çalıştırılacağını belirlemek için in vitro mesane modeli denemesinden önce kullanılabilir.

Biyofilm oluşumunu incelemek için in vitro mesane modelini kullanmanın belki de ana sınırlaması, biyofilm ölçümlerinin üriner kateterin çıkarılmasını ve diseksiyonunu gerektirdiğinden bir son nokta okuması olmasıdır. Tersine, deney sırasında herhangi bir noktada in vitro mesane modelinden planktonik örnekler alınabilir. Ek olarak, in vitro mesane modellerinden biyofilm örnekleri alındıktan sonra, biyofilm üretimini daha iyi ölçmek için çok sayıda ekstra alt akış tekniği kullanılabilir. Geçmiş çalışmalar, kristalin biyofilmlerde bulunan kalsiyum ve magnezyum miktarını ölçmek için alev fotometrisini kullanmıştır ve üreaz-negatif biyofilmlerinEPS matrisinin bileşenlerini doğru bir şekilde tanımlamak için daha karmaşık lekeler kullanılabilir 45,73,81,82,83,84.

Bu çalışma aynı zamanda CAUTI tedavisine yönelik terapötiklerin etkilerini incelemek için in vitro mesane modelinin uygulanmasını da açıklamaktadır. İn vitro mesane modeli, AUM kullanımı gibi CAUTI nişinin önemli yönlerinin yanı sıra klinik olarak anlamlı biyofilm oluşumu ve CAUTI'de görülen artan organik yükü simüle eder. Antibiyotikler gibi terapötikler, klinik olarak anlamlı ilaç biyoyararlanımını simüle etmek için doğrudan AUM tankına eklenebilir ve geçmiş çalışmalar, bir antibiyofilm etkisi göstermek için tioridazin ve fluoksetin gibi yeniden tasarlanmış ilaçları kullanmıştır81. Ek olarak, minimum inhibitör konsantrasyon testleri ve bakteriyel süspansiyon testleri, biyositlerin antimikrobiyal aktivitesini anlamak için sıklıkla kullanılır, ancak tahlillerin gerçek dünyadaki biyosit duyarlılığı ile ilişkili olduğunu gösteren çok az kanıt vardır 41,85,86,87,88. İn vitro mesane modeli, CAUTI'yi tedavi etmeyi veya önlemeyi amaçlayan biyosidal ürünlerin test edilmesi için avantajlıdır, çünkü üriner kateterin varlığı ve CAUTI nişinin daha temsili simülasyonu, antimikrobiyal yağlayıcı jeller ve sulama solüsyonları gibi ürünlerin üreticinin talimatlarına göre test edilebileceği anlamına gelir. Geçmiş çalışmalar, faj tedavisinin etkinliğini belirlemek için in vitro mesane modelini de kullanmış ve faj tedavisinin, in vitro mesane modelini bloke etmek için P. mirabilis süresini 100 saatin üzerinde uzatabileceğini göstermiştir47. İn vitro mesane modelinde standart boyutlu bir Foley kateterinin kullanılması, aynı zamanda yeni, kaplamalı kateterlerin antimikrobiyal aktivite açısından test edilebileceği anlamına gelir. Slate ve arkadaşlarının geçmiş çalışmaları.teranostik siprofloksasin kaplama ile kaplanmış kateterlerin, in vitro mesane modeli48'de P. mirabilis'in tıkanma süresini ~ 60 saat uzatabileceğini gösterdi. Bu, in vitro mesane modelinin, CAUTI'yi tedavi etmeyi amaçlayan yeni terapötiklerin çalışmasında potansiyel uygulamasını vurgular ve biyolojik olarak ilgili simüle edilmiş bir CAUTI nişinde antimikrobiyallerin daha doğru bir değerlendirmesine olanak tanır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Jonathan Nzakizwanayo ve Dr. Anthony J. Slate'e bu protokolün geliştirilmesindeki ortak uzmanlıkları için teşekkür ederiz. Bath Üniversitesi'ndeki çalışma, Tıbbi Araştırma Konseyi GW4 Biomed DTP tarafından V.B.'ye öğrenci olarak finanse edildi (MR / N0137941/1). B. V. J. ayrıca Dunhill Medical Trust'tan (RPGF1906\171) sağlanan fonlarla da desteklenmektedir. O.E.C. tarafından yapılan araştırma, Kidney Research Northwest (RCN: 1144798) tarafından finanse edildi. Şekil 1 Biorender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
313 Hızlı Yük Pompa Kafası UzatmasıWatson-Marlow313Peristaltik pompa - ekstra pompa kafası uzatması 
323S/D manuel kontrollü değişken hızlı pompaWatson-Marlow323S/DPeristaltik pompa
3L Yatak çantaları, kollu musluklarla steril Büyük Ayı Sağlık GDW173
3mm iç çap platin kürlenmiş silikon boruFisher10111801Küçük AUM devre borusu (pompa borusunu modellere bağlayın)
5mm iç çap platin kürlenmiş silikon boruFisher10539201Orta AUM devre borusu (pompa borusunu AUM rezervuarına bağlayın)
amonyum klorür (NH < alt > 4< / alt > Cl)Fisher11473713
susuz sodyum sülfat (Na2< / sub>SO4< / sub>)Fisher11498717
Azlon Konik konektör ve nbsp;Fisher10712807AUM devresinde farklı uzunluklarda boruları bağlamak için kullanılır
Yatak çantası askıları Büyük Ayı Sağlık 10705P
Bochem tutam musluk borusu kelepçeleri, 25 mm çapFisher11805101
kalsiyum klorür (CaCl2)Fisher10021681
Sitrik asit monohidrat MerckC1909-500GDeney sonrası modellerden kristal biyofilmi çıkarmak için kullanılır 
Balıkçı markası  Cam Dereceli B Sınıfı Tip 1 PipetlerFisher11992168
Graphpad prizma 10GraphPadV10.0vitro blader modelleri tedarik etmek için kullanılır İn vitro mesane modeli sonuçlarının grafiğini çıkarmak ve istatistiksel analiz için kullanılan analitik yazılım.
Hanna HI 2211-02 pH tezgah üstü ölçüm cihazıPhillip Harris PP00057414
in vitro mesane modeli -Nzakizwanayo ve ark. (2019) tarafından daha önce tanımlandığı gibi ısmarlama ekipman.
Instillagel 6 mL yağlayıcı jelmydoctorshop.co.uk40-006Bölüm 7.1.'de kullanılan kayganlaştırıcı jeller; diğer tedarikçiler mevcuttur.
Kartell Plastilab Düzensiz konik konektörFisher 11914289Farklı çaplardaki boruları bağlamak için kullanılır
MacConkey agar tuzsuz (kurutulmuş)Fisher10472643Proteus mirabilis
magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
monopotasyum fosfat (KH2PO4)Fisher10573181
Nalgene Y-şekilli konektörFisher10186070Bir AUM rezervuarından birden fazla AUM devresini çalıştırmak için kullanılır (tank başına 1-4 model) 
potasyum klorür (KCl)Fisher10375810
Pyrex Aspiratör Şişesi, Buzlu Cam Yan Soketli, Kapasite: 5000 mLFisher11347884AUM rezervuarı
Delikli Kauçuk Tıpalar, Çap Dış: 37mm, Kırmızı, Çap: 37mmFisher11517612AUM rezervuarında ve AUM'lu
in vitro modelleri tedarik etmek için kullanılırBoyut 14 Fransız %100 silikon Foley kateter, şişirme için steril su şırıngası ile Büyük Ayı Sağlık 4833-0514
sodyum klorür (NaCl)Fisher10735921
sodyum oksalat (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse konsantre biyosidal temizleyici 5L Fisher12447580Deney sonrası modelleri sterilize etmek için kullanılır
trisodyum sitrat (Na3< / sub>C 6< / sub>H < sub>5< / sub >O< sub>7 < / sub>)Fisher11434993
tripton soya suyuFisher10198002
üre (CH4< / sub>N2< / sub>O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl %0,9B.BraunFB99833Bölüm 7.2'de kullanılan tuzlu mesane irrigasyon torbası;
Watson-Marlow Pumpsil 1.6mm iç çap platinle kürlenmiş silikon boruFisher12406280Kalın AUM devre borusu (perstaltik pompada kullanım için)
Sıkılmış bung jelatin VWR 24360.233 ile AUM'lu in

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. R., et al. Epidemiology and health-economic burden of urinary-catheter-associated infection in English NHS hospitals: A probabilistic modelling study. J Hosp Infect. 103 (1), 44-54 (2019).
  2. Stickler, D. J. Bacterial biofilms in patients with indwelling urinary catheters. Nat Clin Pract Urol. 5 (11), 598-608 (2008).
  3. Feneley, R. C., Hopley, I. B., Wells, P. N. Urinary catheters: History, current status, adverse events and research agenda. J Med Eng Technol. 39 (8), 459-470 (2015).
  4. Lapides, J., Diokno, A. C., Silber, S. J., Lowe, B. S. Clean, intermittent self-catheterization in the treatment of urinary tract disease. J Urol. 107 (3), 458-461 (1972).
  5. Suetens, C., et al. Prevalence of healthcare-associated infections, estimated incidence and composite antimicrobial resistance index in acute care hospitals and long-term care facilities: Results from two European point prevalence surveys, 2016 to 2017. Euro Surveill. 23 (46), 1800516(2018).
  6. Nicolle, L. E. Catheter associated urinary tract infections. Antimicrob Resist Infect Control. 3, 23(2014).
  7. Jacobsen, S. M., Stickler, D. J., Mobley, H. L., Shirtliff, M. E. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clinical Microbiol Rev. 21 (1), 26-59 (2008).
  8. Trautner, B. W., Darouiche, R. O. Role of biofilm in catheter-associated urinary tract infection. Am J Infect Control. 32 (3), 177-183 (2004).
  9. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. N Engl J Med. 291 (5), 215-219 (1974).
  10. Warren, J. W., et al. Fever, bacteremia, and death as complications of bacteriuria in women with long-term urethral catheters. JInfect Dis. 155 (6), 1151-1158 (1987).
  11. Walker, J. N., et al. High-resolution imaging reveals microbial biofilms on patient urinary catheters despite antibiotic administration. World JUrol. 38 (9), 2237-2245 (2020).
  12. Chant, C., Smith, O. M., Marshall, J. C., Friedrich, J. O. Relationship of catheter-associated urinary tract infection to mortality and length of stay in critically ill patients: A systematic review and meta-analysis of observational studies. Crit Care Med. 39 (5), 1167-1173 (2011).
  13. Clarke, K., et al. Catheter-associated urinary tract infections in adults: Diagnosis, treatment, and prevention. J Hosp Med. 15 (9), 552-556 (2020).
  14. Tambyah, P. A., Maki, D. G. The relationship between pyuria and infection in patients with indwelling urinary catheters: A prospective study of 761 patients. Arch Intern Med. 160 (5), 673-677 (2000).
  15. Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
  16. Stewart, P. S., Costerton, J. W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet. 358 (9276), 135-138 (2001).
  17. Stewart, P. S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms. Int J Med Microbiol. 292 (2), 107-113 (2002).
  18. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  19. Sabir, N., et al. Bacterial biofilm-based catheter-associated urinary tract infections: Causative pathogens and antibiotic resistance. Am JInfect Control. 45 (10), 1101-1105 (2017).
  20. Touzel, R., Sutton, J., Wand, M. Establishment of a multi-species biofilm model to evaluate chlorhexidine efficacy. JHosp Infect. 92 (2), 154-160 (2016).
  21. Luo, Y., Yang, Q., Zhang, D., Yan, W. Mechanisms and control strategies of antibiotic resistance in pathological biofilms. J Microbiol Biotechnol. 31 (1), 1-7 (2021).
  22. Dincer, S., Uslu, F. M., Delik, A. Antibiotic resistance in biofilm. Bacterial biofilms. , IntechOpen. (2020).
  23. Soto, S. M. Importance of biofilms in urinary tract infections: New therapeutic approaches. Adv Biol. 2014 (1), 543974(2014).
  24. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol. 13 (1), 34-40 (2005).
  25. Otto, S. B., et al. Privatization of biofilm matrix in structurally heterogeneous biofilms. MSystems. 5 (4), e00425-e00520 (2020).
  26. Wood, T. K., Knabel, S. J., Kwan, B. W. Bacterial persister cell formation and dormancy. Appl Environ Microbiol. 79 (23), 7116-7121 (2013).
  27. Gaston, J. R., Johnson, A. O., Bair, K. L., White, A. N., Armbruster, C. E. Polymicrobial interactions in the urinary tract: Is the enemy of my enemy my friend. InfectImmun. 89 (4), (2021).
  28. Griffith, D. P., Musher, D. Á, Itin, C. Urease. The primary cause of infection-induced urinary stones. Invest Urol. 13 (5), 346-350 (1976).
  29. Armbruster, C. E., Mobley, H. L. T., Pearson, M. M. Pathogenesis of Proteus mirabilis infection. EcoSal Plus. 8 (1), 1128(2018).
  30. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  31. Mobley, H. L., Warren, J. W. Urease-positive bacteriuria and obstruction of long-term urinary catheters. J Clin Microbiol. 25 (11), 2216-2217 (1987).
  32. Wasfi, R., Hamed, S. M., Amer, M. A., Fahmy, L. I. Proteus mirabilis biofilm: Development and therapeutic strategies. Front Cell Infect Microbiol. 10 (414), (2020).
  33. Broomfield, R. J., Morgan, S. D., Khan, A., Stickler, D. J. Crystalline bacterial biofilm formation on urinary catheters by urease-producing urinary tract pathogens: A simple method of control. J Med Microbiol. 58 (10), 1367-1375 (2009).
  34. Stickler, D. J. Clinical complications of urinary catheters caused by crystalline biofilms: Something needs to be done. J Intern Med. 276 (2), 120-129 (2014).
  35. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Pseudomonas methods and protocols. , 631-641 (2014).
  36. Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol. 37 (6), 1771-1776 (1999).
  37. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  38. Bouatra, S., et al. The human urine metabolome. PloS one. 8 (9), e73076(2013).
  39. Holling, N., et al. Elucidating the genetic basis of crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Infect Immun. 82 (4), 1616-1626 (2014).
  40. Lawrence, E., Turner, I. Materials for urinary catheters: A review of their history and development in the UK. Med Eng Phys. 27 (6), 443-453 (2005).
  41. Stickler, D. J. Chlorhexidine resistance in Proteus mirabilis. J Clin Pathol. 27 (4), 284-287 (1974).
  42. Fraise, A. P. Biocide abuse and antimicrobial resistance-a cause for concern. J Antimicrob Chemother. 49 (1), 11-12 (2002).
  43. Pelling, H., et al. Derepression of the smvA efflux system arises in clinical isolates of proteus mirabilis and reduces susceptibility to chlorhexidine and other biocides. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01535(2019).
  44. Stickler, D. J., Morris, N. S., Winters, C. Simple physical model to study formation and physiology of biofilms on urethral catheters. MethodsEnzymol. 310, 494-501 (1999).
  45. Nzakizwanayo, J., Pelling, H., Milo, S., Jones, B. V. An in vitro bladder model for studying catheter-associated urinary tract infection and associated analysis of biofilms. Proteus mirabilis: Methods and Protocols. , 139-158 (2019).
  46. Clarke, O. E., et al. Lipopolysaccharide structure modulates cationic biocide susceptibility and crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Front Microbiol. 14, 1150625(2023).
  47. Nzakizwanayo, J., et al. Bacteriophage can prevent encrustation and blockage of urinary catheters by proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 60 (3), 1530-1536 (2015).
  48. Slate, A. J., et al. Infection-responsive coatings to reduce biofilm formation and encrustation of urinary catheters. J Appl Microbiol. 134 (6), lxad121(2023).
  49. Maierl, M., Jörger, M., Rosker, P., Reisner, A. In vitro dynamic model of a catheterized bladder and biofilm assay. Bio Protoc. 5 (2), e1381(2015).
  50. Stickler, D., Clayton, C., Chawla, J. The resistance of urinary tract pathogens to chlorhexidine bladder washouts. J Hosp Infect. 10 (1), 28-39 (1987).
  51. King, J., Stickler, D. An assessment of antiseptic bladder washout solutions using a physical model of the catheterized bladder. J Hosp Infect. 18 (3), 179-190 (1991).
  52. King, J., Stickler, D. The effect of repeated instillations of antiseptics on catheter-associated urinary tract infections: A study in a physical model of the catheterized bladder. Urol Res. 20, 403-407 (1992).
  53. Morris, N., Stickler, D. Encrustation of indwelling urethral catheters by Proteus mirabilis biofilms growing in human urine. J Hosp Infect. 39 (3), 227-234 (1998).
  54. Stickler, D., Morgan, S. Observations on the development of the crystalline bacterial biofilms that encrust and block foley catheters. J Hosp Infect. 69 (4), 350-360 (2008).
  55. Stamm, W. E. Catheter-associated urinary tract infections: Epidemiology, pathogenesis, and prevention. Am J Med. 91 (3, Supplement 2), S65-S71 (1991).
  56. Sarigul, N., Korkmaz, F., Kurultak, I. A new artificial urine protocol to better imitate human urine. Sci Rep. 9 (1), 20159(2019).
  57. Brooks, T., Keevil, C. A simple artificial urine for the growth of urinary pathogens. Lett Appl Microbiol. 24 (3), 203-206 (1997).
  58. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Front CellI Infect Microbiol. 6 (14), 3389(2016).
  59. Ipe, D. S., Ulett, G. C. Evaluation of the in vitro growth of urinary tract infection-causing gram-negative and gram-positive bacteria in a proposed synthetic human urine (SHU) medium. J Microbioll Methods. 127, 164-171 (2016).
  60. Chutipongtanate, S., Thongboonkerd, V. Systematic comparisons of artificial urine formulas for in vitro cellular study. Anal Biochem. 402 (1), 110-112 (2010).
  61. Saude, E. J., Adamko, D., Rowe, B. H., Marrie, T., Sykes, B. D. Variation of metabolites in normal human urine. Metabolomics. 3, 439-451 (2007).
  62. Andersen, S., et al. Proteomes of uropathogenic Escherichia coli growing in human urine and in j82 urinary bladder cells. Proteomes. 10 (2), 15(2022).
  63. Uppuluri, P., Dinakaran, H., Thomas, D. P., Chaturvedi, A. K., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of Candida albicans biofilms grown in a synthetic urine medium. J Clin Microbiol. 47 (12), 4078-4083 (2009).
  64. Gaston, J. R., et al. Enterococcus faecalis polymicrobial interactions facilitate biofilm formation, antibiotic recalcitrance, and persistent colonization of the catheterized urinary tract. Pathogens. 9 (10), 835(2020).
  65. Warren, J. W., Tenney, J. H., Hoopes, J. M., Muncie, H. L., Anthony, W. C. A prospective microbiologic study of bacteriuria in patients with chronic indwelling urethral catheters. The JI Infect Dis. 146 (6), 719-723 (1982).
  66. Armbruster, C. E., et al. Genome-wide transposon mutagenesis of Proteus mirabilis: Essential genes, fitness factors for catheter-associated urinary tract infection, and the impact of polymicrobial infection on fitness requirements. PLoS Pathog. 13 (6), e1006434(2017).
  67. Armbruster, C. E., et al. The pathogenic potential of Proteus mirabilis is enhanced by other uropathogens during polymicrobial urinary tract infection. Infect Immun. 85 (2), e00808(2017).
  68. Siegman-Igra, Y., Kulka, T., Schwartz, D., Konforti, N. Polymicrobial and monomicrobial bacteraemic urinary tract infection. J Hosp Infect. 28 (1), 49-56 (1994).
  69. Nye, T. M., et al. Microbial co-occurrences on catheters from long-term catheterized patients. Nat Commun. 15 (1), 61(2024).
  70. Hunt, B. C., et al. Metabolic interplay between Proteus mirabilis and Enterococcus faecalis facilitates polymicrobial biofilm formation and invasive disease. mBio. 15, e02164(2024).
  71. Stickler, D., Ganderton, L., King, J., Nettleton, J., Winters, C. Proteus mirabilis biofilms and the encrustation of urethral catheters. Urol Res. 21, 407-411 (1993).
  72. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  73. Habash, M., Reid, G. Microbial biofilms: Their development and significance for medical device-related infections. J Clin Pharmacol. 39 (9), 887-898 (1999).
  74. Ommen, P., Zobek, N., Meyer, R. L. Quantification of biofilm biomass by staining: Non-toxic safranin can replace the popular crystal violet. J Microbiol Methods. 141, 87-89 (2017).
  75. Wilson, C., et al. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Research and Reviews: J Eng Technol. 6 (4), 30214915(2017).
  76. Niebergall, A. K., et al. Influence of polymerized siloxane coating on growth and biofilm formation of aerobic grown nosocomial bacteria. J Cell Biotechnol. 3 (2), 107-115 (2018).
  77. Ionescu, A., Brambilla, E., Sighinolfi, M. C., Mattina, R. A new urinary catheter design reduces in vitro biofilm formation by influencing hydrodynamics. J Hosp Infect. 114, 153-162 (2021).
  78. Pelling, H., et al. Bacterial biofilm formation on indwelling urethral catheters. Lett Appl Microbiol. 68 (4), 277-293 (2019).
  79. Schaffer, J. N., Pearson, M. M. Proteus mirabilis and urinary tract infections. Microbiol Spectr. 3 (5), 1128(2015).
  80. Konieczna, I., et al. Bacterial urease and its role in long-lasting human diseases. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 789-806 (2012).
  81. Nzakizwanayo, J., et al. Fluoxetine and thioridazine inhibit efflux and attenuate crystalline biofilm formation by Proteus mirabilis. Sci Rep. 7 (1), 12222(2017).
  82. Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H. C. Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa. J Microbiol Methods. 50 (3), 237-248 (2002).
  83. Van Den Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. J Microbiol Methods. 98, 31-34 (2014).
  84. Trafny, E. A., Lewandowski, R., Zawistowska-Marciniak, I., Stępińska, M. Use of MTT assay for determination of the biofilm formation capacity of microorganisms in metalworking fluids. World J Microbiol Biotechnol. 29, 1635-1643 (2013).
  85. Chapman, J. S. Biocide resistance mechanisms. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (2), 133-138 (2003).
  86. Cloete, T. E. Resistance mechanisms of bacteria to antimicrobial compounds. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (4), 277-282 (2003).
  87. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiol Spectr. 6 (2), 1128(2018).
  88. Maillard, J. Y. Bacterial resistance to biocides in the healthcare environment: Should it be of genuine concern. J Hosp Infect. 65, 60-72 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyofilm Olu umuriner KateterlerAntimikrobiyal DirenFoley KateteriKateter T kan klKoloni Olu turan BirimlerKristal Viyole BoyamaKlorheksidin rrigasyonu

İlgili makaleler