Yöntem makalesi

Akış Sitometrisi Kullanılarak Yaralı Omurilikteki Mikroglia ve Periferik İnfiltre Makrofajların Belirlenmesi

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67967

⸱

24 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

Bu makalede

Özet

Yaralı omuriliklerde mikroglia (MG) ve periferik infiltre makrofajları (Mø) tanımlamak zordur. Bu protokolde, sırasıyla M1 benzeri MG, M2 benzeri MG, M1 benzeri Mø ve M2 benzeri Mø'yu tanımlamak için akış sitometrisi (FCM) kullanıldı. Bu teknoloji, MG ve Mø'nun rolünü anlamak için diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarına da uygulanabilir.

Özet

Sağlıklı bir omurilikte, periferik sızan makrofajlar neredeyse tespit edilemez ve mikroglia (MG), fagositoz yoluyla omurilik mikro çevresinin stabilitesinin korunmasına, hücresel kalıntıların temizlenmesine ve nörotrofik faktörlerin üretilmesine katılır. Omurilik yaralanmasından (SCI) sonra, MG aktive edilir ve periferik bağışıklık hücreleri yaralı omuriliğe sızar. Bu immün hücreler arasında aktive olmuş MG ve periferik infiltre makrofajlar (Mø) SKY patolojik sürecinde önemli rol oynamaktadır. Bu hücreler pro-inflamatuar (M1 benzeri) ve anti-inflamatuar (M2 benzeri) fenotiplere ayrılabilir; Bununla birlikte, morfolojideki benzerlikleri ve birçok hücresel belirteç nedeniyle onları ayırt etmek zordur. Biyomedikal alanda yaygın olarak kullanılan bir teknik olan akış sitometrisi (FCM), tek bir deneyde hücre boyutu, partikül boyutu, hücre yüzeyi ve hücre içi belirteçler gibi birden fazla hücresel parametreyi aynı anda tespit edebilir. Yıllar süren araştırmalar boyunca, FCM, omuriliklerde MG ve Mø'yu tanımlamaya çalıştı ve sonuçta stabil bir tespit yöntemi geliştirmek için sürekli olarak optimize edildi. Bu yöntem, CD45, CD11b, CD68, CCR7 ve diğer belirteçlerin ekspresyon profillerini tespit ederek SCI'den sonra M1/M2 benzeri MG ve M1/M2 benzeri Mø'nin tanımlanmasına izin verir. Bu protokolde, CD11b+CD45−/düşükCD68+CCR7+, CD11b+CD45−/düşükCD68+CCR7-, CD11b+CD45yüksekCD68+CCR7+ ve CD11b+CD45yüksekCD68+CCR7- hücreleri sırasıyla M1 benzeri MG, M2 benzeri MG, M1 benzeri Mø ve M2 benzeri Mø olarak tanımlanabilir.

Giriş

Omurilik yaralanması (SCI), çeşitli nedenlerle oluşan omurilik hasarının bir sonucudur. SCI yüksek bir engellilik oranına sahiptir ve şu anda etkili bir tedavi seçeneği yoktur, bu da onu dünyadaki en ciddi halk sağlığı sorunlarından biri haline getirmektedir 1,2. SCI'nin patofizyolojik süreci karmaşıktır ve iki aşamaya ayrılır. Başlangıçta, yaralanmadan kaynaklanan mekanik travma hemen akut hücresel disfonksiyona ve hücre ölümüne neden olur. Daha sonra, ikincil hasar günler, haftalar ve hatta aylar boyunca daha fazla hücresel işlev bozukluğuna ve hücre ölümüne yol açar. İkincil yaralanma mekanizmaları içinde, inflamasyonun ikincil hasarın ciddiyetinin önemli bir belirleyicisi olduğu ve sonuçta hücre ölümünü ve hücre işlevselliğini belirlediği kanıtlanmıştır3. Enflamatuar yanıtların özellikleri, yaralı omurilik içindeki enflamatuar hücrelerin infiltrasyonu ve aktivasyonudur, bu da enflamatuar hücrelerde ve enflamatuar faktörlerde bir artışa yol açar, inflamatuar bir mikro çevre oluşturur ve sonunda omurilik disfonksiyonuna neden olur4.

Merkezi sinir sistemindeki (MSS) mikroglia ve periferik infiltre makrofajlar, omurilik yaralanmasını (SCI) takiben inflamatuar yanıtta kritik bir rol oynar5,6. CNS'nin yerleşik makrofajları olarak mikroglia, CNS hücrelerinin %5-10'unu oluşturur ve SCI iyileşmesi için gereklidir 7,8. Mikroglia, SCI'den sonra hücresel kalıntıları yutabilir ve çıkarabilir, bu da iyileşme izlerinin oluşumuna aracılık eder 9,10. Bununla birlikte, mikroglia'nın aşırı aktivasyonu, sürekli bir inflamatuar yanıta yol açabilir ve aksonal rejenerasyonu engelleyen glial skarların oluşumunu teşvik edebilir11. SCI'den sonra, aktive edilmiş mikroglia esas olarak iki fenotip sergiler: M1 benzeri ve M2 benzeri12,13. M1 benzeri fenotip, hücre apoptozuna ve ikincil yaralanmaya katkıda bulunan inflamatuar faktörlerin sentezini destekleyen proinflamatuardır. M1 benzeri mikroglia ayrıca nörotoksik etkilere sahiptir, hasarı ve nöronal apoptozu şiddetlendirir14,15. Buna karşılık, M2 benzeri fenotip, anti-enflamatuar özelliklere sahiptir ve anjiyogenez, remiyelinizasyon, aksonal büyüme ve doku onarımını destekler16,17. M2 benzeri mikroglia, inflamasyonu modüle etmede ve onarım süreçlerinde çok önemli bir rol oynar.

Periferik makrofajlar, hasarlı kan-omurilik bariyerleri ve damar sistemi 17,18 yoluyla SKY'den sonra lezyon bölgesine sızar ve inflamatuar yanıtı, fagositozu, skar oluşumunu ve nöral doku rejenerasyonunu daha da düzenler19,20. Periferik infiltre makrofajlar, SCI, fagositoz doku enkazı21 sonrası inflamatuar yanıtı azaltabilir, nöral rejenerasyonu ve matris yeniden şekillenmesini teşvik edebilir. Bununla birlikte, periferik infiltre makrofajların aracılık ettiği sürekli bir inflamatuar yanıt, uzun süreli iyileşme için zararlı olan ikincil yaralanmaya yol açabilir22,23. M1 benzeri periferik sızan makrofajlar, nekrotik hücreleri temizleyebilen güçlü fagositik ve antijen sunma yeteneklerine sahiptir24. Bununla birlikte, proinflamatuar sitokinlerin, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve reaktif nitrojen türlerinin (RNS) aşırı salgılanması, nöronlara ve glial hücrelere zarar vererek daha şiddetli nöronal apoptoza yol açabilir25. Tersine, M2 benzeri periferik infiltre makrofajlar, nöronal apoptozu inhibe edebilir ve SCI sonrası inflamatuar yanıtı hafifletebilir, böylece nöral dokununonarımını teşvik edebilir 26.

SKY sonrası aktive olmuş mikroglia ve periferik olarak sızan makrofajlar, ayırt edilmelerini zorlaştıran morfolojik ve moleküler ekspresyon benzerlikleri sergiler. Yaygın olarak benimsenen bir teknik olan akış sitometrisi (FCM), hücre yüzeyinin ve hücre içi moleküllerin ekspresyonunu analiz etmek, farklı hücre alt popülasyonlarını tanımlamak ve aynı anda tek tek hücrelerin birden fazla parametresini değerlendirmek için kullanılır. Aktive edilmiş mikrogliaları periferik olarak sızan makrofajlardan ayırt etmek için stabil bir FCM testi yapılmıştır ve bu da SCI'deki rollerinin araştırılmasını kolaylaştırmıştır. Bu makalede, geliştirilen kararlı algılama yöntemi açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma Bengbu Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (No. 2020-050). Hayvan bakımı, Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından sağlanan düzenlemelere uygundur. Toplam 18 adet sekiz haftalık dişi C57 / BL6 faresi ticari olarak elde edildi ve kullanıldı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney ve hayvan hazırlama

  1. Ameliyattan önce fareleri havalandırmalı kafeslerde barındırın. 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünü koruyun ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlayın. Bir haftalık iklimlendirme için ortam oda sıcaklığını 20-22 °C'de ve nemi %30-70 arasında tutun.
  2. Fareler için cerrahi aletleri otoklavlayarak sterilize edin ve kullanmadan önce kurutun. Aletleri ve hayvan ameliyathanesini ameliyattan yarım saat önce ultraviyole sterilizasyona tabi tutun. Fareleri rastgele gruplama ilkesine göre gruplandırın ve etiketleyin. Daha sonra kullanmak üzere ağırlıklarını kaydedin ve kaydedin.
  3. Fareleri bir ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) kokteyli ile intraperitoneal enjeksiyonla (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) uyuşturun. T8'den T10'a kadar olan omurlardan sırttaki saçları tıraş edin.

2. SCI fare modelinin hazırlanması

  1. Cerrahi alanı baştan kuyruğa bir iyot çubuğu kullanarak, T9'u merkezleyerek dezenfekte edin ve ardından% 75 alkollü çubukla dezenfekte edin. T9 merkezli ciltte 1 cm'lik bir kesi yapın. T9'u çevreleyen fasya, kas ve bağları 1 cm boyunca inceleyin.
    1. T9'u ortaya çıkarmak için T9 spinöz sürecine bitişik kasları ayırın. T9 ve T10 arasındaki laminayı ortaya çıkarmak ve çıkarmak için oftalmik makas kullanın ve yaklaşık 2 mm çapında olan T9'da bulunan omuriliği tamamen açığa çıkarın.
      NOT: T9 laminasını kaldırırken makasın omuriliğe temas etmediğinden emin olun.
  2. T7 ve T11'in dikenli süreçlerini sıkıştırarak omurgayı stabilize edin. 1,3 mm çapında ve 0,5 N'lik bir kuvvete sahip bir çubuk kullanarak ılımlı bir SCI modeli oluşturun. SCI'den sonra kuyruğun yukarı doğru kıvrıldığını ve arka bacak seğirmesini gözlemleyin. Sahte ameliyatlı fareler için, kontüzyon olmadan sadece laminektomi yapın.
  3. Kesi yerinde hemostaz elde edin. Steril 5-0 cerrahi dikişler kullanarak katmanlı kapatma yapın. Kas yaklaşımı için, Adson forseps ile derin fasyayı dişlerle kavrayın ve panniculus carnosus tabakasını 5-0 emilebilir monofilament kullanarak dikin, iğneyi yara kenarından 2 mm dik olarak sokarak simetrik tam kalınlıkta ısırıklar elde edin (2-3 mm derinlik) 3 mm aralıklarla.
    1. Fasyal düzlemleri anatomik olarak hizalamak için kare düğümleri kontrollü gerginlikle bağlayın. 1 mm epidermal eversiyon oluşturmak için mikro İris makası kullanarak cilt kenarlarını yeniden konumlandırın. Dermisi saatçinin forsepsleri ile hassas bir şekilde hizalayın ve 2 mm aralıklarla basit, kesintili 5-0 emilmeyen sütürlerle sabitleyin, böylece deri altı ölü boşluk olmadan düzgün bir koaptasyon sağlayın.
    2. Yara merkezinden dışa doğru tek yönlü vuruşlar kullanarak dikiş hattını iyot çubuklarıyla dezenfekte edin. Kalan kanı tuzlu suyla nemlendirilmiş gazlı bezle nazikçe silin ve kesi boyunca ince bir tabaka üçlü antibiyotik merhem uygulayın.
  4. Ameliyat sonrası fareleri uygun sıcaklık ve nemde tutulan bir kafese koyun. Farelere bağımsız idrara çıkma konusunda yardımcı olmak için günde iki kez (sabah ve akşam) idrara çıkma bakımı sağlayın.
  5. Enfeksiyonu önlemek için her fareye günde 0.5 mL salin ve antibiyotik (gentamisin, 2000-2500 U / fare) subkutan olarak enjekte edin.

3. C57 / BL6 farelerinden omurilik dokusunun izolasyonu

  1. Ameliyattan önce fareleri uyuşturun (adım 1.3). Tamamen uyuşturulduktan sonra, sırtüstü pozisyonda ameliyat masasına sabitleyin. Sahte olarak çalıştırılan fareler de benzer şekilde tedavi edilir.
  2. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunda, sternumun altında ve diyafram boyunca enine bir kesi yapın. Kalbi kanama durdurucularla nazikçe stabilize edin ve perfüzyon kanülünü apikal sol ventriküle yerleştirin ve aort içine ilerletin.
    1. Hemen sağ kulak kepçesini kesin ve 10 mL PBS çözeltisi ile 250 mL / s hızında perfüzyona başlayın. Sağ kulak kepçesinden akan sıvı kanlı kırmızıdan berrak ve renksizliğe döndüğünde veya karaciğer kırmızıdan beyaza geçtiğinde perfüzyon başarılı kabul edilir27.
  3. Vertebra foramenini ortaya çıkarmak için farenin kuyruk ucundaki omurgayı kesin. Oftalmik makas kullanarak, omurilik dokusunu yaralanma bölgesinin 0,5 cm üstünde ve altında dikkatlice inceleyin. İzole edilmiş omurilik dokusunu %5 boyama tamponu içeren steril, enzim içermeyen bir kültür kabına yerleştirin ve daha sonra kolloidal silika kaplı polivinilpirolidon (PVP) yoğunluk gradyan santrifüjlemesinde kullanmak üzere 4 °C'de buz üzerinde saklayın.
    NOT: Omuriliği yaralanma merkezinin yakınında diseksiyon yaparken, yaralanma bölgesinde omuriliğin yırtılmasını veya zarar görmesini önlemek için dokunun bütünlüğünü sağlayın. % 5 Boyama Tamponu (SB), 2.5 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 47.5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içerir.

4. Polivinilpirolidon ile kaplanmış kolloidal silika kullanılarak yoğunluk gradyan santrifüjleme

  1. Omurilik dokusunu 300 gözenekli bir hücre süzgecine yerleştirin ve 5 mL / 10 mL tek kullanımlık bir şırınganın pistonunu kullanarak öğütün. Öğütme işleminden sonra, hücre süspansiyonunu 300 gözlü süzgeçten santrifüjleme için 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün (5 dakika, 110 x g, oda sıcaklığı).
    1. Santrifüjlemeden sonra, hücre tortusuna 1 mL tripsin hücre sindirim çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. 1.5 mL fetal sığır serumu ekleyerek sindirimi durdurun, ardından tekrar santrifüjleyin (110 x g, 5 dakika, oda sıcaklığı). Hücre tortusunu 1 mL% 5 boyama tamponu (SB) içinde yeniden süspanse edin.
  2. Sırayla 4 mL %70 kolloidal silika kaplı polivinilpirolidon solüsyonu, 4 mL %30 kolloidal silika kaplı polivinilpirolidon solüsyonu ve 1 mL %5 SB ile yeniden süspanse edilmiş hücre solüsyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin. Karışımı santrifüjleyin (300 x g, 30 dk, 20 °C).
    NOT: Kolloidal silika kaplı polivinilpirolidon ayırma reaktifini, kolloidal silika kaplı polivinilpirolidon ve 10× PBS'nin 9:1 karışımı olarak hazırlayın. % 70 kolloidal silika kaplı polivinilpirolidon çözeltisini 1× PBS ve% 30 kolloidal silika kaplı polivinilpirolidon çözeltisini DMEM veya RPMI 1640 hücre kültürü ortamı ile seyreltin.
  3. Santrifüjlemeden sonra, hücreler santrifüj tüpünde katmanlar oluşturacaktır (Şekil 1). 8 mL kalibrasyon işaretinin üzerindeki hücre kalıntılarını ve trombosit katmanlarını atın. Kalan çözeltiyi (1,5 mL kalibrasyon işaretine kadar) dikkatlice aspire edin ve işaretin altındaki tortuyu atın.
    1. Kalan çözeltiyi 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjleme için toplam hacmi 15 mL'ye (400 x g, 5 dk, 4 °C) getirmek için 1× PBS ekleyin.
  4. Süpernatanı atın ve hücre tortusunu% 5 SB'de yeniden süspanse edin. Çözeltiyi yıkama ve santrifüjleme için bir akış sitometrisi (FCM) tüpüne aktarın (110 x g, 5 dk, 4 °C). FCM tüpündeki hücre tortusunu 200 μL% 5 SB ile yeniden süspanse edin.

5. FCM boyama

  1. 200 μL hücre süspansiyonunu iki yeni akış sitometri tüpüne eşit olarak bölün. Bir tüpü "İzotip Kontrolü" ve diğerini "Spesifik Boyama" olarak etiketleyin.
  2. Boyama prosedürü
    1. "İzotip Kontrolü" tüpüne aşağıdaki izotip uyumlu antikorları ekleyin: PE etiketli Sıçan IgG2b kappa, FITC etiketli Sıçan IgG2b kappa, APC etiketli Sıçan IgG2b kappa ve APC-eFluor 780 etiketli Sıçan IgG2b kappa.
    2. "Spesifik Boyama" tüpüne, önerilen seyreltme oranlarına göre aşağıdaki floresan etiketli antikor panelini ekleyin: Sıçan anti-fare CD45 APC, Sıçan anti-fare CD11b PE, Sıçan anti-fare CD68 FITC ve Sıçan anti-fare CCR7 APC-eFluor 780.
    3. Tüpleri oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak 30 dakika inkübe edin.
  3. Her seferinde 1 mL SB ekleyerek lekeli hücreleri iki kez yıkayın. Hücreleri santrifüjleyin (110 x g, 5 dk, 4 °C). Son olarak, akış sitometrisi analizi için hücreleri %2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.

6. FCM algılama

NOT: Prosedürün ayrıntıları için önceki raporlara27,28 bakın.

  1. Uyumlu yazılımla akış sitometresini kullanarak numuneleri analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. İlk olarak, birincil grafiği oluşturmak için izotip kontrol tüpünü analiz edin (x ekseninde FSC ve y ekseninde SSC). Hücre popülasyonunu uygun bir aralıkta konumlandırmak için ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) voltajlarını ayarlayın.
    2. İki ek grafik ayarlayın: Biri x ekseninde IgG-APC ve y ekseninde IgG-PE. X ekseninde IgG-FITC ve y ekseninde IgG APC-Cy7 (not: bu kanalda APC-eFluor 780 tespit edildi) olan bir diğeri.
    3. IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC ve IgG APC-Cy7 için floresan kanal voltajlarını, hücre popülasyonunu çift negatif bölgenin 103'ü içinde konumlandırmak için ayarlayın.
  2. FSC ve SSC voltajlarının yanı sıra floresan kanal voltajları, izotip kontrol tüpü kullanılarak ayarlandıktan ve optimize edildikten sonra, bu ayarlar değişmeden kalmalıdır. Antikor lekeli deney tüplerini analiz etmeye devam edin.
    1. X ekseninde CD11b-PE ve y ekseninde SSC ile birincil bir grafik oluşturun. X ekseninde CD68-FITC ve y ekseninde CCR7 APC-Cy7 ile başka bir grafik oluşturun. İzotip kontrol tüpünü referans olarak kullanarak, temel değerleri ayarlayın ve CD11b + hücreleri için "bölgeyi" tanımlayın. Birincil grafikte, CD11b+ hücre bölgesini geçit ve bunu "P1 kapısı" olarak tanımlayın.
    2. Ardından, x ekseninde CD68-FITC ve y ekseninde CCR7 APC-Cy7 ile grafiği seçin. Sağ tıklayın ve Nüfusu Göster'i seçin, ardından P1'i seçin. Bu, CD68 + / CCR7 + veya CD68 + / CCR7- eksprese eden CD11b + grubu içindeki hücre popülasyonlarını gösterecektir. Örnek başına 50.000 olay toplayın.
    3. Verileri aldıktan sonra, floresan telafisini gerektiği gibi ayarlayın. CD11b+, CD68+ , CCR7+ , (M1 benzeri) hücrelerin ve CD11b+, CD68+ , CCR7- (M2 benzeri) hücrelerin yüzdesini analiz edin ve belirleyin. Pozitif olarak işaretlenmiş hücrelerin ortalama yüzdesi, toplam örnek popülasyonunun yüzdesi olarak ifade edilir.
  3. İzotip kontrol tüpünden iyi ayarlanmış voltaj parametrelerini kullanarak, deney tüplerinin analizine devam edin.
    1. İlk olarak, CD45-APC ve CD11b-PE ile bir grafik oluşturun, ardından CD68-FITC ve CCR7 APC-Cy7 ile iki grafik oluşturun. Numune başına 50.000 olay toplayın ve verileri aldıktan sonra floresan telafisini ayarlayın.
    2. CD45 / CD11b sözde renkli grafiklerinde, her örnek için CD11b + CD45 / düşük ve CD11b + CD45yüksek hücreleri için "bölgeleri" analiz edin. Ardından, bu iki bölgedeki CD68 + CCR7 + hücrelerini ve CD68 + CCR7 hücrelerini analiz edin.
    3. Aşağıdaki hücre popülasyonlarının yüzdelerini belirlemek için analizleri entegre edin: CD11b+ CD45−/düşük CD68+ CCR7+ (M1 benzeri mikroglia), CD11b+ CD45−/düşük CD68+ CCR7- (M2 benzeri mikroglia), CD11b+ CD45yüksek CD68+ CCR7+ (M1 benzeri makrofajlar), CD11b+ CD45high CD68+ CCR7- (M2 benzeri makrofajlar).
      NOT: Pozitif olarak işaretlenmiş hücrelerin ortalama yüzdesi, toplam örnek popülasyonunun yüzdesi olarak ifade edilir.

7. FCM veri analizi

  1. Akış sitometrisi analiz yazılımını başlatın ve akış sitometrisi deney dosyalarını arayüzdeki "Tüm Örnekler" bölümüne sürükleyin. Akış sitometrisi deneyleri, arayüzde "Tüm Örnekler" altında görüntülenecektir. Pozitif ve negatif floresan sinyalleri arasındaki eşiği belirlemek için izotip kontrol tüpünü analiz ederek başlayın.
    1. İki boyutlu bir nokta grafiği görüntüleyen bir grafik penceresi açmak için izotip kontrol tüpü örneğine çift tıklayın. X ekseni için FSC-A'yı ve y ekseni için SSC-A'yı seçin. Arayüzün üst kısmındaki Dikdörtgen Kapı düğmesine tıklayın ve hücresel kalıntıları çıkardıktan sonra alanı seçmek için dikdörtgeni kullanın (Şekil 2A).
    2. Yeni bir grafik penceresi oluşturmak için seçilen alana çift tıklayın. X ekseni için FITC'yi ve y ekseni için Histogram'ı seçin. Negatif ve pozitif floresan sinyalleri arasındaki eşiği belirlemek üzere tek parametreli histogramda bir geçit ayarlamak için arayüzün üst kısmındaki Bölge Kapısı düğmesine tıklayın. Bölge kapısı pozitif alanı tanımlayacaktır (Şekil 2A).
      NOT: Daha küçük FSC değerlerine sahip alan, hücresel kalıntıları temsil eder.
    3. Deneyde kullanılan dört floresan antikorun her biri için, izotip kontrol tüpü örneğini kullanarak negatif ve pozitif sinyaller arasındaki eşiği belirleyin. X ekseninde, y eksenini Histogram olarak tutarken florokromları sırayla PE, APC ve APC-Cy7 olarak değiştirin.
    4. Kapıları ayarlamak ve dört floresan antikorun her biri için negatif ve pozitif sinyaller arasındaki eşiği belirlemek için tek parametreli histogramdaki bölge kapısı aracını kullanın (Şekil 2A).
  2. M1 benzeri ve M2 benzeri hücrelerin oranlarını analiz etmek için:
    1. İki boyutlu bir nokta grafiği elde etmek için deneysel tüp örneğine çift tıklayın. X ekseni için FSC-A'yı ve y ekseni için SSC-A'yı seçin. Arayüzün üst kısmındaki Dikdörtgen Kapı düğmesine tıklayın ve hücresel kalıntıları çıkardıktan sonra alanı seçmek için dikdörtgeni kullanın (Şekil 2B).
    2. Yeni bir grafik penceresi oluşturmak için seçilen alana çift tıklayın. X ekseni için CD11b-PE'yi ve y ekseni için SSC-A'yı seçin. Arayüzün üst kısmındaki Dikdörtgen Kapı düğmesine tıklayın ve izotip kontrolü tarafından ayarlanan PE pozitif/negatif eşiği referans olarak kullanarak CD11b+ kapısını tanımlayın (Şekil 2B).
    3. Yeni bir grafik penceresi oluşturmak için CD11b+ kapı alanına çift tıklayın. X ekseni için CD68-FITC'yi ve y ekseni için CCR7 APC-Cy7'yi seçin. Çapraz Kapı düğmesine tıklayın. İzotip kontrolü tarafından belirlenen FITC ve APC-Cy7 pozitif/negatif eşikleri referans olarak kullanarak, hücreleri kategorize etmek için çapraz geçidi kullanın, CD11b+ CD68+ CCR7+ (M1 benzeri) hücrelerin ve CD11b+ CD68+ CCR7- (M2 benzeri) hücrelerin oranlarını belirleyin (Şekil 2B).
      NOT: M1 benzeri makrofajların (M1 benzeri Mø), M2 benzeri makrofajların (M2 benzeri Mø), M1 benzeri mikrogliaların (M1 benzeri MG) ve M2 benzeri mikrogliaların (M2 benzeri MG) oranlarını analiz etmek için geçit ilkeleri, M1 benzeri ve M2 benzeri hücreleri analiz etmek için kullanılanlarla tutarlıdır. Pozitif ve negatif floresan sinyallerini ayırt etmek için eşikler, kapıların ayarlanması için referans görevi gören izotip kontrol tüpüne dayanmaktadır. Yazılım işlem süreci Şekil 2B'de gösterilmiştir ve hücre oranlarını belirlemek için kullanılan işaretleyici ifade profilleri, temsili sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Omurilik dokusundan bağışıklık hücreleri, polivinilpirolidon yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile kaplanmış kolloidal silika kullanılarak ayrılır. Santrifüjleme işlemi sırasında hücreler yüzdürme yoğunluklarına göre farklı katmanlara dağıtılır ve böylece hücre ayrımı sağlanır (Şekil 1). Yukarıdan aşağıya dağılım şu şekildedir: hücresel kalıntı, mononükleer hücre açısından zengin tabaka, lenfosit açısından zengin tabaka ve altta eritrosit ve granülosit tabakası.

M1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bir SCI hayvan modelinin başarılı bir şekilde oluşturulması esastır. SCI modeli, T9 segmentindeki omuriliğin 0.5 N'luk bir kuvvete maruz bırakılmasıyla kurulmuştur. Hayvan modelinin başarısı, farenin kuyruğunun kıvrılması, her iki arka bacağın spazmlar yaşaması ve arka ayakların felç olması, farenin SCI'den sonra yürümesini imkansız hale getirmesiyle gösterilmiştir (bkz. adım 2.3). Ameliyat sonrası bakım, farenin hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Fare bağımsız olarak idrar yapa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82072416) tarafından desteklenmiştir; ve Bengbu Tıp Fakültesi Birinci Bağlı Hastanesi'nin (BYYFY2022TD001) üst düzey bilimsel ve teknolojik yenilik ekibi fonu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1&kez; PBS  Güneş EnerjisiP1020
10&kez; PBS  Güneş EnerjisiP1022
18 sekiz haftalık dişi C57/BL6 fare Cavens Laboratuvar Hayvanları Ltd., Chang Zhou, Çin
APC-eFluor 780 etiketli Sıçan anti-fare CCR7 (IgG2b kappa)Davetli47-1971-820.25μ g/test
APC-eFluor 780-etiketli Sıçan IgG2b kappa  İzotip kontrolüDavetli47-4321-820.25μ g/test
APC etiketli Sıçan anti-fare CD45 (IgG2b kappa)Davetli17-0451-820.125μ g/test
APC-etiketli Sıçan IgG2b kappa  İzotip kontrolüDavetli17-4031-820.125μ g/test
DMEMGibco11965092
Fetal sığır serumuLonseraS711-001 Serisi
FITC etiketli Sıçan anti-fare CD68 (IgG2b kappa)Davetli  MA5-166760.25μ g/test
FITC-etiketli Sıçan IgG2b kappa  İzotip kontrolüDavetli11-4031-820.25μ g/test
ParaformaldehitBiyokeskin23319084
PE etiketli Sıçan anti-fare CD11b (IgG2b kappa)Davetli12-0112-810.25μ g/test
PE-etiketli Sıçan IgG2b kappa  İzotip kontrolüDavetli12-4031-820.25μ g/test
Percoll  Güneş EnerjisiP8370 Serisi
Tripsin ÇözeltisiBiyokeskinBL526A Serisi

Kaynaklar

  1. Rubiano, A. M., Carney, N., Chesnut, R., Puyana, J. C. Global neurotrauma research challenges and opportunities. Nature. 527 (7578), S193-S197 (2015).
  2. Fehlings, M., Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clin Epidemiol. 6, 309-331 (2014).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. Immune response following traumatic spinal cord injury: Pathophysiology and therapies. Front Immunol. 13, 1084101(2023).
  4. Sun, X., et al. Multiple organ dysfunction and systemic inflammation after spinal cord injury: A complex relationship. J Neuroinflammation. 13 (1), 260(2016).
  5. Brockie, S., Zhou, C., Fehlings, M. G. Resident immune responses to spinal cord injury: Role of astrocytes and microglia. Neural Regen Res. 19 (8), 1678-1685 (2024).
  6. Wang, Z., Zhou, W., Zhang, Z., Zhang, L., Li, M. Metformin alleviates spinal cord injury by inhibiting nerve cell ferroptosis through upregulation of heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 19 (9), 2041-2049 (2024).
  7. Li, F., et al. Lupenone improves motor dysfunction in spinal cord injury mice through inhibiting the inflammasome activation and pyroptosis in microglia via the nuclear factor kappa B pathway. Neural Regen Res. 19 (8), 1802-1811 (2024).
  8. Zhou, H. -Y., et al. Dynamic development of microglia and macrophages after spinal cord injury. Neural Regen Res. 20 (12), 3606-3619 (2024).
  9. Hakim, R., et al. Spinal cord injury induces permanent reprogramming of microglia into a disease-associated state which contributes to functional recovery. J Neurosci. 41 (40), 8441-8459 (2021).
  10. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  11. Zeng, F., et al. Microglia overexpressing brain-derived neurotrophic factor promote vascular repair and functional recovery in mice after spinal cord injury. Neural Regen Res. , (2024).
  12. Tang, Y., Le, W. Differential roles of M1 and M2 microglia in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 53 (2), 1181-1194 (2015).
  13. Butovsky, O., Weiner, H. L. Microglial signatures and their role in health and disease. Nat Rev Neurosci. 19 (10), 622-635 (2018).
  14. Wang, J., He, W., Zhang, J. A richer and more diverse future for microglia phenotypes. Heliyon. 9 (4), e14713(2023).
  15. Zeng, F., et al. Knockout of TNF-α in microglia decreases ferroptosis and convert microglia phenotype after spinal cord injury. Heliyon. 10 (17), e36488(2024).
  16. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  17. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  18. Hao, D., et al. Trends of epidemiological characteristics of traumatic spinal cord injury in China, 2009-2018. Eur Spine J. 30 (10), 3115-3127 (2021).
  19. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell Mol Life Sci. 72 (21), 4111-4126 (2015).
  20. Kong, X., Gao, J. Macrophage polarization: A key event in the secondary phase of acute spinal cord injury. J Cell Mol Med. 21 (5), 941-954 (2016).
  21. Lech, M., Anders, H. -J. Macrophages and fibrosis: How resident and infiltrating mononuclear phagocytes orchestrate all phases of tissue injury and repair. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1832 (7), 989-997 (2013).
  22. Mosley, R. L., et al. The glial scar-monocyte interplay: A pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One. 6 (12), e27969(2011).
  23. Zhu, Y., et al. Hematogenous macrophage depletion reduces the fibrotic scar and increases axonal growth after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 74, 114-125 (2015).
  24. Hou, C., et al. Mono-macrophage-derived MANF protects against lipopolysaccharide-induced acute kidney injury via inhibiting inflammation and renal M1 macrophages. Inflammation. 44 (2), 693-703 (2020).
  25. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  26. Zhang, J., et al. The effects of the M2a macrophage-induced axonal regeneration of neurons by arginase 1. Biosci Rep. 40 (2), BSR20193031(2020).
  27. Li, J. L., et al. The polarization of microglia and infiltrated macrophages in the injured mice spinal cords: A dynamic analysis. PeerJ. 11, e14929(2023).
  28. Gratama, J. W., et al. Analysis of variation in results of flow cytometric lymphocyte immunophenotyping in a multicenter study. Cytometry. 30 (4), 166-177 (1997).
  29. Delarasse, C., Fontaine, B., El-Behi, M., Martin, E. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. (124), e55781(2017).
  30. Chen, Y. J., et al. Temporal kinetics of macrophage polarization in the injured rat spinal cord. J Neurosci Res. 93 (10), 1526-1533 (2015).
  31. Chen, Y. -Q., et al. CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ameliorates murine spinal cord injury by improving local immune microenvironment. J Neuroinflammation. 17 (1), 255(2020).
  32. Vijay, S., Nair, R. R., Sharan, D., Jakkala, K., Ajitkumar, P. Percoll discontinuous density gradient centrifugation method for the fractionation of the subpopulations of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis from in vitro cultures. MethodsX. 11 (7), 102344(2023).
  33. Sharma, A., et al. Successful transplantation of transfected enriched buffalo spermatogonial stem cells to homologous recipients. Theriogenology. 142, 441-449 (2020).
  34. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nat Protoc. 3 (7), 1228-1239 (2008).
  35. Maurer, F., et al. Continuous Percoll gradient centrifugation of erythrocytes: Explanation of cellular bands and compromised age separation. Cells. 11 (8), 1296(2022).
  36. Gamboa-Suárez, B. A., Lotta-Arévalo, I. A., Sarmiento-Salazar, F., Matta, N. E. Finding a needle in a haystack: DNA Haemoproteus columbae enrichment using percoll density gradient and flow cytometry. Vet Parasitol. 328, 110170(2024).
  37. Cao, Y., et al. Paeoniflorin suppresses kidney inflammation by regulating macrophage polarization via KLF4-mediated mitophagy. Phytomedicine. 116, 154901(2023).
  38. Nishihara, T., et al. Chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats causes different activation modes of microglia between the anterior and posterior horns of the spinal cord. Neurochem Int. 134, 104672(2020).
  39. Durafourt, B. A., et al. Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages. Glia. 60 (5), 717-727 (2012).
  40. Wachholz, S., et al. Microglia activation is associated with IFN-alpha induced depressive-like behavior. Brain Behav Immun. 55, 105-113 (2016).
  41. Chen, X., et al. Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics. Acta Biomater. 103, 318-332 (2020).
  42. Guo, S. D., et al. Nasal delivery of Fasudil-modified immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci Ther. 25 (6), 783-795 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroglia Tan mlamaOmurilik YaralanmasYo unluk Gradyan Santrif gasyonumm n H cre zolasyonuCD11b Mark rCD68 Mark rCCR7 Mark rM1 M2 Fenotipleri

İlgili makaleler