Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sepsisin Neden Olduğu Akut Akciğer Hasarı Olan Farelerde Shikonin'in HIF-1α / VEGF Sinyal Yolu Üzerindeki Etkileri

509 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68085

⸱

6 Haziran 2025

 , 
1The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

Bu makalede

Özet

Protokol, farelerde sepsisin neden olduğu akut akciğer hasarını hafifletmede shikonin'in etkinliğini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Çalışma, HIF-1α / VEGF yolunu hedef alarak, farklı shikonin dozlarının sağkalım oranlarını, akciğer patolojisini ve inflamatuar belirteçlerin ekspresyonunu nasıl etkilediğini araştırıyor ve potansiyel terapötik faydalarını vurguluyor.

Özet

Sepsis sıklıkla yüksek mortalite komplikasyonu olan akut akciğer hasarına (ALI) neden olur. HIF-1α / VEGF yolu sepsiste önemli bir rol oynar ve anti-enflamatuar özelliklere sahip doğal bir bileşik olan shikonin, bu yolu hedefleyerek akciğer hasarını hafifletebilir. Balb / c fareleri rastgele dört gruba ayrıldı: sahte grup, model grubu, düşük doz tedavi grubu ve yüksek doz tedavi grubu. Sahte gruba çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) olmaksızın laparotomi, model gruba ise sepsis ile ilişkili akut akciğer hasarını indüklemek için CLP uygulandı. Modellemeden sonra, düşük doz ve yüksek doz tedavi grupları, 14 gün boyunca günde bir kez sırasıyla 12.5 mg / kg ve 50 mg / kg dozlarında gavaj yoluyla shikonin aldı. Farelerin 7 günlük sağkalım oranı izlendi. Akciğer dokusu patolojisini değerlendirmek için hematoksilen ve eozin (HE) boyaması kullanıldı, akciğer ıslak/kuru (W/D) ağırlık oranı ölçüldü ve akciğer dokusunda HIF-1α, VEGF, TNF-α ve IL-6 ekspresyonunu tespit etmek için Western blot yapıldı. Shikonin, septik farelerin hayatta kalma oranını önemli ölçüde iyileştirdi ve en büyük etki yüksek doz grubunda gözlendi (p < 0.05). Model grubu ile karşılaştırıldığında, shikonin ile tedavi edilen gruplarda akciğer W / D oranı ve doku hasarı, doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde azalmıştır. Ek olarak, shikonin, HIF-1α, VEGF, TNF-α ve IL-6'nın ekspresyonunu önemli ölçüde azalttı ve yüksek doz grubu en belirgin azalmayı gösterdi (p < 0.05). Shikonin, septik farelerde akut akciğer hasarını hafifletir, potansiyel olarak HIF-1α ekspresyonunu inhibe ederek ve ilgili enflamatuar faktörlerin üretimini azaltarak.

Giriş

Sepsis, enfeksiyon tarafından tetiklenen ciddi bir sistemik inflamatuar yanıttır. 1 Genellikle çoklu organ fonksiyon bozukluğuna yol açar ve durum ilerledikçe yaşamı tehdit edici hale gelebilir. 2 Mekanik ventilasyon ve destekleyici bakım gibi tedavilerin kullanılmasına rağmen, sepsis ile ilişkili ALI için mortalite oranları yüksek kalmaktadır ve %30-40'a ulaşmaktadır3. Bu tedaviler esas olarak altta yatan nedenlerden ziyade semptomları ele alır ve genel etkinliklerini sınırlar. Bu nedenle, akciğer hasarının nedenlerini hedef alan yeni terapötik yaklaşımların tanımlanması, sepsiste hasta sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirebilir.

Son çalışmalar, hipoksi ile indüklenebilir faktör-1α'yı (HIF-1α) sepsis ile indüklenen ALI 4,5'in ilerlemesinde kritik bir düzenleyici olarak tanımlamıştır. HIF-1α, sepsis sırasında akciğer dokusunda birikir ve iltihabı ve doku hasarını şiddetlendiren aşağı akış genlerinin ekspresyonunu yönlendirir6. Bu süreç, akciğer hasarının kötüleşmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu nedenle, HIF-1α sinyal yolağını hedeflemek, sepsis kaynaklı ALI'de görülen inflamatuar ve hipoksik yanıtları hafifletmek için umut verici bir yaklaşım sunmaktadır.

Daha etkili tedavi arayışında, Geleneksel Çin tıbbı (TCM) değerli bilgiler sağlamıştır 7,8. Shikonin, Lithospermum erythrorhizon7'den ekstrakte edilen bir antrakinon bileşiğidir. Kayda değer anti-inflamatuar9, antibakteriyel10 ve anti-tümör etkileri11 gösterir. Shikonin, lipopolisakkaritin (LPS) neden olduğu akciğer hasarını hafifletebilir, bu da akciğer koşullarında potansiyel terapötik rolünü düşündürür12. Aynı zamanda, bazı çalışmalar, shikonin'in mononükleer makrofaj sistemini düzenleyerek, pro-inflamatuar ve anti-enflamatuar tepkileri dengeleyerek sepsisin neden olduğu oksidatif hasarı hafifletebileceğini de öne sürmüştür. Bununla birlikte, sepsis kaynaklı ALI'de shikonin'in koruyucu etkilerinin arkasındaki mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu, mevcut araştırmalarda kritik bir boşluğu temsil ediyor.

Bu çalışmada, çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) kullanılarak sepsis ile indüklenen ALI'nin bir fare modelinde shikoninin koruyucu etkilerini araştırmayı amaçladık. CLP teknolojisi, karmaşık sistemik inflamatuar yanıtları ve çoklu organ disfonksiyonunu simüle edebildiği için sepsis araştırmalarında önemli bir rol oynar ve bu da onu yeni tedavi stratejilerinin etkinliğini değerlendirmek için uygun hale getirir. CLP teknolojisi, geleneksel LPS enjeksiyon yöntemlerine kıyasla klinik olarak nispeten daha önemlidir: klinik sepsisin patolojik sürecine daha yakın olan bağırsak mikrobiyota translokasyonunun neden olduğu sistemik inflamatuar yanıtı simüle eder. Derecelendirilebilir ve kontrol edilebilir: ligasyon uzunluğunu ve perforasyon boyutunu ayarlayarak, hastalığın şiddeti kontrol edilebilir ve tüm sepsis çalışması için uygundur. Ek olarak, çoklu organ disfonksiyonu ve sitokin yanıtındaki benzer dinamik değişiklikleri simüle edebilir. HIF-1α / VEGF sinyal yolunu modüle etmede shikonin'in rolünü araştırarak, sepsis ile ilişkili akciğer hasarının altında yatan mekanizmaları ele alan ve potansiyel olarak klinik sonuçları iyileştiren yeni terapötik stratejiler hakkında bilgi vermeyi umuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokol, Wenzhou Tıp Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nden onay aldı. Bu çalışmada erkek C57Bl / 6 fareler (5-6 aylık; 20-25 g) kullanıldı. Ana reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Sepsis fare modelinin hazırlanması

  1. 25 °C sabit sıcaklık, %50 nem ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü altında ev fareleri.
  2. 7 günlük bir iklimlendirme döneminden sonra, fareleri rastgele dört gruba ayırın: Sham grubu, Model grubu, Düşük doz tedavi grubu ve Yüksek doz tedavi grubu, her grupta 20 fare.
  3. Önceki bir çalışmadan13 elde edilen referanslara dayanarak, düşük doz grubunu 14 gün boyunca 12.5 mg / kg purpurin konsantrasyonu ve yüksek doz grubunu 14 gün boyunca 50 mg / kg konsantrasyonla tedavi edin. Sahte cerrahi grubu için, ligasyon veya ponksiyon olmadan laparotomi, çekal traksiyon, redüksiyon ve kapatma yapın ve 14 gün boyunca aynı dozda fizyolojik salin ile tedavi edin. Sepsis grubu için deneysel adımlar aşağıdaki gibidir.
  4. Gece boyunca açlık çektikten sonra (suya izin verildi), fareleri işlem boyunca steril koşullar altında sodyum pentobarbital (40-80 mg / kg) ile uyuşturun. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün.
  5. Alt ekstremiteleri hemostatik forseps ile hafifçe sıkıştırırken solunum hızının yavaşlaması, kas gerginliğinde azalma ve belirgin bir stres tepkisi olmaması olarak uygun anesteziyi kontrol edin.
  6. % 75 etanol, 3x ile dezenfeksiyon yapın. Fare karnının sol orta pozisyonunda yaklaşık 1 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın ve karın boşluğunu ortaya çıkarmak için cildi, fasyayı ve kasları katmanlar halinde kesin.
  7. Her iki elinizde künt uçlu oftalmik forseps kullanarak, karın boşluğunu nazikçe keşfedin, farenin çekumunu bulun ve serbest bırakın ve çekumun ucundan yaklaşık 1 cm mesafede bağlayın.
  8. Çekumun ucunu delmek ve bağlamak için 21G'lik bir iğne kullanın, künt uçlu oftalmik forseps kullanarak delinme bölgesinden az miktarda bağırsak içeriğini nazikçe sıkın ve ardından çekuma geri alın.
  9. 1 mL% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile deri altı sıvı resüsitasyonu yapın. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat geçiren hayvanın, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade edilmediğini not ediyoruz.
  10. 7 günlük CLP modellemesinden sonra, ötenazi için aşırı anestezi uygulayın.
    NOT: Purpurinin cilt, solunum yolu ve sindirim sistemi üzerindeki olası tahriş edici etkilerinin yanı sıra suda yaşayan organizmalar, çevre kirliliği üzerindeki yüksek toksisitesi nedeniyle, deney sırasında kişisel koruma kullanın.

2. Hayvan modellerinin değerlendirilmesi

  1. Fare hayatta kalma gözlemi
    1. Hayvanlarla ilgili işlemleri yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. İstatistiksel analiz için modellemeden sonra 1 hafta içinde ölüm oranını kaydedin. Bazı fareler ötenaziden önce sepsis olmadan ölürken, CLP model farelerin belirli bir ölüm oranı vardır (Tablo 1).
    2. Akciğer ıslak-kuru ağırlık oranı ölçümü
      1. 24 saatlik modellemeden sonra, fareleri 1.4-1.5 adımlarına göre tekrar uyuşturun.
      2. Farenin klavikula orta hattının sol tarafında yaklaşık 1 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın ve cerrahi makas ve forseps ile göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için deri, fasya ve kas katmanlarını çıkarın.
      3. Sol akciğeri çıkarın ve yüzey sıvısını boşaltın. Islak ağırlığı ölçün ve ardından kuru ağırlığı elde etmek için 80 ° C'lik bir fırında 72 saat sabit bir ağırlığa kurutun.
      4. Akciğer su içeriğini şu şekilde hesaplayın:
        Akciğer su içeriği = (Islak ağırlık - Kuru ağırlık) / Islak ağırlık x %100.
    3. Akciğer dokularının histopatolojik karşılaştırılması
      1. Belirtilen zaman noktalarında, sol akciğeri yukarıda adım 2.2'de açıklandığı gibi toplayın. Akciğeri% 10 nötr formaldehit içinde sabitleyin, parafine gömün ve 5 μm kalınlığında bölümlere ayırın.
      2. Akciğeri her seferinde 5-10 dakika boyunca 2 kez ksilen içinde mumdan arındırın. Gradyan başına 3 dakika boyunca %100, %95, %85 ve %75 ile seri etanol rehidrasyonu gerçekleştirin. 2 dakika damıtılmış suda bekletin.
      3. Yaklaşık 100 mL hematoksilen çözeltisi ile 10 dakika boyayın, ardından yüzen renkleri gidermek için damıtılmış su ile durulayın.
      4. Yaklaşık 70 mL diferansiyasyon solüsyonu ekleyin ve 30 saniye bekletin. Ardından, her seferinde 3-5 dakika olmak üzere 2 kez musluk suyuna batırın.
      5. 2 dakika boyunca damla damla yaklaşık 100 mL eozin boya çözeltisi ekleyin. Fazla boya çözeltisini dökün ve aşağıda açıklandığı gibi hızlı bir şekilde kurutun.
      6. Aşağıda açıklandığı gibi dehidrasyon, şeffaflık ve sızdırmazlık gerçekleştirin.
        1. Numuneleri gradyan etanole batırın: %75, %85, %95 ve %100 etanol (I) her biri 2-3 saniye. % 100 etanol (II) içinde 1 dakika bekletin ve her seferinde 1 dakika boyunca ksilen 2x içinde bekletin. Bir pipet veya damlalık kullanarak, doku dilimlerinin yüzeyine nötr sakız damlatın ve kabarcık oluşumunu önlemek için mümkün olduğunca eşit şekilde yayın. Kapatın ve 400x'te mikroskop altında gözlemleyin.
      7. Akciğer bölümü başına 10 rastgele alan seçin. Bir patoloğa alveolar ödem, kanama ve nötrofil infiltrasyonu gibi patolojik değişiklikleri 0 (normal) ile 4 (ciddi hasar) arasında puanlamasını isteyin. Değerlendirme için toplam puanı kullanın.
    4. Batı lekeleme
      1. Nükleer protein ekstraksiyon kiti talimatlarına göre akciğer dokusundan nükleer proteinleri çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre BCA yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
      2. Protein yükleme numunelerini, numune başına 50 μg protein yüklenmiş olarak hazırlayın. SDS-PAGE ayırma jeli (% 10) ve istifleme jeli (% 3) hazırlayın. 45 dakika boyunca 80 V'ta elektroforez gerçekleştirin, ardından numuneler ayırma jeline girdikten sonra proteini 60 dakika boyunca 110 V'ta PVDF membranına aktarın.
      3. Proteinleri bir zara aktarın ve 60 dakika boyunca bloke edin. Birincil antikorlarla (bakınız Malzeme Tablosu, 1:1000) gece boyunca 4 °C'de inkübe edin, ardından ikincil antikor (bakınız Malzeme Tablosu, 1:1000) 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
      4. Membranı TBST ile yıkayın ve görselleştirme için ECL kullanın. Karanlık bir odada, hazırlanan reaktifleri bir PVDF membranına ekleyin ve çalkalama ve floresan görüntüleme gerçekleştirin. ECL reaktifleri, zar üzerindeki biyomoleküllerle etkileşime girerek, floresan görüntüleme cihazları tarafından kaydedilen güçlü kemilüminesans reaksiyonları üretir.
      5. Bir görüntü analiz sistemi, Bant Niceleme Yöntemi kullanarak protein bantlarının gri tonlama değerini analiz edin (Bant dansitometrisini analiz etmek için kullanılan sistem hakkında ayrıntılı bilgi için bkz.
    5. İstatistiksel analiz
      1. İstatistiksel analiz için SPSS 26.0 programını kullanın. Birden çok grubun ortalamalarını karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA ve ikili karşılaştırmalar için LSD-t testlerini kullanın. 0,05 < bir p değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Shikonin'in terapötik potansiyelini değerlendirmek için, önce 7 günlük bir süre boyunca septik farelerde sağkalım üzerindeki etkisini değerlendirdik. Shikonin ile tedavi, doza bağlı bir şekilde sağkalım oranlarını iyileştirdi (Şekil 1).

Sepsiste akciğer hasarının yaygın olarak görülmesi göz önüne alındığında, farelerde pulmoner ödemi de değerlendirdik. Pulmoner ödem, akciğer ıslak-kuru ağırlık (W/D) oranı ölçülerek değerlendirildi. W/D oranı, mode...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sepsis araştırmaları için altın standart model olan CLP modeli, bu deneyde önemli bir adımdır çünkü CLP, insan sepsisinin karmaşıklığını diğer birçok modelden daha iyi taklit eder. Sepsis ile ilişkili ALI, yüksek mortalite oranları ve mevcut tedavilerin sınırlı etkinliği nedeniyle kritik bir klinik zorluk olmaya devam etmektedir 14,15. Çalışmamız, ilk kez, shikonin'in bir CLP modeli oluşturarak hem HIF-1α hem de inflamatuar yanıt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Çalışma, Wenzhou Bilim ve Teknoloji Projesi (Y2020976) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
H & E leke kiti boyama kitiSolaibao TeknolojisiG1120HE
Düşük SıcaklıkSantrifüjü Sigma3K15
Mikroplaka OkuyucuBio-RadModel 680
tavşan monoklonal VEGF-reseptörü1 antikoruAbcamab238632
tavşan poliklonal HIF-1 ve alfa; antikorAbcamab51608
SDS-SAYFASI elektroforez sistemiBio-RadMINI Protean2
ShikoninMedChemExpressHY-N0822

Kaynaklar

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med. 348 (2), 138-150 (2003).
  2. Vincent, J. L. Current sepsis therapeutics. EBioMed. 86, 104318(2022).
  3. Li, W., et al. Classic signaling pathways in alveolar injury and repair involved in sepsis-induced ali/ards: New research progress and prospect. Dis Markers. 2022, 6362344(2022).
  4. Mokrá, D. Acute lung injury - from pathophysiology to treatment. Physiol Res. 69 (Suppl 3), S353-S366 (2020).
  5. Prangsaengtong, O., Jantaree, P., Lirdprapamongkol, K., Svasti, J., Koizumi, K. Shikonin suppresses lymphangiogenesis via nf-kappab/hif-1alpha axis inhibition. Biol Pharm Bull. 41 (11), 1659-1666 (2018).
  6. Liu, Y., Xiang, D., Zhang, H., Yao, H., Wang, Y. Hypoxia-inducible factor-1: A potential target to treat acute lung injury. Oxid Med Cell Longev. 2020, 8871476(2020).
  7. Fan, T. T., Cheng, B. L., Fang, X. M., Chen, Y. C., Su, F. Application of chinese medicine in the management of critical conditions: A review on sepsis. Am J Chin Med. 48 (6), 1315-1330 (2020).
  8. Liang, X., et al. Efficacy of traditional chinese medicine on sepsis: A systematic review and meta-analysis. Int J Clin Exp Med. 8 (11), 20024-20034 (2015).
  9. Boulos, J. C., Rahama, M., Hegazy, M. F., Efferth, T. Shikonin derivatives for cancer prevention and therapy. Cancer Lett. 459, 248-267 (2019).
  10. Guo, Y., et al. Recent advances in shikonin for the treatment of immune-related diseases: Anti-inflammatory and immunomodulatory mechanisms. Biomed Pharmacother. 165, 115138(2023).
  11. Guo, C., et al. Pharmacological properties and derivatives of shikonin-a review in recent years. Pharmacol Res. 149, 104463(2019).
  12. Zhang, Y., et al. Shikonin ameliorates lipoteichoic acid‑induced acute lung injury via promotion of neutrophil apoptosis. Mol Med Rep. 23 (2), 133(2021).
  13. Bai, G. Z., et al. Shikonin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. J Surg Res. 182 (2), 303-311 (2013).
  14. Fein, A. M., Calalang-Colucci, M. G. Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome in sepsis and septic shock. Crit Care Clin. 16 (2), 289-317 (2000).
  15. Sun, B., et al. Acute lung injury caused by sepsis: How does it happen. Front Med. 10, 1289194(2023).
  16. Song, Y., Lin, W., Zhu, W. Traditional chinese medicine for treatment of sepsis and related multi-organ injury. Front Pharmacol. 14, 1003658(2023).
  17. Li, M. Y., et al. Shikonin suppresses proliferation and induces cell cycle arrest through the inhibition of hypoxia-inducible factor-1alpha signaling. Chem Biol Interact. 274, 58-67 (2017).
  18. Shi, J., et al. Dexmedetomidine ameliorates endotoxin-induced acute lung injury in vivo and in vitro by preserving mitochondrial dynamic equilibrium through the hif-1a/ho-1 signaling pathway. Redox Biol. 41, 101954(2021).
  19. Das, U. N. Infection, inflammation, and immunity in sepsis. Biomolecules. 13 (9), 1332(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Shikonin TedavisiSepsis Fare ModeliHIF-1 AlfaVEGF Yolağıİnflamatuar SitokinlerWestern BlotAkciğer PatolojisiHematoksilin Eozin BoyamaSağkalım Oranı

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.