Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

At Kanından Trombositten Zengin Plazma Elde Etmek için Basit Bir Çift Santrifüj Tüpü Yöntemi

2.4K görüntülenme

DOI:

10.3791/67985

15 Ağustos 2025

Bu makalede

Özet

Trombositten zengin plazma (PRP), at kas-iskelet sistemi rahatsızlıklarının tedavisinde kullanılır. Farklı teknikler, değişen trombosit ve lökosit konsantrasyonları ile PRP verir. Bu makale, at kanından PRP elde etmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

Trombositten zengin plazma (PRP), atlarda osteoartrit, tendinopatiler ve desmopatiler gibi kronik kas-iskelet sistemi rahatsızlıkları için rutin bir tedavi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu etkinlik, ister endojen ister ekzojen olarak aktive edilmiş olsun, bu ortobiyolojik ajanın aktivasyonu üzerine salınan yüksek konsantrasyonda büyüme faktörleri ve anti-enflamatuar sitokinlerden kaynaklanır. Artan popülaritesine rağmen, atlarda PRP elde etme tekniklerini gösteren eğitici videoların kayda değer bir eksikliği vardır.

Bu çalışma, atlarda PRP elde etmek için bir çift santrifüj tüpü yöntemini incelemektedir. Altı attan alınan tam kan sodyum sitrat tüplerinde toplandı ve 5 dakika boyunca 120 × g ve 5 dakika boyunca 240 × g olmak üzere iki kez santrifüj edildi. PRP için ortalama trombosit konsantrasyonu 360.95 ± 56.31 trombosit (PLT) × 103/μL iken, ortalama lökosit konsantrasyonu 103/μL × 1.53 hücre ± 3.05 idi. PRP'deki trombosit sayısı tam kandan 2.41 kat daha yüksekken, PRP'deki lökosit konsantrasyonu 0.44 kat daha düşüktü. PRP'de PLT için toplama etkinliği %17 iken, PRP'de lökositler için toplama etkinliği %3.1 idi. PRP'de transforme edici büyüme faktörü beta 1 ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü BB'nin ortalama konsantrasyonları sırasıyla 2601.82 (%95 güven aralığı (CI): 2358.88-2844.76) pg/mL ve 1208.05 (%95 CI: 1051.09-1365.02) pg/mL idi. Bu sonuçlar, PRP'nin at pratisyenleri tarafından kullanıma uygun basit, uygun maliyetli bir yöntemle verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde elde edilebileceğini göstermektedir.

Giriş

Trombositten zengin plazma (PRP), tendinopatiler, desmopatiler, osteoartrit ve laminitis 1,2,3 gibi kronik at kas-iskelet sistemi rahatsızlıklarını tedavi etmek için yaygın olarak kullanılan ortobiyolojik bir üründür. Uzuv yaralarının ve oküler yüzey hastalığının tedavisinde de etkilidir 4,5. Kullanım gerekçesi, esas olarak trombositler6 tarafından salınan yüksek konsantrasyonlarda büyüme faktörlerine (GF'ler) dayanmaktadır. Lökositler ayrıca düzenleyici ve antienflamatuar sitokinleri serbest bırakarak katkıda bulunur7. Dönüştürücü büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü BB (PDGF-BB) gibi GF'ler güçlü anabolik, proliferatif, anjiyojenik ve antienflamatuar etkiler gösterir8. Ekzojen veya endojen aktivasyon üzerine PRP, trombositten zengin bir jele polimerize olarak hücre trafiğini, ankrajını ve farklılaşmasını kolaylaştırır 6,9. Bu şekilde PRP, sadece GF'ler ve sitokinler için bir kap olarak değil, karmaşık bir canlı iskele görevi görür10.

Hem insanlarda hem de atlarda kullanılan PRP ürünlerini çeşitli sistemler sınıflandırmaktadır 6,11,12. En basit ve en yaygın sistemlerden biri, bu hemobileşenleri lökosit konsantrasyonunagöre sınıflandırır 11,12. Bu sınıflandırmaya göre, atın tam kanındaki seviyelere göre düşük ila ihmal edilebilir lökosit konsantrasyonlarına ve düşük ila orta trombosit konsantrasyonlarına sahip PRP ürünleri saf PRP (P-PRP)6,11,12 olarak adlandırılır. Buna karşılık, yüksek lökosit konsantrasyonlarına ve orta ila yüksek trombosit konsantrasyonlarına sahip PRP ürünleri, lökosit ve trombositten zengin plazma (L-PRP) olarak adlandırılır6,11,12.

P-PRP ürünleri tipik olarak, sodyum sitrat ve sitrat, fosfat ve dekstroz13 gibi antikoagülanlar içeren tüplerde atlardan tam kanın toplandığı tüpten tüpe santrifüjleme ile elde edilir. Trombositleri diğer bileşenlerden ayırmak için kan iki kez santrifüj edilir14. Buna karşılık, L-PRP ürünleri esas olarak insan kanı için tasarlanmış yarı otomatik kitler kullanılarak hazırlanırve bunların bazıları atlarda kullanım için onaylanmıştır 6,15. Bu yarı otomatik kitler genellikle özel santrifüjler gerektirir ve daha yüksek bir maliyete16 sahiptir, ayrıca klinik ortamlarda pratik kullanımlarını zorlaştırabilecek aseptik kullanımla ilgili potansiyel endişeler17 ile birlikte gelir. Ek olarak, bu kitler, bazı klinik durumlarda zararlı olabilecek istenmeyen aşırı lökosit veya kırmızı kan hücresi konsantrasyonuna neden olabilir18. Örneğin, yüksek lökosit sayıları aşırı iltihaplanmaya neden olabilir ve aşırı miktarda kırmızı kan hücresi iyileşme sürecine müdahale edebilir veya doku tahrişi veya reddi gibi komplikasyonlara yol açabilir15; bununla birlikte, at L-PRP üretmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, özel ekipman gerektirmeyen bir yerçekimi sürecini içerir19.

Bu sınırlamaların ışığında, PRP hazırlığı için daha basit ve daha uygun maliyetli alternatifler oldukça arzu edilir. Çeşitli in vitro çalışmalar, kas-iskelet sistemi hastalığının deneysel modelleri ve atlarda yapılan gözlemler, hem P-PRP hem de L-PRP ürünlerinin tedavi edilen hücreler ve dokular üzerinde faydalı etkileri olduğunu göstermiştir 1,2,20. Bu ürünler iyileşmeyi destekler, iltihabı azaltır ve doku yenilenmesini artırır6. Bununla birlikte, bir atı tedavi etmek için P-PRP veya L-PRP kullanma kararı, teknik ve ekonomik faktörlerden etkilenebilir.

Yazarlara göre, at kanından bir PRP ürünü elde etmek için geniş çapta doğrulanmış adım adım bir prosedürü tanımlayan ve tam olarak gösteren yayınlanmış bir çalışma yoktur. Bu makale, atlardan güvenli bir şekilde tam kan almak ve hem deneysel hem de klinik kullanıma uygun bir PRP ürünü üretmek için gerekli prosedürleri özetlemektedir. Ayrıca, trombositlerin ve lökositlerin miktar tayini ve terapötik etkilerinin ayrılmaz bir parçası olan TGF-β1 ve PDGF-BB konsantrasyonunun belirlenmesi ile bu ortobiyolojik olanın doğrulanmasını da içerir. Bu çalışma, süreci standartlaştırarak ve ürünün etkinliğini göstererek, at pratisyenlerinin PRP'yi güvenle ve hassasiyetle hazırlamaları için güvenilir ve erişilebilir bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

At PRP'si üretmek için çift santrifüjleme yöntemi ilk olarak 2006 yılında Argüelles ve ark.14 tarafından tanımlanmış olsa da, protokol ilk kez bir videoda tam olarak sunulmuştur. Bu video, kas-iskelet sistemi bozuklukları olan atlar için daha karmaşık ve pahalı PRP kitleri kullanmalarını engelleyen teknik sınırlamalar ve bütçe kısıtlamaları ile karşı karşıya kalan at uygulayıcıları için pratik bir kaynak olarak hizmet etmeyi amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Kolombiya, Manizales'teki Universidad de Caldas Veteriner Eğitim Hastanesi'nde atlarda PRP'nin hazırlanması ve kullanılması için iç protokollere uygun olarak yürütülmüştür. Veriler kurumumuzda klinik olarak tedavi edilen topal atlardan elde edildiği için bu çalışmada Dahili Hayvan Bakım Kurulu onayı gerekmemiştir. Bu protokolü geliştirmek için yaş ortalaması 7.4 (± 2.6) yıl olan altı Kolombiyalı Creole atı, üç kısrak ve üç dişiden elde edilen veriler kullanıldı. Atların sahipleri çalışmanın doğası hakkında bilgilendirildi ve bilgilendirilmiş bir onam formu imzaladı. Çalışmaya dahil edilen tüm atlar, tedavi edilen kas-iskelet sistemi problemi dışında klinik olarak sağlıklıydı. Sadece bazal trombosit sayısı 100 × 103 / mL tam kan olan hayvanlar dahil edildi. Daha düşük trombosit konsantrasyonlarına sahip atların trombositopenik14 olarak kabul edilebileceğini not etmek önemlidir. Ek olarak, bu hayvanlar at türleri için normal aralıkta normal kan sayımı, karaciğer ve böbrek klinik biyokimya parametreleri ve idrar analiz değerleri sergiledi.

1. At kısıtlaması ve cilt dezenfeksiyonu

  1. Hem atın hem de veterinerin güvenliği için, hayvanın davranışına bağlı olarak atı (Eqqus caballus) bir klinik muayene oluğunda veya bir dizginle (Şekil 1A) güvenli bir şekilde tutun. Ardından, 5 cm x 5 cm'lik bir saç alanını, boynun bir tarafının üçte birlik kısmından elektrikli bir tıraş makinesiyle şah damarının üzerinden klipsleyin.
    NOT: Bazı sahipler atın kırpılmamasını tercih eder. Bir çalışma, P-PRP21'in bakteriyel kontaminasyonunu önlemek için damar delinme bölgesinde saç kesmenin gerekli olmadığını göstermektedir. Bu nedenle, bu prosedür veteriner hekimin takdirindedir.
  2. Steril olmayan gazlı bez ve eldiven kullanarak yaklaşık 3 dakika boyunca juguler venin kırpılmış alanı üzerinde en az 10 cm boyunca steril olmayan bir ön cilt hazırlığı yapın. Antiseptik köpüğe batırılmış birkaç parça gazlı bezi dairesel bir şekilde uygulayın (Şekil 1B).
  3. Damar delinme bölgesini hem steril eldivenler hem de dezenfektana batırılmış gazlı bez kullanarak aseptik olarak hazırlayın. Boyun bölgesindeki cildi yaklaşık 5 dakika boyunca dairesel hareketlerle ovalayın. Alanı% 95 etil alkole batırılmış steril gazlı bezle temizleyin.

2. Aseptik kan alma










  1. figure-protocol-1
    figure-protocol-2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ortalama trombosit sayısı (trombositler × 103/μL) PRP'de tam kana göre anlamlı olarak daha yüksekti (p < 0.001). Buna karşılık, PRP'deki ortalama lökosit konsantrasyonu (lökositler × 103/μL) tam kandakinden anlamlı derecede düşüktü (p < 0.001) (Tablo 1). Spesifik olarak, PRP'deki trombosit sayısı tam kandan 2.41 kat daha yüksekken, PRP'deki lökosit konsantrasyonu 0.44 kat daha düşüktü. PRP'de PLT için toplama etkinliği iken, PRP'de lökosit toplama etkinliği %3.1 idi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

PRP'nin beşeri ve veteriner hekimlikte kronik kas-iskelet sistemi rahatsızlıklarının tedavisinde kullanımı giderek artmaktadır 1,8,26,27. Bununla birlikte, deneysel ve klinik ortamlarda PRP uygulamalarına yönelik önemli bir eleştiri, bu hemobileşenleri hazırlamak için kullanılan teknikler ve protokoller hakkında temel verilerin eksikliğidir28<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Universidad de Caldas, Manizales, Kolombiya'daki Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados'a bu makaleyi yayınlama konusundaki mali destekleri için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL düz venöz kan toplama tüpleri BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, ABDReferans 366430Bu sadece bir örnektir, diğer markaların tüpleri kullanılabilir.
4.5 mL sodyum sitrat tüpleri (105 M/3. 2%) BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, ABD107451Bu sadece bir örnektir, diğer markaların tüpleri kullanılabilir.
Tezgah Üstü SantrifüjRotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, AlmanyaDiğer tezgah üstü santrifüjler kullanılabilir.
Kelebek iğne (21 G × 0.75 in.) ile 12 in. tüp ve önceden takılmış tutucu Safety-Lok Kan Alma Seti, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, ABDReferans 367296Bu sadece bir örnektir, diğer markaların kelebek iğneleri kullanılabilir.
Klorheksidin köpük çözeltisi %2.3-4 Bu ürünlerin markası veya ticari isimleri ülkeden ülkeye değişiklik gösterebilir.
Sınıf II laminer akış başlığıThermo Fischer Bilimsel, Waltham, MA, ABDDiğer sınıf II laminer akış davlumbazları kullanılabilir
ELISA okuyucuThermo Fischer Bilimsel, Waltham, MA, ABD
%95 oranında etil alkolBu ürünlerin markası veya ticari isimleri ülkeden ülkeye değişiklik gösterebilir.
İnsan PDGF-BB İkili Set ELISAR& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, ABDDY220 Serisi
İnsan TGF-beta 1 Çift Set ELISAR& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, ABDDY240 Serisi
Povidone iyot köpük çözeltisi %4-10 Bu ürünlerin markası veya ticari isimleri ülkeden ülkeye değişiklik gösterebilir.
SPSS 25.0 yazılımıIBM Corp, SPSS, NY, ABD
Çeşitli hacimlerde steril luer şırıngalar Atılabilir Şırınga, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, ABDBu sadece bir örnektir, diğer markaların şırıngaları kullanılabilir.
Steril spinal iğne (18 G × 90 mm) BD Quincke Spinel İğnesi, Franklin Lakes, NJ, ABDBu sadece bir örnektir, diğer markaların omurilik iğneleri kullanılabilir.

Kaynaklar

  1. Pérez Fraile, A., González-Cubero, E., Martínez-Flórez, S., Olivera, E. R., Villar-Suárez, V. Regenerative medicine applied to musculoskeletal diseases in equines: a systematic review. Vet Sci. 10 (12), 666(2023).
  2. Boone, L., Peroni, J. Introduction to equine biologic and regenerative therapies. Vet Clin North Am Equine Pract. 39 (3), 419-427 (2023).
  3. Carmona, J. U., Gómez, W. A., López, C. Could platelet-rich plasma be a clinical treatment for horses with laminitis. J Equine Vet Sci. 61, 46-57 (2018).
  4. Gilger, B. C. Use of biologics and stem cells in equine ophthalmology. Vet Clin North Am Equine Pract. 39 (3), 541-552 (2023).
  5. Pereira, R., et al. Evaluation of three methods of platelet-rich plasma for treatment of equine distal limb skin wounds. J Equine Vet Sci. 72, 1-7 (2019).
  6. Camargo Garbin, L., Lopez, C., Carmona, J. U. A critical overview of the use of platelet-rich plasma in equine medicine over the last decade. Front Vet Sci. 8, 641818(2021).
  7. Jiménez-Aristizabal, R. F., et al. Long-term cytokine and growth factor release from equine platelet-rich fibrin clots obtained with two different centrifugation protocols. Cytokine. 97, 149-155 (2017).
  8. McCarrel, T. M. Equine platelet-rich plasma. Vet Clin North Am Equine Pract. 39 (3), 429-442 (2023).
  9. Garbin, L. C., Olver, C. S. Platelet-rich products and their application to osteoarthritis. J Equine Vet Sci. 86, 102820(2020).
  10. Anitua, E., et al. Advances in platelet rich plasma-derived extracellular vesicles for regenerative medicine: a systematic-narrative review. Int J Mol Sci. 24 (17), 13043(2023).
  11. Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27 (3), 158-167 (2009).
  12. Dohan Ehrenfest, D. M., et al. Classification of platelet concentrates (platelet-rich plasma-PRP, platelet-rich fibrin-PRF) for topical and infiltrative use in orthopedic and sports medicine: current consensus, clinical implications and perspectives. Muscles Ligaments Tendons J. 4 (1), 3-9 (2014).
  13. Giraldo, C. E., Álvarez, M. E., Carmona, J. U. Effects of sodium citrate and acid citrate dextrose solutions on cell counts and growth factor release from equine pure-platelet rich plasma and pure-platelet rich gel. BMC Vet Res. 11, 60(2015).
  14. Argüelles, D., et al. Evaluation of single and double centrifugation tube methods for concentrating equine platelets. Res Vet Sci. 81 (2), 237-245 (2006).
  15. Carmona, J. U., López, C., Sandoval, J. A. Review of the currently available systems to obtain platelet related products to treat equine musculoskeletal injuries. Recent Patents on Regenerative Medicine. 3 (2), 148-159 (2013).
  16. Jildeh, T. R., Su, C. A., Vopat, M. L., Brown, J. R., Huard, J. A review of commercially available point-of-care devices to concentrate platelet-rich plasma. Cureus. 14 (8), e28498(2022).
  17. Arita, A., Tobita, M. Adverse events related to platelet-rich plasma therapy and future issues to be resolved. Regen Ther. 26, 496-501 (2024).
  18. Sutter, W. W., Kaneps, A. J., Bertone, A. L. Comparison of hematologic values and transforming growth factor-beta and insulin-like growth factor concentrations in platelet concentrates obtained by use of buffy coat and apheresis methods from equine blood. Am J Vet Res. 65 (7), 924-930 (2004).
  19. Mirza, M. H., et al. Gait changes vary among horses with naturally occurring osteoarthritis following intra-articular administration of autologous platelet-rich plasma. Front Vet Sci. 3, 29(2016).
  20. Peng, C., Yang, L., Labens, R., Gao, Y., Zhu, Y., Li, J. A systematic review and meta-analysis of the efficacy of platelet-rich plasma products for treatment of equine joint disease. Equine Vet J. 56 (5), 858-869 (2024).
  21. Alvarez, M. E., Giraldo, C. E., Carmona, J. U. Monitoring bacterial contamination in equine platelet concentrates obtained by the tube method in a clean laboratory environment under three different technical conditions. Equine Vet J. 42 (1), 63-67 (2010).
  22. Pereira, R. C. dF., et al. Avaliação de sete protocolos para obtenção de plasma rico em plaquetas na espécie equina. Ciência Rural. (6), (2013).
  23. Giraldo, C. E., Álvarez, M. E., Carmona, J. U. Influence of calcium salts and bovine thrombin on growth factor release from equine platelet-rich gel supernatants. Vet Comp Orthop Traumatol. 30 (1), 1-7 (2017).
  24. Carmona, J. U., López, C., Ceballos-Márquez, A. Temporal release and denature of several mediators in pure platelet-rich plasma and temperature-induced platelet lysates derived from a similar bovine platelet concentrate. Vet Med Int. 2022, 2609508(2022).
  25. Weibrich, G., Kleis, W. K., Hitzler, W. E., Hafner, G. Comparison of the platelet concentrate collection system with the plasma-rich-in-growth-factors kit to produce platelet-rich plasma: a technical report. Int J Oral Maxillofac Implants. 20 (1), 118-123 (2005).
  26. Cecerska-Heryć, E., Goszka, M., Serwin, N., et al. Applications of the regenerative capacity of platelets in modern medicine. Cytokine Growth Factor Rev. 64, 84-94 (2022).
  27. Bahadir, B., Sarikaya, B. Platelet-rich plasma in the management of rotator cuff tendinopathy. Jt Dis Relat Surg. 35 (2), 462-467 (2024).
  28. Harrison, P., Alsousou, J. Studies on platelet rich plasma - new editorial policy for "platelets". Platelets. 31 (3), 281-282 (2020).
  29. Chahla, J., et al. A call for standardization in platelet-rich plasma preparation protocols and composition reporting: a systematic review of the clinical orthopaedic literature. J Bone Joint Surg Am. 99 (20), 1769-1779 (2017).
  30. Ríos, D. L., López, C., Álvarez, M. E., Samudio, I. J., Carmona, J. U. Effects over time of two platelet gel supernatants on growth factor, cytokine and hyaluronan concentrations in normal synovial membrane explants challenged with lipopolysaccharide. BMC Musculoskelet Disord. 16, 153(2015).
  31. Carmona, J. U., et al. In vitro effects of platelet-rich gel supernatants on histology and chondrocyte apoptosis scores, hyaluronan release and gene expression of equine cartilage explants challenged with lipopolysaccharide. BMC Vet Res. 12 (1), 135(2016).
  32. Castillo-Franz, C., López, C., Carmona, J. U. Evaluation of the catabolic and anabolic gene expression effects and histology changes induced by platelet-rich gel supernatants in equine suspensory ligament explants challenged with lipopolysaccharide. MLTJ-Muscles Ligaments and Tendons. 11 (1), 1-14 (2021).
  33. Argüelles, D., Carmona, J. U., Climent, F., Muñoz, E., Prades, M. Autologous platelet concentrates as a treatment for musculoskeletal lesions in five horses. Vet Rec. 162 (7), 208-211 (2008).
  34. Carmona, J. U., Argüelles, D., Climent, F., Prades, M. Autologous platelet concentrates as a treatment of horses with osteoarthritis: a preliminary pilot clinical study. J Equine Vet Sci. 27 (4), 167-170 (2007).
  35. Dejnek, M., et al. Content of blood cell components, inflammatory cytokines and growth factors in autologous platelet-rich plasma obtained by various methods. World J Orthop. 13 (6), 587-602 (2022).
  36. Giraldo, C. E., et al. Effects of the breed, sex and age on cellular content and growth factor release from equine pure-platelet rich plasma and pure-platelet rich gel. BMC Vet Res. 9, 29(2013).
  37. Zimmermann, R., et al. Sample preparation technique and white cell content influence the detectable levels of growth factors in platelet concentrates. Vox Sang. 85 (4), 283-289 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

PRP Haz rlamaKas skelet Sistemi BozukluklarTrombosit KonsantrasyonuL kosit Azalt mB y me Fakt rleriLaminer Ak l KabinMasa st Santrif j