Method Article

Seçilmiş Doku Bölgelerini Kullanan Kütle Spektrometresi Tabanlı Proteomikler için Kolaylaştırılmış Bir Yaklaşım

DOI:

10.3791/68076

⸱

April 18th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science, School of Medicine, CHA University, 2Department of Proteomic Research, CHA Future Medicine Research Institute, 3Department of Pathology, Seoul National University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerinde izole edilmiş ilgi alanlarını kullanarak kütle spektrometresi tabanlı bir proteomik yöntem oluşturuyoruz. Bu protokol, arşivlenmiş formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerindeki belirli doku alanlarından proteomu analiz etmek için kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik, hücreler, dokular ve vücut sıvıları dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik numunelerde kapsamlı proteom analizi sağlar. Uzun süreli arşivleme için yaygın olarak kullanılan formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) doku kesitleri, proteomik çalışmalar için değerli kaynaklar olarak ortaya çıkmıştır. Araştırmacılar, depolama faydalarının ötesinde, patologlarla ortak çabalar yoluyla ilgi alanlarını (ROI'ler) normal doku bölgelerinden izole edebilirler. Bu potansiyele rağmen, ROI izolasyonu, proteomik numune hazırlama ve MS analizini kapsayan proteomik deneyler için kolaylaştırılmış bir yaklaşım eksik kalmaktadır. Bu protokolde, ROI'lerin makrodiseksiyonu, süspansiyon yakalama tabanlı numune hazırlama ve yüksek verimli MS analizini birleştiren entegre bir iş akışı sunulmaktadır. Bu yaklaşımla, patologlar tarafından teşhis edilen benign seröz kistik neoplazmlar (SCN) ve prekanseröz intraduktal papiller müsinöz neoplazmlardan (IPMN) oluşan hastaların FFPE dokularının ROI'leri makrodiseke edildi, toplandı ve analiz edildi, bu da yüksek proteom kapsamı ile sonuçlandı. Ayrıca, iki farklı pankreatik kistik neoplazm arasındaki moleküler farklılıklar başarılı bir şekilde tanımlandı, böylece bu yaklaşımın FFPE dokuları ile proteomik araştırmaları ilerletmek için uygulanabilirliği gösterdi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onlarca yıldır, cerrahi olarak eksize edilen insan dokuları formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) bloklar olarak arşivlenmiştir. Bu doku blokları başlangıçta parafine gömülü üç boyutlu (3D) yapıyı korur. Dokular daha sonra mikrotomlar kullanılarak dilimlenir, slaytlara monte edilir ve deneyimli patologlar tarafından histopatolojik tanıyı kolaylaştırmak için yaygın olarak hematoksilen ve eozin (HE) veya immünohistokimya (IHC) ile boyanır 1,2. FFPE dokuları, enzimatik ve proteolitik aktiviteyi durduranformalin tarafından indüklenen protein çapraz bağlanması nedeniyle uzun süreli depolama için belirgin avantajlar sunar 3. Büyük, iyi arşivlenmiş örnek setlerinin oluşturulmasını destekledikleri için, FFPE dokuları, genomik 4,5,6,7 dahil olmak üzere çeşitli alanlarda biyobelirteç keşfi için bir temel taşı olarak kabul edilmiştir.

Bununla birlikte, sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) tabanlı proteomikteki uygulamaları tarihsel olarak zorluklar doğurmuştur. Önemli bir sınırlama, triptik sindirime müdahale eden formalin kaynaklı protein çapraz bağlanmasıdır - küresel proteom analizinde kritik bir adım8. Ayrıca, doku slaytlarından elde edilebilen az miktarda protein, genellikle geleneksel numune hazırlama yöntemlerini uygunsuz hale getirir. Bu zorluklara rağmen, ilerlemeler, protein çapraz bağlarının uzun süreli yüksek sıcaklık tedavisi ile tersine çevrilebileceğini göstermiştir 9,10,11. Aynı zamanda, düşük miktarda protein numuneleri için optimize edilmiş numune hazırlama yöntemleri, proteomik araştırmalarında FFPE dokularının kullanımını genişletmiştir 12,13,14,15.

Proteomikte FFPE doku slaytlarını kullanmanın önemli bir avantajı, bölgeye özgü bir analizi mümkün kılma yeteneklerinde yatmaktadır. FFPE slaytları tipik olarak hem lezyonları hem de bitişik normal dokuyu (ANT) içerir. Tüm dokunun ayrım gözetmeksizin analiz edilmesi, karışık moleküler imzalar nedeniyle kafa karıştırıcı sonuçlar doğurur. Buna karşılık, ilgilenilen bölgelerin (ROI'ler) izole edilmesi ve analiz edilmesi - lezyonlara karşı ANT - patolojik bölgelere özgü moleküler özelliklerin daha kesin karakterizasyonunu sağlar. Sonuç olarak, FFPE tabanlı yaklaşımlar proteomik çalışmalarda giderek daha popüler hale gelmiştir 16,17,18,19,20. Büyüyen uygulamalarına rağmen, tüm proteomik deneyi adım adım anlatan aerodinamik bir iş akışı hala kıttır. Özellikle, video tabanlı bir protokol yayınlanmamıştır.

Bu çalışmada, lezyona özgü bölgelerdeki moleküler değişikliklerin doğru profillemesi için uyarlanmış sağlam bir LC-MS tabanlı proteomik iş akışı oluşturulmuştur. İki patolog tarafından teşhis edilen FFPE dokuları kullanılarak, benign seröz kistik neoplazmlar (SCN) ve prekanseröz intraduktal papiller müsinöz neoplazmlardan (IPMN) ROI'ler makrodiseke edildi, toplandı ve analiz edildi. Protokol, ROI'lerin bir makrodiseksiyonunu, minimum protein girdileri için optimize edilmiş süspansiyon yakalama tabanlı numune hazırlamayı ve dar aralıklı veriden bağımsız edinim (DIA)-MS analizini içerir. Bu yöntem, yaklaşık 1 cm²'lik doku alanlarından 9.000'den fazla proteinin tanımlanmasını sağladı ve SCN ve IPMN ile ilişkili farklı proteomik imzaları deşifre etti.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Seul Ulusal Üniversite Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB No. 1904-114-1028) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Tüm katılımcılar çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Bu protokolde kullanılan tüm materyaller ile ilgili detaylı bilgi Malzeme Tablosunda sunulmuştur.

1. Proteomik numune hazırlama için FFPE doku antijeni alımı

NOT: Herhangi bir çapraz kontaminasyonu önlemek için neşterlerin ve kullanılan tüp gibi tüm malzemelerin steril olduğundan emin olun. Bu çalışmanın protokolleri, laboratuvar kurulumuna bağlı olarak küçük değişikliklerle herhangi bir FFPE dokusu için uyarlanabilir.

  1. Tam montajlı FFPE doku bloklarından 10 μm'lik FFPE doku kesitleri kesin ve bunları cam slaytlara yerleştirin.
    NOT: Bu çalışmada, proteomik örnek hazırlama için insan pankreas kisti FFPE dokusu (iki farklı kistik doku tipi-SCN ve IPMN) kullanıldı.
  2. FFPE dokusunun parafin mumunu (deparafinize) ksilen içinde iki yıkama ile dikkatli bir şekilde çıkarın: Biri 5 dakika, diğeri 2 dakika.
  3. Dokuyu dereceli etanol karışımı ile seri yıkama yoluyla yeniden sulandırın:% 100,% 85,% 70 ve% 50 etanolde 3 dakika, ardından deiyonize suda durulayın.
    NOT: Ksilen ve etanolün kimyasal çeker ocakta işlendiğinden emin olun.

2. FFPE doku proteini ekstraksiyonu

  1. Patologlar tarafından ROI'nin belirtildiği HE veya IHC lekeli bir doku lamı hazırlayın.
  2. Lekesiz doku slaytını ve lekeli doku slaytını arka tarafları birbirine bakacak şekilde yerleştirin ve bunları hizalayın. Cam slayt aracılığıyla yatırım getirisinin gözlemlendiğinden emin olun.
  3. Neşter kullanarak ilgisiz doku bölgelerini çıkarın.
    NOT: Komşu normal doku analiz edilmesi gerekiyorsa, bunları diğer tüplerde toplayın.
  4. Neşter kullanarak doku ROI'lerini slaydın ortasına kazıyın ve bunları temiz 1,5 mL düşük proteinli bağlayıcı tüplere aktarın.
  5. Her tüpe 180 μL sodyum dodesil sülfat (SDS) lizis tamponu (% 5 SDS, 2 mM tris (2-karboksietil) fosfin) [TCEP], deiyonize suda 300 mM pH 8.5 Tris-HCl) ekleyin.
    NOT: Lizis tamponunun hacminin, sonikasyon sırasında dokuyu çözündürmek ve ekstrakte edilen proteinleri askıya almak için yeterli olduğundan emin olun. Yetersiz tampon eksik doku lizizine yol açabilirken, aşırı tampon protein lizatını seyreltebilir.
  6. 5 s açık ve 5 s kapalı 10 döngü uygulayarak% 20'lik bir genlikte prob sonikasyonu gerçekleştirin.
  7. Numuneleri 1.000 x g ile 3,5 saat boyunca 100 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Verimli protein ekstraksiyonu için inkübasyon sırasında her saat 1 dakika boyunca numunelerin su sonikasyonunu gerçekleştirin.
  8. İnkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında (RT) 10 dakika soğutun. Doku kalıntılarını süpernatanttan ayırmak için numuneleri RT'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı temiz, etiketli bir tüpe toplayın ve daha fazla kullanılana kadar -80 ° C'de saklayın.

3. FFPE doku lizatının protein miktar tayini

NOT: Protein miktar tayini için çoğu biskinkoninik asit tahlil adımı, küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarına dayanmaktadır. Reaktiflerin üreticinin yönergelerine göre hazırlanması önerilir.

  1. Stok çözeltisini (2 mg / mL BSA) seri olarak seyrelterek değişen konsantrasyonda sığır serum albümini (BSA) standartlarını hazırlayın. Gerekirse, numuneleri 20 veya 40 seyreltme faktörü ile seyreltin.
  2. Deiyonize suyu boş olarak ve SDS lizis tamponunu numune kontrolü olarak hazırlayın.
  3. 9 μL standart, boş, numune kontrolü ve numuneleri mikroplaka kuyusunun merkezine pipetleyin.
  4. Her oyuktaki numuneye 4 μL uyumluluk reaktif çözeltisi ekleyin.
  5. Plakayı örtün ve 1 dakika boyunca orta hızda bir plaka çalkalayıcı üzerinde karıştırın. Bundan sonra, plakayı 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  6. Her bir oyuğa 260 μL BCA çalışma reaktifi ekleyin ve ardından plakayı 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  7. Plakayı RT'de 3 dakika soğutun.
  8. Bir plaka okuyucuda kuyucukların emilimini 562 nm'de ölçün.
  9. Boşluğun 562 nm absorbans değerini tüm numunelerin ve numune kontrolünün değerinden çıkarın.
  10. Ayrıca, boş çıkarılmış numune kontrolünün 562 nm absorbans değerini tüm numunelerinkinden çıkarın.
  11. Her bir numunenin protein konsantrasyonunu belirlemek için standart eğriyi çizin ve kullanın.
    NOT: Tahmini 200-250 μg proteinin, her biri yaklaşık 1cm2 alana sahip üç cam FFPE doku slaytından ekstrakte edildiğinden emin olun.

4. Proteinin aseton çökelmesi

NOT: Aseton çökeltme ve süspansiyon tutucu bazlı protein sindirimi için toplam 100-300 μg protein kullanıldığından emin olun.

  1. Protein örneğini (100-300 μg'ye karşılık gelir) aseton uyumlu bir tüpe yerleştirin.
  2. Tüpe numune hacminin beş katı bir hacimde -20 °C aseton ekleyin.
  3. Karışımı -20 °C'de 18 saat inkübe edin.
  4. Tüpü 15 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
  5. Protein peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice atın.
  6. 500 μL -20 °C aseton ekleyin ve 4.4-4.5 adımlarını tekrarlayın.
  7. Numuneyi havayla kurutun.

5. Süspansiyon yakalama bazlı protein sindirimi

NOT: Süspansiyon yakalama filtresi bazlı protein sindirim prosedürü, küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarından uyarlanmıştır.

  1. Süspansiyon tutucu lizis tamponu hazırlayın (deiyonize suda %5 SDS, 5 mM TCEP, 50 mM pH 8.5 TEAB).
  2. Numune tüpüne 40 μL tampon ekleyin ve havayla kurutulmuş protein peletini çözmek için iyice girdaplayın.
  3. Numuneyi 100 ° C'de 1.000 x g'da 35 dakika çalkalayarak inkübe edin.
  4. Numuneye 10 μL alkilleyici reaktif (100 mM pH 8.5 Tetraetilamonyum bromür [TEAB]'de 100 mM kloroasetamid [CAA]) ekleyin.
  5. 1 saat boyunca 300 x g'da çalkalayarak RT'de inkübe edin.
  6. Dikkatli bir asitleştirici (deiyonize suda %10 trifloroasetik asit [TFA]) hazırlayın. Güçlü bir asit olan TFA'nın kimyasal çeker ocakta işlendiğinden emin olun.
  7. %1 TFA'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için numuneye 5 μL asitleştirici ekleyin (nihai numune hacmi: 55 μL).
  8. pH kağıdı kullanarak numunenin pH değerini kontrol edin. PH'ın 1'den küçük olduğundan emin olun.
  9. Proteinleri yakalamak için numuneye 350 μL bağlama/yıkama tamponu-1 (%90 MeOH'de 0,1 M pH 8,5 TEAB) ekleyin.
    NOT: Numune kaybını önlemek için protein yakalama sırasında (adım 5.9) girdaplama ve santrifüjlemeden kaçının. Yeterli miktarda protein, yarı saydam bir görünüme sahip görünür kolloidal protein partikülünün oluşumunu sağlar.
  10. Süspansiyon yakalama kolonunu 2 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve çözünmeyen herhangi bir malzeme de dahil olmak üzere tüm numuneyi süspansiyon yakalama kolonuna aktarın.
  11. Proteinleri yakalamak için sütunu 50 saniye boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Tüm numunelerin kolondan geçtiğinden emin olun; Değilse, filtrasyon tamamlanana kadar santrifüjlemeyi tekrarlayın.
  12. Kolona 400 μL yıkama tamponu-2 (% 50 CHCl3 /% 50 MeOH) ekleyin, 50 saniye boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
  13. Adım 5.12'yi üç kez tekrarlayın.
  14. 400 μL tampon-1 ekleyin, 50 saniye boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
  15. Adım 5.14'ü üç kez tekrarlayın.
  16. Tampon-1'in tüm geçişini sağlamak için 4000 x g'da 1.25 dakika santrifüjleyin.
  17. Enzimatik sindirim için süspansiyon yakalama kolonunu yeni bir numune tüpüne aktarın.
  18. Süspansiyon yakalama kolonuna 125 μL sindirim tamponu (50 mM pH 8.5 TEAB'de 0.16 μg/μL tripsin/Lys-C) ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için kapatın.
    NOT: Tripsin/Lys-C oranı 1:10 (ağırlık/ağırlık) olmalıdır. Etkili sindirim için en az 10 μg tripsin/Lys-C sağlayın.
  19. 37 °C'de çalkalamadan 18 saat inkübe edin.
  20. Aşağıdaki elüsyon tamponlarını hazırlayın: tampon-1 (deiyonize suda 50 mM pH 8.5 TEAB), tampon-2 (deiyonize suda %0.2 FA) ve tampon-3 (deiyonize suda %50 asetonitril [ACN]).
  21. Süspansiyon yakalama kolonuna 80 μL elüsyon tamponu-1 ekleyin ve 1.25 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin.
  22. Adım 5.20'yi 80 μL elüsyon tamponu-2 ve tampon-3 ile tekrarlayın.
  23. Ayrıştırılmış peptitleri bir araya getirin ve temiz, yeni bir tüpe aktarın.

6. Peptit miktar tayini

NOT: Kantitatif kolorimetrik peptit testinin adımlarının çoğu, üreticinin talimatından küçük değişikliklerle uyarlanmıştır. Reaktiflerin üreticinin yönergelerine göre hazırlanması önerilir.

  1. Standardın stok çözeltisini (1 mg/mL) seri olarak seyrelterek bir dizi standart hazırlayın. Gerekirse, numuneleri 4 veya 5'lik bir seyreltme faktörü kullanarak seyreltin.
  2. Deiyonize suyu boş olarak ve numune kontrolü ile eşit oranlarda elüsyon tamponu-1, tampon-2 ve tampon-3 karışımı olarak hazırlayın.
  3. 20 μL standartları, boş, numune kontrolünü ve numuneleri her bir mikroplaka kuyucuğunun ortasına yerleştirin.
  4. Her bir oyuğa 180 μL çalışma reaktifi ekleyin ve plakayı bir plaka çalkalayıcı üzerinde 1 dakika boyunca iyice karıştırın.
  5. Plakayı örtün ve plakayı 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
  6. Plakanın RT'de 3 dakika soğumasına izin verin.
  7. Bir plaka okuyucu kullanarak kuyuların emilimini 480 nm'de ölçün.
  8. Boşluğun 480 nm absorbans değerini tüm numunelerin ve numune kontrolünün değerinden çıkarın.
  9. Ayrıca, boş çıkarılmış numune kontrolünün 480 nm absorbans değerini tüm numunelerinkinden çıkarın.
  10. Her numune için peptit konsantrasyonunu hesaplamak için standart eğriyi çizin ve kullanın.

7. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi analizi

  1. Peptit miktar tayininden sonra, 20 μg peptitleri liyofilize edin.
  2. Peptitleri 40 μL sulu tamponda (% 0.1 formik asit [FA] su içinde% 3 ACN) bir sonikasyon banyosunda 10 dakika boyunca yeniden çözün. Elde edilen peptit konsantrasyonu 0.5 μg / μL olacaktır.
  3. Numuneyi 60 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin ve numuneleri MS analizi için şişelere aktarın.
  4. Nano LC-MS/MS sisteminin otomatik örnekleyicisini kullanarak her numuneden 2 μL enjekte edin.
  5. Ters fazlı bir kolon üzerinde ayrı peptitler (0.075 mm ID x 150 mm kolon, 3 μm C18 malzeme ile paketlenmiş, 100 nL / dk'da 127 dakikalık %5-35 asetonitril gradyanı kullanılarak. Peptitleri bir nanosprey iyon kaynağı ile iyonize edin ve orbitrap tabanlı bir kütle spektrometresine aktarın.
  6. Dar aralıklı veriden bağımsız bir edinim yöntemi kullanarak peptitleri analiz edin21.
  7. Aşağıdaki MS parametre ayarını uygulayın: MS m/z aralığı: 495-745, çözünürlük hedefi: 15000, AGC hedefi: 3 x 10E6, maksimum enjeksiyon süresi: otomatik, MS/MS penceresi: Kullanıcı tanımlı (Ek Dosya 1), çözünürlük hedefi: 45000, AGC hedefi 3 x 10E6, maksimum enjeksiyon süresi: otomatik, HCD Çarpışma Enerjisi: %22, %26, %30.
    NOT: Analizden önce standart numuneleri analiz ederek cihazın ilk kalite kontrolünün yapılması önerilir. Parametreleri yapılandırmak için MS veri toplama yazılımını kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).

8. Proteomik arama için veri analizi

NOT: MS ham verilerinin proteomik araması için, LC-MS veri formatını dönüştürmek ve proteom araması yapmak için açık kaynaklı araçlar kullanılmıştır ( Materyal Tablosuna bakınız). Veri analizi için kullanılan parametreler Ek Dosya 2'de detaylandırılmıştır. Açık kaynaklı araçlar için temel kullanım talimatları için, Malzeme Tablosunda yer alan bağlantıya bakın.

  1. LC-MS'den elde edilen ham MS/MS spektrum dosyalarını (*.raw) açık kaynaklı yazılım kullanarak *.mzML formatına gizleyin.
  2. Proteom aramasını gerçekleştirmek için açık kaynaklı bir arama motorunun girdisi olarak biçime dönüştürülmüş ham dosyaları (*.mzML) kullanın.
  3. Ek Dosya 2'de belirtilen parametrelere dayalı olarak proteomik aramayı başlatın.

9. İstatistiksel analiz

NOT: Diferansiyel olarak ifade edilen proteinleri tanımlamak için istatistiksel analiz için, tek değişkenli analiz yapmak üzere açık kaynaklı bir araç kullanılmıştır (örneğin, Student'ın t-testi; Malzeme Tablosuna bakın). Malzeme Tablosunda sağlanan bağlantı aracılığıyla açık kaynaklı araç için temel kullanım talimatlarına başvurmanız önerilir.

  1. Tanımlanan proteinlerin listesini (*.txt) açık kaynaklı araca aktarın.
  2. Örnekleri gruplara ayırın. Bu çalışma için SCN ve IPMN olmak üzere iki grup belirlenmiştir.
  3. Veri dağılımını yaklaşık normal dağılıma ayarlamak için bolluk değerlerinin Günlük2 dönüşümünü gerçekleştirin.
  4. Eksik değerlere sahip proteinleri çıkarmak için bir filtreleme adımı uygulayın. Bu çalışmada, dahil edilmek için her grupta en az iki geçerli değer gerekliydi.
  5. Sonraki tek değişkenli analiz için kapsamlı bir niceliksel protein listesi oluşturmak için normal dağılım tabanlı bir yaklaşım kullanarak eksik değerleri atayın.
  6. İki grup arasında diferansiyel olarak ifade edilen proteinleri tanımlamak için bir Öğrenci t-testi yapın. Bu çalışmada Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesi uygulanmıştır.
  7. Aşağıdaki kriterleri karşılayan diferansiyel olarak ifade edilen proteinleri çıkarın: Benjamini-Hochberg FDR < 0.05 ve |kat değişimi| ≥ 2.

10. Biyoinformatik analiz

NOT: Aşırı temsil analizi için ticari bir biyoinformatik aracı kullanılmıştır (örneğin, Ingenuity yol analizi, Malzeme Tablosuna bakın). Bu aracı kullanmadan önce üreticinin talimatlarına başvurmanız önerilir.

  1. DEP'lerin listesini (*.txt) ticari araca aktarın.
  2. Aşırı temsil analizi yapmak için temel analizi başlatın.
  3. Fisher'ın kesin testini kullanarak DEP'lerden zenginleştirilmiş önemli kanonik yolları dışa aktarın (p değeri 0,05'< ayarlandı). Araştırmayla ilgili ilgi yollarını belirleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas kistik FFPE dokularına tek atışlık veriden bağımsız edinim kullanılarak etiketsiz kantitasyon ile birleştirilen süspansiyon yakalama filtresi bazlı proteomik numune hazırlama uygulandı (Şekil 1). FFPE doku işlemesi sırasında farklı pankreas kistik FFPE dokuları arasında hassas ROI izolasyonu elde edildi (Şekil 2A), bu da her bir pankreas kistik neoplazm tipi için biyolojik tri-replikatlar arasında tekrarlanabilir toplam iyon kromatogramlarının elde edil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, patolojik tanı için cam slaytlar üzerine monte edilmiş FFPE doku kesitlerinden izole edilen ROI'leri kullanan hızlı ve etkili bir proteomik yöntemi ana hatlarıyla belirtir. Cerrahi girişimin avantajlı olduğu durumlarda, kanser ve kist gibi solid neoplazmlar cerrahi olarak rezeke edilir ve patolojik değerlendirme için saklanır. Uzun süreli depolama için, dokular formalin içinde sabitlenir ve parafin (FFPE) içine gömülür. FFPE doku blokları daha sonra 4-10 μm kalınlığa kadar k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makaledeki tüm figürler BioRender (http://www.biorender.com) ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibeleri ile desteklenmiştir (Hibe No. RS-2023-00253403 ve RS-2024-00454407).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ACN'de %0,1 FA (LC-MS sınıfı)Fisher ChemicalLS120-212
Suda %0,1 FA (LC-MS sınıfı)Fisher ChemicalLS118-4
0.5M TCEPThermo Scientific77720
%10 SDSInvitrogen2679093
1M TEAB (pH 8.5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl (pH 8.5)BİYOÇÖZÜMBTO21
A-14C santrifüjSatorious167709
Aseton (HPLC sınıfı)Fisher ScientificA949-4
ACN (HPLC sınıfı)JTbaker9017-88
CHCl3 (HPLC sınıfı)Thermo Scientific022920.k2
CR kağıtADVANTEC70406001
DIA-NN ver 1.9 Açık kaynak https://github.com/vdemichev/DiaNNProteomik Arama Motoru 
EPOCH2 mikroplaka okuyucuAgilent 
EtanolMERCKK50505283 836
FA (LC-MS sınıfı)Fisher ChemicalA117-50
Yaratıcılık Yolu Analizi (IPA)QIAGEN830018Biyoinformatik aracı
Liyofilizatör (SRF110R + vaper tuzağı)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (HPLC sınıfı)MERCKUN1230
Mikroplaka BCA protein Test kiti İndirgeyici Ajan UyumluThermo Scientific23252
MSConvert Açık kaynak http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlMS veri dönüştürme yazılımı
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 ayırma kolonu Thermo ScientificES903
PerseusAçık kaynakhttps://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.htmlİstatistiksel araç
PIERCE kloroasetamid Tartımsız FormatThermo ScientificA39270
PIERCE Kantitatif kolorimetrik peptit TestiThermo Scientific23275
Plaka çalkalayıcı Yeşil SSerikerVS-202D
Prob sonikatörüVibraCellTMVCX750
Protein LoBind Tüpü 1.5 mLEppendorf22431081
QSP 10 ve mikro; L pipet ucuThermo ScientificTLR102RS-Q
QSP 300 & mikro; L Pipet UcuThermo ScientificTLR106RS-Q
NeşterBard-Parker372615
S-Trap: Hızlı Evrensel MS numune HazırlamaPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Flakon 0,2 mLThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Tripsin / Lys-C (LC-MS sınıfı)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Su (HPLC sınıfı)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS veri toplama yazılımı
XyleneSigma-Aldrich102033629
2106208

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
  2. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  3. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).
  4. Basyuni, S., et al. Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility. Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).
  5. Gracia Villacampa, E., et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).
  6. Zhang, X., et al. Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer. EBioMedicine. 77, 103897(2022).
  7. Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving. Innov. 5 (1), 100532(2024).
  8. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  9. Soni, R. K. Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach. STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).
  10. Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).
  11. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  12. Ye, X., et al. Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications. TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).
  13. Nwosu, A. J., et al. In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm. J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).
  14. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).
  15. Makhmut, A., et al. A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics. Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).
  16. Shin, D., et al. Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer. Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).
  17. Lee, H., et al. Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm. Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).
  18. Tüshaus, J., et al. Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study. EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).
  19. Schweizer, L., et al. Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation. EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).
  20. Kobayashi, G., et al. Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations. J Proteomics. 301, 105196(2024).
  21. Kawashima, Y., et al. Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry. J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).
  22. Li, W., et al. Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients. Mol Med. 28 (1), 43(2022).
  23. Martinelli, P., et al. GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer. Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).
  24. Racu, M. -L., et al. Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy. Cancers. 15 (15), 3765(2023).
  25. Roy, L. D., et al. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).
  26. Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer. BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).
  27. Waters, A. M., Der, C. J. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).
  28. Yao, H., et al. Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).
  29. Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells. Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).
  30. Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme. J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).
  31. Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome. Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).
  32. Searle, B. C., et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).
  33. Prakash, J., Shaked, Y. The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics. Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).
  34. Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies. Front Oncol. 11, 751311(2021).
  35. Ferrara, B., et al. The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options. Cancers. 13 (17), 4442(2021).
  36. Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship. Cancers. 10 (9), 316(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ProteomicsFFPE TissueRegion Of InterestSuspension TrappingProtein DigestionPancreatic NeoplasmsData Independent AcquisitionPeptide QuantificationLiquid ChromatographyBioinformatics Analysis

Related Articles