Yöntem makalesi

DNA/RNA Hibrit Komplekslerinden Telomerik Tekrarı Içeren RNA'nın Tahmini

DOI:

10.3791/67984

⸱

5 Aralık 2025

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, DNA:RNA hibritlerinin ve ilişkili RNA'larının (TERRA dahil) birden fazla doku arasında izole edilmesini sağlar. Yaklaşımımız hibrit etkileşimlerin bir alt kümesini kapsa da, tam genom genelinde karakterizasyon için ek genomik haritalama gereklidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomerik tekrarlayan RNA (TERRA), daha yüksek ökaryotlardaki tüm telomerlerden transkribe edilen uzun ve kodlamayan bir RNA'dır ve bu moleküllerin yalnızca bir alt kümesi, telomerlerde kararlı DNA/RNA hibritleri oluşturur. Bu hibrit tahminleri tanımlamak ve saflaştırmak için ayrıntılı bir moleküler protokol belirledik. Bu kolaylaştırılmış yöntem, in vivo doğal olarak oluşan DNA/RNA hibrit etkileşimlerinin doğrudan çıkarılmasını sağlar ve tüm bu bölgelerin tespit edilmesinde uygulanabilir. Prosedürel adımları en aza indirerek, bu teknik, DNA'ya bağlı RNA'yı izole etmede oldukça verimlidir ve aşağı akış dizilemesinin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini tahmin eder. Guanidin izotiosiyanat reaktifi, tam hücre lizisi ve homojenizasyonu için kullanılır; nükleik asitlerin (DNA ve RNA), özellikle DNA/RNA hibritlerinin bütünlüğünü korur. Kloroform eklemek, santrifüjleme yoluyla faz ayrımını başlatır (üç farklı katman): alt fenol-kloroform fazı, ara faz ve üst sulu faz. Çekirdekten ve sitoplazmadan salınan RNA, sulu fazda kalırken, yüksek moleküler ağırlıklı DNA, DNA/RNA hibrit bölgeleri dahil, interfaz içinde sınırlıdır. İzopropil alkol ve ardından santrifüjleme ile sulu faz (serbest RNA), interfaz ve DNA, özellikle DNA/RNA hibritleri geri kazanılır. Kalan protein izlerini çıkarmak için örnek Proteinaz K ile kuluçka edilir. DNA, fenol/kloroform ekstraksiyonu, izopropil alkol ve santrifüjleme ile DNA'ya hibritleşmiş RNA serbest bırakılır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomun transkripsiyonu, üç zincirli yapılardan oluşan geçici hibrit moleküllerin, yani R-döngülerinin oluşmasına yol açar. Bu yapılar, kodlamayan ve kodlayan DNA zincirlerini içerir; kodlamayan iplik, tamamlayıcı RNA1 ile hibritlerin oluşumuyla yerini değiştirir. Genom transkripsiyonu sırasında, her iki DNA zincirinden farklı hızlarda çok sayıda kodlamayan RNA üretilir. Bu RNA'ların çoğu kısa ömürlü ara madde olarak hizmet verir, ancak bazıları, özellikle telomerler ve centromerler 1 gibi kodlamayan bölgelerden kaynaklanan genom biyolojisini yöneten düzenleyici ağlarda kritik roller oynar. Genomdaki DNA/RNA hibritlerinin dağılımı da hücrelerin herhangi bir zamanda transkripsiyonel aktivitesini yansıtabilir.

Kodlamayan RNA'ların düzenleyici işlevlerine olan ilgi arttıkça, transkripsiyonlarını ve genom boyunca, özellikle geçici DNA/RNA hibritleri biçiminde dağılımlarını takip etme merakı artmaktadır. Bunu ele almak için, herhangi bir biyolojik hücre veya dokuya uygulanabilir kararlı DNA/RNA hibritlerinin tespiti için bağımsız bir test geliştirdik. Bu yöntem, DNA ile birlikte arındırılan tamamlayıcı RNA'ların izolasyonunu, ardından PCR çökeltmesi veya dizileme yoluyla analiz yapılmasını sağlar.

Hücre kültürü modellerinden yapılan araştırmalar, DNA replikasyonu ve transkripsiyonu sırasında replikasyon stresi, DNA hasarı, replikasyon çatal çarpışmaları ve RNA polimeraz II duraklamasının topolojik, yapısal ve hibritleşme olayları nedeniyle gerçekleşebileceğini ortaya koymuştur. Bu süreçler, özellikle DNA çift sarmalının çözülmesi, burulma stresine yol açar ve transkripsiyon1 sırasında R-döngüleri gibi anormal yapıların oluşmasına yol açabilir.

Çoğu R-loop verisi, DNA-RNA hibrit-spesifik monoklonal antikor S9.6'ya dayanarak maya veya kültürlenmiş kanser hücreleri kullanılarak oluşturulmuştur. Yapısal çalışmalar, S9.6'nın antijen bağlayıcı parçasının (Fab) özellikle 13 bp RNA-DNA hibritdupleks 1'e bağlandığını göstermiştir. R-döngülerinin antikor tabanlı tespiti, transkripsiyon sırasında guanin açısından zengin bölgelerde oluşan hibritleri esas olarak tespit etmiştir; burada gelişmiş RNA-DNA hibritleşmesi muhtemeldir. S9.6 antikoru kullanılarak yapılan in vitro çalışmalar, 5′ ucuna yakın dört veya daha fazla ardışık guanin içeren RNA'ların daha kolay tespit edildiğini ve bunun artan R-loopoluşumu 1 ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Helikazlar, topoizomerazlar, RNaz H1 ve RNase H2 gibi çeşitli enzimler, transkripsiyon sırasında R-loop dengesinin korunmasına yardımcı olur. R-loop homeostazının bozulması, genomik istikrarsızlığın artmasıyla ilişkilendirilir ve kanser ile nörodejeneratif bozukluklar gibi hastalıklara katkıda bulunur2.

Bir zamanlar transkripsiyonel olarak sessiz olduğuna inanılan telomerlerin, Telomerik Tekrarlayıcı RNA (TERRA)3 olarak bilinen uzun kodlamayan RNA'ları transkribe ettiği bulunmuştur. Bu transkripsiyonlar subtelomerik bölgelerden gelir ve telomerik tekrarlar içerir; telomerhomeostazının 4'ü korumada hayati roller oynar. Bu makalede, DNA/RNA hibrit komplekslerinden DNase I tedavisiyle serbest bırakılan RNA molekülleri olarak 'TERRA-hibrit RNA' olarak adlandırılıyoruz; bu moleküller ekstraksiyon özellikleri ve primer özgüllüğüne dayalı olarak TERRA dizilerini içeriyor olarak kabul edilmektedir.

TERRA transkripsiyonu, centromer-telomer yönünde gerçekleşir ve uzunluğu değişkendir; 100 bp'den 9 kb'ye kadar değişir; TERRA'nın çoğu sulu fazda serbest RNA molekülü olarak geri kazanılır. Küçük bir kısmı DNA'ya bağlı kalır ve kanser ile yaşlanma gibi temel biyolojik süreçlerle ilişkilidir 4,5. TERRA seviyeleri, subtelomerik lokuslara bağlı olarak değişir ve telomerler6'nın heterokromatik durumu tarafından düzenlenir. Hücre kültürü çalışmaları ayrıca, çeşitli subtelomer bölgelerden gelen TERRA transkriptlerinin uzunluk açısından heterojenlik gösterdiğini göstermektedir. Bazı tümör kökeni hücre kültürü çalışmalarında, araştırmacılar 20q subtelomerik bölgenin TERRA transkriptlerinin birincil kaynağı olduğunu ve bu bölgenin genellikle CpGadaları 7,8,9'da metillendiğini bulmuştur. Farelerde, kromozom 18'in subtelomerik bölgesi, TERRAüretimi 10,11'in önemli yerlerinden biridir. Ayrıca, embriyonik hücrelerdeki psödootozomal subtelomerik bölgelerden kaynaklanan TERRA transkripsiyonları olan PAR-TERRA'lar, kromozom 18 11,12'ye kıyasla 200 katına kadar fazla TERRA içerdiği gösterilmiştir.

TERRA'nın transkripsiyonu, TERRA'yı bastıran H3K9 ve H4K20 trimetilasyonu gibi DNA metilasyonu ve histon modifikasyonlarıyla kontrol edilirken, histon asetilasyonu TERRAtranskripsiyonu 6,13,14 ile pozitif korelasyondur. TERRA ayrıca ekstratelomerik bölgelere, intergenik alanlar ve intronlara bağlanır; bu da genomdüzenlemesi 2'de daha geniş bir rol olduğunu gösterir.

Ayrıca, TERRA'nın azalması, özellikle bağlanma noktalarına yakın birçok genin düzensizliğine yol açar; bu da kromatinin epigenetik düzenlemesi vegen ifadesi 2'deki rolünü gösterir. Kısaltılmış telomerlerde TERRA birikimi, homolog rekombinasyon (HR) tabanlı telomer uzantısını teşvik eder ve telomer uzunluğuhomeostazına katkıda bulunur 15,16.

TERRA ve diğer DNA/RNA hibritlerinin rolünü ele almak için, DNA'ya istikrarlı şekilde hibritleşmiş RNA moleküllerini izole etmek için özel olarak tasarlanmış bir test kullandık. Kısa bir süreliğine, çekirdekler izole edilip DNaz-free RNase ile tedavi edilip korunmasız RNA'yı çıkardı. DNA/RNA hibritleri, daha sonra seçici DNaz sindirimi kullanılarak çıkarıldı; bu sindirim, başlangıçta DNA'ya hibritize edilmiş RNA'yı serbest bıraktı. Bu fraksiyon, "DNA/RNA hibrit-ilişkili RNA" olarak adlandırılır ve daha sonra RNA-seq ile analiz edilmiş, standart fenol-kloroformekstraksiyonu 17 ile elde edilen toplam çözünür RNA ile karşılaştırılmıştır. Bu yaklaşım, RNA-DNA hibrit oluşumunun hem telomerik hem de telomer olmayan yerlerini tanımlamamıza ve DNA'ya bağlı ile çözünen RNA havuzlarının transkriptomik profillerini karşılaştırmamıza olanak sağladı. Bir zamanlar sadece telomer transkripsiyonunun bir yan ürünü olarak kabul edilen TERRA, artık telomer bakımında çift rolüyle tanınmaktadır; telomer uzunluğu homeostazı için kritik olan telomeraz aktivitesini ve homolog rekombinasyonu etkiler. Ayrıca, tespit testlerindeki gelişmeler, genom boyunca RNA ve DNA arasındaki dinamik etkileşimlerin daha ayrıntılı anlaşılmasını sağlamıştır. Bu bilgi, TERRA gibi DNA/RNA hibritlerinin hücresel süreçlerdeki etkilerinin ve kanser ile nörodejeneratif bozukluklar gibi hastalıklarla potansiyel bağlantılarının daha fazla araştırılmasına yol açmaktadır. Bu alandaki devam eden araştırmalar, genomik düzenleme ve bunun sağlık ile hastalıkla ilgisi konusundaki anlayışımızı kesinlikle derinleştirecektir.

Bu çalışmada TERRA moleküllerini ve DNA/RNA hibritlerini tanımlamak için kullanılan yöntem, burada detaylandırılan optimize edilmiş guanidinyum tiosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon protokolüdür. Bu protokol, RNA-DNA/RNA hibritlerinin, toplam RNA ve genomik DNA'nın birleşik bir iş akışı içinde eşzamanlı izolasyonuna olanak sağlamak için geliştirilmiştir. Klasik üç fazlı ayırma yöntemini stratejik olarak değiştirerek, bu protokol DNA/RNA hibritlerinin fenol interfazında seçici olarak tutulmasını kolaylaştırır ve böylece kayblarını en aza indirir – bu, geleneksel ekstraksiyon tekniklerinin doğal bir sınırlamasıdır.

Geleneksel olarak, DNA/RNA hibritlerinin tespiti ve izolasyonu, özellikle DNA/RNA hibrit yapılarını tanıyan S9.6 monoklonal antikoru ile immünopresipitasyonadayanmıştır 18,19. Bu S9.6 tabanlı yaklaşım, yaygın olarak kullanılmasına rağmen, antikor erişilebilirliği, maliyet ve potansiyel çapraz reaktivite nedeniyle sınırlanabilir. Buna karşılık, protokolümüz hem hücresel hem de doku kaynaklı örnekler için kolayca uygulanabilen, maliyet verimli, antikordan bağımsız bir alternatif sunar.

İzole DNA/RNA hibrit fraksiyonunun saflığını ve yapısal bütünlüğünü daha da artırmak için, proteinaz K aracılı deproteinizasyonu ve ardından DNase I tedavisini ekledik. DNase I adımı, DNA/RNA hibritlerinin DNA zincirini seçici olarak sindirir ve böylece hibritleşmiş RNA'yı sonraki izolasyon ve sonraki moleküler analiz için serbestbırakır 20. Bu yaklaşım, kurtarılan RNA türlerinin özellikle in vivo olarak DNA'ya istikrarlı şekilde hibritize edilmiş türler olmasını sağlar. Modüler yapılandırması ve ölçeklenebilirliği sayesinde, protokolümüz çeşitli biyolojik bağlamlara geniş çapta uyarlanabilir olup, araştırmacılara DNA/RNA hibrit biyolojisini çok çeşitli deneysel sistemlerde sorgulamak için sağlam bir araç sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanları içeren tüm deneysel protokoller, Erciyes Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (lisans numarası 19-07-2019, karar no. 19/127). Bu çalışmada balb/c fareleri kullanıldı: 6 haftalık beş sağlıklı dişi (25 g) ve beş erkek, 8 haftalık (30 g). Fareler, Laboratuvar Hayvan Bakımı İlkeleri'ne (Avrupa kuralları) göre bakıldı ve tedavi edildi. Burada sunulan çalışma, Erciyes Üniversitesi İnsan Etik Komitesi'nden etik onay alan önceki bir araştırma projesinden türetilen 13 sağlıklı kontrol denekten alınan kan örnekleri kullanıldı (Karar No: 17/002). Bu protokol için grafiksel bir özet Şekil 1'de sunulmaktadır. RNA bozulmasını en aza indirmek için tüm adımlarda RNazsız malzemeler ve aseptik teknikler kullanın.

1. Fare yetiştiriciliği

  1. Ötenazi için gerekli anestezi dozunu belirlemek için, her fareyi tartarak 60 mg/kg dozda ketamin ve intraperitoneal enjeksiyonla 10 mg/kg ksilazin uygulanır.
  2. Anestezi uygulandıktan sonra, pedal çekilme refleksinin (ayak parmağı sıkışması) olmaması ve dokunsal uyarıya yanıt olmaması ile tam anestezi doğrulanın. Anestezi doğrulandıktan sonra, servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapılacaktır.

2. İnsan örnekleri

  1. Katılımcıları sağlıklı kontrol kontrol olarak seçerek kronik hastalıkların (diyabet, kardiyovasküler hastalık, hipertansiyon veya kanser gibi), akut enfeksiyonlar, otoimmün veya inflamatuar bozukluklar, nörolojik veya psikiyatrik durumlar ve yakın zamanda reçeteli ilaç kullanımı ile ilgili herhangi bir öykü dışlanmasınısağlamakta 17.
  2. Her gönüllünün dizinin arkasındaki bölgeden (popliteal fossa) 2 mm delik bir delme aleti kullanılarak cilt biyopsisi örnekleri alın. İşlemden önce lokal anestezi deri altına uygulanır ve tüm biyopsiler steril koşullarda yapılır.

3. Tüm hücre tiplerinden DNA/RNA hibrit ekstraksiyonu

  1. Doku toplama ve liz
    1. Her ekstraksiyonda 500 μL kalp kanı, tüm hipotalamus-hipofiz kompleksi, tüm böbrek üstü bezi veya tek bir fareden toplanan sperm örneği kullanılmalıdır.
    2. Toplanan tüm örnekleri steril 1.5 mL tüplere aktarın. Her tüpe 500 μL fenol ekleyin. Vortex kan örneklerini iyice karıştırmak için.
      1. Doku örneklerinde, görünür parça kalmayana kadar 2 mm bir şırınga ile tamamen homojenizasyon yapılabilir.
    3. Tüpleri örnek bütünlüğünü korumak için soğutma bloğuna yerleştirin.
      NOT: Fenol, kloroform ve amonyum asetat gibi tehlikeli reaktiflerle çalışırken her zaman laboratuvar güvenlik yönergelerine uyun.
  2. Faz ayrımı
    1. Her tüpte 180 μL kloroform ekleyin ve kısa bir süreliğine girdabınızı karıştırın. Faz ayrımı için tüpleri buzda 15 dakika kuluçka yapın.
    2. Numuneleri inceleyin - sulu fazın temiz olduğundan emin olun. Faz bulutluysa, tekrar girdaba girip 5 dakika daha buz haline dön.
    3. Santrifüj örnekleri 12.000 × g, 4 °C'de 15 dakika boyunca alındı.
  3. RNA çökelmesi
    1. Berrak sulu fazı, soğutma bloğuna yerleştirilen yeni steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.
    2. Sulu faza eşit hacimde (1:1) izopropanol ekleyin, kısa bir girdap karıştırın ve 15 dakika buzda kuluçka yapın.
    3. 12.000 × g, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
      NOT: RNA pelleti tüpün dibinde görünür olmalıdır.
  4. RNA pelletinin yıkanması
    1. Tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatantı peleti rahatsız etmeden atabilirsiniz.
    2. Pellete 1,5 mL %70 etanol ekleyin. Tüpü nazikçe yurur, yıkamak için 5 saniye boyunca.
    3. 7.500 × g, 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Tüpü ters çevirerek süpernatantı at. Etanol yıkamayı 2 kez tekrarlayın (toplamda üç yıkama).
  5. RNA arındırması
    1. Son etanol yıkamasından sonra, tüpü ters çevirin ve kalan etanol havada kurutulmasına izin verin veya pipetle dikkatlice çıkarın.
    2. RNA peletine 100 μL RNase içermeyen su ekleyin ve RNA'yı tamamen yeniden süsperlemek için tüpü yukarı aşağı nazikçe pipet yapın veya hafifçe hareket ettirin.
      NOT: RNA örneklerini her zaman buz üzerinde veya soğutma rafı/soğutma bloğunda tutun, böylece bozulma önlenir.
  6. RNA niceliklendirme ve depolama
    1. Resüspansiyon edilmiş RNA içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin.
    2. RNA konsantrasyonunu ve saflığını spektrofotometre kullanarak ölçün. RNA konsantrasyonunu belirlemek için 260 nm (A260) soğukkansı kaydedilsin. A260/A280 ve A260/A230 oranlarını hesaplayarak saflığı değerlendirin.
    3. Sadece A260/A280 oranlarında 1.9 ile 2.1 arasında RNA örnekleri kullanılır.
      NOT: Bu çalışmada tipik RNA konsantrasyonları 100 ila 180 ng/μL arasında değişiyordu.
    4. RNA örnekleri −80 °C'de saklanır ve daha fazla kullanıma kadar devam eder.
  7. Protein çıkarımı ve DNA'nın izolasyonu
    1. RNA izolasyonundan sonra, fenol çıkarma aşamasından interfaz korun.
      NOT: Bu adım gereklidir çünkü ara fazda fenol ekleme ve santrifüjleme sonrası DNA izolasyonu için daha fazla işlenebilir.
    2. DNA çıkarımına devam edin; 3.2.1-3.4.1 adımlarını takip edin, başlangıç maddesi olarak interfaz ile başlayın. Fenol ekstraksiyonundan çıkan tüm ara fazı (DNA içeren) soğutma rafında tutulan steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.
    3. Protein sindirimi: Tüpe 0,5 mL lizis tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM EDTA; %0,1 SDS; 400 μg/mL Proteinaz K) ekleyin. Proteinleri sindirmek için gece boyunca 56 °C'de kuluçka yapın.
    4. DNA'nın tuz çökeltmesi
      1. Ertesi gün, her numuneye 100 μL 5 M amonyum asetat ekleyip kısa bir süre karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1.788 × g santrifüj yapın.
      2. Şeffaf sulu fazı dikkatlice yeni steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sulu faza eşit miktarda moleküler biyoloji kalitesinde izopropanol (1:1 oranı) ekleyin, nazik ters çevirme ile karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.788 × g seviyesinde santrifüj yapın. DNA pelletini rahatsız etmeden süpernatantı at.
      3. DNA pelletini 1 mL %70 etanol ile yıkayın, ardından 1.788 × g ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
      4. Etanol yıkamayı çıkarın ve atın. DNA pelletinin kısa bir süre havada kurumasına izin verin.
      5. Kurutulmuş DNA pelletini 50 μL Nukleazsız suya yeniden süzülür.
  8. DNA'yı temizlemek için serbest nükleik asidi çıkarın:
    1. Çözünmüş DNA'yı bir DNA spin sütununa yükleyin. 15.000 × g ile 15 saniye boyunca santrifüj yapın ve akış akışını atın.
    2. Kolonu %70 etanol ile 2 kez yıkayın, her seferinde 1 dakika boyunca 15.000 × g santrifüj yapın. Her yıkamadan sonra akış kısmını atın.
    3. Spin kolonunu temiz bir 1.5 mL toplama tüpüne aktarın. Kolon matriksine 30 μL nükleaz içermeyen su ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın, ardından 15.000 × g ile 1 dakika santrifüj yapın ve DNA elüasyonu yapıldı.
    4. Elyated DNA'yı buz üzerine koyun. Örneği iki tüpe ayırın: biri 4 °C'de DNA depolama için, ikincisi ise sonraki DNA/RNA hibrit ekstraksiyonu için.
  9. DNA'ya bağlı RNA Ekstraksiyonu (DNA/RNA Hibritleri)
    1. DNaz tedavisi
      1. 5 μL (15 U) DNase I ve 75 μL 10x DNaz sindirim tamponu birleştirerek bir DNaz sindirim karışımı hazırlayın.
      2. Kurutulmuş DNA pelletine 80 μL DNAZ karışımı ekleyin. Örneği oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın.
    2. Fenol-kloroform ekstraksiyonu
      1. Numuneye 300 μL fenol ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
      2. Karışıma 180 μL kloroform ekleyin ve oda sıcaklığında ek 5 dakika kuluçka yapın.
      3. Maksimum hızda (örneğin, 15.000 × g) santrifüj ile 4 °C'de 10 dakika boyunca faz ayırmak için kullanılır. Üst sulu fazı (RNA:DNA hibritleri içeren) dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.
  10. DNA/RNA hibrit izolasyonu
    1. 3.3'ten 3.5.2'ye kadar olan adımlardan DNA/RNA hibritlerinin izolasyonunu tamamla.
    2. Sulu faza eşit hacimde (1:1) izopropanol ekleyin, kısa bir girdap karıştırın ve 15 dakika buzda kuluçka yapın.
    3. 12.000 × g, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Tüpün dibinde RNA peletini arayın. Tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatantı peleti rahatsız etmeden atabilirsiniz.
    4. Pellete 1,5 mL %70 etanol ekleyin. Tüpü nazikçe yurur, yıkamak için 5 saniye boyunca. Santrifüj 7.500 × g, 4 °C'de 5 dakika boyunca kalın. Tüpü ters çevirerek süpernatantı at. Etanol yıkamayı 2 kez tekrarlayın (toplamda üç yıkama).
  11. RNA arındırma:
    1. Son etanol yıkamasından sonra, tüpü ters çevirin ve kalan etanol havada kurutulmasına izin verin veya pipetle dikkatlice çıkarın.
    2. DNA/RNA hibrit peletine 30 μL RNase içermeyen su ekleyin ve RNA'yı tamamen yeniden süsküylemek için tüpü nazikçe yukarı aşağı veya hafifçe salla.
    3. DNA/RNA hibrit örnekleri −80 °C'de saklanır ve daha fazla kullanıma devam eder.

4. cDNA sentezi

NOT: RNA, cDNA ve DNA bütünlüğünü RNaz/DNazsız malzemeler kullanarak ve işlem boyunca örnekleri buz üzerinde tutarak garanti edin.

  1. Her örnek için 6 μL (20 ng RNA; serbest RNA için 3.6.5. veya DNA/RNA hibrit RNA için 3.13.3. adımda izole edilmiştir) kullanın. Gerekli RNA hacmini etiketli PCR tüplerine aktarın.
  2. cDNA sentez ana karışımını kit üreticisinin talimatlarına göre hazırlayın. Her reaksiyon için, ana karışımın ters transkriptaz, dNTP, primer, tampon ve RNase inhibitörleri içerdiğinden emin olun. Her reaksiyon için, 14 μL ana karışımı ile 6 μL RNA örneğini PCR tüpünde birleştirin (toplam hacim: her reaksiyon başına 20 μL). En az bir ters transkriptoz olmayan (-RT) kontrolünü aynı miktarda RNA kullanarak ters transkriptaz enzimi eklemeden paralel bir reaksiyon hazırlayarak dahil edin.
  3. Tablo 1'de belirtilen sıcaklık programını kullanarak termal döngüleyicide cDNA sentezi gerçekleştirin.
  4. Ortaya çıkan cDNA'yı 1:5 oranında nükleazsız suyla seyreltir ve qPCR analizine kadar −80 °C'de depolayın.

5. Q-PCR ile TERRA ifade seviyelerinin belirlenmesi

  1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, qPCR reaksiyon karışımını SYBR Yeşil bazlı qPCR kiti ile hazırlayın. Her reaksiyon için 1 μL SYBR Green Master Mix, 0. μL TERRA için ön primer (bkz. Tablo 2), TERRA için 0. μL ters primer (bkz. bkz) ve μL nukleazsız su birleştirin.
  2. 96 kuyruklu bir qPCR plakasının her kuyusuna reaksiyon karışımından 16 μL dağıtın.
  3. Her kuyuya 4.6. adımdan 4 μL seyreltilmiş cDNA ekleyin, böylece nihai reaksiyon hacmi 20 μL olur.
    NOT: Her örnek için en az iki teknik ve iki biyolojik kopya ekleyin. Kirlenme kontrolü için şablonsuz kontroller (NTC) ve RNA kaynaklı sinyaller için özgüllüğü sağlamak için ters transkriptaz kontrol sistemleri ekleyin.
  4. Tablo 3'te belirtilen sıcaklık programı kullanılarak qPCR yapılabilir.
  5. 2-ΔΔCt yöntemiyle TERRA ifadesini β-Aktine (ev geni) normalize edin.

6. Telomer uzunluğunun belirlenmesi

  1. Telomer uzunluğu ölçümü 21 için qPCR karışımını hazırlayın. Her reaksiyon için 1 μL SYBR Green Master Mix, 0. μL telomer ön primer (bkz. Tablo 2]), 0. μL telomer ters primer ( bkz. Tablo 2) ve μL nukleazsız su birleştirin.
  2. 96 kuyuklu bir qPCR plakasının her kuyusuna 16 μL telomer reaksiyon karışımı dağıtın.
  3. Her kuyuya 4 μL genomik DNA (Adım 3.10.5'ten) eklenerek nihai reaksiyon hacmi 20 μL olur.
  4. Üretici tarafından belirlenen uygun program parametrelerine göre qPCR uygulanın ( bkz. Tablo 3).
  5. Paralel olarak, aynı konsantrasyonlar ve nihai hacim kullanılarak tek kopyalı referans gen (36B4) için reaksiyonlar kuruldu.
  6. Standart eğriler, sentetik telomer oligonukleotidin seri sulandırılması kullanılarak oluşturuldu (Tablo 2) ve göreli bolluk ve amplifikasyon verimliliğini tahmin etmek için. Mutlak nicel hesaplama yapılmadı. Göreceli telomer uzunluğu, ΔCtyöntemi 21 kullanılarak T/S oranı (telomer tekrarı kopya sayısı ile tek kopya gen numarası) olarak hesaplanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, birden fazla fare dokusunda (kan, sperm, deri, hipotalamus, hipofiz, adrebreğ) ve insan kanı ile cilt örneklerinde serbest TERRA, DNA/RNA hibrit TERRA ve telomer uzunluğu seviyelerini niceleştirdik ve karşılaştırdık; böylece dokuya özgü dinamikleri ve telomer biyolojisi ile ilişkiyi araştırdık. Serbest TERRA, fenol-kloroform ekstraksiyonu (protokol adımları 3.6.1-3.6.5) sonrası sulu fazdan izole edildi ve kromatin veya DNA i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokolün merkezi gücü, karmaşık doku örneklerinden serbest TERRA ve DNA/RNA hibrit TERRA'nın adımlı olarak çıkarılması ve ayırt edilmesidir. Kritik adımlar arasında, fenol-kloroform ekstraksiyonu sırasında sulu ve fazlar fraksiyonların dikkatlice ayrılması yer alır; çünkü çapraz kontaminasyon serbest ve hibrit TERRA arasındaki ayrımı karıştırabilir. Sonraki DNase I ile interfaz fraksiyonunun tedavisi de çok önemlidir: yetersiz sindirim DNA'ya bağlı RNA'yı erişilemez hale...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmayı desteklediği için Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Birimi'ne TYL-2019-9224 ve TSA-2022-11929 hibe numaralarıyla minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 mL PCR tüpleri Greiner671201
15 mL Falcon TüpleriIsolab078.02.001
2 mL ŞırıngeHayatYok
96- Multiwell plakasıGreiner50-720-3203
Mutlak EtanolMerck1070172511
Amonniyum AsetatSigma238074-500G
cDNA Sentezis KitiRoche07 912 439 001
KloroformMerck1024451000
DNAse I Kit ZymoE1010
EDTASigmaE9884-1KG
Cam şişeIsolabLB. IS.061.01.901
Dereceli silindirIsolab  015.01.901
Guanidin izotiosiyanat SigmaG9277-100G
İzoproponalMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Mikrosantrifüj Tüpleri (1.5 mL)Greiner616201
Mikropipetler (10 & mikro; L)GilsonFD10001
Mikropipetler (100 & mikro; L)GilsonFD10004
Mikropipetler (1000 & mikro; L)GilsonFD10003
Mikropipetler (2 & mikro; L)GilsonGFAM00064
NanodropShimadzuC101-E112
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
PCR CihazıSensoquestT3-0140
PGL3 Temel VektörPromega #212936
Pipet uçları (10 ve mikro; L, 200 & mikro; L, 1000 & micro; L)Greiner772352
Plastik Petri kaplarıGreiner627102
Proteinaz KSigmaP6556-10MG
SDSSigma8170342500
Serolojik PipetGreiner760107
DönmeGilsonPMC880
Sybr Yeşil UstaRoche4707516001
TermomikserEppendorf#5355
Trizma üssüSigma1503-1KG         
TrizolBiorad7326890
Unimax 1010 DT ShakerHeidolph543-12310-00-6
VortexHeidolph541-10000-00-1
Zymo-Spin I SütunlarıZymoC1003-50

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. F., Wang, G. G. R-loops: formation, function, and relevance to cell stress. Cell Stress. 3, 38-46 (2019).
  2. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  3. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat-containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  4. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  5. Oliva-Rico, D., Herrera, L. A. Regulated expression of the lncRNA TERRA and its impact on telomere biology. Mech Ageing Dev. 167, 16-23 (2017).
  6. Azzalin, C. M., Lingner, J. Telomeres: the silence is broken. Cell Cycle. 7, 1161-1165 (2008).
  7. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Finding a human telomere DNA-RNA hybrid G-quadruplex formed by human telomeric 6-mer RNA and 16-mer DNA using click chemistry: a protective structure for telomere end. Bioorg Med Chem. 22, 4419-4421 (2014).
  9. Montero, J. J., López De Silanes, I., Graña, O., Blasco, M. A. Telomeric RNAs are essential to maintain telomeres. Nat Commun. 7, 1-13 (2016).
  10. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  11. De Silanes, I. L., et al. Identification of TERRA locus unveils a telomere protection role through association to nearly all chromosomes. Nat Commun. 5, 4723(2014).
  12. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  13. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  14. Pfeiffer, V., Lingner, J. TERRA promotes telomere shortening through exonuclease 1-mediated resection of chromosome ends. PLoS Genet. 8, e1002747(2012).
  15. Balk, B., Dees, M., Bender, K., Luke, B. The differential processing of telomeres in response to increased telomeric transcription and RNA-DNA hybrid accumulation. RNA Biol. 11, 95-100 (2014).
  16. Yu, T. Y., Kao, Y. W., Lin, J. J. Telomeric transcripts stimulate telomere recombination to suppress senescence in cells lacking telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 3377-3382 (2014).
  17. Mehmetbeyoglu, E., et al. Decrease in RNase HII and accumulation of lncRNAs/DNA hybrids: a causal implication in psoriasis. Biomolecules. 12 (3), 368(2022).
  18. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. J Immunol Methods. 89, 123-130 (1986).
  19. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. J Mol Recognit. 26, 376-381 (2013).
  20. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chédin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Mol Cell. 45, 814-825 (2012).
  21. O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A quantitative PCR method for measuring absolute telomere length. Biol Proced Online. 13, 1-10 (2011).
  22. Arora, R., Azzalin, C. M. Telomere elongation chooses TERRA ALTernatives. RNA Biol. 12, 938-941 (2015).
  23. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nat Struct Mol Biol. 20, 1199-1206 (2013).
  24. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  25. Luke, B., Lingner, J. TERRA: telomeric repeat-containing RNA. EMBO J. 28, 2503-2510 (2009).
  26. Cañas, J. C., Aguilera, A., Gómez-González, B. Detection of R-loops by in vivo and in vitro cytosine deamination in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 2528, 39-53 (2022).
  27. Cerritelli, S. M., Sakhuja, K., Crouch, R. J. RNase H1, the gold standard for R-loop detection. Methods Mol Biol. 2528, 91-114 (2022).
  28. Skourti-Stathaki, K. Detection of R-loop structures by immunofluorescence using the S9.6 monoclonal antibody. Methods Mol Biol. 2528, 21-29 (2022).
  29. Kianmehr, L., et al. Analysis of RNA/DNA hybrid profiles in blood from autistic patients reveals differences in mRNA and non-coding RNA regions. bioRxiv. , (2024).
  30. Yilmaz Sukranli, Z., et al. Experimentally altering microRNA levels in embryos alters adult phenotypes. Sci Rep. 14, 19014(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Telomerik RNADNA RNA HibritleriTERRA TahminiKodlama Yapmayan RNAHibrit Safla t rmaFaz Ayr mProteinaz KDNaz lemiFenol Kloroform EkstraksiyonuN kleik Asit zolasyonu

İlgili makaleler