Method Article

Amerikan İşaret Dili ve İngilizce'de Potansiyel PLK1 Inhibitörlerini Tanımlamak İçin İki Dilli Hesaplamalı İş Akışı

DOI:

10.3791/67979

⸱

April 3rd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery Lab, School of Science, Technology, Accessibility, Mathematics, and Public Health (STAMP), Gallaudet University, 2University of Connecticut

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iki dilli protokol, Polo benzeri Kinazlar 1'den 3'e (PLK1–3) ve veritabanı kaynaklı doğal moleküllerin Emilim, Dağılım, Metabolizma, Salgılama, Toksisite ve Stabilite (ADMET-S) özelliklerini değerlendiren hesaplamalı ilaç keşif iş akışı sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polo benzeri Kinaz 1 (PLK1), hücre döngüsünün S, G2 ve M fazlarında önemli roller oynar ve aşırı ekspresyonu, meme kanseri dahil olmak üzere birçok kanserde sıkça gözlemlenir; burada genomik istikrarsızlığa ve apoptoza düzensiz hale gelir. Kinaz domenini hedef alan geleneksel ATP rekabetçi inhibitörlerinin aksine, PLK1'in polo-box domaininin (PBD) seçici inhibisyonu, mitotik ilerleme için kritik olan protein-ligand etkileşimlerini bozmak için umut verici bir strateji sunar ve böylece kanser hücrelerinde apoptozu tetikler. Ancak, PLK1 ile nörolojik fonksiyon ve stres yanıtı için hayati öneme sahip homologları (PLK2 ve PLK3) arasındaki yüksek yapısal benzerlik, hedef dışı etkilerden kaçınmak için olağanüstü seçicilik gerektirir. Bu zorluğu ele almak için protokol, sanal tarama, yapısal kümeleme, protein-ligand kenetlenmesi, bağlanma afinite tahmini, ADMET-S profilleme ve kuantum mekanik (QM) kararlılık analizini entegre eden iki dilli (Amerikan İşaret Dili ve İngilizce) hesaplamalı bir iş akışını içermektedir. SuperNatural 3.0 doğal ürün veritabanından başlayarak, bileşikler meme kanseri önemi ve ilaç benzerliği kriterleriyle filtrelendi, kimyasal çeşitliliği sağlamak için kümelendi ve PLK1-, PLK2- ve PLK3-PBD yapılarıyla etkileşimleri değerlendirildi. Sanal kenetlenme ve in silico ADMET-S değerlendirmeleri seçiciliği veya etki mekanizmasını kesin olarak doğrulayamazken, bu çalışma test edilebilir hipotezler üretir ve gelecekteki moleküler dinamik simülasyonları, biyokimyasal doğrulama veya deneysel tarama için doğal ürün kökenli adayların odaklı bir setini önceliklendirir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polo benzeri kinazlar (PLK'lar), yapısal olarak bir N-terminal domain ve bir veya iki polo-box domaininden (PBD)1,2 oluşan bir C-terminusundan oluşan bir protein kinaz ailesidir.  Bu polo-box alanlarının sayısı ve işlevsel çeşitliliği, farklı PLK aile üyeleri arasında değişiklik gösterir. PLK1, hücre bölünmesinin S, G2 ve M aşamalarında yer alır. Hücre döngüsünde, PLK1 S fazında DNA hasarı kontrol noktası ve G2 fazında kromozom yoğunlaşma ile centrozom olgunlaşmasının düzenleyicisi olarak işlev görür. PLK1 ayrıca M fazına mitotik girişi, ardından mil montajı, anafaz girişi ve sitokinez 3,4 gelir. PLK1'in aşırı ekspresyonu, anormal centrozom oluşumu nedeniyle genetik istikrarsızlığa yol açar ve hücrelerin apoptozu düzenleyememesine neden olan hücre döngülerinin bozulmasına yol açar.  Bu tür aşırı ifade akciğer, baş ve boyun, özofagus, mide, kolorektal ve meme kanserlerindegözlemlenir 4. Bu nedenle, PBD'yi hedefleyen ajanlarla PLK1'in inhibisyonuapoptoz 5,6 tetikleyebilir. Bu iş akışı, nörolojik fonksiyon ve genotoksik stres yönetimi için kritik olan PLK2 ve PLK3'ü engelleymekten kaçınmak için yüksek seçicilik eldeetmeyi amaçlar 3.

PLK2, belirli bağlamlarda tümör baskılayıcı olarak işlev görür; G1/S geçişini düzenler ve kontrolsüz hücre çoğalmasını önlemek için siklin E'nin parçalanmasını teşvik eder. PLK3, hem hücre döngüsü düzenlemesinde hem de genotoksik strese yanıtta karmaşık bir rol sergiler; DNA hasar kontrol noktası aktivasyonu ve apoptoz indüksiyonu yoluyla genom bütünlüğünün korunmasına katkıdabulunur 7. Önemli olarak, PLK1 inhibisyonu kanser tedavisinde umut vadeden bir tedavi stratejisi olarak ortaya çıkmış olsa da, PLK2 ve PLK3'ün nörolojik işlevsellik ve stres yanıtındaki temel rolleri, bu kritik kinazlar üzerindeki hedeften yan etkileri en aza indirmek için yüksek seçici inhibitörlerin geliştirilmesini gerektirir3. Bu biyolojik bağlam ve %38 üzerindeki yapısal benzerlikler, PLK1'in polo-box alanını (PBD) hedef alan bileşiklerin tespit edilmesinin önemini vurgulamaktadır; bu bileşikler normal hücresel fizyolojide PLK2 ve PLK3'ün koruyucu işlevlerine müdahale etmektedir.

Özellikle PLK1'i hedefleyen bilinen polo benzeri kinaz (PLK) inhibitörleri, kanser tedavisinde potansiyel terapötik uygulamaları nedeniyle kapsamlı şekilde incelenmiştir. BI 2536, volasertib (BI 6727), onvansertib (NMS-1286937) ve GSK461364 dahil olmak üzere çeşitli bileşikler, genellikle ATP-rekabetçiinhibitörler 8,9,10 olarak geliştirilip klinik denemelere sunulmuştur. Thymoquinone (TQ)11,12, Poloxin13,14 ve Allopole-A15 gibi diğer inhibitör türleri PBD'yi hedef alır. Umut verici olduğu bildirilse de, şu anda onaylanmış PBD-spesifik inhibitörler veya geç evre klinik çalışmalar bulunmamaktadır; çünkü ADMET-S özellikleri ve hedef dışı etkiler gibi zorluklarvardır 6. Örneğin, birkaç PLK1-PBD inhibitörü spesifik olmayan proteinalkilatörleri 16 olarak bildirilir ve bu da klinik uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu nedenle, potansiyel PLK1-PBD inhibitörlerinin seçicilik ve ADMET-S profillerini iyileştirmek, ilaç keşfinde kritik bir hedef olarak kalmaktadır.

Bu çalışmanın amacı, sanal tarama, yapısal benzerlik filtreleme, kenetlenme, bağlanma enerjisi hesaplamaları ve ADMET-S değerlendirmesi kullanarak ADMET-S özelliklerine sahip potansiyel PLK1-PBD inhibitörlerini incelemektir. PLK2 ve PLK3, potansiyel seçiciliği değerlendirmek için aynı protokollere tabi tutuldu. Kinaz inhibitörü keşfi için çok sayıda hesaplama boru hattı mevcut olsa da, PLK1–3 PBD'ler arasında eşzamanlı seçicilik taramasını kapsamlı ADMET-S ve kuantum-mekanik stabilite analizleriyle entegre eden çok azı vardır; özellikle doğal ürün kütüphaneleri kullanılarak. İş akışı, yerleşik sanal tarama paradigmaları üzerine inşa edilir ancak eğitim erişilebilirliği ve erken aşama hipotez oluşturma için uyarlanmıştır. Protokol yalnızca standart bir dizüstü bilgisayar (8 GB RAM), ücretsiz akademik yazılım ve önceden programlama uzmanlığı gerektirmemesi nedeniyle lise, lisans ve lisansüstü ortamlar için, kurs tabanlı lisans araştırma deneyimleri (CURE'lar) için uygundur.

Bu çalışmanın hesaplama hattı, PLK1-PBD, PLK2-PBD ve PLK3-PBD yapılarının Protein Veri Bankası'ndan (PDB) alındığı veya yapısal tutarsızlıkları gidermek için modellenip işlendiği protein hazırlama ile başlar. Sonrasında, doğal bir ürün veritabanı taraması yapıldı; bileşikler anti-meme kanseri potansiyeli ve Lipinski'nin Beş Kuralı uyumu temelinde filtrelendi. Sonraki adımlar, moleküler parmak izi ve benzerlik temelinde 50 temsilci yapıya kümelemektir. Bu temsilciler, protein-ligand kenetlenme ve bağlanma afinitesi hesaplamalarından geçerek üç PLK için etkileşim verileri üretti. Daha sonra, ADMET-S özellikleri üç farklı web sunucusu kullanılarak farmakokonetik, ilaç benzerliği, toksisite ve metabolik stabiliteyi tahmin etmek için değerlendirilir. QM hesaplamaları, HOMO–LUMO boşluğunun En Yüksek Dolu Moleküler Yörneği (HOMO) ve En Düşük Boş Moleküler Orbital (LUMO) analiziyle moleküler kararlılığı değerlendirmek için kullanıldı. Son olarak, ADMET-S verileri analiz edilerek bileşikleri fizikokimyasal, emilim, dağılım, metabolizma, salgılama, toksisite ve stabilite kriterlerine göre potansiyel ve seçici PLK1-PBD inhibitörleri olarak filtreleyip sıraladı.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kullanılan tüm yazılım araçlarının Araştırma Kaynak Tanımlayıcıları (RRID) ve sürüm numaraları Materyaller Tablosu'nda sağlanmıştır.

1. Hedef protein hazırlama

  1. Bu proje için yapısal dosyaların ve hesaplama sonuçlarının saklanabileceği bir çalışma dizini oluşturun.
  2. Protein Veri Bankası'nı ziyaret ederek hedef protein PLK1-PBD (4HCO11) tanımlayıcısını alın ve yapısal tutarsızlıkları çözmek için HARvard Moleküler Mekaniği - Grafiksel Kullanıcı Arayüzü (CHARMM-GUI 17,18) Kimya bölümünü takip edin.
    1. CHARMM-GUI adresini ziyaret edin ve akademik bir hesap kaydedin. Akademik bir hesap kaydettikten sonra, giriş oluşturucusuna, ardından PDB Okuyucu'ya tıklayın, PDB ID 4HCO'yu girin ve bir sonraki adıma tıklayın.
    2. Bir sonraki sayfada, sadece PROA – protein zinciri A'nın seçildiğinden emin olun ve sonraki iki sayfa için bir sonraki adıma tıklayın.
    3. step1_pdbreader.pdb dosyasını bir dizine indirin, dosyayı 4hco veya tercih edilen olarak yeniden adlandırın ve histidin (HSD) oluşumlarını (HIS) olarak yeniden adlandırmak için bir metin düzenleyici veya kod kullanın.
  3. PLK2-PBD (PDB tanımlayıcısı: 4XB019) için prosedürü CHARMM-GUI kullanarak tekrarlayın.
    NOT: PLK3-PBD gibi PDB tanımlayıcıları olmayan yapılar için, homoloji modelli yapılar veya Alphafold20 kullanın. Uniprot21'den dizilerin doğruluğunu garanti edin.

2. Doğal ürün veritabanı taraması

  1. SuperNatural 3.0 Kütüphanesi doğal ürünler veritabanını ziyaret edin ve hastalıklar altsayfası 22'yi seçin.
    1. Herhangi bir veya hiç güven sınırı olmayan meme kanseri seçin, çünkü tüm sonuçlar programlı olarak filtrelenmelidir ve Bul'a tıklayın. Sonuçları tercih edilen bir dizine kaydetmek için Tam sonuç dosyasını İndir'e tıklayın ve sonuçları .csv olarak kaydedebilirsiniz. Daha sonra, 0.900–1.000 güven sınırına sahip olanlar için kod ile filtreleyin (n = 73.406 üzerinden 1.193).
      NOT: Alternatif olarak, meme kanseri için Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) tanımlayıcısı yollar altsayfa 23'te girilebilir.
    2. SSS alt sayfasına gidin, alt kısımda tüm veri setini .csv dosyası olarak indirilebilir olarak bulun. Bunu indirin ve veri setinden Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES) dizelerini 1.193 molekülün SuperNatural tanımlayıcılarıyla eşleştirmek için bir script kullanın ve SMILES dizileri listesini hazırlayın (smiles.csv).

3. Küme örnekleme

  1. Neredeyse tüm açık kaynak paketleri içeren bir Anaconda dağıtımını (https://www.anaconda.com/download) indirin veya RStudio (RStudio Desktop - Posit) veya Jupyter (Jupyter Notebook) gibi entegre geliştirme ortamını (IDE) tek tek indirin. Conda kullanarak açık kaynaklı kimya ve makine öğrenimi paketi olanRDKit 24'ü kurun.
    NOT: Conda'yı kurma ve Conda ortamı oluşturma talimatları conda 25.9.2.dev31 dokümantasyonunda bulunabilir. RDKit kurulumu ve ortamda modül kurulumu için bkz. Kurulum — RDKit 2025.03.6 dokümantasyonu.
  2. "Lipinski.py" betikini Supplemental File 1'deki "smiles.csv" klasörüne yerleştirin ve çalıştırın. Script, Conda ortamını açar, modülleri yükler, SMILES dizileri dosyasını okur, biyoerişilebilirlik ve soğurma tahmini için Lipinski'nin 5 Kuralı temelinde bir filtre uygular (n = 1.193'ten 999) ve SMILES dizileri listesini "all.csv" olarak kaydeder.
    NOT: "all.csv"nin oluşturulduğunu ve ~999 bileşik (filtrelenmiş alt küme) içerdiğini doğrulayın. Her girişin geçerli bir SMILES dizisi içerdiğini doğrulamak için dosyayı açın. Python, konsolda aşağıdakileri çalıştırdıktan sonra RStudio'da çalışır: kütüphane(reticulate); Tikulat::use_condaenv(nameofcondaenv)
  3. "Clustering.py" betikini (Ek Dosya 1) "all.csv" ile aynı klasöre yerleştirin ve tercih edilen IDE'de çalıştırın. Scriptler kümeleme modüllerini yükler, SMILES dizileri dosyasını okur ve moleküler parmak izi ile Tanimoto benzerliğine göre bileşikleri 50 kümeye gruplar.
    NOT: Ek Dosya 1'de 50 temsilci yapı (rep_struct.csv) dizinde SMILES dizileri listesi olarak kaydedilmiştir. Tanimoto benzerliği (kimyainformatikte Jaccard indeksi olarak da bilinir)25 , iki molekül arasındaki yapısal benzerliği moleküler parmak izlerine göre niceltmek için kullanılan bir metriktir; Tanimoto katsayısı 0 (benzerlik yok) ile 1 (aynı parmak izleri) arasında değişir. "rep_struct.csv"in her kümeyi temsil eden tam olarak 50 benzersiz SMILES girişine sahip olduğundan emin olun.

4. Protein-ligand kenetlenme ve bağlanma afinitesi hesaplaması

  1. AutoDock Vina tabanlı boşluk algılama rehberli Kör Kenetlenme web sunucusunu (CB-Dock2)26 ziyaret edin.
    1. Docking sekmesine gidip 4HCO proteinini yükleyin.
    2. Ligandı yüklemek için draw ligand üzerine tıklayın ve SMILES dizileri listesinden bir ligand yapıştırın (rep_struct.csv, Ek Dosya 1). Daha kolay ziplenmiş veri toplamak için bir e-posta adresi girin, ardından Otomatik Kör Kenetlenme seçeneğine tıklayın. Kalan 49 küçük molekül kümesi temsilcisi için lig1, lig2, ..., lig50 olarak etiketleyerek tekrarlayın.
  2. E-posta yoluyla gönderilen sonuçlara gidip zip klasörlerini 4HCO adlı bir alt dizine indirin, onları sıradan olarak (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50) başlıklandırın.
    1. Klasörleri açın ve ".complex.pdb" ile biten protein-ligand kompleks dosyalar dışındaki tüm dosyaları çıkarın.
      NOT: Her ligand dizininin (4hco_lig1-den 4hco_lig50'a) karşılık gelen ".complex.pdb" dosyasını içerdiğinden emin olun.
    2. Bir metin düzenleyiciyle örnek .complex.pdb dosyası açın, protein zinciri kimliği P ve ligand ID'si A:UNL ile dikkatlice not alın ve dosya sıkıştırma aracı kullanarak klasörleri yeniden düzenleyin.
    3. Seçicilik ve protein-ligand bağlanmaafinitesi 27 değerlendirmek için PROtein binDing enerGY tahmin (PRODIGY) web sunucusunu ziyaret edin.
      1. PRODIGY-lig (protein-küçük molekül) sekmesine tıklayarak aynı anda birden fazla protein-ligand kompleksinin (örneğin 4hco_lig1) olduğu zipli bir klasör yükleyin. Protein zinciri ve ligand ID'lerini girin, captcha doğrulamasını tamamlayın ve Prodigy-Ligand'ı Gönder'e tıklayın.
      2. Veri işlendikten sonra, sonuçları indirmek için tüm çıktıların arşiv dosyasına (.zip) tıklayın. Önceki adımı tekrarlayın ve 4hco_lig50'a kadar olan tüm alt dizinler için sonuç toplama.
    4. 4XB0 ve PLK3 proteinleri için tüm adımları dosya isimlendirmelerine (örneğin 4xb0_lig1 veya plk2_lig1) dikkatlice dikkat ederek tekrarlayın.
      NOT: Tüm protein-ligand kompleksleri için çıktı CSV'lerin indirildiğini ve hem ΔG hem de arayüz kalıntı veri sütunlarını içerdiğini doğrulayın.

5. ADMET-S değerlendirmesi

  1. ADMETlab3 3.0 platform28'i ziyaret edin.
    1. "ADMET Screening" altında GET STARTED seçeneğine tıklayın ve SMILES listesini girin.
      1. Bir dizinde rep_struct.csv açın, SMILES dizileri listesinin tamamını metin alanına yapıştırın ve gönderin.
      2. Platformun renk kodlu puanlama sistemini kullanarak farmakokinetik ve ilaç benzerliği özelliklerini değerlendirin ve değerlendirme sonuçlarını daha fazla analiz için .csv dosyası olarak indirin.
      3. SwissADME aracı29'a geçin.
  2. Tüm 50 molekül için SMILES dizileri listesini giriş alanına yapıştırın.
    1. Çalışmak için Çalıştır seçeneğine tıklayın; biyoyararlanabilirlik ve geçirgenlik özelliklerini, BBB nüfuzunu da dahil olmak üzere.
    2. Çıktıyı diğer ADMET sonuçlarıyla entegrasyon için .csv dosyası olarak indirin.
  3. Kullanıcının işletim sistemiyle uyumlu ToxTree30'u (Karar ağacı yaklaşımıyla Toksik Tehlike Tahmini) indirip kurun.
    1. Yazılımı terminal üzerinden şu komutla açın: sh Toxtree.sh
    2. SMILES dizileri tek tek ToxTree'ye girerek toksisiteyi Cramer kurallarına göre sınıflandırın.
    3. Sonuçları diğer ADMET verileriyle entegrasyon için .csv dosyası olarak dışa aktarın.
      NOT: ADMETLab3 ve SwissADME çıktı CSV'lerinin ligand sayısıyla (n = 50) eşleşip eşleşmediğini ve Toxtree sonuçlarının her bileşiği Cramer kuralları (I–III) kapsamında sınıflandırdığını kontrol edin.
  4. ORCA31 yüklendikten sonra, çalışma dizininde stabilite adlı bir klasör oluşturun ve her molekül için alt klasörler (örneğin plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50).
    1. Her molekülü SMILES dizisinden oluşturmak için Avogadro (Avogadro) kullanın: Uzantılar sekmesine gidin ve molekülü optimize etmek için Geometriyi Optimize et'e tıklayın. ORCA Girişi dosyalarını Uzantılar > ORCA ile oluşturun > ORCA Girişi oluşturun ve aşağıdaki ayarları uygulayın:
      ! B3LYP OPT FREQ def2-TZVP
      %maxcore 4000
      %pal
      nprocs 1
      Son
    2. Her ligand için indirilen .sh iş dosyasını benzersiz iş adları ve bir e-posta adresi içerecek şekilde değiştirin. Daha sonra, "kararlılık" dizinini aşağıdaki komutları kullanarak yüksek performanslı bir hesaplama (HPC) sistemine aktarın:
      SSH xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      mkdir ~/4hco
      SCP -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
    3. İşleri Simple Linux Utility for Resource Management (HPC kümeleri için SLURM iş yükü yöneticisi) aracılığıyla bir döngü betiği ile çalıştırın:
      için i {1..50} içinde; do
      CD ~/4HCO/stability/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      bitti
    4. İş tamamlama e-postalarını aldıktan sonra, ligand klasörlerine gidin ve çıktı dosyalarını açın, verileri inceleyin ve HOMO ile LUMO değerlerini not edinin:
      CD ~/4hco/stability/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. ADMET-S verilerinin analizi

  1. SwissADME biyoyararlanabilirlik ve geçirgenlik radar haritalarından elde edilen fizikokimyasal özellikler verilerini .csv bir dosyada birleştirin.
    1. SwissADME'den .csv dosyasını kaydet ve ona "Physiochemical.csv" adını ver.
    2. "Physiochemical.py" betikini (Ek Dosya 1) "Physiochemical.csv" ile aynı klasöre yerleştirin ve çalıştırın.
    3. Aşağıdaki kriterleri uygulayın: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nStereo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4 ile 0,5, Fsp3: >0,41 ve nHet: 1–15.
  2. Absorbsiyon ve dağılım verilerini SwissADME'den türetin.
    1. Snapshot yapın ve SwissADME'de BOILED-Egg32 tablosunu kaydedin.
    2. Aşağıdaki kriterleri uygulayın: moleküller "yumurta" bölgesinde yer almalı ve p-glikoprotein inhibitörü olarak görev yapmalıdır, çünkü kırmızı noktalar tercih edilir.
  3. Sitokrom (CYP) substratı ve inhibitörler için ADMETlab3.0'dan metabolizma verilerini türetin.
    1. ADMETlab3.0'dan .csv dosyayı kaydedin ve adını "Metabolism.csv" olarak verin.
    2. .csv dosyasını düzenleyin ve sadece CYP-inh ile CYP-sub sütunlarını saklayın.
    3. "Metabolism.R" betikini (Ek Dosya 1) "Metabolism.csv" ile aynı klasöre yerleştirin ve çalıştırın.
    4. Aşağıdaki kriterleri uygulayın: CYP p450 inhibitörü ve substrat dışı kategori 0 olarak tercih edilir.
  4. Plazma temizleme ve yarı ömür için ADMETlab3.0'dan salıntı verilerini türetin.
    1. ADMETlab3.0'dan .csv dosyayı kaydedin ve adını "Excretion.csv" olarak verin.
    2. .csv dosyasını düzenleyin ve sadece cl-plasma ile t0.5 sütunlarını saklayın.
    3. "Excretion.py" betikini (Ek Dosya 1) "Excretion.csv" ile aynı klasöre yerleştirin ve çalıştırın.
    4. Aşağıdaki kriterleri uygulayın: plazma boşluğu: 0,01–5 ml/min/kg.
    5. toksisite sınıfı için Toxtree'den ve toksikofor sayısı için ADMETlab3.0'dan alınan toksisite verileri.
      1. ADMETlab3.0'dan .csv kaydedin ve adını "Toxicity.csv" olarak verin.
      2. .csv dosyasını düzenleyin, sadece Toxicophore sütununu koruyun ve her ligandın toksisite sınıfını Toxtree'den kaydeden yeni bir sütun ekleyin.
      3. "Toxicity.py" betikini (Ek Dosya 1) "Toxicity.csv" ile aynı klasöre yerleştirin ve çalıştırın.
      4. Aşağıdaki kriteri uygulayın: toksikofor sayısı 0–2 olmalıdır.
    6. Kararlılık verilerini ORCA çıkış dosyalarından türetin. ("YÖRGE ENERJİKLERI", özellikle HUMO ve LUMO enerji değerleri).
      1. Her ligandın HUMO ve LUMO enerjilerini ayrı sütunlar halinde kaydeden bir Excel tablosu oluşturun.
      2. Bant Boşluğunu hesaplayan yeni bir sütun ekleyin (HUMO–LUMO = Bant Boşluğu).
      3. Excel tablosunu "Stability.csv" olarak kaydedin.
      4. "Stability.py" betikini (Ek Dosya 1) "Stability.csv" ile aynı klasöre yerleştirin ve çalıştırın.
      5. Aşağıdaki kriterleri uygulayın: bant aralığı farkı 3,6–5 eV arasında olmalıdır.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedef protein yapı dosyası protokolü, hedef protein dosyasının analiz ve yapı tabanlı kenetlenme için optimize edilmesini sağlar. Ortaya çıkan yapı dosyası, PDB formatında, eksik kalıntılar ve hidrojenlerden, eksik atom tiplerinden ve su molekülleri ile birlikte kristalleşmiş ligandlar gibi gereksiz bileşenlerden arınmıştır. Şekil 1A,B, hazırlık öncesi ve sonrası yapılarda görsel farklılıkları (Mol* Viewer33 tarafından görselleştirilmiştir) göstermektedir. Eğer kalıntı biçimlendirme sorunları (tanınmayan atom isimleri veya eksik kalıntılar gibi) kalırsa, CB-Dock2 genellikle yükleme sırasında hata verir. Bu noktada, HSD'nin HIS olarak yeniden adlandırılması veya standart dışı kalıntıların kaldırılması gibi küçük manuel düzeltmeler uygulanabilir ve kenetlenme adımını tekrar denenmeye başlanır.

Şekil 2, moleküler parmak izi ve Tanimoto benzerliğine dayalı ana bileşen analizi (PCA) yoluyla kümelenme sonuçlarını göstermektedir. Şekilde, her küme, benzer renkli noktalar içeren gri tonlu bir oval ile gruplandırılmıştır; bu noktalar kümelerdeki molekülleri temsil eder.  Eksenler üzerindeki PCA bileşenleri 1 ve 2, Tanimoto matrislerinde yüksek boyutlu elemanlardan indirgenin iki boyutlu doğrusal temsilini sağlar. Bu çalışmada, Tanimoto benzerliği, küme örnekleme aşamasında 999 Lipinski uyumlu doğal ürün arasında tekrarı azaltmak ve kimyasal çeşitliliği artırmak için kullanılmıştır. Moleküler parmak izleri kullanılarak çift Tanimoto benzerlikleri hesaplanarak, veri seti yapısal olarak ilişkili bileşik olan 50 kümeye bölünür. Her kümeden tek bir temsilci molekül seçilir; böylece son 50 ligandlık setin geniş bir kimyasal alanı kaplaması ve aşağı akış kenetlenme ile ADMET-S analizlerinde hesaplamalı yedekliği en aza indirir. Bu strateji, özellikle SuperNatural 3.0 gibi büyük doğal ürün kütüphaneleriyle çalışırken sanal taramanın verimliliğini ve temsililiğini artırır. ( bkz. Şekil 2).

Her protein-ligand kompleksi için optimal pozlar, van der Waals kuvvetleri ve hidrojen bağları dikkate alınarak CB-Dock2'deki PLK1 proteininin beş CurPocket pozu arasında Vina skorları şeklinde tahmin edilen affinitelerle birlikte simüle edilir.  Şekil 3'teki ligand 1'in örnek simülasyonu, ikinci CurPocket pozuna (C2) en iyi bağlanmayı gösterir; en düşük Vina puanı –7,5 kcal/mol olan diğer dört üst poza kıyasla. CB-Dock2 ile moleküler kenetlenme, ampirik parametrelere ve stokastik küresel optimizasyon algoritmasına dayalı bir puanlama fonksiyonu aracılığıyla yapılır. CB-Dock2, titizlikle doğrulanmış ve diğer son teknoloji kör kenetlenme araçlarına kıyasla üstün performans göstermiştir; bu da onu kenetlenme çalışmaları için mükemmel bir seçimhaline getirmektedir 26,34. Sunucu, bağlama poz tahmininde (RMSD <2 Å) yaklaşık %85 başarı oranına ulaşır ve ilk CB-Dock versiyonu SwissDock, COACH-D ve MTiAutoDock34 gibi popüler araçları geride bırakır. Bu yüksek doğruluk, CB-Dock2'nin iki tamamlayıcı kenetlenme şemasının yenilikçi entegrasyonuna bağlanıyor: yapı tabanlı ve şablon tabanlı yaklaşımlar.

Şekil 4, PRODIGY web sunucusunun tahmin edilen affiniteleri kullanarak her protein-ligand kombinasyonu için ortalama tahmin edilen afinitelerin ısı haritasını göstermektedir.  Daha yüksek eğilimler, daha düşük azı enerjileri (kcal/mol) ve daha yeşil ısı haritası tonlarıyla belirtilir, elverişli bağlanma eğilimleridir. Buna karşılık, daha yüksek azı enerjileri ve kırmızı ısı haritası tonlarıyla belirtilen daha düşük eğilimler daha az avantajlıdır. Seçicilik açısından, hedef protein (PLK1) için homologlara (PLK2–3) kıyasla elverişli afinitelere sahip bileşiklere sahip olmak idealdir. Örneğin, ligand 27, ligand 45'e göre seçici bir PLK1-PBD ligandıdır ve ligand 45'e göre benzer eğilimler gösterir. 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 ve 49 vuruşları PLK1-PBD'ye PLK2/3'e göre daha yüksek eğilim gösterse de, kimyasal olarak 2D parmak izi alanında çeşitliliğe sahiptirler (ortalama ECFP4 Tanimoto ≈0.135, çift ≥ 0.50), bu da daha geniş özgüllüğün muhtemelen korunan PBD cep geometrisi ve paylaşılan 3D farmakofor/etkileşim desenlerinden kaynaklandığını gösterir; iskelet kimliği değil. Öneriler arasında, PLK1-PBD tanımasının yapısal belirleyicilerini belirlemek için etkileşim-parmak izi karşılaştırması ve farmakofor haritalama yer almaktadır.

Fizikokimyasal özellik değerlendirmesinin sonuçları bir Radar tablosunda gösterilmiştir (Şekil 5). Değerlendirilen özellikler arasında atomik etkileşimler, çözünürlük ve biyoyararlanılım yer almaktadır. Bazı bileşikler, kabul edilebilir aralıklarla daha arzu edilen fizikokimyasal özellikleriyle öne çıkar: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4 ile 0,5, Fsp3 > 0,41 ve nHet = 1–15. Bu radar tablosu, hesaplamalı tarama iş akışında tanımlanan 50 temsilci ligandın fizikokimyasal özelliklerinin kapsamlı ve çok boyutlu bir görselleştirmesini sağlar. Her bileşiğin önceden tanımlanmış "ilaç benzeri" kriterlere ne kadar iyi uyduğunu değerlendirmek için belirlenmiş alt ve üst sınırlara göre özelliklerini çizerek tasarlanmıştır. Grafik, kutup ekseninin etrafında düzenlenmiş on ana moleküler tanımlayıcıyı içerir; bunlar arasında pKa asidik ve pKa temel dahildir. Yeşil çokgen (Alt Sınır) ile mavi çokgen (Üst Sınır) arasındaki gölgeli alan, protokolde sağlanan eşiklere göre her bir özellik için ideal veya kabul edilebilir aralığı belirliyordu. pKa asidinin üst ve alt sınırları (2–12 ve pKa baz (3–10), ilaç keşfinde pKa için tek bir üst ve alt sınır olmadığından, literatürincelemelerine (35,36,37) dayanarak belirlenmiştir. Her renkli çizgi 50 liganddan birini temsil eder. Tek bir ligand için veri noktalarının bağlanmasıyla oluşan şekil, seçilen on özellik boyunca profilini aynı anda gösterir. 50 ligandın büyük çoğunluğu, yeşil ve mavi çokgenlerle tanımlanan kabul edilebilir bölge içinde veya çok yakınında yer alır. Bu, ilk filtreleme adımlarının, özellikle Lipinski'nin Beş Kuralı'nın uygulanması ve Tanimoto benzerliğine dayalı kümelemenin, veri setini uygun ilaç benzeri özelliklere sahip moleküllerle zenginleştirmede son derece etkili olduğunu gösteriyor. Tüm parametreler için belgelenmiş değerlerin tam aralığının tasviri önerilir.

Şekil 6A–C, ADMETlab3.0 ve SwissADME'den alınan ADME verilerinin bileşenlerini göstermektedir. Emilim ve dağılımdan başlayarak, SwissADME'den Şekil 6A'daki BOILED-EGGmodeli 38, grafikteki sarı ve beyaz üç nokta işaretleriyle gösterildiği gibi, ilaçların lipofililik ve geçirgenlik yoluyla emilimini ve dağılımını temsil etmektedir. P-gp substratları ve inhibitörleri içerir; bunlar sırasıyla mavi ve kırmızı noktalarla temsil edilir; burada P-gp inhibrelenmesi daha yüksek emilim oranları için kritik öneme sahiptir. Şekil 6B'de, metabolizma ısı haritası yaklaşık 7 CYP sitokrom p450 enzim çeşitinin inhibisyonunu ve substratını görselleştirir. Ligandlar için istenen sonuç, CYP non-inhibitörü ve substrat dışı (yeşil) olarak hizmet vermesidir; tercih edilen sonuçlar, ilaç-ilaç etkileşimleri olmayan/düşük olan güvenli ilaç güvenlik profilini doğrular. Şekil 6C, ilacın temizlenmesi ve yarı ömrünün dışlanması verilerini göstermektedir. Salgılama, optimal plazma klirensi (<5 mL/min/kg) ile ayırt edilebilir. Tüm antikanser ilaçların yarı ömrü ilacın etki mekanizmasına, toksisitesine ve hedefine bağlıdır. İdeal yarı ömür, ilaç konsantrasyonlarını bir terapötik pencere içinde tutarken toksisiteyi en aza indirir ve uygun dozlamaprogramlarına olanak tanır 39,40.

İki tür toksisite değerlendirmesinin birleşimi tasvir edilmiştir. Şekil 7A'da, ADMETlab3.0 tarafından tanımlanan toksikofor sayısı her ligand için gösterilmiştir.  Toksikoforların kabul edilebilir aralıkları hakkında kesin bir eşik veya bilgi yoktur.  Şekil 7B'de, Toxtree uygulaması toksisite sınıfı (I-III) ile Cramer Kuralı ihlalleri ve uyumu ile ilgili bilgiler sağlar. Ligand 1 için örnek sonucu toksisite sonuçlarını ve SMILES kodunu üst çubukta, yapıyı ise sol alt pencerede gösterir. Sağ üst penceredeki sınıf toksisitesi tanımlaması, ligand 1 için Cramer Kurallarına dayanarak yüksek toksisiteyi (Sınıf III) gösterir; diğer olasılıklar gibi Sınıf II (orta toksisite) veya Sınıf I (düşük toksisite) gibi olasılıklardan farklıdır.  Sağ alt pencere, Cramer'ın Kuralı karar ağacına dayalı sınıf tanımlamasının yazılı gerekçesini gösterir.

ORCA QM olarak optimize edilmiş yapılar için titreşim frekansı hesaplamaları, bant boşluğunun belirlenmesi için yörünge enerji değerlerini hesaplar. Şekil 8 , HOMO ve LUMO arasındaki farktan türetilen her ligandın bant boşluğunu (eV) göstermektedir. Eşik aralığı, gölgeli bölgede 3.6 eV ile 5.0 eV arasında temsil edilir; burada gölgeli bölgedeki her nokta, daha arzu edilen bir kararlılık ve tepkiye sahip enerji seviyelerini sağlar. Tüm hesaplama iş akışının genel bir özeti, hedef protein hazırlanması ve doğal ürün veritabanı taramasından ADMET-S değerlendirmesine kadar ardışık aşamaları gösteren Şekil 9'da özetlenmiştir; bu aşamalar, seçici PLK1-PBD inhibitörlerini tespit ederken ilaç benzeri özellikleri ve kimyasal stabiliteyi sağlamak için tasarlanmıştır. Bu görsel yol haritası, protokolün modülerliğini, erişilebilirliğini ve eğitim uygulamasına uygunluğunu vurgular.

Tablo 1, protokolü doğrusal bir komut dizisinden sınıf ve bağımsız araştırma kullanımına uygun, sağlam, hata farkında bir boru hattına dönüştürerek operasyonel hale getirir. Hesaplamalı ilaç keşfinde bilinen bir zorluk olan tekrarlanabilirliği açıkça ele alır ve doğrulama kriterlerini ana geçiş noktalarına yerleştirir. Örneğin, CHARMM-GUI işleminden sonra histidin kalıntılarının "HIS" olarak eşit şekilde etiketlendiğini doğrulamak, aşağı akış kenetlenmesinde sessiz arızaları önlerken, kümelenmeden önce SMILES bütünlüğünün doğrulanması ADMET tahmininde zincirleme hataları önler. Tablo ayrıca pedagojik tasarımı da vurguluyor; her sorun giderme ipucu, minimum hesaplama geçmişiyle uygulanabilir (örneğin, "zincir kimliklerini kontrol etmek için metin düzenleyicide .complex.pdb aç"), bu da el yazmasının işitmete, lisans/lisansüstü ve lise öğrencileri için erişilebilirlik hedefiyle uyumludur. Ayrıca, sonuçların orantısız şekilde sonuçları etkilediği adımları işaretleyerek, örneğin karşılaştırmalı PRODIGY puanlama ile seçicilik değerlendirmesi gibi, tablo kullanıcıların dikkat ve kaynakları önceliklendirmesine yardımcı olur.

Bu entegre iş akışının temel gücü, tamamlayıcı hesaplama tahminleri arasındaki tutarsızlıkları ortaya çıkarabilme yeteneği ve herhangi bir yöntemin sınırlamalarını vurgulayan uç durumları ortaya çıkarmasıdır. Örneğin, PLK1-PBD için ligand 5, güçlü bir CB-Dock2 Vina skoru (−7.9 kcal/mol) ve olumlu PRODIGY affinitesi (ΔG = −9 kcal/mol, Şekil 4) gösterse de, birkaç ADMET filtresinden geçemedi. BOILED-Egg emilim-dağılım modeline uymuyordu, daha az arzu edilen plazma temizleme değerini (9.3 mL/m/kg, Şekil 6) gösterdi; bu da hızlı eliminasyonu öneriyordu ve Toxtree tarafından beş toksikofor içeren Cramer Sınıf III (yüksek toksisite) olarak sınıflandırıldı (Şekil 7A). Buna karşılık, ligand 33 orta düzeyde PRODIGY tarafından tahmin edilen PLK1 afinitesi (−5.4 kcal/mol) gösterdi ancak tüm ADMET kriterlerini karşıladı; düşük toksisite (Sınıf I), optimal LogP (0.7) ve olumlu emilim-dağılımı ile plazma klirensi gösterdi. Daha zayıf eğilimine rağmen, ligand 33 daha uyuşturucu benzeri bir adaydır. Bu karşıtlık, erken aşama ilaç keşfinde temel bir prensibi gösterir: yüksek bağlanma afinitesi tek başına yeterli değildir, uygun farmakokinetik ve güvenlik olmadan. Aynı zamanda, ligand 5 gibi bileşikler, düşük ADMET performansına sahip olsalar da, potansiyel zarar vermeden güvenlik veya metabolik stabiliteyi artırmak için gelecekteki optimizasyon için değerli iskelet fikirleri sunabilir.

Bu iş akışındaki erken filtreler kalıcı dışı bırakmak yerine önceliklendirme ve önceliklendirme için tasarlanmış olsa da, 50 adayın daha da sadeleştirilmesi, ADMET araçları ve literatürden elde edilen istenen sınırlar uygulanarak bazılarını "en iyi isabetler" olarak tanımlıyor. 114 ADMET ile ilgili ve elektronik tanımlayıcı arasında değerlendirilen 50 taranmış liganddan 13'ü en az 95 tercih edilen özellik kriterini karşıladı. Bunlar arasında, altı bileşik (10, 13, 14, 32, 43 ve 47) hem ADMET-S profillerinin olumlu olduğunu hem de PLK1-PBD için PLK2/3'e göre daha yüksek bağlanma afiniteleri göstermiş ve bu nedenle en iyi aday inhibitörler olarak belirlenmiştir (Şekil 10). Karşılaştırmalı yapısal-fonksiyonel ve nicel benzerlik analizleri, tespit edilen isabetlerin bilinen PLK1-PBD inhibitörleriyle ortak önemli farmakoforik özellikleri paylaştığını ve bağlanma davranışında potansiyel yakınsamaya işaret ettiğini ortaya koydu. Tüm isabetler, TQ, Poloxin ve Allopole-A'nın hidrofobik halka sistemlerini yansıtan aromatik veya heteroaromatik iskeleler içeriyordu ve PBD cebinde π–π ve hidrofobik etkileşimlere olanak sağlıyordu. Fonksiyonel örtüşme, referans inhibitörlerdeki ana kutup temaslarını aracı kılan koruma hidrojen bağ motifleri (karboksil, amid ve karbonil grupları) aracılığıyla ortaya çıktı. Esnek alifatik ve döngüsel bağlantıcılar, birkaç vuruşta bulunan Poloksin analoglarının konformasyonel uyumlanabilirliğine paralel olarak temel bağlanma kalıntılarına doğru yönlendirmeyi kolaylaştırır. Kantidal olarak, Tanimoto benzerlik skorları (0,36–0,54), vuruşlar ile bilinen inhibitörler arasında orta düzeyde yapısal benzerliği doğruladı; Atışlar 10, 13 ve 14 en çok Poloxin'e, Hit 32 TQ'ya, Hit 43 ve 47 ise Allopole-A'ya benziyordu. Bu sonuçlar toplamda, yapısal ve fonksiyonel bir örtüşmeyi ortaya koymakta olup, vuruşların muhtemelen doğrulanmış PLK1-PBD inhibitörlerinin bağlanma topolojisi ve etkileşim desenlerini taklit ettiğini ve daha fazla optimizasyon için yeterli yeniliği koruduğunu gösteriyor (Şekil 10).

Hesaplama iş akışının sağlamlığını değerlendirmek için, bilinen PLK1-PBD inhibitörleri (Poloxinpan 14 ve Allopole-A15) pozitif kontrol olarak analiz edildi; ADMET-S, kenetlenme ve bağlanma afinite analizlerinde Metformin ve Imeglimin (yapısal olarak ilişkisi olmayan iki antidiyabetik ajan) negatif kontrol olarak değerlendirildi. Pozitif kontrol kontrolleri sırasıyla –5.8 ve –5.6 kcal/mol bağlanma eğilimleri gösterirken, negatif kontroller daha zayıf olan –5.1 kcal/mol (Metformin) ve –4.8 kcal/mol (Imeglimin) eğilimleri gösterdi ki, bu da PBD'ye bağlanma aktivitelerinin eksikliğiyle uyumludur. İlginç bir şekilde, ADMET-S değerlendirmesi negatif kontrollerin pozitif kontrollere (114 özellikten 88'i) göre daha arzu edilen tanımlayıcıları (114 özellikten 88'i) sağladığını ortaya koydu; bu da iş akışının farmakokinetik olağlılığı hedefe özgü bağlanma potansiyelinden ayırt etme yeteneğini doğruladı. Bu bağlar, dengeli bir bakış açısının korunmasının önemini vurgular: bileşikler, güçlü hedef yakınlığı gösterirlerse, yalnızca optimal olmayan ADMET tahminleri temelinde erken atılmamalıdır; çünkü bu tür iskeleler optimizasyon için değerli başlangıç noktaları sunabilir. Buna karşılık, mükemmel farmakokinetik özelliklere sahip ancak zayıf bağlanma özelliğine sahip moleküller, analog gelişim için düşük riskli şablonlar olarak hizmet edebilir. Bu hesaplamalı gözlemleri doğrulamak ve önceliklendirme kriterilerini geliştirmek için daha fazla biyokimyasal ve hücresel doğrulama gerekmektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Hazırlıksız ve CHARMM-GUI tarafından hazırlanmış bir 4HCO yapısı arasındaki yapısal karşılaştırmalar. (A) PDB'den doğrudan yüklenen 4HCO yapısı, eksik kalıntıları vurgular. (B) CHARMM-GUI hazırlık protokolüne göre 4HCO yapısı. 4HCO (PLK1-PBD TQ'ya bağlanmış), organik ligand bağlanmış az sayıdaki PLK1-PBD kristallerinden biri olduğu için seçilmiştir ve bu da yapıya dayalı küçük molekül inhibitör keşfine doğrudan uygulanabilir hale gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Moleküler parmak izi ve Tanimoto benzerliğine dayalı K-means kümelenmesi sonrası 999 Lipinski uyumlu doğal ürünün ana bileşen analizi (PCA). Her nokta, atanan küme (1–50) ile renklendirilen bir bileşiği temsil eder; kümeler kimyasal benzerliği vurgulamak için gri üç noktalarla gruplanır. Kümeler içindeki sıkı kümelenme ve kümeler arasındaki ayrım, Tanimoto tabanlı kümelemenin veri setinde kimyasal çeşitliliği korurken yapısal yetmezliği başarıyla azalttığını göstermektedir. Bu çeşitlilik, aşağı akış kenetlenmesi için seçilen 50 temsilci ligandın geniş bir kimyasal alan bölgesini kapsaymasını sağlayarak sanal tarama sonuçlarının sağlamlığını ve genellenebilirliğini artırır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: CB-Dock2 kör kenetlenmesi, PLK1 polo-box alanı (PBD) içinde ligand 1'in yüksek affiniteli bağlama pozisyonunu tanımlar. Gösterilen CurPocket C2 konformasyonu (Vina skoru = −7,5 kcal/mol), van der Waals temaslarının elverişli ve temel PBD kalıntılarıyla hidrojen bağları ile karakterize edilen beş tahmini bağlanma noktası arasında optimal pozu temsil eder (Trp414, His538 ve Lys540). Bu sonuç, birlikte kristalize olmuş ligand olmadan biyolojik olarak ilgili bağlanma ceplerini bulmak için yapı tabanlı kör kenetleme kullanımını doğrulamaktadır ve iş akışının en güçlü tahmin edilen bağlanma enerjisine sahip pozları aşağı akış seçicilik analizi için nasıl önceliklendirdiğini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: PRODIGY web sunucusunun protein-ligand kombinasyonlarıyla öngörülen afinitelerin ısı haritası. Isı haritası, PLK1, PLK2 ve PLK3 ile bağlı olduğunda ligandlar arasındaki örtüşmeyi doğrudan ele alır. Bazı ligandlar (ligand 45 dahil) üç PLK izoformu arasında benzer bağlanma afiniteleri gösterir ve bu zayıf seçiciliği gösterirken, diğerleri (özellikle ligandlar 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 ve 49) güçlü PLK1 tercihi gösterir (ΔΔG ≥ 3.0 kcal/mol ile PLK2/PLK3), bu da PBD-seçici inhibitisyon hedefiyle uyumludur. Nicel olarak, 50 ligandın 20'si, PRODIGY tarafından tahmin edilen ΔG değerlerine dayanarak hem PLK2 hem de PLK3 üzerinde PLK1 için neredeyse 2 kat seçicilik gösterir. Bu diferansiyel bağlanma, kör kenetlenme protokolünün yakaladığı PBD bağlanma ceplerindeki ince varyasyonlara atfedilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: ADMETlab3.0 ve Swiss ADME'den birleştirilmiş fizikokimyasal özelliklerin temsili. Parametreler şunlardır: nHD = Hidrojen Donörleri sayısı, nHA = Hidrojen Alıcı sayısı, bazi pKa, asidik pKa, nStereo = Stereocenter sayısı, LogP = n-oktanol/su dağılım katsayısı, LogD = pH=7.4 seviyesinde n-oktanol/su dağılım katsayısı, LogS = sulu çözünebilirlik değeri, Fsp3 = sp3 hibritleşmiş karbon sayısı/toplam karbon sayısı ve nHet = heteroatom sayısıdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: ADMETlab3.0 ve SwissADME'den alınan ADME sonuçlarının birleşimi. (A) Wildman-Crippin LogP (WLOGP) arasındaki BOILED-EGG tablosu vs. SwissADME'den topolojik kutup yüzey alanı (TPSA), sarı (sarı) bölgede soğukluk ve dağılım kan-beyin bariyeri (BBB) geçirgenliğini, beyaz ellipsde gastrointestinal yol yoluyla emilimi (HIA), mavi ve kırmızı noktalarda P-glikoprotein substratları ve substrat olmayanları temsil eder. "Yumurta"nın dışında bulunan moleküllerin emilim ve dağılımı zayıf kabul edilir. (B) İnsan Karaciğer Metabolizması (HLM) stabilitesini içeren çeşitli Sitokrom P450 (CYP) tanımlayıcılarıyla metabolizmanın ısı haritası; burada kırmızı inhibitör/substrat olarak, yeşil ise inhibitör olmayan/substrat olmayan unsur olarak hizmet verir, yeşil ise arzu edilir olarak kalır. (C) Söküntü, parametreleri, plazma boşalmasını ve yarı ömrü içerir. Noktalı kırmızı çizgi istenen plazma boşluğunu (<5 mL/min/kg) gösterirken, 5-15 mL/min/kg ve >15 mL/min/kg sırasıyla orta ve yüksek boşluğu gösterir.  Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Entegre toksisite profili, taranan ligandlar arasında kritik güvenlik sorumluluklarını ortaya koymaktadır. (A) ADMETlab3.0 tarafından öngörüldüğü gibi, toksikofor sayılarının 50 temsilci doğal ürün arasında dağılımı. (B) Ligand 1 için numune toksisite sonuçları, kırmızı renkle vurgulanmış Sınıf III toksisitesini göstermekte ve aşağıdaki metin kutusunda belirtilen ilgili Cramer Kurallarının ayrıntılı açıklamasıyla birlikte. Bu çift değerlendirme yaklaşımı (toksikoforlar + Cramer sınıfı), yüksek riskli bileşiklerin erken triyajını mümkün kılar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: 50 temsil eden doğal ürün türeden türetilmiş ligand için HOMO–LUMO bant boşluk enerjileri (eV cinsinden), B3LYP/def2-TZVP teori seviyesinde ORCA kullanılarak hesaplanmıştır. Gölgeli bölge (3,6 ila 5,0 eV) optimal stabilite penceresini gösterir: 3,6 eV'nin altındaki bant boşlukları yüksek kimyasal reaktivite veya potansiyel fotodegradasyonu gösterirken, 5,0 eV'nin üzerindeki değerler zayıf elektronik polarizasyon ve azalmış bağlanma uyum yeteneğini gösterebilir. Bu aralık içinde bulunan ligandlar, kinetik stabilite ve moleküler yanıt arasında olumlu bir denge sergiler; bu da potansiyel PLK1-PBD inhibitörü adayları olarak önceliklendirilmesini destekler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: İki dilli hesaplamalı ilaç keşfi iş akışının akış şeması. Pipelin, PLK1-PLK3 PBD yapılarının hazırlanmasıyla başlar, ardından SuperNatural 3.0 veritabanının hastalık odaklı taraması ve Lipinski'nin Beş Kuralı (moleküler ağırlık ≤ 500 Da, hidrojen bağ donörleri ≤ 5, kabul ediciler ≤ 10, LogP ≤ 5) ile filtrelenir. Temsilci bileşikler kümelenmeden sonra seçilir ve protein-ligand kenetlenmesi, bağlanma afinitesi tahmini ve absorpsiyon, dağılım, metabolizma, salgılanma, toksisite ve QM stabilite değerlendirmesi dahil kapsamlı ADMET-S profilleme ile değerlendirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 10: En üst aday ligandlar ile bilinen PLK1-PBD inhibitörleri arasında karşılaştırmalı yapısal-fonksiyonel örtüşme. Şekil, sanal tarama, kümeleme, bağlanma eğilimi ve ADMET-S profilleme analizlerinden belirlenen en önemli altı aday bileşiği (10, 13, 14, 32, 43 ve 47) vurgulamaktadır. Bu ligandlar, 114 istenen fizikokimyasal ve farmakokinetik tanımlayıcıdan en az 95'ini karşıladı ve PLK2/3'e kıyasla PLK1-PBD için daha yüksek bağlanma afiniteleri gösterdi. Potansiyel yapısal ve fonksiyonel yakınsamayı değerlendirmek için, her ligand, ortak çekirdek farmakoforik motifler ve çift Tanimoto benzerlik katsayıları (ECFP4 parmak izleri) temelinde bilinen PLK1-PBD inhibitörleri TQ, Poloxin ve Allopole-A ile karşılaştırıldı. Orta derecede benzerlik puanları (0,36–0,54) ve aromatik veya heteroaromatik halkalar, hidrojen-bağ donör/alıcı çiftleri ve hidrofobik bağlantıcılar gibi yaygın fonksiyonel gruplar, bağlanma özelliklerinde kısmi örtüşme olduğunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

İş akışı aşamasıAra kontrol noktası (başarıyı nasıl doğrular)Kritik adım (başarı/başarısızlık neden belirler)Yaygın sorunlar ve sorun giderme rehberi
1. Hedef Protein Hazırlığı• PDB dosyası Mol* Görünümü'nde hatasız yüklenir.
• Bağlama cebinde eksik kalıntı yok (görsel inceleme).
• "HIS" olarak etiketlenmiş histidin kalıntıları (HSD/HSE değil)		Yanlış protein yapısı → yanlış bağlanma cepleri → yanıltıcı kenetlenme pozları. CHARMM-GUI, doğru protonasyon, hidrojen yerleşimi ve su/ligandların uzaklaştırılmasını sağlar.Sorun: CB-Dock2 PDB dosyasını reddediyor. Çözüm: Standart dışı kalıntıları kaldırın, sadece protein zincirinin var olduğundan emin olun ve atom/kalıntı isimlerini metin düzenleyici kullanarak standartlaştırın.
2. Doğal Ürün Filtreleme (Lipinski'nin 5 Kuralı)• "all.csv" yalnızca geçerli GÜLÜMSEMELER içerir (boş olmayan, kimyasal olarak ayrışılabilir).
• Beklenen eşleşmeleri sayın (örneğin, 999/1.193).		Geçersiz SMILES, RDKit, kenetlenme sunucuları ve ADMET araçlarını çöker. Filtreleme kimyasal geçerliliği korumalıdır.Sorun: Script kümeleme sırasında başarısız oluyor. Düzeltme: Python'da Chem.MolFromSmiles(smiles, sanitize=True) kullanarak SMILES doğrulaması ekleyin; geçersiz kayıtları kaydedip kaldırmadan önce devam edin.
3. Küme Örnekleme• "rep_struct.txt"de 50 benzersiz GÜLÜMSEME.
• PCA grafiki (Şekil 2) net küme ayrımı gösterir.		Zayıf kümeleme → gereksiz veya çeşitli olmayan temsilciler verimsiz taramaya →.Sorun: Tüm moleküller tek bir grupta kümelenir.
Çözüm: Parmak izi tipini (örneğin, Morgan/ECFP4), Tanimoto eşiğini ve SMILES standartlaştırmasını doğrulayın. Çeşitlilik düşükse, küme sayısını artırmayı düşünün.
4. Protein-Ligand Kenetlenmesi (CB-Dock2)• Her ligand ≥1 ".complex.pdb" dosyası döndürür.
• Vina puanları negatiftir (örneğin, ≤ −5 kcal/mol).
• Ligand CurPocket'te konumlanır (yüzey değil).		Kenetlenme bağlama pozisyonu ve yakınlığı tanımlar. Yanlış poz → yanlış PRODIGY tahminleri.Sorun: İş başarısız oluyor ya da ligand kesilmedi. Düzeltme: CB-Dock2'de ligandı SMILES kullanarak yeniden çiz; dosya adında özel karakter olmamasını sağlamak; İş durumu için e-posta adresini doğrulayın. Eğer ısrarcıydıysanız, yedek olarak SwissDock'u deneyin.
5. Bağlayıcı Yakınlık (PRODIGY)• PRODIGY, tüm kompleksler için ΔG değerlerini döndürür.
• Eğilimler, CB-Dock (Vina) puanlarıyla (trend tutarlılığı) korelasyonludur.		Seçicilik değerlendirmesi, PLK1 ile PLK2/PLK3 arasındaki doğru ΔG'ye bağlıdır. Yanlış atanmış zincir/ligand kimlikleri yanlış tahminler →.Sorun: "Zincir bulunamadı" hatası. Düzeltme: .complex.pdb'yi bir metin düzenleyicide açın; protein zinciri kimliğini (örneğin, "P") ve ligand kalıntı adını (ör. "UNL") doğrular; PRODIGY'de doğru giriş yapın.
6. ADMET-S Değerlendirmesi• Tüm 50 SMILES sonuçları SwissADME, ADMETlab3.0 ve ToxTree'de döner.
• Çıkış CSV'lerinde "N/A" veya "Hata" satırları yok.		Tutarsız ADMET verileri → hatalı aday sıralaması. Platformlar, egzotik doğal ürün iskelelerinde arızalanabilir.Sorun: ADMETlab3.0 SMILES'ı reddediyor. Düzeltme: RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...)) kullanarak SMILES'i kanonikleştirin. ToxTree için her seferinde bir molekül girin ve yapı renderasyonunu doğrulayın.
7. Kuantum Kararlılığı (ORCA)• Her ORCA işi "SCF yakınsamadı" veya "geometri hatası" olmadan tamamlanır.
• HOMO/LUMO değerleri çıktı (.out) dosyasında bulunur.		Bant aralığı kimyasal kararlılık/reaktiviteyi belirler. Başarısız işler = anahtar filtre için eksik veri.Sorun: ORCA işi çöküyor. Çözüm: Avogadro'da geometriyi yeniden optimize et; tekrarlanan atomların olmadığından emin ol; %maxcore artırmak veya büyük moleküller için def2-SVP bazına geçmek önemlidir.
8. Entegre ADMET-S Filtreleme• Ligandların nihai listesi tüm kriterleri karşılıyor (örneğin, LogP 0–3, bant aralığı 3.6–5 eV, Cramer Sınıf I/II).
• ≥1 ligandı PLK1 seçiciliğini gösterir (ΔΔG ≥ 2 kcal/mol vs. PLK2/3).		Aşırı katı veya tutarsız eşikler, geçerli ipucuları ortadan kaldırır; Çok esnek eşikler toksik/kararsız bileşikleri artırır.Sorun: Hiçbir ligand tüm filtrelerden geçmiyor.
Çözüm: Bir kriterin gevşetilmesini (örneğin, LogP'nin 4 veya 3 toksikofora ≤ izin vermesi) ve takasları belgeleyin. Karşılaştırma için bilinen ilaçlarla karşılaştırın.

Tablo 1: Seçici PLK1-PBD inhibitörlerinin belirlenmesi için sekiz aşamalı iki dilli hesaplama iş akışında kritik kalite kontrol kontrol noktaları, yüksek etkili karar noktaları ve sorun giderme stratejileri. Her satır, protein hazırlamadan entegre ADMET-S filtrelemesine kadar ana bir protokol aşamasına karşılık gelir ve (i) başarılı tamamlamanın nasıl doğrulanacağını (ara kontrol noktası), (ii) adımın neden genel başarı veya başarısızlık için kritik olduğunu (kritik adım gerekçesi) ve (iii) yaygın teknik arızalara pratik çözümleri (sorun giderme rehberliği) belirtir. Bu tablo, protokolü akademik veya kaynak kısıtlı ortamlarda uygulayan öğrenciler ve araştırmacılar için hem bir doğrulama yol haritası hem de bir öğretim yardımcısı olarak hizmet verir.

Ek Dosya 1: Python betikleri. Lipinski kural uygulaması için Python betiklerini içerir; küme analizinde kullanılan Python betikleri; fizikokimyasal özellik hesaplamaları için Python scripti; metabolizma analizi için R alfabesi; Boşaltma analizi için Python beti; toksisite tahmini için Python beti; kararlılık değerlendirmesi için Python betikleri; ve analiz edilen 50 bileşiğin SMILES telleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, sanal tarama, kenetlenme ve ADMET-S analizi yoluyla potansiyel PLK1-PBD inhibitörlerini belirlemek ve değerlendirmek için keşif amaçlı bir hesaplama iş akışına odaklanmaktadır. Bu boru hattı, tahmin edilen bağlanma eğilimleri ve farmakokinetik özelliklere dayalı olarak bileşikleri etkili bir şekilde önceliklendiriyor. Bu protokolde, olası PLK1 inhibitörleri seti tanımlanır ve bunların ADMET özellikleri ile PLK1–3 proteinlerine bağlanma eğilimleri değerlendirilir. Protokol, yaklaşık 73.400 molekül veritabanından 50 molekülü tanımlamak için hastalık odaklı bir yaklaşım kullanır (Şekil 9). Daha sonra, bu 50 molekül ADMET-S değerlendirmesine tabi tutuldu ve bu değerlendirmede farmakokinetik ve farmakodinamik özellikleri, ilaç benzerlikleri ve stabiliteleri hesaplandı. Ayrıca, PLK1–3 proteinlerine bağlanma afiniteleri hesaplanarak PLK1'e karşı inhibitör güçleri ve selektiflikleri değerlendirildi. Sonuçlara dayanarak, birkaç molekül daha arzu edilen özellikler gösterdi. Sonraki ilaç keşfi çalışmaları, bazı molekülleri elemeyi seçip bu araştırmadan birkaç parçaya odaklanabilir veya erken elemeden kaçınarak bu sonuçları ilaç tasarım sürecinde ADMET özelliklerini optimize etmek için daha sonra kullanabilir.

PLK1, PLK2 ve PLK3'e odaklanmanın biyolojik gerekçesi, PLK4 ve PLK5'i hariç tutmanın hem yapısal hem de işlevsel değerlendirmelerine dayanır. PLK4 ve PLK5, PLK1'den belirgin yapısal ve fonksiyonel farklılıkları ve kanser tedavisiyle sınırlı ilgileri nedeniyle bu çalışmadan çıkarılmıştır. PLK1, kinaz alanı ve polo-box alanı (PBD) ile karakterize edilir ve mitotik olayların düzenlenmesinde kritik bir rol oynar ve kanser tedavisinde önemli bir hedefhaline gelir 41. Buna karşılık, PLK4 ve PLK5 yapısal olarak birbirinden ayrılır: PLK4, kanonik bir PBD yerine gizemli bir polo-box (CPB) içerir ve esas olarak merkez çoğaltma ile çalışır. Aynı zamanda, PLK5 fonksiyonel kinaz alanına sahip değildir ve neredeyse tamamen beyindeifade edilir 3. PLK1-PBD ile minimal yapısal örtüşmeleri ve kanserde mitotik düzensizlikle sınırlı ilgileri göz önüne alındığında, dahil edilmeleri PLK1-PBD inhibitörleri için seçiciliği anlamlı şekilde bilgilendirmez. Bu nedenle, tarama stratejisi, seçiciliği değerlendirmek için biyolojik olarak ilgili ve hesaplamalı bir çerçeve sunar. Önemli olarak, en önemli altı aday ligand (10, 13, 14, 32, 43 ve 47), bilinen inhibitörler TQ ve Allopole-A'dan daha elverişli bağlanma enerjileri ve ADMET-S profilleri göstererek, potansiyel PLK1-PBD modülatörleri olarak öne çıkarıldılar.

Özellikle hesaplamalı ilaç keşif araçlarına yeni başlayan öğrenciler veya araştırmacılar tarafından sağlam uygulamayı desteklemek için, ana kontrol noktalarının özeti (yine Protokol bölümünde), kritik adımlar ve iş akışı için sorun giderme rehberi Tablo 1'de sunulmaktadır. Tablo uyum sağlar; örneğin, bir kullanıcı HPC erişimi yoksa, ORCA kararlılık analizinin ertelenebildiğini not edebilir ve bir web sunucusu kapalıysa SwissDock gibi alternatifler önerilir. Bu esneklik, iş akışının çeşitli kurumsal bağlamlarda sürdürülebilir kalmasını sağlarken, bilimsel titizliği korur ve çalışmanın erken aşama ilaç keşfine kapsayıcı, iki dilli ve eğitim odaklı bir katkı olarak yeniliğini pekiştirir. Tüm iş akışı entegre bir boru hattı olarak tasarlanmış olsa da, birkaç kritik adım başarısını veya başarısızlığını temel olarak belirler ( bkz. Tablo 1). Ayrıca, eşlik eden videoda senkronize İngilizce altyazılar ve dikkat dağıtıcı olmadan eşit erişim sağlamak için tasarlanmış Amerikan İşaret Dili (ASL) işaretçisi yer alıyor. İmzalayıcının talimatları ekrandaki eylemlerle zamansal olarak hizalanmıştır; örneğin "next" işareti yapıp imleç "Next" butonuna tıkladığında duraklatır. 4HCO hazırlık aşamasında, imzacı, zincir seçimini yönlendirmek için parmak etiketlemesi ("A" ve "B") kullanır ve bu ekran kaydında tam olarak yansıtılır. SuperNatural 3.0 tarama bölümünde, imzacının penceresi yeniden boyutlandırılır ve sağa üst tarafa hareket eder, dikkati "yol" simgesine yönlendirir, imleç takip ederken duraklar. Bu tasarım tercihleri, işitme engelli ve işitme engelli izleyicilerin işitme kullanıcılarıyla aynı bütün, gerçek zamanlı rehberliği almasını sağlar ve böylece yüz yüze, eğitmen liderliğindeki laboratuvar deneyimini etkili bir şekilde taklit eder.

Faydalarının yanı sıra, iş akışını iyileştirmenin birçok yolu vardır. İlk olarak, ilk filtreleme değiştirilebilir; Hastalık odaklı ve küme örnekleme yöntemleri yerine, ligand-hedef protein bağlanması için en uygun bileşiklerin belirlenmesi için doğal ürün veritabanındaki tüm moleküllerin birbirine bağlanması simülasyonlarıyla başlanabilir. Ayrıca, bağlanma ayakınlığının doğru tahmini için daha ayrıntılı tahminler gereklidir.  PRODIGY'nin protein-ligand affinitesinin "elektrostatik olmayan" hesaplamaları, etkileşimde yer alan kategorize edilmiş atomik temas türlerinin (Karbon-Karbon, Azot-Azot, Oksijen-Oksijen ve diğer atomlar) sayısını, 4 kat çapraz doğrulama ile eğitilmiş çoklu doğrusal regresyon modeline uydurmayı içerir ve bu yöntem çeşitli durumlarda deneysel eğilimlerle anlamlı şekilde korelasyongöstermiştir (42,43).  FoldX44, fastDRH45, derin öğrenmemodelleri 46 ve gelişmiş örnekleme ile MD gibi alternatif yaklaşımlar kullanılabilir ve her yöntemin doğruluğuna bağlı olarak tahminlerde farklı derecelerde uyumbeklenmektedir 47.

Bir diğer yön ise, ADMET-S değerlendirmesinde kullanılan çeşitli yazılım araçlarının çok sayıda metrik üretmesidir ve ilaç adaylığını değerlendirmek için kullanılan her bir ölçütü anlamak hayati öneme sahiptir. Doğruluğu sağlamak için bir yol, piyasadaki birkaç ilacın eşikleri nasıl karşıladığını belirlemek için protokole tabi tutulmak olabilir.  Bu bağlamda, toksisite, daha fazla araştırma gerektirir; çünkü moleküller yalnızca Cramer's Rules gibi nüanslı karar ağaçlarından alınan toksisite profillerine dayanarak atılmaz; çünkü kullanılabilir birçok ilaç benzer sınıflandırmaya sahiptir.  Toksikofor sayısı, toksisite profilleriyle birlikte bile toksisite konusunda tam olarak bilgilendirici değildir.  Bu bağlamda, bu iş akışının bir uzantısı olarak, küçük moleküllü örneklerin mevcut ilaçlarla karşılaştırmalı incelemeleri yapılarak yorumları bilgilendirmek olacaktır.  Örneğin, araştırmacılar, HOMO–LUMO bant boşluk değerlerinin QM hesaplamalarıyla belirlenen kararlılığı yorumlarken, Tamoksifen48,Letrozol 49 ve Sisplatin50gibi mevcut meme kanseri ilaçlarında DFT hesaplamalarının uygulanmasını ve gözlemlerini belgeleyen önceki literatürlere atıfta bulundular. Daha önce, benzer iş akışları çeşitli hastalık/bozukluk hedefleri için potansiyel inhibitörleri belirlemek amacıylabenimsenmiştir 51. Son zamanlarda, Stafford ve ark.6 , PLK1-PBD inhibitörü tasarım stratejilerini ve kanserde tedavi fırsatlarını inceledi. Son çalışmaların çoğu, PLK1-PBD ve PLK4-PB3'e karşı çift hedefli inhibitörleri yapı rehberli farmakofor modelleme, sanal tarama, moleküler kenetlenme, moleküler dinamik (MD) simülasyonu ve biyolojik değerlendirme kullanarak tespitedilmiştir 52. Zhou ve ark. ayrıca 3D QSAR farmakoforu, ADMET, iskele zıplama, moleküler kenetlenme ve MD53 kullanarak deniz doğal ürünleri kütüphanesinden PLK1-PBD inhibitörlerini tanımlamıştır.

Genel olarak, bu çalışmanın yeniliği dört katlıdır. Birincisi, hem Amerikan İşaret Dili hem de İngilizce olarak sunulan iki dilli bir hesaplama protokolüdür ve özellikle işitme engelli öğrenciler ve araştırmacılar için STEM alanına erişilebilirliği ve kapsayıcılığı geliştirir. Bu iki dilli sunum, hesaplamalı ilaç keşfinde nadir görülür ve Gallaudet Üniversitesi'nin adil bilimsel eğitime öncülük etme misyonuyla uyumludur. İkinci olarak, PLK1 hâlâ etkileyici bir antikanser hedefi olsa da, entegre yapısal, enerjik ve ADMET-S kriterleri kullanılarak PLK1, PLK2 ve PLK3 arasında seçiciliği değerlendiren titiz hesaplamalı çalışmalar azdır. Önceki çalışmaların çoğu yalnızca kinaz bölgesi inhibisyonuna odaklanır veya karşılaştırmalı seçicilik profili yoktur. Bu çalışma, yüksek PLK1 affinitesi ve minimum hedef dışı bağlanma temelinde bileşikleri önceliklendiren filtrelerle üç PLK-PBD'ye karşı başlangıç, keşif amaçlı eşzamanlı tarama protokolü sunarak bu boşluğu kapatmaktadır. Üçüncüsü, iş akışı özellikle eğitim ve kaynak sınırlı ortamlar için verimlilik ve kullanılabilirlik göz önünde bulundurularak tasarlandı. Veritabanı filtrelemesinden ADMET-S değerlendirmesine kadar tüm süreç, standart akademik donanımda (8 GB RAM'li bir dizüstü bilgisayar) iki hafta içinde ücretsiz web tabanlı yazılımlar (CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab) kullanılarak tamamlanabilir. Kenetlenme ve bağlanma affinite hesaplamaları zaman alıcı aşamalar değildir (ligand başına ~30 saniye). En zaman alan adım, ORCA ile yapılan QM kararlılık analizidir; bu çalışma, daha sonraki aşamalara ertelenebilen veya yüksek performanslı hesaplama kaynaklarında çalıştırılabilir, gösterildiği gibi. Scriptler modüler olup sadece temel komut satırı veya Jupyter Notebook düzenlemeleri gerektirir, böylece mevcut müfredatlara sorunsuz entegrasyon sağlanır. Çalışma zamanı, veritabanı filtreleme ve Lipinski uyumu dakikalar alarak mütevazı bir süreçtir; ~1.000 molekülün kümelenmesi, tipik bir masaüstü bilgisayarda 30 dakikadan kısa sürede tamamlanır. Tüm yazılım araçları akademik kullanım için ücretsiz erişilebilir, platformlar arası (Windows, macOS, Linux) ve ticari lisans gerektirmez; bu da giriş engellerini önemli ölçüde azaltır. Dördüncü olarak, tanımlanan ligandlar, nanomolar aralık etkileşimleriyle uyumlu umut verici bağlanma eğilimleri gösterir; ayrıca olumlu ilaç benzerliği, metabolik stabiliteler ve düşük toksisite profilleri bulunur. Birçok aday, arzu edilen ADMET-S özelliklerine sahip güçlü, seçici PLK1-PBD bağlayıcıları olarak ortaya çıkmaktadır ve moleküler dinamik simülasyonları veya in vitro testlerle daha fazla doğrulama gerektirir.

Bu nedenle, metodolojik faydasının ötesinde, bu çalışma erişilebilir, açık kaynaklı ve verimli hesaplamalı araçların, yüksek değerli biyomedikal bir sorunu ele almak için bir başlangıç noktası olarak nasıl kullanılabileceğini ve kapsayıcı bilimsel eğitimi teşvik ettiğini örneklemektedir. PLK1-PBD inhibitörleri onkolojide popülerlik kazanmaya devam ederken, bu iş akışı erken aşama ilaç keşfi için tekrarlanabilir ve eğitim dostu bir plan sunuyor. Çok yönlülüğü, lise, lisans ve lisansüstü ortamlar için uygun hale getirir ve öğrencilere gerçek, uygulamalı araştırma fırsatları sunan CURE'lar için mükemmel bir temel sağlar. Yalnızca kinaz domeni kenetlenmesi veya tek protein taramasına dayanan boru hatlarının aksine, yaklaşım aynı anda PLK1–3 boyunca PBD seçiciliğini değerlendirir; bu, %>38 yapısal homolojisi ve farklı biyolojik rolleri göz önüne alındığında gereklidir. Ayrıca, kümeleme, ADMET-S ve QM kararlılığını açık erişim çerçevesinde birleştirerek, kaba kuvvet sanal taramaya kıyasla yedeklik ve kayıp riski azaltıldı.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R15GM148942-01), Ulusal Tıp Kütüphanesi (R25LM014208) ve Pittsburgh Üniversitesi'nden Momentum Bursu tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Udel (darwin.hpc.udel.edu) DARWIN'i, Ulusal Bilim Vakfı hibeleri #2138259, #2138286, #2138307, #2137603 ve #2138296 ile desteklenen İleri Siber Altyapı Koordinasyon Ekosistemi: Hizmetler ve Destek (ACCESS) programından [MED230016] tahsis yoluyla kullandı.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ADMETLab3Simülasyonlar Plus. IncV3.0ADMET özellikleri
AlphafoldGoogle DeepMind & İzomorfik Laboratuvarlar (Alfabe yan kuruluşları)V3.0.13D Protein Modellemesi
Anaconda/CondaAnaconda, Inc.V24.9.2Açık kaynak paket yönetim sistemi 
CB-Dock2Yang Cao LaboratuvarıV2.0Protein-ligand kör kenetlenme
CHARMM-GUILehigh ÜniversitesiV3.8Biyomoleküler manipülasyon ve simülasyon
DARWIN ERIŞIM ÜZERINEDelaware ÜniversitesiYokYüksek performanslı hesaplama
ORCAFAccTs GmbHV6.1.0Kuantum kimyası paketi
Protein Veri BankasıDünya Çapında Protein Veri BankasıRRID:SCR_006555Protein veritabanı
RDKitAçık kaynakRRID:SCR_014274Kimya formatik programlama
SuperNatural 3.0Fizyoloji ve Bilim Enstitüsü-BT (Berlin)V3.0Doğal moleküller kütüphanesi
SwissADMEİsviçre Biyoinformatik EnstitüsüRRID:SCR_017865ADME özellikleri
ToxtreeIdeaconsult LtdV3.1.0Toksisite sınıflandırması

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eckerdt, F., Yuan, J., Strebhardt, K. Polo-like kinases and oncogenesis. Oncogene. 24 (2), 267-276 (2005).
  2. Dube, D. Polo-like kinases: An antimitotic drug target for cancer therapy. Protein Kinase Inhib. 2022, 457-477 (2022).
  3. de Cárcer, G., Manning, G., Malumbres, M. From PLK1 to PLK5: Functional evolution of polo-like kinases. Cell Cycle. 10 (14), 2255-2262 (2011).
  4. Lee, S. Y., Jang, C., Lee, K. A. Polo-like kinases (Plks), a key regulator of cell cycle and new potential target for cancer therapy. Dev Reprod. 18 (1), 65-71 (2014).
  5. Park, J. E., Hymel, D., Burke, T. R. Jr, Lee, K. S. Current progress and future perspectives in the development of anti-polo-like kinase 1 therapeutic agents. F1000Res. 6, 1024(2017).
  6. Stafford, J. M., Wyatt, M. D., McInnes, C. Inhibitors of the PLK1 polo-box domain: Drug design strategies and therapeutic opportunities in cancer. Expert Opin Drug Discov. 18 (1), 65-81 (2023).
  7. Feng, Y. B., et al. Overexpression of PLK1 is associated with poor survival by inhibiting apoptosis via enhancement of survivin level in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer. 124 (3), 578-588 (2009).
  8. Gutteridge, R. E. A., Ndiaye, M. A., Liu, X., Ahmad, N. PLK1 inhibitors in cancer therapy: From laboratory to clinics. Mol Cancer Ther. 15 (7), 1427-1435 (2016).
  9. Steegmaier, M., et al. BI 2536, a potent and selective inhibitor of polo-like kinase 1, inhibits tumor growth in vivo. Curr Biol. 17 (4), 316-322 (2007).
  10. Vanden Bossche, J., et al. Spotlight on volasertib: preclinical and clinical evaluation of a promising PLK1 inhibitor. Med Res Rev. 36 (4), 749-786 (2016).
  11. Yin, Z., Song, Y., Rehse, P. H. Thymoquinone blocks pSer/pThr recognition by PLK1 polo-box domain as a phosphate mimic. ACS Chem Biol. 8 (2), 303-308 (2013).
  12. Reindl, W., Yuan, J., Krämer, A., Strebhardt, K., Berg, T. Inhibition of polo-like kinase 1 by blocking polo-box domain-dependent protein-protein interactions. Chem Biol. 15 (5), 459-466 (2008).
  13. Scharow, A., et al. Optimized PLK1 PBD inhibitors based on poloxin induce mitotic arrest and apoptosis in tumor cells. ACS Chem Biol. 10 (11), 2570-2579 (2015).
  14. Reindl, W., Yuan, J., Krämer, A., Strebhardt, K., Berg, T. A pan-specific inhibitor of the polo-box domains of polo-like kinases arrests cancer cells in mitosis. ChemBioChem. 10 (7), 1145-1148 (2009).
  15. Park, J. E., et al. Specific inhibition of an anticancer target, polo-like kinase 1, by allosterically dismantling its mechanism of substrate recognition. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (35), e2305037120(2023).
  16. Archambault, V., Normandin, K. Several inhibitors of the PLK1 polo-box domain turn out to be non-specific protein alkylators. Cell Cycle. 16 (12), 1220-1224 (2017).
  17. Jo, S., Kim, T., Iyer, V. G., Im, W. CHARMM-GUI: A web-based graphical user interface for CHARMM. J Comput Chem. 29 (11), 1859-1865 (2008).
  18. Park, S. J., Kern, N., Brown, T., Lee, J., Im, W. CHARMM-GUI PDB manipulator: Various PDB structural modifications for biomolecular modeling and simulation. J Mol Biol. 435 (14), 167995(2023).
  19. Kim, J. H., Ku, B., Lee, K. S., Kim, S. J. Structural analysis of the polo-box domain of human polo-like kinase 2. Proteins. 83 (7), 1201-1208 (2015).
  20. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  21. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D523-D531 (2023).
  22. Gallo, K., et al. SuperNatural 3.0—A database of natural products and natural product-based derivatives. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D654-D659 (2023).
  23. Du, J., et al. KEGG-PATH: Kyoto encyclopedia of genes and genomes-based pathway analysis using a path analysis model. Mol Biosyst. 10 (9), 2441-2447 (2014).
  24. Bento, A. P., et al. An open source chemical structure curation pipeline using RDKit. J Cheminform. 12 (1), 51(2020).
  25. Chung, N. C., Miasojedow, B., Startek, M., Gambin, A. Jaccard/Tanimoto similarity test and estimation methods for biological presence-absence data. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 644(2019).
  26. Liu, Y., et al. CB-Dock2: Improved protein–ligand blind docking by integrating cavity detection, docking and homologous template fitting. Nucleic Acids Res. 50 (W1), W159-W164 (2022).
  27. Vangone, A., et al. Large-scale prediction of binding affinity in protein–small ligand complexes: the PRODIGY-LIG web server. Bioinformatics. 35 (9), 1585-1587 (2019).
  28. Fu, L., et al. ADMETlab 3.0: An updated comprehensive online ADMET prediction platform enhanced with broader coverage, improved performance, API functionality and decision support. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W422-W431 (2024).
  29. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 7 (1), 1-13 (2017).
  30. Patlewicz, G., Jeliazkova, N., Safford, R., Worth, A., Aleksiev, B. An evaluation of the implementation of the Cramer classification scheme in the Toxtree software. SAR QSAR Environ Res. 19 (5-6), 495-524 (2008).
  31. Neese, F. Software update: The ORCA program system—version 5.0. Wiley Interdiscip Rev Comput Mol Sci. 12 (5), e1606(2022).
  32. Daina, A., Zoete, V. A BOILED-Egg to predict gastrointestinal absorption and brain penetration of small molecules. ChemMedChem. 11 (11), 1117-1121 (2016).
  33. Sehnal, D., et al. Mol* Viewer: Modern web app for 3D visualization and analysis of large biomolecular structures. Nucleic Acids Res. 49 (W1), W431-W437 (2021).
  34. Liu, Y., Cao, Y. Protein–ligand blind docking using CB-Dock2. Comput Drug Discov Des. 2023, 113-125 (2023).
  35. Manallack, D. T. The pKa distribution of drugs: application to drug discovery. Perspect Med Chem. 1, 25-38 (2007).
  36. Manallack, D. T., Prankerd, R. J., Yuriev, E., Oprea, T. I., Chalmers, D. K. The significance of acid/base properties in drug discovery. Chem Soc Rev. 42 (2), 485-496 (2013).
  37. Charifson, P. S., Walters, W. P. Acidic and basic drugs in medicinal chemistry: A perspective. J Med Chem. 57 (23), 9701-9717 (2014).
  38. Wildman, S. A., Crippen, G. M. Prediction of physicochemical parameters by atomic contributions. J Chem Inf Comput Sci. 39 (5), 868-873 (1999).
  39. Pasha, T., et al. Therapeutic importance of biological half-life of antineoplastic agents – A review. Adv Pharmacol Pharm. 10, 265-272 (2022).
  40. Smith, D. A., Beaumont, K., Maurer, T. S., Di, L. Relevance of half-life in drug design. J Med Chem. 61 (10), 4273-4282 (2018).
  41. Sharma, P., et al. A cryptic hydrophobic pocket in the polo-box domain of the polo-like kinase PLK1 regulates substrate recognition and mitotic chromosome segregation. Sci Rep. 9 (1), 1-15 (2019).
  42. Kurkcuoglu, Z., et al. Performance of HADDOCK and a simple contact-based protein–ligand binding affinity predictor in the D3R Grand Challenge 2. J Comput Aided Mol Des. 32 (1), 175-185 (2018).
  43. Gaieb, Z., et al. D3R Grand Challenge 2: Blind prediction of protein–ligand poses, affinity rankings, and relative binding free energies. J Comput Aided Mol Des. 32 (1), 1-20 (2018).
  44. Delgado, J., Radusky, L. G., Cianferoni, D., Serrano, L. FoldX 5.0: Working with RNA, small molecules and a new graphical interface. Bioinformatics. 35 (20), 4168-4169 (2019).
  45. Wang, Z., et al. fastDRH: A webserver to predict and analyze protein–ligand complexes based on molecular docking and MM/PB (GB) SA computation. Brief Bioinform. 23 (5), bbac201(2022).
  46. Wang, H., Liu, H., Ning, S., Zeng, C., Zhao, Y. DLSSAffinity: Protein–ligand binding affinity prediction via a deep learning model. Phys Chem Chem Phys. 24 (17), 10124-10133 (2022).
  47. Schöning-Stierand, K., et al. Proteins Plus: A comprehensive collection of web-based molecular modeling tools. Nucleic Acids Res. 50 (W1), W611-W615 (2022).
  48. Flores-Holguín, N., Glossman-Mitnik, D. CDFT-based chemical reactivity properties analysis of the fluorine substitution in the selective estrogen receptor modulator (SERM) tamoxifen. Theor Chem Acc. 142 (8), 79(2023).
  49. Akçay, H. T., Bayrak, R. Computational studies on the anastrozole and letrozole, effective chemotherapy drugs against breast cancer. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 122, 142-152 (2014).
  50. Georgieva, I., Trendafilova, N., Dodoff, N., Kovacheva, D. DFT study of the molecular and crystal structure and vibrational analysis of cisplatin. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 176, 58-66 (2017).
  51. Lawal, M. M., Kucukkal, T. G. Evaluation of small molecule binding to the polo-box domain of PLK1 at the molecular level. J Comput Biophys Chem. 25 (5), 751-768 (2026).
  52. Zhao, C., et al. Discovery of novel dual-targeting inhibitors against PLK1-PBD and PLK4-PB3: structure-guided pharmacophore modelling, virtual screening, molecular docking, molecular dynamics simulation, and biological evaluation. J Enzyme Inhib Med Chem. 40 (1), 2522810(2025).
  53. Zhou, N., Zheng, C., Tan, H., Luo, L. Identification of PLK1-PBD inhibitors from the library of marine natural products: 3D QSAR pharmacophore, ADMET, scaffold hopping, molecular docking, and molecular dynamics study. Mar Drugs. 22 (2), 83(2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PLK1 InhibitorsPolo Box DomainVirtual ScreeningProtein Ligand DockingBinding Affinity PredictionADMET EvaluationQuantum Mechanical AnalysisNatural Product DatabaseK Means ClusteringBreast Cancer

Related Articles