Primer renal proksimal tübül epitel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için tüm insan böbreklerinin işlenmesi ve bu hücrelerin renal proksimal tübülü özetlemek için üç boyutlu, mikroakışkan, mikrofizyolojik bir platformda uygulanması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Primer İnsan Proksimal Tübül Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Renal Proksimal Tübülün Mikrofizyolojik Modelinin Oluşturulmasında Kullanımı
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Böbrek hastalığı, 37 milyon Amerikalı da dahil olmak üzere dünya çapında 850 milyondan fazla insanı etkilemektedir. Kronik böbrek hastalığı için risk faktörleri arasında çevresel etkiler, genetik yatkınlıklar, birlikte var olan tıbbi durumlar ve akut böbrek hasarı öyküsü yer alır. Bu faktörlerin gelişmesi genellikle aylar veya yıllar alır ve hastalık etiyolojisi ve patofizyolojisi ile ilgili uzunlamasına çalışmaları karmaşıklaştırır. Hastalık mekanizmalarını daha iyi anlamamızı sağlamak ve ilaç geliştirmede nefrotoksisite tahminini geliştirmek için gelişmiş böbrek modellerine ihtiyaç vardır. Böbrekteki proksimal tübül epitel hücreleri (PTEC'ler), ksenobiyotik ve toksin klirensinin yanı sıra temel besin maddelerinin yeniden emilmesinde kritik bir rol oynar. Daha önce, izole edilmiş primer PTEC'lerle doldurulmuş üç boyutlu (3D) mikrofizyolojik sistem (MPS) platformlarının, renal ilaç etkileşimlerini araştırmak, bileşiklerin nefrotoksisitesini değerlendirmek ve ilaç klerensini tahmin etmek için kullanılabileceğini göstermiştik. Burada, tüm insan böbreklerinden birincil PTEC'leri izole etmek ve kültürlemek ve bunları in vivo böbrek fizyolojisini taklit eden bir 3D MPS platformuna tohumlamak için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, MPS cihazlarında 6 aya kadar PTEC canlılığını, fizyolojik morfolojisini ve anahtar taşıyıcı proteinlerin fonksiyonel polarizasyonunu destekleyen uzun vadeli çalışmalara olanak tanır.
Giriş
Böbrek, çok çeşitli ksenobiyotiklerin, toksinlerin ve endojen bileşiklerin vücuttan temizlenmesinde ve ortadan kaldırılmasında kritik bir rol oynar. Bu, atık ürünleri uzaklaştırmak için kanın filtrelenmesi ve elektrolit dengesinin, sıvı seviyelerinin ve pH'ın düzenlenmesiyle elde edilir. Her insan böbreği, böbreğin yapısal ve işlevsel birimleri olan yaklaşık bir milyon nefron içerir1. Bu nefronlar içinde, proksimal tübül epitel hücreleri (PTEC'ler) olarak bilinen proksimal tübüllerdeki özel epitel hücreleri, glikoz, amino asitler ve iyonlar gibi temel moleküllerin yeniden emilmesinden ve ayrıca ilaç substratlar....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm çalışmalar, Washington Üniversitesi'nin insan dokusu işleme yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Uygun donörler aşağıdaki gereksinimleri karşılar: 36 saatten az soğuk iskemik zaman (CIT), bilinen böbrek hastalığı öyküsü, diyaliz veya başka herhangi bir tıbbi durum (ör., diabetes mellitus tip 1 veya 2, hepatit B, hepatit C, insan immün yetmezlik virüsleri (HIV), viral/bakteriyel menenjit, metisiline dirençli Staphylococcus aureus enfeksiyonu, sifiliz, sepsis veya Covid-19). Bu çalışmada kullanılan tüm insan böbrekleri, UNOS onaylı bir OPO aracılığıyla elde edildi.
1. Biyogüvenlik kabi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
2D kültürde zaman içinde izole edilmiş primer PTEC'lerin morfolojisi ve birleşmesi
Böbrek korteksinden izolasyonun ardından, PTEC'lerin ilk ortam değişikliğinden önce en az 48 saat boyunca rahatsız edilmeden büyümesine izin verildi. Hücrelerin kültürlenmesinden yaklaşık bir hafta sonra, kültür şişesi boyunca tek tip bir epitelyal, parke taşı benzeri morfoloji ile küçük PTEC partileri görünmelidir (Şekil 1A,B). Farklı donö.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
MPS veya çip üzerinde organ teknolojileri, insan fizyolojisinin temel yönlerini özetlemek için son derece ilgili bir in vitro platform sunar ve böylece ilaç geliştirme ve toksikolojik değerlendirmelerde hayvan modellerine olan bağımlılığı azaltır. Son zamanlarda, FDA Modernizasyon Yasası 2.0 (2022), diğer alternatiflerin yanı sıra MPS'nin Araştırma Amaçlı Yeni İlaç uygulamalarına dahil edilmesine izin vermiştir29. Bu protokol, insan proksimal tübül fonksi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması veya finansal açıklama yapmadıklarını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışmanın bazı bölümleri, NASA sözleşmesi 80ARC023CA001, Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), NCATS ve Uzayda Bilimin İlerlemesi Merkezi (CASIS) (UG3TR002178), Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS) (P30ES00703), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (T32GM007750), Kuzeybatı Böbrek Merkezlerinden Böbrek Araştırmalarına sınırsız bir hediye tarafından desteklenmiştir. Enstitü ve Washington Üniversitesi Eczacılık Okulu (Ji-Ping Wang Ödülü ve Bradley Bursu).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mL Luer-Lok uçlu şırıngalar | Becton, Dickinson | 309628 | |
| 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri | CELLTREAT Bilimsel Ürünleri | 229442 | |
| 15 mL steril konik polipropilen tüp | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 3D mikrofizyolojik cihaz | Nortis | TCC-001 | |
| 5 mL Luer-Lok uçlu şırıngalar | Becton, Dickinson | 309646 | |
| 50 mL steril konik polipropilen tüp | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Antibiyotik-Antimikotik (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Kollagenaz, Tip IV, toz | ThermoFisher Scientific | 17104019 | |
| D-(+)-Glikoz | MilliporeSigma | G8270 | |
| Tanımlanmış Tripsin İnhibitörü | ThermoFisher Scientific | R007100 | |
| Dimetil sülfoksit, Biyoreaktiv, Termobilimsel Kimyasallar | ThermoFisher Scientific | J66650-AK | |
| Dispase II, barut | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Dulbecco' s MEM (DMEM)/F-12 glukozsuz | ABD Biyolojik Yaşam Bilimleri | D9807-02 | |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS), kalsiyum, magnezyum | ThermoFisher Scientific | 14040117 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Premium | ThermoFisher Scientific | A5670701 | |
| Finnpipette F2 İyi Laboratuvar Pipetleme (GLP) Kitleri | ThermoFisher Scientific | 05-719-511 | Mikropipetler |
| Fisherbrand SureOne Micropoint Pipet Uçları, Evrensel Uyum, Filtrelenmemiş | Fisher Scientific | 02707407, 02707410, 02707438 | |
| Taze tüm insan böbreği | Novabioz | https://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/ | İnsan böbrekleri, UNOS tarafından onaylanan bir OPO olan Novabiosis ile elde edilmiştir |
| Nemlendirilmiş kuluçka makinesi (37 derece ve derece; C ve 5% CO2) | Fisher Scientific | 51033556 | |
| Hidrokortizon | MilliporeSigma | H0888 | |
| Yörünge Sallacı Kuluçka Aşaması | Avantor | 12620-946 | |
| İnsülin-Transferrin-Selenyum (100X) (ITS -G) | ThermoFisher Scientific | 41400045 | |
| İç İplik Kriyojenik Şişeler | Corning | 430487 | |
| Kimtech Bilim Kimwipe'leri | Kimberly-Clark Profesyonel | 34120 | |
| Luer Stubs (Küt iğne), 22 G x 0.5 inç | Instech Laboratuvarları, Inc. | LS22 | |
| Orta 199, Earle's Salts (10x) | ThermoFisher Scientific | 21180021 | |
| Megafuge 8 Küçük Tezgah Üstü Santrifüj | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Metal Bağlantı (küt) | Instech Laboratuvarları, Inc. | SC 20/15 | |
| Bay Frosty Dondurma Kabı | ThermoFisher Scientific | 5100-0036 | |
| Nikon Eclipse Ti-S Mikroskobu | Nikon Instruments | https://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/ | Orijinal model üretimi kaldırıldı |
| Nunc İşlenmemiş Şişeler, T-25 | ThermoFisher Scientific | 169900 | |
| Nunc İşlenmemiş Şişeler, T-75 | ThermoFisher Scientific | 156800 | |
| Pipet, 10 mL, Gradasyonlu, 1/10 mL, Steril | Greiner Bio-One | 607180 | |
| Silikon borular, C-flex borular, (ID: 0.020", OD: 0.083") | Cole-Parmer | 06422-00 | |
| Tek kenarlı jilet (steril) | Bioseal | KI-205/50 | |
| Sodyum Bikarbonat | MilliporeSigma | S6297 | |
| Sodyum Hidroksit | MilliporeSigma | S8045 | |
| PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri | ThermoFisher Scientific | 567-0020 | |
| Doku kültürü işlenmiş tabaklar, 150 mm x 20 mm Havalandırmalı | Genesee Scientific | 25-203 | |
| Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızı | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Tip I kolajen, fare kuyruğu | Corning | 354236 | |
| Tip IV Kolajen, Fare | Corning | 354233 |
Kaynaklar
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Zhang, X., et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational stu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
