Method Article

Frajil X Messenger Ribonükleoproteinden Yoksun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositlerin Üretimi ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/68081

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin fonksiyonel ön beyne özgü astrositlere farklılaşmasını kolaylaştıran bir protokolü açıklıyoruz. Bu, Frajil X Sendromu gibi nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde glial hücrelerin rolünün araştırılmasını ve diğer beyin bozukluklarının modellenmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otizm spektrum bozukluğu ve zihinsel engelliliğin önde gelen kalıtsal bir nedeni olan Frajil X sendromu (FXS), kemirgen modelleri kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Daha yakın zamanlarda, insan kök hücresinden türetilmiş model sistemleri, FXS'nin patofizyolojisi hakkında mekanik içgörüler elde etmek için de kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar neredeyse sadece nöronlara odaklanmıştır. Ayrıca, glia'nın sağlık ve hastalıkta nöronal fonksiyonda önemli bir rol oynadığına dair artan kanıtlara rağmen, insan astrositlerinin FXS'den nasıl etkilendiği hakkında çok az şey bilinmektedir.

Bu nedenle, bu çalışmada, beyin gelişiminin temel uzay-zamansal kilometre taşlarını yakalayan ve aynı zamanda gliogenez süreciyle de uyumlu olan bir protokolü başarıyla geliştirdik. Birlikte bu, nörogelişimsel bozuklukları incelemek için yararlı bir çerçeve sunar. İlk olarak, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri, Dekapentaplejik (SMAD) inhibisyona ve küçük moleküllere karşı ikili Anneler Baskılayıcı ile nöroektodermal soy içine yerleştirdik. Daha sonra, kontrol (CTRL) ve FXS hastadan türetilmiş astrositik progenitör hücreler (APC'ler) oluşturmak için spesifik büyüme faktörleri ve sitokinler kullandık. APC'lerin farklılaşan bir sitokin olan siliyer nörotrofik faktör ile tedavisi, progenitör hücreleri düzenledi ve astrositik olgunlaşmaya doğru sürükledi, ön beyne özgü glial fibriler asidik protein eksprese eden astrositler verdi.

Bu astrositlerin, ATP uygulamasına kalsiyum yanıtları ile kanıtlandığı gibi işlevsel olduklarını ve FXS'de düzensiz glikolitik ve mitokondriyal metabolizma sergilediklerini bulduk. Birlikte ele alındığında, bu bulgular, nörogelişimsel bozuklukların neden olduğu astrositik fonksiyondaki değişikliklerin hücre otonom ve hücre otonom olmayan sonuçlarının araştırılması için insan kaynaklı yararlı bir deneysel platform sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zihinsel engellilik ve otizm spektrum bozukluğunun (OSB) yaygın bir kalıtsal formu olan Frajil X Sendromu (FXS), frajil X haberci ribonükleoprotein 1 (FMR1) geni (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624) tarafından üretilen frajil X haberci ribonükleoprotein (FMRP) eksikliğinden kaynaklanır. FMRP, mRNA translasyonunun düzenlenmesinde, mRNA granül oluşumu ve taşınmasında ve gen ekspresyonunun mikroRNA aracılı regülasyonundarol oynar 1. Bu nedenle, FMRP kaybı sadece beyin gelişimini değil, aynı zamanda yetişkin beyin fonksiyonlarını da etkiler. Hem FMR1'in mRNA transkript seviyeleri hem de beyindeki FMRP için immün boyama, glial hücrelerde de önemli ekspresyonun yanı sıra yüksek nöronal ekspresyon göstermiştir2. Bununla birlikte, FXS'nin hayvan modellerinde daha önce yapılan çalışmaların büyük çoğunluğu, öncelikle nöronlara ve işlevlerindeki sapmalara odaklanmıştır. Sonuç olarak, glia'nın FXS3'teki rolü hakkında çok az şey bilinmektedir. Geleneksel olarak "pasif destek" hücreleri4 olarak düşünülen astrositlerin, sinaptogenezin teşvik edilmesi7, gelişmekte olan nöral devrelerin8 iyileştirilmesi ve nörotransmitter geri dönüşümü9 dahil olmak üzere çok çeşitli nöronal işlevlere 5,6 aracılık etmede kritik olduğuna dair biriken kanıtlar vardır. Buna paralel olarak, astrositlerin hastalık patogenezindeki rolüne dair artan kanıtlar vardır ve birçok nörolojik durum astrositik disfonksiyon ile ilişkilendirilmiştir10.

FXS'nin hayvan modellerini kullanan daha önceki çalışmaların çoğu, FXS'yi tedavi etmek için nöronlardaki çeşitli moleküler hedeflerin belirlenmesine ve doğrulanmasına odaklanmış olsa da, bu klinik öncesi bulgular her zaman başarılı klinik sonuçlara yol açmamıştır. Ayrıca, son klinik çalışmalardaki aksaklıklar da insan temelli model sistemlere olan ihtiyacın altını çizmektedir. İnsan kök hücresinden türetilmiş beyin hücrelerine dayanan nörolojik bozukluk modelleri, hayvan çalışmalarından elde edilen mekanik içgörüler ile hastalar için klinik sonuçlarla sınırlı başarı arasındaki bu boşluğu kapatmak için güçlü bir strateji sunmaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmaların sadece bir kısmı astrositlere odaklanmıştır ve bu da çoğunlukla omurga kökenli astrositlere odaklanmıştır. Bu da, astrositlerin yapısının ve işlevinin beyin bölgeleri arasında farklılık gösterdiğini gösteren çalışmaların ışığında önemlidir11,12. Bu nedenle, insan astrositlerinde hastalığa bağlı değişikliklerin daha iyi anlaşılması, astrositlerdeki bu beyin bölgesine özgü farklılıkları da hesaba katmalıdır. Bununla birlikte, ön beyne özgü insan kök hücre türevli astrositleri kullanan nörogelişimsel bozukluk modelleri nispeten az araştırılmıştır13. Bu nedenle, bu boşlukları ele almaya başlamak için, FXS mutasyonları taşıyan hastadan türetilmiş indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ön beyne özgü astrositler üretmek için protokolleri açıklıyoruz; Ayrıca, astrositlerin işlevsel olduğunu ve değişmiş metabolizma gösterdiğini gösteriyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) (Tablo 1) kullanılarak yapılan tüm deneyler, uygun kurumsal düzenleyici onaylar alındıktan sonra gerçekleştirilmiştir. Şekil 1A , hiPSC'lerin olgun ön beyne özgü astrositlere tam farklılaşma protokolünü temsil eder.

1. hiPSC'lerin bakımı ve genişletilmesi

  1. iPSC'leri kaplamadan bir gün önce, 6 oyuklu bir tabağı 1:60 seyreltilmiş Matrigel (bir Hücre Dışı Matris [ECM]) ile Advanced Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium/Ham'ın F-12'sinde (DMEM/F12) kaplayın ve 2-8 °C'de saklayın.
    NOT: Matrigel kaplı tabakları >5 gün boyunca 2-8 °C'de saklamaktan kaçının, çünkü bu zamanla ECM'de protein bozulmasına neden olabilir. Yemeğin kurumasını önlemek için, 6 oyuklu bir tabağın bir oyuğu başına en az 1 mL 1:60 seyreltilmiş Matrigel kaplayın ve tabağa eşit şekilde yayın. Aynı gün kullanıyorsanız, plakayı 37 ° C'de ve 1 saat boyunca% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
  2. HiPSC'lerin kültürlendiği gün, kaplama malzemesini çıkarın ve 1x nihai konsantrasyonda ROCK inhibitörü ile birlikte 1 mL tam Essential 8 besiyeri (Esansiyel 8 takviyeli E8 bazal besiyeri) ekleyin ve hiPSC'leri eklemeden önce tabağı 37 °C ve %5 CO2 inkübatörde tutun.
  3. Kolonilerin daha iyi yapışması için hiPSC'leri tam E8 ortamında ROCK inhibitörü ile birlikte 1x son konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
    NOT: Büyük miktarlarda kültür ortamı hazırlamayın. En fazla 3-4 gün hazırlayın ve 2-8 °C'de saklayın.
  4. Ertesi gün, hücreler% 80 birleşene kadar (yaklaşık 4-5 gün) ROCK inhibitörü olmadan tüm E8 ortamını doldurun.
  5. % 80 birleşmeye ulaştıklarında, kolonileri enzimatik olarak ayırın.
    1. iPSC'leri geçmek için, harcanan ortamı tabaktan çıkarın ve önceden ısıtılmış (37 ° C) kollajenaz (2 mg / mL) karışımı (2 mg / mL) ve dispas (1 mg / mL) 1: 1 oranında 1 mL ekleyin ve iPSC kolonilerinin kalkmasına izin vermek için 37 ° C'de 20-30 dakikadan fazla inkübe edin.
      NOT: Bulaşıkları 37 °C'de 20-30 dakikadan fazla bırakmayın; Bu sürenin ötesinde koloniler parçalanacak ve hücreler ölecektir.
  6. Koloniler kalkmaya başladığında, bulaşıkları kuluçka makinesinden çıkarın ve 2 mL Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ekleyerek enzim aktivitesini nötralize edin.
  7. Kolonileri DPBS ile kazıyın ve süspansiyonu geniş delikli 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın.
  8. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak kolonileri parçalamak için süspansiyonu 2-3x nazikçe ezin ve kolonilerin yerleşmesine izin verin.
    NOT: Kolonileri tek hücre haline getirmeyin; Bu, hücrelerin yemeğe yapışmamasına ve daha fazla hücre ölümüne neden olabilir. Ayrıca, onları büyük koloniler olarak bırakmayın; Bu, daha sonra daha farklılaşmış kolonilere yol açacaktır.
  9. Koloniler yerleştikten sonra (yaklaşık 2 dakika sonra), tüpte yaklaşık 1 mL bırakarak DPBS enzim karışımını aspire edin.
  10. Tüpe 2 mL DPBS ekleyin, kolonileri hafifçe vurarak karıştırın ve çökmelerine izin verin. Kolonilerden kalan tüm enzimi çıkarmak için bu 2 kez tekrarlayın. 2. yıkamadan sonra mümkün olduğu kadar çok süpernatanı çıkarın, kolonileri 1 mL tam E8 Ortamında yeniden süspanse edin ve 1.2-1.3 adımlarında belirtildiği gibi taze hazırlanmış bir tabakta tabağa koyun.
  11. Alternatif olarak, gelecekteki genişleme ve kullanım için kriyoprotektan çözeltisi olarak %10 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanan kolonilerin bir kısmını kriyoprezervasyon yapın.
    1. Kriyoprotektan solüsyon olarak %90 tam E8 besiyeri ve %10 DMSO'yu karıştırarak kriyoprezervasyon ortamını taze olarak hazırlayın ve kullanana kadar 2-8 °C'ye koyun.
  12. Kriyoprezervasyon yapmak için 1.5-1.10 adımlarını izleyin.
  13. Adım 1.10 sırasında, 2. yıkamadan sonra, kolonilerin yerleşmesine ve süpernatanı çıkarmasına izin verin. Kolonilere 1 mL taze hazırlanmış soğuk kriyoprezervasyon ortamı ekleyin ve kriyoviyallere aktarın.
    NOT: Kriyoprezervasyon ortamını kolonilere ekledikten sonra, içeriği hızlı bir şekilde kriyoviyallere aktarın. DMSO, hücrelere zarar verebilecek bir kriyoprotektan olduğundan, geciktirme daha düşük bir canlanma oranına neden olabilir.
  14. Kriyovialleri hemen bir kriyo kutusuna taşıyın ve gece boyunca -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
  15. Ertesi gün, tüm kriyoviyalleri ileride kullanmak üzere bir Sıvı Nitrojen tankına (LN2 tankı) kaydırın.
    NOT: hiPSC'ler, herhangi bir anormallik için G-bandı (Ek Şekil S1) kullanılarak rutin olarak karyotiplendirilmeli, pluripotens için immünositokimya kullanılarak karakterize edilmelidir (Şekil 1B) ve mikoplazma için test edilmelidir.
    1. İmmünositokimya kullanarak hiPSC'leri karakterize etmek için, kolonileri 1:60 Matrigel kaplı, otoklavlanmış 13 mm cam lameller üzerine yerleştirin. % 40 birleştikten sonra, hücreleri PBS-T (PBS-0.1% Tween 20) ile yıkayın, 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin, 10 dakika boyunca PBS'de% 0.3 Triton X-100 ile geçirgen hale getirin ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için PBS'de% 3 Sığır Serum Albümini (BSA) ile 1 saat bloke edin.
    2. Bloke ettikten sonra, kültürleri 1 saat boyunca birincil antikorlarla inkübe edin ve daha sonra 3x'i PBS-T ile her biri 5 dakika boyunca yıkayın, ardından karanlıkta 1 saat boyunca karşılık gelen ikincil antikorları (Malzeme Tablosu) yıkayın.
    3. Lamelleri montaj ortamı ile cam kızaklara monte edin ve 405 nm, 488 nm, 561 nm ve 633 nm'de konfokal lazer tarama ile görüntüler elde edin. 512 x 512 pikselde görüntü yakalayın; Z adım boyutunu 0.5 havadar iğne deliği çapı ile 1 μm'ye ayarlayın.

2. Astrositik progenitör hücrelerin (APC'ler) oluşumu ve karakterizasyonu

  1. HiPSC'leri adım 1.5-1.10'da belirtildiği gibi enzimatik olarak kaldırın ve bunları %50 Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (IMDM), %50 Jambonun F-12 Besin Karışımı (F12), 5 mg/mL BSA, %1 Kimyasal Olarak Tanımlanmış Lipid Konsantresi (CD-Lipid), 450 μM Monotiogliserol, 7 μg/mL İnsülin, 15 μg/mL Transferrin içeren kimyasal olarak tanımlanmış ortam14 ile yapışmayan bir süspansiyon kültür kabına (100 mm) yerleştirin, 7 gün boyunca ön beyin patern mitojenleri N-asetil Sistein (1 mM), LDN 193189 (0.1 μM) ve SB431542 (10 μM) ile desteklenmiş% 1 Penisilin-Streptomisin.
    NOT: Küçük molekül inhibitörleri SB431542 ve LDN-193189 (LDN), kemik morfogenetik proteininin ve transforme edici büyüme faktörü-beta sinyal yolaklarının inhibitörleridir.
    Bu noktadan itibaren, ortam 2 günde bir veya Pazartesi/Çarşamba/Cuma protokolünü takiben yenilendi.
  2. Kortikosferlerin gelişimine yardımcı olmak için hücre süspansiyonunu normoksik koşullar altında 7 gün boyunca 40 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin (Şekil 1A).
  3. 8. günde, kortikosferleri 7 gün boyunca% 1 Antibiyotik-Antimikotik,% 1 N2 takviyesi,% 1 glutamin ikamesi,% 0.1 B27 takviyesi ve% 0.1 / mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile Gelişmiş DMEM / F12 içeren bir hücre proliferasyon ortamına aktarın.
  4. Erken gliosferler elde etmek için küreleri 2 hafta boyunca %1 Antibiyotik-Antimikotik, %1 N2, %1 glutamin ikamesi, %0.1 B27 takviyesi, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), bFGF-H (20 ng/mL bFGF-5 mg/mL heparin) içeren Gelişmiş DMEM/F12 içeren glial zenginleştirme ortamına tabi tutarak glial spesifikasyon için indükleyin (Şekil 1A).
  5. Erken gliosferlerin olgunlaşması için, bFGF-H'yi 20 ng / mL lösemi inhibitör faktörü (LIF) ile değiştirin ve küreleri 4 hafta boyunca koruyun.
  6. Olgunlaşma ortamında 4 hafta sonra, küreleri uzun süre glial zenginleştirme ortamında tutun. Topaklanmayı ve canlılık kaybını önlemek için, her 2 haftada bir, steril bir endüstriyel bıçak kullanarak gliosferleri mekanik olarak doğrayın ve doğramadan üretilen DNA parçalarını çıkarmak için tüm ortamı DNaz I ile değiştirin.
  7. Bir Papain ayrışma kiti kullanarak gliosferleri APC'lerin tek katmanlarına ayırın ve 1:80 Matrigel kaplama seyreltme ile hücre kültürü ile muamele edilmiş yapışkan bir tabak üzerine plaka koyun.
  8. APC'leri glial zenginleştirme ortamında %80 birleşene kadar çoğaltın ve enzim hücresi ayırma ortamını kullanarak bunları enzimatik olarak geçirin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  9. Geçmek için:
    1. Harcanan ortamı çıkarın ve konik bir tüpte toplayın. Hücrelere enzim hücre ayrılma ortamını ekleyin ve 1-2 dakika bekleyin. Hücreler ayrılmaya başladığında, enzim aktivitesini nötralize etmek için harcanan ortamı ekleyin.
    2. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 800 x ɡ'de 2 dakika santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı aspire edin, hücreleri glial zenginleştirme ortamında yeniden süspanse edin ve yaklaşık 1 x 106 hücre / kuyu üzerine 1:80 Matrigel kaplı 6 oyuklu bir tabağa yerleştirin.
  10. Kriyoprezervasyon için:
    1. Hücreleri% 90 kortikosfer proliferasyon ortamı (bFGF olmadan) ve% 10 kriyoprotektan oluşan soğuk bir karışımda yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınan hücreleri kriyoviyallere aktarın.
    2. Kriyovialleri hemen bir kriyokutuya taşıyın ve gece boyunca -80 °C dondurucuda saklayın.
    3. Ertesi gün, tüm kriyoviyalleri ileride kullanmak üzere bir Sıvı Nitrojen tankına (LN2 tankı) kaydırın.
      NOT: APC'ler, 6 numaralı geçişe kadar %10 DMSO kullanılarak dondurularak saklandı.
  11. Ayrışmış APC'leri vimentin ve Nükleer Faktör IA (NFIA) belirteçleri ile immün boyama (adım 1.15.1-1.15.3'te belirtildiği gibi) ile karakterize edin (Şekil 1C, D) (Seyreltmeler için Malzeme Tablosuna bakınız).
  12. HiPSC'den türetilmiş APC'lerin ön beyin bölgesel özgüllüğünü doğrulamak için, hücreleri gerçek zamanlı qPCR kullanarak insan çatal başlı kutu G1 (hFOXG1) (pozitif) gibi bir ön beyin işaretleyicisi ve insan Homeobox B4 (hHOXB4) (negatif) gibi bir arka beyin belirteci için test edin (Şekil 1E, F).
    NOT: Bu deneyler için kullanılan primer dizileri Ek Tablo S1'de listelenmiştir.

3. Ön beyne özgü astrositlerin homojen bir popülasyonunun üretilmesi ve karakterizasyonu

  1. Astrositlerin APC'lerden farklılaşması
    1. APC'leri astrositlere ayırmak için 14 gün boyunca Astrositik farklılaşma ortamı (ADM) kullanın. Astrositik farklılaşma ortamı Nörobazal, %1 Antibiyotik-Antimikotik, %1 glutamin ikamesi, %1 N2 takviyesi, %0.2 B27 takviyesi, %1 esansiyel olmayan amino asit ortamı (NEAA) ve 10 ng/mL siliyer nörotrofik faktör (CNTF) içerir.
    2. Glial fibriler asidik protein (GFAP) ve S100β ekspresyon belirteçleri ile immün boyama (adım 1.15.1-1.15.3'te belirtildiği gibi) kullanarak astrositik kimliği doğrulayın (Şekil 2A, B).
  2. APC'lerde ve astrositlerde de novo protein sentezi
    1. HiPSC'den türetilmiş ön beyin APC'lerini ve astrositleri steril otoklavlanmış 13 mm cam lameller üzerinde koruyun ve bunları adım 1.15.1-1.15.3'te belirtildiği gibi immünobolayın.
    2. De novo protein sentezi için, adım 3.2.3-3.2.6'da kısaca açıklanan floresan kanonik olmayan amino asit etiketleme (FUNCAT) yöntemini kullanın (Şekil 3A).
    3. Metiyonin eksikliğini sağlamak için, büyüme ortamını kültürlerden çıkarın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca ve% 5 CO2 boyunca 1 mM L-azidohomoalanin (AHA) ile karıştırılmış metiyonin ve sistein içermeyen ortam ile değiştirin.
    4. Kültürleri PBS-T ile yıkayın, 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin, 10 dakika boyunca PBS'de% 0.3 Triton X-100 ile geçirgen hale getirin ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için 1 saat boyunca PBS'de% 3 BSA ile bloke edin.
    5. Kültürleri karanlıkta oda sıcaklığında Click hücre kimyası reaksiyon karışımı ve Alkyne Alexa Fluor 647 ile 1 saat inkübe edin, ardından 1 saat boyunca birincil antikorlar ve 1 saat boyunca karşılık gelen ikincil antikorlar (Malzeme Tablosu) (Şekil 3B).
    6. Lamelleri montaj ortamı ile cam slaytlara monte edin ve daha fazla görüntü analizi için kullanın.
      1. 405 nm, 488 nm, 561 nm ve 633 nm'de konfokal lazer tarama ile görüntüler elde edin.
      2. 512 x 512 pikselde görüntü yakalayın; Z adım boyutunu 0.5 havadar iğne deliği çapı ile 1 μm'ye ayarlayın.
      3. Mikroskopi ve görüntüleme parametrelerini hücre tipleri arasında sabit bir ayarda tutun. Aynı oturumda her biyolojik kopya için görüntü yakalayın.
      4. Herhangi bir standart görüntü analiz yazılımı (örneğin, Fiji veya Imaris) kullanarak yoğunluk ölçümleri yapın. Imaris'te, kalıntıları gidermek için voksel aralığını (250-350) sınırlayan Vimentin (APC'ler) ve GFAP (astrositler) ile floresan kanonik olmayan amino asit etiketleme (FUNCAT) sinyali için pozitif hücre gövdelerinin hacimsel ölçümlerini elde etmek için SURFACES modülünü kullanın.
        NOT: Her iki hücre tipi için tüm biyolojik replikalardaki parametreleri koruyun.
  3. Adenozin 5'-trifosfat (ATP) ile indüklenen salınımlı kalsiyum dalgaları
    1. ATP'ye hücresel yanıtı ölçmek için 5 × 103 hücre/tabakta bir cam tabanlı tabak (35 mm) üzerinde plaka astrositleri.
    2. Hücrelerin 24 saat boyunca cam tabana yapışmasına izin verin, 3 kez HBSS (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glikoz, 1 mM MgCl2, pH = 7.3) ile kalsiyum olmadan yıkayın ve 5 μM oranlı metrik boya Fura-2AM ve% 0.02 Pluronics F127 ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      NOT: Fura-2AM, ışığa ve sıcaklığa duyarlı bir kimyasaldır; -20 °C'de saklayın.
    3. İnkübasyon sonrası, 2x'i kültür ortamı ile yıkayın ve HBSS içeren 2 mM Ca2+ ile değiştirin ve odak kaymasını dengeleyen ters çevrilmiş mikroskopta 60x yağ objektifi (1.35 NA) kullanarak hücreleri 2 FPS hızında görüntüleyin.
    4. ATP'nin neden olduğu kalsiyum yanıtlarını, 25inci s'de 5 mM'lik son konsantrasyonda ATP'nin banyo uygulamasıyla kaydedin (Şekil 4A).
    5. Fiji/ImageJ kullanarak her hücrenin etrafına ilgi alanları çizin ve tüm zaman noktalarında F340/F380 oranını hesaplayın (Şekil 4B).
  4. Hücre metabolik tahlilleri
    NOT: Canlı hücrelerin oksijen tüketim oranı (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR), üreticinin protokolüne göre ölçülmüştür (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Tahlilden bir gün önce, astrositlerin CNTF ortamında mikroplakaya (1.5 × 10:4 tohumlama yoğunluğu) yapışmasına izin verin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Glikoliz stres testi için:
      1. Hücre kültürü ortamını 2 mM glutamin (pH 7.4'e ayarlanmış) ile takviye edilmiş baz ortamı ile değiştirin ve COolmayan bir 2 odasında 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
        NOT: pH, 37 °C'lik bir su banyosunda ayarlanmalıdır.
      2. Sensörü kalibre etmek için kartuş plakasını cihaza yerleştirin. Kalibrasyondan sonra, kartuş plakasını aşağıdaki kit bileşenlerinin son konsantrasyonunda hücre kültürü plakasıyla değiştirin: 10 mM glikoz, 1 μM oligomisin ve 50 mM 2-deoksi-glikoz (2-DG) (Şekil 5A).
      3. Testin sonunda, hücreleri parçalayın ve toplam protein içeriğini tahmin edin.
    3. Mitokondri stres testi için:
      1. CNTF ortamını, 37 ° C'de bir su banyosunda 2 mM glutamin, 1 mM piruvat, 10 mM glikoz (pH 7.4'e ayarlanmış) ile desteklenmiş baz ortamla değiştirin.
      2. Plakayı CO2 olmayan bir odada 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Bu arada, sensörü kalibre etmek için kartuş plakasını cihaza yerleştirin.
      3. Kalibrasyondan sonra, kartuş plakasını aşağıdaki kit bileşenlerinin son konsantrasyonu ile hücre kültürü plakasıyla değiştirin: 1.5 μM oligomisin, 1 μM karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) ve 0.5 μM rotenon/antimisin A (Şekil 5C).
      4. Testin sonunda, hücreleri parçalayın ve toplam protein içeriğini tahmin edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kolonileri, ticari olarak temin edilebilen tanımlanmış besiyeri kullanılarak korundu ve pluripotens belirteçleri, Oct4 ve Nanog için immün boyandı (Şekil 1B). FXS ve CTRL APC'ler, vimentin ve NFIA için immünopozitif hücrelerin karşılaştırılabilir yüksek oranda zenginleştirilmiş oranlarını gösterdi (Şekil 1C, D). Sağlıklı ve FXS hiPSC'lerden türetilen APC'lerin, baskın ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, FXS'nin neden olduğu fonksiyonel değişiklikleri karakterize etmek için bir tahlil platformu olarak hizmet eden insan iPSC'den türetilmiş astrositler üretmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu astrositler kültürde işlevsel olarak yaşayabilir ve bu çalışmada gerçekleştirilen bir dizi ölçümle kanıtlandığı gibi çeşitli özellikler sergiler. Bu protokoldeki kritik bir adım, enzimatik kaldırma yöntemi kullanılarak iPSC'lerin kortikosferlere ilk dönüştürülmesidir. Bu aşamada, kollajenaz tip...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prof. Sumantra Chattarji'ye okul içi fonlar için teşekkür ederiz. Kalsiyum görüntüleme kurulumuna erişim için Prof. Gaiti Hasan'a, Merkezi Görüntüleme ve Akış Tesisi-Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi'ne, redaksiyon ve öneriler için Padmanabh Singh ve Prangya Hota'ya ve Seahorse XF testlerinin gerçekleştirilmesindeki yardımları için Labmate Asia ekibine teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-TiyogliserolSigma-AldrichM6145
Accutase  çözeltiSigma-AldrichA6964Enzim hücre ayrılma ortamı 
Adenozin 5′-trifosfat magnezyum tuzuSigma-AldrichA9187
Gelişmiş DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
Antibiyotik-Antimikotik (100x)ThermoFisher Scientific15240062
B-27 Takviyesi (50x), serum içermeyenThermoFisher Scientific17504044
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA9418
Kimyasal Olarak Tanımlanmış Lipid KonsantresiThermoFisher Scientific11905031
Kollajenaz, Tip IV, tozThermoFisher Scientific17104019
Deoksiribonükleaz IWorthington Biyokimya ŞirketiLK003170
Dimetil sülfoksitSigma-AldrichD2650
Dispase II, tozThermoFisher Scientific17105041
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokThermoFisher Scientific14190144
Essential 8 OrtaBoy ThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2 Coriell Tıbbi Araştırma Enstitüsü GM07072, GM05848FXS hasta hücreleri
GlutaMAX takviyesiThermoFisher Scientific35050061glutamin ikamesi
Ham'ın F-12 Besin KarışımıThermoFisher Scientific11765054
Sağlıklı kontrol hücreleri Cedars-Sinai Tıp Merkezi ND30625sağlıklı kontrol hücreleri 
Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzuSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
İnsülin, insanRoche11376497001
LDN 193189 Stratech ScientificS2618-SEL
Lösemi İnhibitör Faktör insanSigma-AldrichL5283
Matrigel  Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Temel Membran MatrisiCorning354230
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)ThermoFisher Scientific11140050
Mouse FGF-basic (FGF-2/bFGF) Rekombinant ProteinPeprotech450-33
Mr. Frosty dondurma kabıThermoFisher Scientific5100-0001cryobox
N-2 Takviyesi (100x))ThermoFisher Scientific17502048
N-Asetil-L-sisteinSigma-AldrichA9165
Nörobazal OrtamThermoFisher Scientific21103049
Nunc Biyobankacılık ve Hücre Kültürü Kriyojenik TüplerThermoFisher Scientific377267
Nunc Hücre Kültürü Tedavi Edilmiş 6 kuyulu çanakThermoFisher Scientific140675
Papain Ayrışma SistemiWorthington Biochemical CorporationLK003150
Penisilin-StreptomisinThermoFisher Bilimsel15140122
Rekombinant İnsan CNTF Proteini, CF Ar-Ge D Systems257-NT-010
Rekombinant İnsan EGF Proteini, CF R& D Systems236-EG-01M
RevitaCell Takviyesi (100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Denizatı XFe24 Analizörü Agilent Technologies
Denizatı XF Hücre Mito Stres Test KitiAgilent Technologies103015-100
Denizatı XF Glikoliz Stres Test KitiAgilent Technologies103020-100
Doku Kültürü Kapları-100 cmBiostar LifetechTCD000100
TransferrinRoche10652202001
VWR Tıraş Bıçağı BıçaklarVWR International55411-050
Antikorlar  < / güçlü >
< güçlü > Birincil antikor< güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog numarası< / güçlü >< güçlü > Seyreltme< / güçlü >
Oct4 (C-10)Santa Cruz Biyoteknolojisc-5279Seyreltme: 1:250
İkincil antikor: Keçi anti-Fare IgG, Alexa Fluor 568
Nanog R& D SistemleriAF1997Seyreltme: 1: 100 < br / > İkincil antikor: Eşek anti-Keçi IgG, Alexa Fluor 488
VimentinAbcamAb5733Seyreltme: 1: 500 < br / > İkincil antikor: Keçi anti-Tavuk IgY, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851Seyreltme: 1: 500 < br / > İkincil antikor: Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205Seyreltme: 1:500
İkincil antikor: NA
GFAPDAKOZ0334Seyreltme: 1:500
İkincil antikor: Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 568
S100 & beta;DAKOIR504Seyreltme: 1: 500 < br / > İkincil antikor: Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 488
Anti-Çekirdek Antikoru, klon 235-1Merck MilliporeMAB1281Seyreltme: 1: 1000 < br / > İkincil antikor: Keçi anti-Fare IgG1, Alexa Fluor 555
İkincil antikorlar  < / güçlü >< güçlü > Seyreltme< / güçlü >
Keçi anti-Fare IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific  A110041:1000
Eşek anti-Keçi IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110551:1000
Keçi Anti-Tavuk IgY, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110391:1000
Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110111:1000
Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110341:1000
Keçi anti-Fare IgG1, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific A211271:1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
  2. Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors. Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).
  3. Pacey, L. K. K., Doering, L. C. Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome. Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).
  4. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  5. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  6. Khakh, B. S., McCarthy, K. D. Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).
  7. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  9. Rothstein, J. D., et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  10. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).
  11. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).
  12. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).
  13. Bradley, R. A., et al. Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties. Development. 146 (13), dev170910(2019).
  14. Das Sharma, S., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Hu, X., et al. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).
  17. Baser, A., et al. Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells. Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).
  18. Pal, R., Bhattacharya, A. Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells. Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).
  19. Gross, C., Bassell, G. J. Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor. J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).
  20. Kumari, D., et al. Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs. Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).
  21. Jacquemont, S., et al. Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome. Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).
  22. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).
  23. Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes. Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).
  24. Peteri, U. K., et al. Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity. Brain Sci. 11 (2), 209(2021).
  25. Alvarez-Mora, M. I., et al. Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS. Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).
  26. Giulivi, C., et al. Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).
  27. Anitha, A., et al. Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism. Mol Autism. 3 (1), 12(2012).
  28. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Front Neurosci. 11, 737(2018).
  29. Yao, J., et al. Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).
  30. Sonntag, K. C., et al. Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles. Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fragile X SyndromeInduced Pluripotent Stem CellsAstrocyte Progenitor CellsAstrocyte DifferentiationGlial Enrichment MediumCalcium ImagingGlycolytic MetabolismMitochondrial RespirationImmunostaining MarkersNeurodevelopmental Disorders

Related Articles