Yöntem makalesi

Karmaşık dışkı topluluklarının sürekli kültürü için biyoreaktör düzeneği

DOI:

10.3791/68035

⸱

25 Nisan 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, 2Department of Medicine, Department of Infectious Diseases and Immunology, Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, anaerobik koşullar altında karmaşık dışkı topluluklarının sürekli akış kültürü için kullanılacak mini biyoreaktör dizilerinin montajını detaylandırır. Daha fazla analiz için reaktörlerin montajı, aşılanması ve numune alınması yöntemlerini de tartışıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiyota, özellikle bakteriler, toplum bileşimini ve mikrobiyal metabolik çıktıyı dinamik olarak değiştiren mikro ve makro besinler, farmakolojik bileşikler ve inflamatuar mediatörler gibi çeşitli çevresel maruziyetlere yanıt verir. Fizyolojik kültür koşullarının mikrobiyal toplulukları ve çeşitliliği ve metabolik kapasitelerini nasıl etkilediğini anlamak, bunların sağlık ve hastalıklar üzerindeki etkileri hakkında önemli bilgilere katkıda bulunacaktır. Burada, Auchtung ve ark. karmaşık dışkı topluluklarını yetiştirebilen, besin mevcudiyeti, sıcaklık, akış hızı, pH ve oksijen içeriği dahil olmak üzere kesin koşullar altında bakteri konsorsiyumlarını veya tek suşları tanımlayabilen mini biyoreaktör dizileri oluşturmak için. Yayınlanan protokoldeki sınırlamaları iyileştirmek için uyarlamalar da dahil olmak üzere mini biyoreaktör sistemini oluşturma sürecini açıklıyoruz. Ayrıca, çeşitli bakterilerin büyümesini destekleyen zengin bir ortam olan MEGA ortamının (Han ve ark.'dan uyarlanmıştır) kullanımıyla anaerobik koşullar altında mini biyoreaktör sisteminin kurulumunu tartışıyoruz. Bağırsakta insanlaştırılmış fare dışkı örneklerinin mini biyoreaktör sistemine aşılanmasını ve ardından mini biyoreaktör sistemi içinde, topluluk bileşimini izlemek için aseptik örnekleme ile sürekli akış altında yetiştirilebilen karmaşık topluluk kültürlerinin kurulmasını açıklıyoruz. Bu sistem diyet değişikliklerine ve diğer kültürel değişikliklere uyarlanabilir. Burada açıklanan teknikler, dinamik koşullar altında veya konakçıdan türetilmiş faktörlerden izole olarak bozulmaya yanıt olarak çeşitli, titiz dışkı topluluklarının karakterizasyonuna izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak mikrobiyotası, bakteriler, mantarlar, arkeler ve virüsler dahil olmak üzere geniş bir mikroorganizma ağıdır ve bir insan konakçınınkinden çok daha fazla olan büyük bir genetik ve metabolik repertuar içerir1. Mikrobiyomun zengin metabolik kapasitesi, diyet besinlerinin bakteriyel olarak işlenmesinden üretilen metabolitleri, bakteriler tarafından kimyasal olarak modifiye edilmiş konakçı metabolitlerini ve mikrobiyota2 tarafından benzersiz bir şekilde sentezlenen metabolitleri içerir. Mikrobiyota hemen hemen tüm konak biyoproseslerinde rol oynar, aynı zamanda inflamatuar bağırsak hastalığı, kanser, metabolik bozukluklar ve hatta nörolojik bozukluklar gibi hastalık durumlarında da rol oynar 2,3. Mikrobiyotanın katkısını konakçınınkinden ayırmak, belirli mikroorganizmaların veya karmaşık toplulukların sağlık ve hastalıktaki rolünü anlamak için çok önemlidir. Bu diseksiyonu mümkün kılan bir yaklaşım, dinamik koşullar altında çeşitli mikrobiyal toplulukları yetiştiren mikrobiyal biyoreaktörlerin kullanılmasıdır. Büyük ölçekli biyoürün yetiştiriciliği veya metabolik süreçlerin incelenmesi için spesifik besleyici faktörlerin hassas kontrolü dahil olmak üzere, hemen hemen her amaç için dışkı bakteri topluluklarının büyümesine izin veren, ticari olarak temin edilebilen birçok biyoreaktör vardır. Bununla birlikte, bu sistemler son derece maliyetlidir ve kapsamlı bir hazırlık gerektirir ve çeşitli deneysel koşulların paralel olarak incelenmesine olanak sağlamaz. Daha az maliyetli, daha uyarlanabilir ve birçok paralel koşula izin veren basitleştirilmiş bir yaklaşım için, burada Auchtung ve ark.4'ten uyarlanan sürekli akış altında bir mini biyoreaktör dizisinin kurulumu ve kullanımı için protokolü sunuyoruz.

Mini biyoreaktör sisteminin tam kurulumu Şekil 1A'da gösterilmiştir. Bu mini biyoreaktör sistemi, sürekli ortam iletimini ve çıkarılmasını sağlamak için birbirinden tamamen bağımsız olan ve peristaltik akış altında anaerobik bir odaya kurulan 6 reaktör kuyusundan oluşan dizileri kullanır (Şekil 1A). Her reaktör dizisi, kaynak ortam ve atık akışı için 60 durdurmalı boruyu tutan iki adet 48 kasetli peristaltik pompa ile 2 konumlu bir manyetik karıştırma plakası üzerine oturur (Şekil 1A). Anaerobik oda, oksijen içeriği için bir CAM-12 anaerobik monitör, ısıtma kapasitesine sahip oksijeni uzaklaştırmak için bir katalizör kutusu ve bakteri metabolizmasından fazla gazı emmek için bir hidrojen sülfür giderme kolonu ile donatılmıştır. Her reaktör kuyusu, her bir reaktör kuyusunun aşılanmasına veya numune alınmasına izin veren bir kaynak ortam girişi, atık çıkışı ve numune portu ile donatılmıştır (Şekil 1B).

Açıklandığı gibi, biyoreaktör sistemi, dışkı topluluklarının yetiştirilmesini ve bakımını desteklemek için sıcaklık, ortam tüketimi ve besin mevcudiyeti üzerinde dinamik kontrol sağlar. Sıcaklık, ısıtma kapasitesine sahip bir katalizör kutusu tarafından modüle edilir ve tüm anaerobik oda boyunca sıcaklık değişikliklerinin hızlı bir şekilde uygulanmasını sağlar. Ortam tüketimi, reaktörlerdeki ortam devir hızını değiştirmek için değiştirilebilen peristaltik pompa akış hızları tarafından düzenlenir. Medya devri, reaktörlerde yetiştirilen topluluk türlerine göre özelleştirilebilir, örneğin, yavaş büyüyen veya çok hızlı büyüyen hedef suşlar için uyarlanabilir. Son olarak, besin mevcudiyeti, her bir reaktör kuyusu için ayrı numune portları aracılığıyla bileşenler eklenerek dinamik olarak değiştirilebilir. Bir deneyin başlangıcında değiştirilebilen, ancak sistemde dinamik kontrole sahip olmayan statik koşullar, ortam tipi, oksijen içeriği ve eşzamanlı reaktör sayısıdır. Araştırmacılar istedikleri herhangi bir kaynak medyayı uygulamayı seçebilirler ve burada bir medya açıklanırken, sonsuz sayıda başka kaynak medya türü başarıyla uygulanmıştır. Reaktörler aerobik veya mikroaerofilik koşullar altında çalıştırılabilir (mikroaerofilik bir odanın mevcudiyetine bağlı olarak). Son olarak, araştırmacının deneysel ihtiyaçlarına bağlı olarak gerektiği kadar çok veya az sayıda reaktör kurulabilir. Reaktörler bir dizi içinde altılı setler halindeyken, her reaktör diğerlerinden bağımsız olarak çalışır ve istenirse her biri farklı bir kaynağa bağlanabilir.

Bu modüler biyoreaktör sistemi, yaklaşık 25.000 ABD Doları (anaerobik oda veya odaya özgü bileşenler dahil değil) karşılığında tamamen kurulabilir ve yeniden kullanılamayan tek parça, sistemin çalışması başına 100 ABD Dolarından daha az bir fiyata değiştirilebilen borudur. Sistem çoğunlukla otomatiktir, ancak medya kaynak şişelerinin boşaldığında değiştirilmesi gerekeceğinden, medya seviyelerinin günlük olarak kontrol edilmesini gerektirir. Ek olarak, herhangi bir örnekleme manuel olarak tamamlanmalıdır ve sistemdeki herhangi bir dinamik koşullu değişikliğin manuel olarak başlatılması gerekecektir (örneğin, sıcaklığın değiştirilmesi). Auchtung ve ark. tarafından yayınlanan orijinal sistem protokolünden, genel performansı ve yardımcı programı iyileştirmek için birkaç değişiklik yapıldı4. İlk olarak, biyoreaktör dizisinin 3D baskısı için malzeme, tekrarlanan otoklavlama turları yoluyla sistemin yapısal bütünlüğünü iyileştirmek için ABS benzeri Yarı Saydam Şeffaf Plastik olacak şekilde modifiye edilir. Ek olarak, 1/8 inç (3,2 mm) OD PTFE boru yerine, E-LFL, 2,06 mm ID, 100 ft boru kullanılır, çünkü çökmeye karşı daha dirençli olan daha sağlam malzeme nedeniyle sistemde akışta tıkanmalara neden olur. Son olarak, medya kaynaklı şişelerden tüp kaymasındaki değişiklikleri azaltmak için dikenli erkek adaptörlere 1/4 -28 mm diş kullanan ek bir bağlantı parçası kullanılır. Han ve ark.'dan, uyarlanmış MEGA medya tarifi, titiz anaerobik mikroorganizmaların yetiştirilmesini sağlayan tanımlanmamış, karmaşık, oldukça zengin bir ortam sağlar5. Ortam, histidin-hematin bileşeninin alternatif preparatını kullanmak için modifiye edilir, çünkü orijinal artık ticari olarak mevcut değildir. Sodyum hidroksit ayrıca ortamın pH değerini 7.0'a veya istenen herhangi bir pH'a çıkarmak için kullanılır. Genel olarak, bu sistem bütçe ve kullanıcı dostudur, optimize edilmiştir ve sürekli akış kültürü sistemlerine mükemmel bir giriş noktasıdır.

Bu protokolde, malzemeler, sistemin sterilizasyonu ve daha sonra bağırsakta insanlaştırılmış murin dışkı örneklerinin yetiştirilmesi için kullanım dahil olmak üzere bu mini biyoreaktör dizi sisteminin kurulumunu ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu yöntemin genel amacı, kontrollü koşullar altında mikrobiyal toplulukların yetiştirilmesi için kullanılabilecek uyarlanabilir ve uygun maliyetli bir biyoreaktör sistemi oluşturmaktır. Mini biyoreaktör sisteminin montajı için iş akışının ayrıntılı bir şeması Şekil 2'de verilmiştir ve protokol içindeki uygun adımlarda referans alınmıştır. Örneğimizde, insanlaştırılmış bağırsak farelerinden aynı dışkı örneği ile iki reaktörü aşlıyoruz ve sürekli bir MEGA ortam akışı altında mikrobiyal topluluk yapısını tanımlıyoruz.

figure-introduction-1
Şekil 1: Anaerobik odadaki mini biyoreaktör dizisi kurulumunun şematik diyagramı. (A) Anaerobik odada tamamlanan mini biyoreaktör dizisi kurulumunun tam görünümü. 6 kuyulu biyoreaktör dizisi, 60 konumlu manyetik karıştırma plakası üzerinde yer almaktadır. Kaynak luer tee ağı, iki delikli şişe kapağı aracılığıyla sol taraftaki kaynak ortama bağlanır. İki peristaltik pompa, kaynaktan gelen 2 durdurmalı boruyu ve atık ağlarını sırasıyla solda ve sağda tutar. Atık luer tişört ağı, sağ taraftaki atık şişesine boşalır. CAM-12 monitörü, ısıtma kapasitesine sahip katalizör kutusu ve hidrojen sülfür giderme kolonu dahil olmak üzere anaerobik odanın çalışması için gerekli ekipman, dizi sisteminin etrafındaki oda içinde düzenlenmiştir. (B) Reaktörde uygun yükseklikte ortam bulunan bir reaktör kuyusuna bağlı kaynak, numune ve atık portlarının üstten görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-introduction-2
Şekil 2: Mini biyoreaktör dizisi montaj iş akışının şematik diyagramı. (A) Mini biyoreaktör dizisinin yukarıdan aşağıya görünümü, kaynağın, atığın ve numune portlarının yönünü gösterir. (B) Protokolün 2.3-2.4 adımlarını gösteren görünümle mini biyoreaktör dizisinin yandan görünümü. 1/8 inç PTFE boru ve bağlantı parçası (1) takılır ve atık ve s'ye yerleştirilir.ample portlar. PTFE'siz bağlantı parçası (1) kaynak bağlantı noktasına takılmıştır. (C) Protokolün 2.5-2.6 adımlarını gösteren mini biyoreaktör dizisinin yandan görünümü. Bağlantı parçası (2) kaynak ve atık portlarına takılıdır. Bağlantı parçası (3) numune portuna takılır ve bunun için bağlantı parçası (4) üstüne yerleştirilir. (D) Adım 2.9-2.11'i gösteren mini biyoreaktör dizisinin yandan görünümü. E-LFL 2.06 mm boru, kaynak ve atık portlarına bağlanır ve diğer ucu bağlantı parçalarına (5) ve ardından (6) bağlanır. Uygun çaptaki 2 durdurmalı boru daha sonra bağlantı parçasına (6) bağlanır. Ters bağlantı daha sonra 2 durdurmalı borunun sonunda tekrarlanır, bağlantı parçası (6) 2 durdurmalı boruya bağlanır ve bağlantı parçası (5) buna bağlanır. Son olarak, E-LFL 2.06 mm boru, luer tee ağına bağlantı için bağlantı parçasına (5) bağlanacaktır. (E) Adım 2.12-2.15'te açıklanan kaynak ve atık luer tee ağ kurulumunu gösteren mini biyoreaktör dizisinin yukarıdan aşağıya görünümü. Bağlantı parçası (5) ile biten E-LFL 2.06 mm boru, her bir reaktörü, son açıklığı kaynak veya atık şişesindeki kapağa bağlı olan birkaç bağlantı parçasına (7) bağlamak için kullanılır. (F) Adım 2.16-2.17'de açıklanan iki delikli şişe kapağı tertibatının yandan görünümü. Kapaktaki bir açıklık, şişenin içine yerleştirilen PTFE boruya bağlanır. Bu açıklığa bağlantı parçası (1), ardından bağlantı parçası (2) ve bağlantı parçasına (2.06) bağlı E-LFL 5 mm boru yerleştirilir. Bu bağlantı parçası, kaynak veya atık luer ağına bağlanır. PTFE boruya bağlı olmayan açıklığa, bağlantı parçası (1) takılır, ardından bağlantı parçası (2) takılır ve E-LFL 2.06 mm boru başka bir bağlantı parçasına (5) bağlanır. Bu uç, gelecekte steril bir 0.22 μM şırınga filtresine bağlanmak için otoklav sterilizasyonu sırasında folyo ile kapatılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan dışkı örnekleri, Florida Üniversitesi (UF) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan ve UF Hayvan Bakım Tesislerinde (IACUC Protokolü #IACUC202300000005) gerçekleştirilen deneylerden elde edilmiştir. Kısaca, karışık cinsiyetli mikropsuz vahşi tip (GF WT; C57BL / 6) fareler (UF Hayvan Bakım Hizmetleri Mikropsuz Bölümü tarafından izolatörlerde yetiştirilen ve sürdürülen) üreme izolatörlerinden transfer edildi ve mikrobiyal manipülasyona izin vermek için ISOcage P Biyodışlama sistemine yerleştirildi. İnsan donör dışkısından eşit koloni oluşturan birimler (CFU), farelere gavaj için toplandı. Aşılamadan iki hafta sonra, bu farelerden depolama ve daha sonra bu protokolde kullanılmak üzere aseptik olarak dışkı örnekleri toplandı.

NOT: Burada açıklanan dışkı numunesi toplama ve hazırlama, toplanan numunelerin türüne (insan, fare, diğer hayvan) ve bu numunelerin saklanmasına bağlı olarak bu prosedür büyük ölçüde değişebileceğinden, yalnızca uygun bir prosedürün bir örneği olarak tasarlanmıştır. Bireyler, bireysel araştırmacının ihtiyaçlarına göre dışkı örneği toplama ve koruma için bir protokol tasarlamak için uygun literatüre başvurmalıdır.

1. -80 °C depolama için dışkı örneklerinin tipik olarak hazırlanması

  1. Bir anaerobik canlılık koruma ortamı seçin (burada Cary Blair'i kullandık). 1 mL koruma ortamını steril hale getirin, 2 mL'lik tüpleri bir biyogüvenlik kabinine vidalayın ve ardından anaerobik odaya aktarın.
  2. Dışkı örneklerini almadan önce, tüm malzemelerin (otoklavlanmış spatulalar, steril salin ve koruma ortamı içeren vidalı kapaklı kriyojenik şişeler) anaerobik odada 24 saat boyunca önceden indirgendiğinden emin olun.
  3. Otoklavlanmış dışkı toplama kapları ve forseps kullanarak bir biyogüvenlik kabininde steril geçmeli kapaklı tüpler kullanarak farelerden aseptik olarak dışkı örnekleri toplayın. Toplandıktan hemen sonra, tüpleri sıvı nitrojen içinde dondurun.
  4. Numuneleri tartım için portatif bir terazi ile birlikte hemen anaerobik bir odaya aktarın. Her tüpü önceden tartın. Fare dışkı örnekleri için, tüp başına ayrı dışkı peletleri alınabilir. İnsan numuneleri kullanılıyorsa, her bir numuneyi karıştırmak için steril spatulaları kullanın ve eşit olarak kriyojenik şişelere bölün. Her tüpü yeniden tarttıktan sonra, optimum koruma için her tüpe tahmini 1:10 dışkı ortamı (kütle: kütle) oranında ortam ekleyin.
    NOT: Dışkı örneklerinin toplandıktan hemen sonra anaerobik olarak korunması önerilir. Hemen korunmayan numuneler, taze korunmuş numunelere kıyasla daha az canlılığa, bileşim değişikliklerine vb. sahip olabilir 6,7,8. Cary Blair koruma ortamı, daha fazla büyümeyi engellerken bakteri topluluklarının canlılığını korur ve -80 ° C'de saklanabilir. Koruma ortamının dışkıya tahmini oranı için, dışkı örneğinin ıslak ağırlığı oldukça değişken olmasına rağmen, bu mevcut en iyi tahmindir.
  5. Şişeleri etiketleyin, kapatın, anaerobik hazneden çıkarın, flaşı sıvı nitrojenle dondurun ve bir yıl veya daha uzun süre -80 ° C'de saklayın.

2. 6 kuyulu bir reaktör dizisi inşa etmek

  1. 6 kuyulu reaktörün 3D baskısı için CAD dosyasını (Ek Dosya 1) kullanın. Bu dosya, üretim için herhangi bir 3D baskı şirketine gönderilebilir. Reaktörler arasında görselleştirmeyi sağlamak ve aynı zamanda tekrarlanan otoklavlama döngülerine karşı dirençli olmak için baskı malzemesi olarak ABS Benzeri Yarı Saydam Şeffaf plastik kullanın.
    NOT: 6 kuyulu reaktör dizilerini stereolitografi ile ABS benzeri yarı saydam Şeffaf plastikten yapmak üzere devreye aldık. Üretimde dizinin eğilmesini (yani, parçanın %30-%45 açıyla 3D olarak basılmasını) öneririz, bu da boyutsal hataları azaltır. Bu düzeltme, dizi boyunca çapraz olarak uzanan görünür katman çizgileriyle sonuçlanacaktır, ancak bu, reaktörlerin performansını etkilemez.
  2. 25-28 mm'lik bir kılavuz çekme aleti kullanarak, reaktör dizisinin her bir açıklığına vida dişleri yerleştirin.
  3. 1/8 inç PTFE borudan 12, 25 mm'lik şeritler kesin ve her bir boru parçasının bir ucunu 25-28 dişli bağlantıya bir erkek luerin vida dişi açıklığına sokun. Bağlantı parçalarını belirlenen atık ve s'ye güvenli bir şekilde vidalayın.ampdizinin açıklıkları (Şekil 2B).
    NOT: Borunun yerleştirme için daha iyi oturmasını sağlamak amacıyla borunun uçlarını koni benzeri bir konfigürasyonda hafifçe tıraş etmek için bir tıraş bıçağı kullanılabilir.
  4. Reaktörün her bir reaktör kuyusuna bir mikro karıştırma çubuğu yerleştirin ve ardından her bir reaktör kuyusunun kaynak deliklerine bir erkek 1/4-28 dişli bağlantı vidalayın (Şekil 2B).
  5. Dişi luer x 1/8 inç hortum dikeni adaptör bağlantı parçalarını, her reaktör kuyusu için atık ve kaynak için 1/4-28 dişli bağlantı parçalarına vidalayın (Şekil 2C).
  6. Dişi luer x 3/32 inç hortum dikeni adaptör bağlantı parçalarını, numune portu için 1/4-28 dişli bağlantı parçalarına vidalayın. 3/32 inç hortum dikeni adaptörlerinin üzerine kauçuk bir septum yerleştirin ve üst kısmı katlayın (Şekil 2C).
  7. Atık ve kaynak hatları için aşağıdaki uzunluklarda iki set E-LFL, 2,06 mm boru kesin: 14 cm, 15,25 cm, 16,5 cm, 17,75 cm, 19 cm ve 20,25 cm.
    NOT: Orta bölümün etrafına sarılmış renkli etiket bandı, her bir boru uzunluğunu tanımlamak için kullanılabilir.
  8. E-LFL 2.06 mm boruyu, kaynak ve atık bağlantıları için dişi luer 1/8 inç hortum ucu adaptör bağlantılarına takın (Şekil 2D). Boruyu daha yumuşak hale getirmek için sıcak su kullanın. Bu, borunun adaptörlere kolayca oturmasını sağlayacaktır.
  9. Borunun diğer ucuna kilit halkası x 1/8 inç hortum dikeni adaptörü ile bir erkek luer takın. Buna takılan bir dişi luer x 1/16 inç hortum dikeni adaptörünü vidalayın (Şekil 2D).
  10. Uygun boyuttaki 2 durdurmalı boruyu ilgili atık ve kaynak bağlantılarına bağlayın. Atık hatları 1,14 mm iç çap 2 duraklı boru kullanırken, kaynak hatları 1,02 mm iç çap 2 duraklı boru kullanır. 2 durdurmalı borunun diğer ucuna, başka bir dişi luer x 1/16 inç hortum dikeni adaptör bağlantısı takın (Şekil 2D).
  11. 20, 5 cm'lik E-LFL, 2.06 mm boru parçalarını kesin ve her borunun her iki ucuna kilit halkalı x 1/8 inç hortum dikeni adaptör bağlantı parçalarına sahip erkek luer yerleştirin. 5 cm'lik borunun bir ucunu, kilit halkalı erkek luer x 1/8 inç hortum dikeni adaptörü ile her 2 duraklı boru bölümünün sonundaki boş dişi luer x 1/16 inç hortum dikeni adaptörü bağlantısına takın. Kalan 19 boru parçası için bu işlemi tekrarlayın (Şekil 2D).
  12. Reaktör kuyuları 2.06 ve 1'nin kaynak hatları için E-LFL, 2 mm boruyu bir dişi luer tee'nin zıt uçlarını kullanarak bağlayın. Her iki ucunda kilit halkası x 1/8 inç adaptör bağlantı parçalarına sahip erkek luer ile 5 cm'lik boru parçalarından birini, ikinci bir tişört bağlantısına yol açacak şekilde tişörtün orta çıkışına takın (Şekil 2E).
  13. Üçüncü reaktör için 2.06 mm kaynak borusu olan E-LFL'yi ikinci tee'nin karşı tarafına bağlayın. Bir ucuna kilit halkası x 1/8 inç adaptörlü bir erkek luer ile başka bir 5 cm boru takılmalı, diğer ucuna ise kilit halkası x 1/8 inç adaptör takılı bir dişi luer takılmalıdır. 4, 5 ve 6 numaralı reaktörler için aynı modeli izleyin (Şekil 2E).
  14. 25 cm'lik bir E-LFL, 2.06 mm'lik bir boru parçasını kesin, kilit halkalı bir erkek luer x 1/8 inç hortum dikeni adaptörü bağlantısına borunun bir ucuna takın, bu da kalan son dişi luer tee bağlantısına bağlanacak ve diğer ucunda bir dişi luer x 1/8 inç hortum dikeni adaptör bağlantısı takın. Bu ucu alüminyum folyo ile kapatın (Şekil 2E).
    NOT: İşlem sırasında açık uçların steril tutulması önemlidir, bu nedenle otoklavlama sırasında folyo ile kapatılmasını ve bantla yerine sabitlenmesini öneririz.
  15. Adım 2.12-2.14'te açıklanan kaynak hatlarıyla aynı prosedürü tekrarlayarak atık hatlarını hazırlayın (Şekil 2E).
  16. Bir atık toplama şişesini monte etmek için, iki delikli bir şişe kapağını 2 L'lik bir şişeye gevşek bir şekilde sabitleyin. Erkek 1/4-28 dişli bağlantı parçalarını kapağın her iki deliğine de yerleştirin. Kapaktaki önceden takılmış PTFE boruya bağlanmayan erkek dişli bağlantıya 1/8 inç hortum ucu adaptörlerine sahip bir dişi luer takın (Şekil 2F).
  17. Ardından, 5 cm'lik bir E-LFL 2.06 mm boru parçasını kesin ve şişedeki hortum dikeni adaptörüne bağlayın. 5 cm'lik borunun diğer ucuna kilit halkası x 1/8 inç hortum dikeni adaptörlü bir erkek luer takın ve folyo ile örtün (bu boru bir havalandırma deliği görevi görür; otoklavlamadan sonra, kontaminasyonu önlemek için 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi eklenecektir; Şekil 2F).
  18. Kapağın tamamını alüminyum folyo ile kaplayın. Reaktörleri ve atık şişesini, tipik olarak sıvılar için ayarlanan yavaş egzoz programını kullanarak 121 °C'de ve minimum 15 psi'de 45 dakika boyunca otoklavlayın. Reaktörler soğuduktan sonra, bağlantı parçalarını ve alüminyum folyo contaları sıkın ve kullanmadan önce 48 saat anaerobik odaya koyun.

3. MEGA medya hazırlığı

  1. Tüm stok çözümlerini Ek Tablo 1, Ek Tablo 2, Ek Tablo 3, Ek Tablo 4, Ek Tablo 5, Ek Tablo 6, Ek Tablo 7, Ek Tablo 8'e göre hazırlayın.
  2. 2 L'lik bir cam şişede, Ek Tablo 9'daki tüm kuru malzemeleri, ardından 1640 mL ultra saf suyu ve ardından Ek Tablo 10 sıvı bileşenlerinin geri kalanını ekleyin. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bir karıştırma plakası üzerinde orta ateşte (90 ° C) tamamen çözün. Medya soluk mavi ila menekşe renginde olacak ve tam olarak berrak olmayacak, ancak belirgin çözünmemiş topaklara sahip olmayacaktır.
    NOT: Peptitlerin varlığında glikoz ve diğer şekerlerin otoklavlanması modifikasyona yol açabilir ve ortamdaki mevcut şekeri azaltabilir. İstenirse, tüm şeker çözeltileri steril bir şekilde süzülebilir ve adım 3.7'de açıklandığı gibi Ek Tablo 10'un bileşenleri ile eklenebilir.
  3. Tamamen karıştırıldıktan sonra, 10 N sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek ortamın pH'ını 7.0'a ayarlayın ve tam olarak ne kadar hacim eklendiğini ölçün. pH ölçümünden sonra, hacmi tam olarak 2 L'ye getirmek için 14.4 mL su eksi eklenen sodyum hidroksit hacmini ekleyin.
  4. Her iki açıklığa da 1/4-28 mm dişli bir erkek luer sokarak iki delikli bir şişe kapağı hazırlayın.
  5. PTFE boruya önceden takılmamış kapağın deliğinde, 5 cm'lik bir C-flex boru parçası kesin ve dişi luer bağlantısının 1/8 inç hortum ucuna bağlayın. 5 cm'lik borunun diğer ucuna, bir kilit halkası ve 1/8 inç hortum dikeni adaptörü olan başka bir erkek luer yerleştirin ve folyo ile örtün (bu aynı zamanda 0.22 μM'lik bir şırınga filtresine de bağlanacaktır).
  6. Tüm kapağı alüminyum folyo ile kapatın ve 2 L MEGA medya şişesinin üzerine vidalayın. Sıvılar için yavaş egzoz programını kullanarak 121 °C'de ve 45 dakika boyunca minimum 15 psi'de otoklavlayın.
  7. Ortamı otoklavdan çıkarın ve ılık olana kadar karıştırarak soğumaya bırakın. Ek Tablo 10'daki bileşenleri bir biyogüvenlik kabinindeki 2 L'lik medya şişesine ekleyin, kapağı kapatın ve ardından homojenize etmek için bir karıştırma plakasına geçin. Ortam soğuduktan sonra, bağlantı parçalarını ve alüminyum folyo contaları sıkın ve kullanmadan önce 48 saat anaerobik hazneye koyun.
    NOT: Kaynak pompasını 16 saatlik bir tutma süresi için 0.94 μL/dk'da (16 mL/s) çalıştırmanızı öneririz. Bu akış hızı için 6 kuyulu bir reaktör günde yaklaşık 0,135 L ortam kullanır. Ayrıca, atık borusunda tıkanıklık oluşmasını önlemek için atık pompasını 40 μL/dk'da çalıştırmanızı öneririz. Boruları ve akışı izleyin, tıkanıklıklar meydana gelirse atık akışının uygun şekilde artırılabileceğine dikkat edin. Hem kaynak hem de atık akış oranları değiştirilebilir, ancak araştırmacılar topluluk bileşimlerini ve büyüme oranlarını dikkatli bir şekilde izlemelidir, çünkü bunlar daha hızlı veya daha yavaş akışla da değişebilir. 6 kuyulu bir reaktörü bir hafta boyunca çalıştırmak için en az 2 L medya yapmanızı öneririz (1 L'den biraz daha fazla tüketecektir).

4. Anaerobik odada dizi kurulumu

NOT: Montajdan önce yüzey kontaminasyonu olmamasını sağlamak için davlumbazın içinin ve davlumbaz eldivenlerinin %3 hidrojen peroksit ile temizlenmesi ve ardından üçlü deiyonize suyla durulanması önemlidir. Folyonun çıkarılmasının ardından bağlantılar hızlı bir şekilde yapılırsa ve bağlantı parçalarının iç kısmı ve anaerobik hazne eldivenleri ile doğrudan temas kurulmazsa, kontaminasyon olasılığı minimum düzeydedir

  1. Diziyi anaerobik odadaki manyetik bir karıştırma plakası üzerine hizalayın. Karıştırma plakası kontrol cihazını maksimum hıza (1600 rpm) ayarlayarak ve karıştırma çubuklarının döndüğünü gözlemleyerek dizinin doğru şekilde hizalandığından emin olun.
  2. Kaynak ve atık için 2 durdurmalı boruyu cl'ye takın.ampilgili peristaltik pompalardaki kelepçelere. Bunu amaçlanan kullanımdan 24 saatten daha kısa bir süre önce yapıyorsanız, kelepçeleri yerine kilitleyin. Aksi takdirde, borudaki aşınmayı azaltmak için kullanıma hazır olana kadar gevşek bırakın.
  3. Dişi luer x 1/8 inç hortum dikeni adaptör bağlantılarındaki folyo kapağını, kaynak ve atık hatlarındaki çıkarın ve kapaklara vidalanmış 1/4 -28 tehdit bağlantı parçalarına erkek luer'e vidalayın (bu açıklığın dahili PTFE boruya bağlı olduğundan emin olun).
  4. Folyo kapakları çıkarın ve kaynak şişenin 0.22 cm'lik havalandırma hattına ve atık şişenin havalandırma hattına 5 μm'lik bir şırınga filtresi takın.
  5. Reaktörleri doldurmaya başlamak için akışa ılımlı bir hızda (kaynak pompasında 1 mL/dk ve atık pompasında 2 mL/dk) başlayın. Her bir reaktör kuyusundaki atık hattı borusunun, her bir kuyunun aşırı doldurulmasını veya boşaltılmasını önleyecek şekilde kaynak borusununkinden daha düşük olduğundan emin olun.
  6. Reaktörler dolmaya başladığında, hepsinin aynı hacme ulaştığından ve ortamın atık hattına aktığından emin olun. Burada açıklanan ölçümlerle, her bir reaktörün çalışma hacmi 15 mL'dir.
    NOT: Herhangi bir reaktör dolmazsa, gevşek bağlantıları sıkın ve kaynak hatlarında sorun olup olmadığını kontrol edin, gerekirse bunları hazırlanmış ekstralarla değiştirin. Sorun devam ederse, varsa kaynak şişeyi değiştirin. Orta seviye, reaktörlerdeki iç atık hattının üzerine çıkarsa, reaktör atık portunun iç kısmındaki PTFE borusunun hala yerinde olduğunu kontrol edin.
  7. Her reaktör dolduktan sonra, pompa ayarlarını 16 μL/dk akış hızına ayarlayın ve ardından pompaları kapatın.
  8. Aşılamadan önce ortamın gece boyunca reaktörlerde ve atık şişe(ler)de kalmasına izin verin. Bu, ortamın daha fazla anaerobik koşullandırılmasına (toplam ~ 72 saat) izin verir ve kullanıcının sistemin sterilitesini onaylamasını sağlar.
  9. Dışkı numunesi aşılamasından önce sistemin sterilitesini doğrulamak için, her bir reaktörden ve kaynak ortamdan doğrudan ilk doldurmadan sonra (adım 4.7) ve adım 4.8'den sonra tekrar numune alın. Adım 6'da açıklanan reaktörlerden aseptik numune alma prosedürünü izleyin.
    1. Tüm numunelerin optik yoğunluk ölçümünün kaynak ortamınkiyle aynı olduğundan emin olun; Artan bir optik yoğunluk gözlenirse, kontaminasyondan şüphelenilir ve tüm ortam ve sistem yapıdan arındırılmalı, temizlenmeli ve yeniden birleştirilmelidir.

5. Dışkı örneği aşılaması

  1. Anaerobik ortamda en az 24 saat bekletmek için steril geniş delikli pipet uçlarını, steril tuzlu suyu, 50 mL konik tüpleri, 25 mL steril serolojik pipetleri, 5 mL şırıngaları ve 16 gauge iğneleri anaerobik odaya yerleştirin.
  2. İstenilen sayıda reaktörü aşılamak için gereken dışkı materyali miktarını hesaplayın. Her reaktör kuyusu, %25 m/v dışkı bulamacında 3,8 mL süpernatan gerektirir. Altı reaktör kuyusu için, toplam 22,8 mL %25 m/v dışkı bulamacı, 5,7 g katı dışkı maddesi gerektirecek olan aşılama için yeterli süpernatan sağlamalıdır.
  3. Korunmuş dışkı örneklerini kriyojenik şişelerde anaerobik odaya aktarın ve 15 dakika çözülmelerine izin verin.
  4. Dışkı malzemesini kriyojenik şişelerden 50 mL'lik bir konik tüpe aktarmak için geniş delikli bir pipet ucu kullanın, sıkıca kapatın ve partikülleri çökeltmek için 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Anaerobik bir odaya geri aktarın ve süpernatanı çıkarın. Otoklavlanmış bir laboratuvar spatulası kullanarak, dışkı katılarını 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın ve toplam 5.7 g'lık bir kütle elde edin. Tüpe 17.1 mL anaerobik steril salin ekleyin ve sıkıca kapatın.
  6. Konik tüpleri hazneden çıkarın, 5 dakika girdapla homojenize edin, ardından partikülleri çökeltmek için 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  7. Numuneler santrifüje yerleştirilirken her reaktörün üstündeki septayı en az 2 dakika boyunca %10'luk bir çamaşır suyu laboratuvar mendili ile sterilize edin.
  8. Numuneleri anaerobik odaya geri koyun ve steril serolojik pipetler kullanarak süpernatanları yeni 50 mL konik tüplere aktarın.
  9. 16 G 1,5 inç iğneli altı ayrı 5 mL şırıngaya 3,8 mL dışkı bulamacı süpernatan yükleyin.
  10. Mendili çıkarın, iğneyi septumdan geçirin ve dışkı bulamacını yavaşça reaktöre enjekte edin.
  11. Reaktöre akışı başlatmadan önce dışkı topluluklarının her reaktörde yaklaşık 16-18 saat kurulmasına izin verin. Manyetik karıştırma plakasını, dışkı bulamacının enjekte edildiği andan itibaren maksimum hıza (1600 rpm) ayarlayın.

6. Reaktör kuyularından aseptik numune alımı

  1. Sargıyı altı steril 1 mL şırınga ve altı steril 22G 3 inç iğne üzerine delin ve 24 saat boyunca gazını almak için anaerobik odaya yerleştirin.
  2. Numune almadan hemen önce, her reaktörün üstündeki septayı en az 2 dakika boyunca %10'luk bir çamaşır suyu laboratuvar mendili ile sterilize edin.
  3. Çamaşır suyu laboratuvar mendilini çıkarın ve hemen bir şırıngaya bir iğne takın ve iğneyi ilk reaktör kuyusunun septasının ortasına yerleştirin.
  4. Numunenin 1 mL'sini yukarı çekin, iğneyi septadan çıkarın ve numuneyi şırıngadan aşağı akış kullanımı için 1.7 mL etiketli bir tüpe aktarın. Kauçuk septa, iğnenin çıkarılmasının ardından yeniden kapanacaktır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her reaktör kuyusu için yeni bir iğne ve şırınga kullanın.
  5. Süpernatan isteniyorsa, tüpleri anaerobik odadan çıkarın ve bakteri hücrelerini peletlemek için 1 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı ayrı olarak etiketlenmiş 1.7 mL'lik bir tüpe aktarın ve -80 ° C'de saklayın.

7. Mini biyoreaktör sisteminin sökülmesi ve temizlenmesi

  1. Boruyu boşaltmaya başlamak için kaynak şişeyi kaynak luer tee'den ayırın ve akış hızını yükseltin (kaynak pompasında 1 mL/dk ve atık pompasında 2 mL/dk). Borunun tamamen boşalmasına izin verin. Karıştırma plakasını kapatın.
  2. Hortum boşaldığında, atık şişesini atık luer tişörtünden ayırın. Ardından, reaktör düzeneğini anaerobik oda hava kilidine yerleştirin ve odadan çıkarın.
  3. Tüm E-LFL 2.06 mm boru ve PTFE boru segmentlerini ayırın ve atın. Tüm bağlantı parçalarını ayırın ve% 10'luk bir çamaşır suyu çözeltisine yerleştirin.
  4. Mini karıştırma çubuklarını her diziden iyice çıkarın ve ağartma solüsyonuna yerleştirin. Ortamı dezenfeksiyon için ayrı bir %10'luk ağartma solüsyonuna boşaltmak için reaktör dizisini ters çevirin. Ardından, boş diziyi taze bir ağartma solüsyonuna batırın.
  5. Tüm bağlantı parçalarının ve reaktör dizisinin %10'luk çamaşır suyu solüsyonunda 30 dakika bekletin (uzun süreli ıslatma renk bozulmasına neden olur).
  6. Bağlantı parçalarını ve reaktör dizisini deiyonize su ile durulayın, ardından üretici talimatlarına göre gece boyunca enzimatik deterjan çözeltisine batırın.
  7. Bağlantı parçalarını ve reaktör dizisini deiyonize suyla üç kez durulayın, ardından en az 3 gün boyunca tamamen kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, reaktör dizisi ve bağlantı parçaları bir kez daha montaj için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dışkı örnekleri, aşılamadan 2 hafta sonra insan dışkı bulamacı ile kolonize edilen farelerden toplandı ve -80 ° C'de saklandı. Biyoreaktör sistemi, iki replike reaktör kuyusu için sürekli MEGA ortam akışı ile kurulmuştur (Şekil 3A). Dışkı bulamacı, adım 6'da açıklanan protokole göre fare dışkı peletlerinden hazırlandı ve her iki reaktör de yanıtlayıcı fare dışkı bulamacı ile numune portu ile aşılandı. Reaktör kuyularındaki dışkı topluluklarının statik koşull...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde açıklanan mini biyoreaktör sistemi, paralel deney için bağımsız dışkı topluluklarının yetiştirilmesini sağlar. Mikrobiyal toplulukları konakçı faktörlerin izolasyonunda inceleme yeteneği, mikroorganizmaların çevrelerine uyum sağlama konusundaki içsel kapasitelerini anlamak için önemli bir yaklaşımdır. Bu protokol, tanımlanmış bakteri konsorsiyumlarının ve hatta istenirse tek izolat kültürlerinin yetiştirilmesi için kolayca uyarlanabilir. Burada tarif edilen MEGA ortamı, tit...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, 16S rRNA gen dizilimi konusundaki yardımı için Josee Gauthier'e minnettardır. Bu araştırma, kısmen, UF Sağlık Kanser Merkezi Fonları (CJ) ve UF Tıp Bakanlığı Gatorade Fonu (CJ) tarafından desteklenmiştir. R.Z.G., UF Sağlık Kanser Merkezi fonları tarafından desteklenmiştir. R.C.N., Florida Üniversitesi'nde (TL1TR001428, UL1TR001427) Ulusal Sağlık Enstitüleri TL1 Eğitim Bursu, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü Ekip Tabanlı Disiplinlerarası Kanser Araştırma Programı ödülü T32CA257923 ve UF Sağlık Kanser Merkezi tarafından desteklenmiştir. Bu yayında bildirilen araştırmalar, kısmen Fla. Stat. § 381.915 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü Ulusal Kanser Enstitüsü P30CA247796 Ödül Numarası altında. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Florida Eyaleti'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizinde hiçbir rolü yoktu; yayınlama kararı; veya el yazmasının hazırlanması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL BD Kayma Uçlu Şırınga steril, tek kullanımlıkFisher Scientific309659
1/4-28 mm dişli - dikenli erkek adaptör (3,2 mm), 5/paketCole-Parmer008NB32-KD5L1 adet 6 oyuklu dizi oluşturmak için 2 pakete ihtiyacınız var
10M NaOH (Sodyum Hidroksit)Sigma72068-100ML
2.0ml Vidalı Kapaklı Tüp, NonKnurl, Etekli, Doğal, E-Beam Steril tüp, ekli kapaklıFisher Scientific14-755-228
2mag MIXdrive 60 Karıştırma Sürücüsü2mag4006060 konumlu manyetik karıştırma plakası (isteğe bağlı ısıtma kapasitesi ilavesi - cat# 40260)
6 kuyulu reaktör arrray, ABS Benzeri Yarı Saydam Şeffaf plastikProtolabsÖzel3D baskı için .stl dosyası için ek dosyalara bakın
Mutlak Etanol (200 Kanıt)Fisher ScientificBP2818
Asetik asit, buzulSigmaA6283
Adaptör, naylon, 1/4-28 dişe erkek luer, 25/paketCole-ParmerEW-45505-821 adet 6 oyuklu dizi oluşturmak için 6 (1 paket)
gerekir Alüminyum folyoFisher Scientific01-213-100
Anaerobik odaCoy Lab ÜrünleriTip B
Bel-Art  SP Scienceware Flea Micro Spinbar Manyetik Karıştırma Çubukları (1/pk)Fisher Scientific22-2616791 adet 6 oyuklu dizi oluşturmak için 6 
Biyogüvenlik kabini class 2Nuaire
Butirik asitSigmaB103500 
CaCl2 & middot; 2H2O (Kalsiyum Klorür Dihidrat)SigmaC7902
Clorox Healthcare Çamaşır Suyu ile Antiseptik Mendil, Kokusuz, 6 "x 5", 150'lik Mendil PaketiOfis Deposu129202
D- (-) - FruktozSigmaF0127-100G
D-(+)-CellobioseSigmaC7252-100G
D-(+)-GlikozSigmaG8270-100G
D-(+)-Maltoz monohidratSigmaM5885-100G
Matkap Amerika Tak El Musluğu DWTP1 / 4-28Home Depot305699489
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin, 1X Ca ve Mg olmadan, SterilGenesee25-508
Dişi luer & zamanlar; 1/16 & Prime; hortum dikenli adaptör, Naylon, 25/paketCole-ParmerEW-45502-001 adet 6 oyuklu dizi oluşturmak için 24 (1 paket)
gerekir Dişi luer ve kez; 1/8 & Prime; hortum dikeni adaptörü, Naylon 25/paketCole-ParmerEW-45502-041 adet 6 oyuklu dizi oluşturmak için 6 (1 paket)
Dişi luer & kez; 3/32 & Prime; hortum dikeni adaptörü, Naylon, 25/ paketCole-ParmerEW-45502-021 adet 6 kuyulu dizi oluşturmak için, 6 (1 paket)
gerekir Dişi luer tişört, Naylon, 25/paketCole-ParmerEW-45502-561 adet 6 oyuklu dizi oluşturmak için 10 (1 paket)
FeSO4 ve orta nokta gerekir; 7H2O (Demir [II] Sülfat Heptahidrat)SigmaF8633
HematinSigmaH3281
HistidinSigmaH7750
İzovalerik asitSigma129542
K2HPO4 dibazik (dipotasyum hidrojen fosfat)SigmaP2222-1KG
KH2PO4 monobazik (potasyum dihidrojen fosfat)SigmaP0662-500G
Büyük Orifis Pipet UçlarıFisher Scientific02-707-134
L-Sistein hidroklorürSigmaC1276-10G
Kilit halkalı ve zamanlar; 1/8 & Prime; hortum dikeni adaptörü, Naylon, 25/paketCole-ParmerEW-45505-041 adet 6 oyuklu dizi oluşturmak için 42 (2 paket) gerekir
Et özüSigma70164-500G
Med Vet International  Exel İğnesi, 20G X 1 ", Hipodermik, 100 / Kutu, 26417Fisher Scientific50-209-2532
Menadione (Vitamin K3)SigmaM5625
MgSO4   &orta nokta; 7H2O (Magnezyum Sülfat Heptahidrat)SigmaM1880-500G 
Milli-Q su
NaCl (Sodyum Klorür)SigmaS9888-500G 
NaHCO3 (Sodyum Bikarbonat)SigmaS5761-500G
Omnifi t Q serisi iki delikli şişe kapağıCole-Parmer00945Q-21 adet 6 kuyulu dizi oluşturmak için 1
PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115VMasterFlexISM939C-115V24 kanallı peristaltik pompaya ihtiyacınız vardır, kaynak için 1 ve atık için 1 gerekir
Hassas Sızdırmazlık ve reg; kauçuk septa, beyaz, 7 mm OD cam boru (100 / pk)Millipore SigmaZ553905-100EA1 adet 6 oyuklu dizi oluşturmak için 6 septa
Propiyonik asitSigmaP5561 
Pompa Hortumu, 2 Kademeli, Tygon S3 E-Lab, 1,02 mm İç Çap; 12/PKVWRMFLX96460-281 adet 6 kuyulu dizi oluşturmak için 6  (1 paket)
Pompa Hortumu, 2 Kademeli, Tygon S3 E-Lab, 1,14 mm İç Çap; 12/PKVWRMFLX96460-301 adet 6 kuyulu dizi oluşturmak için 6 (1 paket) gerekir
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mlFisher Scientific22-029-646
PYREX 2L Yuvarlak Medya Saklama Şişeleri, GL45 Vidalı KapaklıFisher Scientific06-414-1E
Tıraş BıçağıGenesee12-640
Resazurin, sodyum tuzuThermoFisher'dan ACROS OrganicsAC41890-0010
Çözünür nişastaSigmaS9765-100G
Paslanmaz Çelik Mikro Spatula, kaşık gibi bıçakFisher ScientificS50823
TBNG TYGON ELFL 2.06MMID 100'VWRMFLX06449-421 adet 6 oyuklu dizi oluşturmak için 205,5 cm
İz Mineral TakviyesiATCCMD-TMS'yeihtiyacınız vardır
Triptikaz Pepton (BBL)Fisher ScientificB11921
Boru, PTFE, 1/8 ve Prime; (3,2 mm) OD ve zamanlar; 1,5 mm İç Çap, 10 MCole-Parmer008 T32-150-101 adet 6 kuyulu dizi oluşturmak için 300 mm
Tween 80SigmaP1754 
Vitamin TakviyesiATCCMD-VS
Maya Özü (Bacto)Fisher ScientificDF0127-17-9
gerekir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biol. 14 (8), e1002533(2016).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metab. 26 (1), 110-130 (2017).
  3. Rooks, M. G., Garrett, W. S. Gut microbiota, metabolites and host immunity. Nat Rev Immunol. 16 (6), 341-352 (2016).
  4. Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. MiniBioReactor Arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).
  5. Han, S., et al. A metabolomics pipeline for the mechanistic interrogation of the gut microbiome. Nature. 595 (7867), 415-420 (2021).
  6. Bilinski, J., et al. Fresh versus frozen stool for fecal microbiota transplantation-assessment by multimethod approach combining culturing, flow cytometry, and next-generation sequencing. Front Microbiol. 13, 872735(2022).
  7. Li, X. M., et al. Effects of stool sample preservation methods on gut microbiota biodiversity: New original data and systematic review with meta-analysis. Microbiol Spectr. 11 (3), e0429722(2023).
  8. Fouhy, F., et al. The effects of freezing on faecal microbiota as determined using MiSeq sequencing and culture-based investigations. PLoS One. 10 (3), e0119355(2015).
  9. Sun, X., et al. Microbiota-derived metabolic factors reduce Campylobacteriosis in mice. Gastroenterology. 154 (6), 1751-1763.e2 (2018).
  10. He, Z., et al. Campylobacter jejuni promotes colorectal tumorigenesis through the action of cytolethal distending toxin. Gut. 68 (2), 289-300 (2019).
  11. Newsome, R. C., et al. Interaction of bacterial genera associated with therapeutic response to immune checkpoint PD-1 blockade in a United States cohort. Genome Med. 14 (1), 35(2022).
  12. Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The use of chemostats in microbial systems biology. J Vis Exp. (80), e50168(2013).
  13. Wille, J., Coenye, T. Biofilm dispersion: The key to biofilm eradication or opening Pandora's box. Biofilm. 2, 100027(2020).
  14. Biagini, F., et al. Designs and methodologies to recreate in vitro human gut microbiota models. Bio-des Manuf. 6 (3), 298-318 (2023).
  15. Qi, Y., Yu, L., Tian, F., Zhao, J., Zhai, Q. In vitro models to study human gut-microbiota interactions: Applications, advances, and limitations. Microbiol Res. 270, 127336(2023).
  16. Gościniak, A., Eder, P., Walkowiak, J., Cielecka-Piontek, J. Artificial gastrointestinal models for nutraceuticals research-achievements and challenges: A practical review. Nutrients. 14 (13), 2560(2022).
  17. Marrero, D., et al. Gut-on-a-chip: Mimicking and monitoring the human intestine. Biosens Bioelectron. 181, 113156(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikrobiyota e itlili iAnaerobik OdaPeristaltik PompalarManyetik Kar t r c PlakaFekal nok lasyonTopluluk KompozisyonuTitiz Anaeroplar

İlgili makaleler