Yöntem makalesi

U2 OS Hücre Kültürü Kullanılarak Canlı Hücre, Floresan Mikroskobu için Bir Elektroporasyon Sitometrisi Protokolü

DOI:

10.3791/68005

⸱

13 Haziran 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporasyon, moleküler kargoyu tanıtmak için hücre kültürlerinde geçici gözenekler oluşturmak için darbeli elektrik alanlarının (PEF'ler) kullanılmasıdır. Bu teknik son zamanlarda araştırma ve klinik ortamlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, canlı hücreli, floresan mikroskobu gerçekleştirmek için yakın zamanda geliştirilen "Elektroporasyon Sitometri Sistemi" ni kullanarak elektroporasyon tekniklerini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Darbeli elektrik alanları (PEF'ler), tıbbi araştırmalarda ve klinik uygulamalarda geniş bir uygulama alanına sahiptir. Önemli bir araştırma alanı elektroporasyona (geri dönüşümlü veya geri dönüşümsüz) odaklanmaktadır. Tersinir elektroporasyon, tipik olarak gen elektrotransferi (GET) olarak adlandırılan plazmit DNA gibi hücre zarları yoluyla molekülleri transfer etmek için birkaç on yıldır kullanılmaktadır. Tersine, geri dönüşümsüz elektroporasyon, kanser tedavisinde popüler bir teknik haline geldi ve PEF'leri kullanarak hücreleri kalıcı olarak parçalayarak toksik olmayan bir alternatif sağladı. Bu, elektrokemoterapi (EKT) olarak bilinen etkiyi arttırmak için çeşitli ilaç türleri veya reaktiflerle birleştirilebilir. Bununla birlikte, pratik uygulamalardaki geniş başarıya rağmen, mevcut teknikleri geliştirmek için daha fazla destekleyici teknoloji ve araştırma gerekmektedir. Bunu ele almak için, uzun süreli floresan mikroskobu gerçekleştirme yeteneği ile canlı hücre PEF deneylerini desteklemek için bir elektroporasyon sitometri sistemi geliştirilmiştir. Bu, PEF maruziyetine yanıt olarak hücre döngüsündeki değişiklikleri değerlendirmek için kararlı bir şekilde ifade eden bir FUCCI (CA) 5 U2-OS hücre hattı ile kombinasyon halindeydi. Bunu yaparken, FUCCI(CA)5 raportörüne dayalı olarak hücre aktivitesinde gerçek zamanlı değişiklikler sağlayan 30 saate kadar timelapse mikroskopi elde edildi. Sonuç olarak, faza özgü değişiklikler, aşağı akış analizi için ölçülebilirdi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Darbeli elektrik alanları (PEF'ler), biyoloji ve klinik uygulamalarda çeşitli uygulamalar için ortak bir araç haline gelmiştir1. Bunlar genel olarak elektroporasyon (EP) ve elektrostimülasyon (ES) olarak kategorize edilebilir. Elektroporasyonun tersinir ve tersinmez elektroporasyon olarak bilinen iki alt alanı vardır. Tersinir elektroporasyon (RE), plazmit DNA gibi moleküler kargoları memeli, bakteri ve maya2 gibi çeşitli tipteki hücrelere aktarmak için onlarca yıldır etkili bir araç olarak kullanılmaktadır. Daha yakın zamanlarda, geri dönüşümsüz elektroporasyon (IRE), mevcut kanser tedavilerine toksik olmayan bir alternatif olarak öne çıkmıştır3. Gelişmekte olan bir alt alan, özellikle belirli kardiyak işlev bozukluklarını tedavi etmek için termal olmayan doku çıkarılmasına odaklanan Darbeli Alan Ablasyonu (PFA) olarak adlandırılır4. İlaçlar ve diğer reaktiflerle kombinasyon halinde bu, elektrokemoterapinin (EKT) gelişmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, PEF tedavilerinin mevcut anlayışı klinik uygulamalar tarafından geride bırakılmaktadır5. Burada elektrokemoterapileri araştırmak için bir elektroporasyon sitometri sistemi sunuyoruz. Hücre döngüsü, hücre canlılığının önemli bir göstergesini temsil eder ve değişiklikler, faza özgü etkileri tanımlayabilir. Bu araçları geliştirerek, protokoller daha hızlı uyarlanabilir ve daha geniş bir kanser yelpazesi için daha etkili tedaviler sağlayabilir.

Özel elektrositometri sistemimiz (Şekil 1), alüminyum paralel plaka elektrotları ve bir kapak camı tabanı olan bir haznenin yanı sıra basit bir üstel bozunma darbe üretecinden oluşur. Oda, 3D baskılı bir odadan yapılmıştır ve # 1.5 kapaklı cam taban, tıbbi sınıf basınca duyarlı yapıştırıcı ile yapıştırılmıştır. Elektrotlar, hazneye yerleştirilmiş desteklerin üzerine yerleştirilen yapışkan alüminyum filmden oluşur ve 0,4 cm aralıklarla iki paralel elektrot sağlar. Bu, ticari elektrotlar için yaygın bir konfigürasyondur ve mevcut protokolleri hızlı bir şekilde uyarlayabilen sağlam bir tasarım sağlar. Hazne, aynı zamanda ticari mikroskop sağlayıcıları tarafından desteklenen yaygın bir slayt formatı olan 25 mm x 55 mm slaytlar için tasarlanmış çevresel muhafazalara sığabilir. Darbe üreteci, 330 V'a kadar üstel bozunma darbeleri sağlayarak, tersinir ve tersinmez elektroporasyon dahil olmak üzere çok çeşitli deneylerin elde edilmesini sağlar.

PEF'lerin hücre döngüsü üzerindeki etkilerini incelemek için, bir floresan canlı hücre döngüsü raporlayıcı yapısı olan Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesini (CA)5 (FUCCI(CA)5) ifade eden bir transgenik insan osteosarkom hücre hattı (U2 OS) kullandık. Sistem, hücre döngüsü sırasında belirli oranlarda üretilen ve geri dönüştürülen iki floresan, kesilmiş Geminin ve Cdt1 formunu sunar. Ek olarak, apoptoz, deney sırasında kararlı bir şekilde eksprese eden bir FUCCI (CA) 5 U2-OS hücresi hattı kullanılarak doğrudan izlenebilir. Hücre döngüsü sırasında, raportör her aşamada öngörülebilir bir şekilde çalışır, çünkü bunlar hücrede doğal olarak ifade edilen işlevsel versiyonlarla aynı oranlarda üretilir ve bozulur. Apoptoz meydana geldiğinde, hücre döngüsünün hızla kapanması ile bu döngü bozulur. Tipik olarak, bu, hücre döngüsü içinde floresan bayatlaması olarak görsel olarak ortaya çıkacak ve ardından raportörlerin çekirdek6'ya lokalizasyonu nedeniyle açıkça görülebilen çekirdekte dramatik morfolojik değişiklikler izleyecektir. Bu, zaman içinde tek hücrelerdeki her fazın görsel olarak tanımlanmasına izin verir (Şekil 2). Tersinir elektroporasyon, hücre içi koşullarda değişikliklere neden olur ve araştırma için 180 V üstel bozunma darbesi seçilmiştir. Bu darbe, popülasyonun çoğunluğunda elektroporasyonu sağlarken hücre ölümünü mümkün olduğunca sınırlamak için seçildi. Bu, altı memeli hücre hattı için optimal elektroporasyon darbe parametrelerini araştıran önceki araştırmalara dayanarak belirlendi. 180 V'luk bir darbenin enerji yoğunluğu, optimal transfeksiyon parametrelerinden biraz daha düşüktü ve yüksek porasyon7 ile daha iyi hücre canlılığı sağladı. Nabzın etkisi, PEF uygulaması olan ve olmayan bir timidin çift bloğu kullanılarak senkronize edilmemiş hücrelerde ve S-fazı senkronize hücrelerde incelenmiştir (Şekil 3). Sonuçlar, kontrole kıyasla S ve G2 için ortalama uzunlukta bir azalma olduğunu gösterdi. Bu, S fazının PEF maruziyetine duyarlı olduğunu ve daha hızlı bir hücre döngüsü ile sonuçlandığını gösterdi. Bu, elektroporasyon sitometri sisteminin, hücre döngüsünü incelemek için PEF'lerin dağıtımını uzun süreli canlı hücre görüntüleme ile birleştirebildiğini gösterdi. Bu platformu, PEF'lere yanıt olarak hücre döngüsü boyunca hücre ilerlemesini gözlemlemek için kullanmış olsak da, bu, PEF'ler ve hücre kültürü için çeşitli uygulamaları ve koşulları incelemek için yararlı bir araçtır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü hazırlama

  1. Aşağıdaki parametrelerle tersinir elektroporasyon kullanarak kararlı hattı hazırlayın: 0,4 cm'lik bir küvette 5 μg plazmit DNA ile 100 μL yeniden süspanse edilmiş U2 OS hücresi (6 × 106 hücre / mL) ve 10 ms için 180 V kare dalga darbesi.
  2. Herhangi bir uygun 3D yazıcı ve polilaktik asit (PLA) gibi biyouyumlu plastik kullanarak özel hazne tasarımını D-yazdırın (bkz. Ek Dosya 1). Tamamlanan hazneyi etanol (% 70) kullanarak dezenfekte edin ve kullanmadan önce steril bir kapta saklayın.
  3. U2-OS FUCCI(CA)5 hücrelerini, %10 Fetal Sığır Serumu ve %1 PenStrep içeren 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Media (DMEM)-Yüksek Glikozu ile 10 cm'lik bir plakada kültürleyin ve 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin.
  4. Kültür% 80 birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin, hücre kültürünü Fosfat tamponlu Salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri 1.5 dakika boyunca 1 mL% 0.25 Tripsin kullanarak ayırın.
  5. Hücre kültürünü 5 mL DMEM-Yüksek Glikoz (% 10 FBS ve% 1 PenStrep içeren) içinde yeniden süspanse ederek tripsini nötralize edin.
  6. Yeniden süspanse hücre kültüründen 100 μL'lik bir numune alın ve alt cam lamel üzerindeki elektroporasyon sitometri sistemi odasına yerleştirin. Numuneyi yerleştirdikten sonra haznenin %30 birleşim halinde olduğundan emin olun. Numune inkübasyondan önce aşırı birleşmiş gibi görünüyorsa, numuneyi aspire edin ve numune hacmini düşürün.
  7. Yavaş yavaş, haznenin uzak ucuna 4 mL DMEM-Yüksek Glikoz (%10 FBS ve %1 PenStrep içeren) ekleyin ve sıvının numuneyi dışarı atmasını önleyin.
  8. Haznenin üstüne standart bir mikroskop lamı yerleştirin ve hazneyi 37 °C ve %5CO2'de 24 saat inkübe edin, böylece kültürün hazne tabanına tam olarak yapıştığından emin olun. İsteğe bağlı olarak, daha kolay aşağı akış hücre ölçümü ve apoptoz için hücre çekirdeklerini boyamak için Hoechst 33342 (1 μg/mL) kullanın. Lekeyi hızlandırılmış mikroskopiden 30 dakika önce gerçekleştirin.

2. Mikroskop hazırlama

  1. İlk olarak, çevresel kontrollere ve hazneye sahip ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu açın ve elektroporasyon gerçekleştirmeden önce koşulların stabilize olmasına izin verin.
    NOT: 25 mm x 55 mm x 16 mm hazne slaytını kabul edebilen çevresel bir sisteme sahip herhangi bir ters floresan mikroskobu. Tasarım başlangıçta referans alınan ters çevrilmiş mikroskop (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ilgili çevresel sistem üzerinde çalışmak üzere tasarlanmıştır.
    Sahnenin ısınması, metal genleşmesi nedeniyle görüntüde kaymaya neden olabilir.
  2. Çevresel sistem optimum sıcaklığa ulaşırken, uygun elektrik kabloları kullanarak darbe üreteci kondansatörüne ve yüksek voltaj anahtarına bir Dijital Multimetre bağlayın. Bu protokolü takip etmek için, elektroporasyon odası ile hızlı montaj ve demontaj sağlamak için "timsah" klipsli kablolar kullanın.
  3. Ardından, 20x büyütmeyi seçin ve mikroskobun yazılımını kullanarak, FUCCI(CA)5 sistemindeki iki floresan proteine karşılık gelen FITC (GFP) ve A594 (TexRed/mCherry) kanallarının (isteğe bağlı olarak Hoechst 33342 için DAPI kanalı) seçildiğinden emin olun. Uzun süreli zaman atlamalı çekimlerde fotoğrafın zarar görmesini önlemek için düşük pozlama ayarlarını (genellikle <0,05 sn) kullanın.
  4. Zaman atlamalı çekime başlamadan önce test görüntüleri çekerek görüntü odağını ve kalitesini optimize edin.
    NOT: Floresan, yalnızca renk görselleştirme için gerektiği kadar parlak olmalıdır.
  5. Fotoğraf hasarını azaltırken hızlandırılmış çekim başına yüksek hacimli hücre döngüsü verileri elde etmek için zaman atlamalı çekimi 24 saat boyunca her 10 dakikada bir 3 - 6 bakış açısı yakalayacak şekilde hızlandırın.
    NOT: Sürenin uzunluğu, hücresel aktivitenin zaman ölçeğine bağlı olarak değişebilir.
  6. Hızlandırılmış çekim sırasında hücre kültürünü takip ederek en iyi sonuçları elde etmek için A594 kanalı için otomatik odaklamanın etkinleştirildiğinden emin olun.
  7. Elektrik izleme gerçekleştirilene kadar yazılımı bekleme modunda bırakın. Darbe verildikten sonra, mümkün olan en yüksek veri doğruluğunu sağlamak için hızlandırılmış çekimi hemen etkinleştirin.

3. Elektroporasyon

  1. Elektroporasyon sitometri odasını uygun bir çevre odası ile mikroskoba yerleştirin. Elektroporasyondan önce, hücre döngüsünün etkilenmediğinden emin olmak için çevresel sistem çalışırken odayı kapalı bırakın.
  2. Nabız üretecine bir Dijital Multimetre takın ve çevre haznesini açarak timsah klipsli kablolar kullanarak nabız üretecini hazne elektrotlarına bağlayın.
  3. Darbe üretecindeki kondansatörü 180 V'a kadar şarj edin ve Dijital Multimetre 0 Volt okuyana kadar darbeyi hızlı bir şekilde hazneye boşaltın.
  4. Hazneye giden elektrik bağlantılarını çıkarın ve uygun kültür koşullarını sağlamak için kapağı mümkün olan en kısa sürede değiştirin.
  5. Mikroskop çevre sistemi yerleştirildikten hemen sonra hızlandırılmış çekimi etkinleştirin.

4. Hızlandırılmış veri toplama

  1. Hızlandırılmış çekim tamamlandıktan sonra, zaman atlamalı çekimi, zaman atlamalı çekim boyunca yakalanan görüntülere dayalı olarak tek bir video olarak kaydetmek için mikroskop yazılımını kullanın. Manuel nicelemeye yardımcı olmak için bu aşamada görsel kaliteyi iyileştirin.
    NOT: Herhangi bir kare hızı seçilebilir; Bununla birlikte, 6 kare/sn, 1 video saniyesi ile orta düzeyde bir tekrar hızı sağlar ve bu da 1 saat gerçek zamanlı ile sonuçlanır.
  2. Hızlandırılmış video hazırlandıktan sonra, FITC ve A594 sinyallerindeki değişiklikleri gözlemleyerek zaman içindeki hücre fazlarını takip edin

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FUCCI sistemi (Şekil 2) kullanılarak, protein ekspresyonu ve unbiquitination'ın bir sonucu olarak her bir rengin hücre tarafından ifade edildiği sürenin uzunluğu ölçülerek görsel hücre döngüsü verileri elde edildi. Senkronize edilmemiş ve senkronize deneylerden elde edilen sonuçlara dayanarak (Şekil 3), S-fazı PEF maruziyetinin hücre döngüsünü yukarı regüle ettiği açıktı. Bu, daha hızlı bir hücre döngüsüne işaret eden ortalama faz uzunluğundaki azalma ile kanıtl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde, hücre döngüsü faz verileri, 24 saate kadar olan süreler için yüksek hacimli tek hücreler için ölçülebilir. Bu protokol, FAC'ler gibi alternatif yöntemlerle karşılaştırılabilir hücre döngüsü verileri verdi. Bu, hücrelerin hücre döngüsü boyunca ilerledikçe floresan olarak etiketlendiği yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. En az 24 saat inkübe edildikten sonra, belirli bir faz8'deki popülasyon miktarına bağlı olarak floresa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem Gupta Lab'a hem de Rackus Group üyelerine laboratuvar içinde ve dışında devam eden destekleri için teşekkür ederiz. Mitacs ile ortaklık yoluyla cömertçe sağlanan hibe finansmanı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Oda Slaytı (3D Baskılı/Değerlendirilmiş) N/AN/A
Kültür Plakası (10 cm)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusN/AAlternatif mikroskop modelleri de kullanılabilir. Sahne ve çevre sisteminin elektroporasyon odasını barındırabildiğinden emin olun (55 mm x 
DMEM & ndash; Yüksek GlukozGibco11965092
Fetal Sığır Serumu ThermoFisherA5256701 
i3 MK3S 3D YazıcıPrusaN/ASTL dosyalarını kullanabilen alternatif yazıcı modelleri kullanılabilir.
Kalem StrepThermoFisher15070063
Fosfat Tamponlu TuzluGibco10010031
tFUCCI (CA) 5Addgene153521
TripsinSigma-Aldrich9002-07-07
U2-OS Hücre HattıATCCHTB-96

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
  5. Miklavčič, D., Mali, B., Kos, B., Heller, H., Serša, H. Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice. Biomed Eng Online. 13 (1), 29(2014).
  6. Ando, R., Sakaue-Sawano, A., Shoda, K., Miyawaki, A. Two coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression. Cell Struct Funct. 48 (2), 132-144 (2023).
  7. Nesmith, T., Vieira, C., Rackus, D., Gupta, G. An electroporation cytometry system for long-term, live cell cycle analysis. Biomicrofluidics. 18 (4), 044105(2024).
  8. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166 (3906), 747-749 (1969).
  9. Chao, H. X., et al. Evidence that the human cell cycle is a series of uncoupled, memoryless phases. Mol Sys Bio. 15 (3), e8604(2019).
  10. Diehl, F. F., Sapp, K. M., Vander Heiden, M. G. The bidirectional relationship between metabolism and cell cycle control. Trends Cell Bio. 34 (2), 136-149 (2024).
  11. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).
  12. Klein, S. G., et al. Toward best practices for controlling mammalian cell culture environments. Front Cell Dev Bio. 10, 788808(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pulsed Electric FieldsLive Cell ImagingU2 OS CellsCell Cycle AnalysisTime Lapse MicroscopyFUCCI ReporterS Phase SynchronizationMicrofluidic Cell Culture

İlgili makaleler