Method Article

Plazmonik Nanotcımbız Kullanarak Tek Değiştirilmemiş Proteinlerin Konformasyonel Dinamiğinin İzlenmesi

DOI:

10.3791/68093

⸱

March 21st, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Advanced Optics and Photonics Laboratory, Department of Engineering, School of Science and Technology, Nottingham Trent University, 2School of Physics and Astronomy, University of Nottingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmonik nano cımbızlayıcılar, proteinler de dahil olmak üzere tek nanoparçacıkları nanometre ölçekli bir optik alan içinde yakalamak için altın nanoyapılarda lokalize yüzey plazmon rezonansı kullanır. Saçılan sinyaldeki değişiklikler, protein varlığını ve konformasyonel dinamikleri ortaya çıkararak, florofor modifikasyonları veya yüzey bağlantısı olmadan izlemeyi mümkün kılar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinleri karakterize etmek için mevcut tek moleküllü teknikler tipik olarak etiketler, bağlar veya doğal olmayan çözelti koşullarının kullanılmasını gerektirir. Bu tür değişiklikler protein biyofiziğini değiştirebilir ve elde edilen verilerin kullanışlılığını azaltabilir. Plazmonik nano cımbız, kapalı bir sıcak nokta bölgesi içindeki elektrik alanını geliştirmek için altın nanoyapılar üzerinde lokalize yüzey plazmon rezonansı (LSPR) kullanan bir tekniktir. Bu alan geliştirme, geleneksel optik cımbızlardan çok daha küçük olan tek nanoparçacıkları, tek proteinler gibi yalnızca birkaç nanometre çapa kadar yakalamak için düşük lazer güçlerinin kullanılmasına izin verir. Tek protein moleküllerinin sıcak nokta bölgesi içinde hapsedilmesi, yerel kırılma indisinde (nprotein > nsu) bir kaymaya neden olur ve molekülün polarize edilebilirliğinin bir ürünü olarak ışık saçılımını değiştirir, bu da molekülün hacminden, şekil anizotropisinden ve kırılma indisinden etkilenir. Bir çığ fotodiyot (APD), ışık saçılımındaki müteakip değişiklikleri toplar. Bu değişiklikler daha sonra, boyutu, küresel konformasyonu ve zaman içindeki konformasyonel değişimin dinamikleri dahil olmak üzere hapsolmuş moleküldeki değişiklikleri belirlemek için analiz edilebilir. Mikroakışkanların sisteme dahil edilmesi, kontrollü çevresel değişikliklere ve molekül üzerindeki sonraki etkilerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Bu protokolde, tek protein moleküllerini yakalama, çevresel çözelti koşullarını değiştirme ve bir plazmonik nanotcımbız sistemi kullanarak karşılık gelen konformasyonel değişikliklerini izleme adımlarını gösteriyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein konformasyonel dinamiklerini sorgulamak için mevcut tek moleküllü teknikler arasında floresan rezonans enerji transferi (FRET)1,2 gibi etiketleme tabanlı yöntemler, optik cımbız 3,4 ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM)5 gibi bağlama tabanlı yaklaşımlar, girişim saçılma mikroskobu (iSCAT)6 gibi girişim tabanlı teknikler veya nanogözenekler7 gibi nanoakışkan tabanlı teknikler yer alır.8,9. Bu yöntemlerin birçok avantajı olmakla birlikte; Birkaç önemli sınırlama, değiştirilmemiş protein konformasyonel dinamikleri hakkında veri sağlamalarını engeller. FRET ve optik cımbızlar, proteinlerin biyofiziksel özelliklerinietkileyebilecek florofor etiketleme veya bir yüzeye bağlama gerektirir 10,11,12. iSCAT, teknik olarak etiketsiz olmasına rağmen, proteinlerin özelliklerini potansiyel olarak etkileyen ikisi arasında oluşan girişimi gözlemlemek için protein ile bir yüzey arasında etkileşim gerektirir. Ayrıca, sinyal-gürültü oranı ile sınırlı olan iSCAT, ekipman gürültüsü ve benek benzeri arka plan dalgalanmaları nedeniyle yalnızca proteinleri >40 kDa'yı tespit edebilir13. Bu boyut sınırı makine öğrenimi yoluyla hafifletilebilse de, arabellek bileşenleri optik özellikleri etkileyebileceğinden sınırlıdır ve bu da gürültülü verilere neden olur13,14. Nanoporlar, proteinlerin gözenek boyunca (genellikle 5 μs içinde) hızlı translokasyon süreleri sunar, bu da onları daha yavaş konformasyonel dinamikleri15,16 tespit edemez hale getirir, ancak DNA origamisinin bir nanopor elektro-ozmotik tuzakta kullanılması gibi bu sınırlamaları hafifletmeye yönelik araştırmalar17 veya plazmoniklerin dahil edilmesi 18,19,20,21. Ek olarak, tipik olarak 1 M civarında olan yüksek tuz konsantrasyonları, in vivo çalışma için verilerin uygulanabilirliğini azaltabilir15,22. Protein karakterizasyonu için ideal tek moleküllü teknik, proteinleri gerçek zamanlı olarak izlemeli ve protein veya doğal olmayan çözelti koşullarında modifikasyona gerek kalmadan daha uzun süreler boyunca (yani milisaniyeler) konformasyonel dinamikleri yakalamalıdır.

Plazmonik nanotcıklar, maddeyi yakalamak için ışık kullanmaları bakımından geleneksel optik cımbızlara benzer. Bununla birlikte, plazmonik nano cımbızlar, tek nanopartikülleri23 yakalamak için yeterince güçlü bir gradyan kuvveti oluşturmak için elektrik alanını birkaç büyüklük sırasına göre arttırmak için lokalize yüzey plazmonik rezonansını (LSPR) kullanır. Ek olarak, sıkışan parçacık, nano açıklık yapıları için kendi kendine indüklenen geri etki (SIBA) yakalama olarak bilinen tuzağın gücünü arttırmada aktif bir rol oynar24. Bu SIBA yakalama, düşük lazer güçlerinin (yani miliwatt) proteinler 25,26,27 gibi çapı yalnızca birkaç nanometreye kadar olan küçük parçacıkları yakalamasına izin verir. Tek protein moleküllerinin sıcak nokta bölgesi içinde yakalanması, yerel kırılma indisinde (nprotein > nsu) bir kaymaya neden olur ve proteinin hacmi, şekil anizotropisi ve kırılma indisi28'den etkilenen molekülün polarize edilebilirliğine bağlı olarak ışık saçılımını değiştirir. Bir çığ fotodiyot (APD) daha sonra ışık saçılımındaki sonraki değişiklikleri izlemek için bu bilgiyi algılar. Ayrıca, plazmonik nano cımbızlar, hapsolmuş proteinlerin etiketleme, bağlar ve sert çözelti koşulları olmadan uzun süreler boyunca (yani dakikalar ila saatler) gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin verir.29 proteinler için ideal bir tek molekül tekniği kriterlerini karşılar. Bir çift nano delik (DNH) yapısı kullanarak, plazmonik nanotcıklar, çeşitli proteinleri yakalama ve konformasyonel geçişler29, sökme kinetiği30, enerji manzaraları31, difüzyon izleme32 ve ligand bağlama33,34 dahil olmak üzere bunlardan temel bilgileri aydınlatma yeteneklerini göstermiştir. DNH yapılarının yanı sıra, küçük parçacık boyutlarına sahip parçacıkları yakalamak için alternatif yapı geometrilerigösterilmiştir 35,36. Bu protokolde, entegre bir mikroakışkan sistemi ile bir plazmonik nanotcımbız kurulumunun kurulması ve çalıştırılması için temel adımlar sunulmaktadır. Bu protokolün, plazmonik nano cımbızların araştırmacılar, özellikle de yapısal biyoloji ve biyofizik alanlarındaki araştırmacılar için erişilebilirliğini ve anlaşılmasını artırmaya yardımcı olacağını umuyoruz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DİKKAT: Lütfen kullanılan tüm kimyasallar için ilgili tüm güvenlik bilgi formlarını (SDS) okuyun ve tüm uygun güvenlik uygulamalarına uyun ve gerektiği gibi kişisel koruyucu ekipman (lazer koruyucu gözlükler, laboratuvar önlükleri, eldivenler) kullanın.

1. Plazmonik nanotcımbız kurulumunun oluşturulması

NOT: Optik kurulum, farklı bir lazer ve APD kullanan Modüler Optik Cımbız Sistemi (OTKB) kitine dayanmaktadır (bkz. Malzeme Tablosu). Dış titreşimlerin sistem üzerindeki etkisini azaltmak için optik ekipmanı yalnızca uygun bir optik masa üzerinde kullanın. Kitteki lazer 976 nm idi, ancak DNH yapılarının kama rezonansı için tepe rezonans dalga boyu 740-760 nm33 civarındaydı. Rezonans zirvesine yakın olduğu, LSPR'yi indüklediği ve ayrıca silikon bazlı APD tarafından daha iyi bir algılama verim oranına sahip olduğu için bir NIR lazer (852 nm) seçtik. Biyomolekülleri yakalamak için daha uzun20 veya daha kısa18 dalga boyuna sahip lazerler kullanılmıştır.

  1. Lazeri fotodiyot lazer yuvasına yerleştirin ve bir kolimatöre besleyin, bu da kurulumumuz için 1,7 mm genişliğinde kolimasyonlu bir lazer ışınına yol açar.
  2. Polarizasyonu ayarlamak için ışık yoluna yarım dalgalı bir plaka ekleyin. Dikey polarizasyonun (S-polarizasyon) en yüksek ışık yoğunluğuna sahip olduğundan emin olmak için bir Glan-Taylor polarizör kullanarak ayarlayın.
    NOT: Polarizasyona bağlı oldukları için DNH yapılarından maksimum elektrik alanı artışını sağlamak için doğru polarizasyonun kullanılması hayati önem taşır.
  3. Işığı, plano-içbükey bir mercek (f = -50 mm) ve ardından bir plano-dışbükey mercekten (f = 150 mm) oluşan bir ışın genişletici kurulumuyla odaklayın ve ışın genişliğini yaklaşık 5 mm'ye çıkarmak için alt objektifin tam arka diyaframını doldurun.
  4. Lazeri istenen konuma yansıtmak için dikroik bir ayna (805 nm kısa geçiş) kullanın. Arkasındaki kamerayı (CCD) kurun.
  5. İletilen ışığı toplamak için ışığı alt objektife (100x/1.25 NA) yönlendirin ve üst objektifi (4x/0.1 NA) konfokal mesafeye konumlandırın.
  6. Işığı APD'ye odaklamak için odak uzaklığına yerleştirilmiş plano-dışbükey bir lens aracılığıyla lazer ışığını APD'ye doğru yansıtmak için başka bir dikroik ayna (805 nm kısa geçiş) ekleyin. Beyaz ışık kaynağını (WLS) dikroik aynanın arkasına ekleyin, böylece kameraya ulaşmak için kurulumdan geri geçebilir. Şekil 1 , tamamen monte edilmiş plazmonik nanotrik cımbız kurulumunun bir şemasını göstermektedir.

figure-protocol-1
Resim 1: Plazmonik nano cımbız kurulumu. Şematik, plazmonik nano cımbız kurulumunun tam optik yolunu gösterir. 852 nm'lik bir lazer ışını (kırmızı) bir kolimatörden ve bir yarım dalga plakasından geçer, daha sonra ışın genişletici (BE) tarafından ~5.1 mm'ye genişletilir. Daha sonra 100x'lik bir objektif kullanılarak numuneye odaklanılır. İletilen lazer ışığı 4x objektif tarafından toplanır ve 1 MHz'lik bir örnekleme hızında bir APD tarafından kaydedilir. WLS'den (sarı) gelen beyaz ışık, CCD'ye ulaşmadan önce 4x objektif, numune ve 100x objektiften geçer ve bu da numunenin parlak bir alan görüntüsünü sağlar. Her iki ışık yolunun kesiştiği alanlar turuncu renkle gösterilmiştir. 20° eğimde çekilen DNH'nin SEM görüntüsü. Kısaltmalar: BE = Işın genişletici, CCD = Şarj bağlantılı cihaz, DM = Dikroik ayna, HWP = Yarım dalga plakası, M = Gümüş ayna ve WLS = Beyaz ışık kaynağı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. DNH yapılarının imalatı

  1. Daha önce tarif edildiği gibi e-ışın buharlaştırma kullanarak 550 μm kalınlığında erimiş silika gofret üzerine 5 nm Ti ve ardından 100 nm Au biriktirin29,33. Gofretleri kullanıma hazır 1 cm x 1 cm boyutlarında küp küp doğrayın.
    NOT: E-kiriş buharlaştırması, düşük yüzey pürüzlülüğüne sahip altın bir tabaka ürettiği ve yüksek yakalama verimliliğine sahip yüksek kaliteli DNH yapıları ürettiği için seçilmiştir37.
  2. Boş altın film örneğini alın ve bir galyum iyon kaynağı kullanarak oda sıcaklığında taramalı elektron mikroskobu odaklı iyon ışını (SEM-FIB) kurulumuna monte edin.
  3. Doğru konumlarda DNH üretmek için FIB nano açıklıklarının SEM ile hizalandığından emin olun.
  4. Yüksek akımlı bir iyon ışını (örn. 100 pA) kullanarak bir işaret kutusu oluşturun. Bu işaretleyici, optik kurulum altında DNH yapılarının konumunu bulmak için bir referans kılavuzu görevi görecektir.
  5. DNH yapısını oluşturmak için, merkezden merkeze mesafesi 200 nm ve 160 nm çapında olan iki daire bir dikdörtgen (3 nm x 40 nm) ile köprülenir. Yaklaşık 20-30 nm'lik bir boşluk boyutu için, 0.09'luk bir doz faktörüne sahip daireleri aşındırırken, dikdörtgen doz 30 kV'luk bir prob enerjisi ve 1 pA'lık bir ışın akımı kullanarak 0.300 ila 0.350 arasındadır.
    NOT: Kullanılan SEM-FIB, bu prob enerjisinde 3 nm'lik bir çözünürlüğe sahiptir ve 20-30 nm arasındaki boşluk boyutlarıyla DNH'nin güvenilir bir şekilde üretilmesine olanak tanır. Daha büyük boşluk boyutları üreteceği ve DNH'nin yakalama verimliliğini azaltacağı için daha düşük bir çözünürlük kullanmayız. Bir FIB mümkün değilse, DNH yapıları üretmek için alternatif bir yöntem polistiren nanosfer litografi38 kullanmaktır. DNH yapılarını imal etmek için gereken yüksek hassasiyet nedeniyle, aynı tarif, SEM-FIB kullanımları arasında aynı boşluk boyutunu üretmeyebilir. Dikdörtgenin dozunu ve yüksekliğini değiştirin (0.280 ila 0.350 doz ve 2 ila 4 nm yükseklik) ve yaklaşık 20 nm'yi hedefleyerek boşluk boyutunu ölçün.

3. DNH numunelerinin kaplanması

  1. Borosilikat cam 3.3'ten yapılmış kristalleştirici bir kap gibi solvente dayanıklı bir kap kullanın ve 20 mL etanol ekleyin.
    DİKKAT: Etanol son derece yanıcı ve tahriş edicidir. Sadece çeker ocakta kullanın. Serin ve iyi havalandırılan bir yerde saklayın. Eldiven ve laboratuvar önlüğü ile tutun.
  2. 32 mg Poli (etilen glikol) metil eter tiyol (PEG-tiyol; ortalama moleküler ağırlık 800 g / mol) tartın ve bunu etanol ile karıştırın, tüm PEG-tiolün tek tabaka yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için yaklaşık 2 mM'lik bir konsantrasyona sahip bir çözelti üretmek üzere çözündüğünden emin olun39.
    DİKKAT: PEG-tiyol tahriş edicidir; uygun KKD ile kullanın.
  3. Nanoyapıları içeren numune çiplerini düz cımbız kullanarak karışıma ekleyin, örtün ve PEG-tiyolün altın yüzey üzerinde kendi kendine monte edilmiş bir tek tabaka oluşturması için oda sıcaklığında gece boyunca (~ 16 saat) inkübe edin.
  4. İnkübasyondan sonra, numuneleri çeker ocakta uygun bir kap üzerinde düz cımbızla tutarak durulayın. Her iki tarafa da etanol iyice püskürtmek için bir fışkırtma şişesi kullanın. Daha sonraki depolamadan veya plazmonik nanotcımbızlara monte etmeden önce bir hava tabancası kullanarak tamamen kurulayın.
    NOT: Numuneler, fazla mesaiyi bozabileceğinden, uzun ömürlülüğü artırmak için 4 °C'de saklanabilir.

4. PEG kaplı numunenin bir akış hücresine monte edilmesi

  1. Kaplanmış numuneyi, altın katman yukarı bakacak şekilde düz cımbız kullanarak 3D baskılı akış hücresine (Şeffaf V4 reçineli bir Form 2 yazıcı tarafından yazdırılmıştır) yerleştirin (akış hücresi tasarımımızdaki temel parametreler ve değerler için Ek Şekil 1'e bakın).
  2. Düz cımbız kullanarak şeffaf PET plastik çift taraflı bant kapağının bir tarafını soyun ve akış hücresinin üzerine yerleştirin, böylece akış hücresindeki nanoyapıların ve giriş/çıkış deliklerinin açıkta kalmasını sağlayın. Akış hücresine ve numuneye düzgün şekilde yapıştığından emin olmak için bandın kenarlarına yuvarlak cımbızla hafifçe bastırın.
  3. Bandın diğer tarafını soyun ve yuvarlak cımbız kullanarak numunenin üzerine nazikçe bir cam lamel (kalınlık 0.17 mm) yerleştirin. Düzgün bir şekilde yapıştığından emin olmak için lamelin kenarlarına yuvarlak cımbızla hafifçe bastırın. Bu, akış hücresi içinde bir sıvı kanalı (yükseklik = 50 μm, hacim = 3,5 μL) oluşturur.
    NOT: Nanoyapıların bulunduğu yerde veya yakınında lamel basmayın, çünkü bunlar zarar görebilir. Lamel kirliyse, etanol ile yıkayın ve montajdan önce bir hava tabancası ile kurulayın.
  4. Çoğaltıcı silikon solüsyonlarının A ve B'sinin eşit parçalarını 1: 1 oranında (veya üreticinin talimatına göre) küçük bir pipet ucu kullanarak bir mikroskop lamı üzerine karıştırın.
  5. Lamel ve akış hücresi arasındaki boşlukları karışık çoğaltıcı silikonla doldurun ve nazikçe lamel altına itin. Akış hücresini baş aşağı tutun ve pipet ucunu kullanmadan önce, numunenin alt tarafındaki erimiş silikanın görünür kenarlarına nazikçe hareket ettirmek için çoğaltma silikonunu deliğin iç duvarının etrafına dikkatlice yerleştirin ( Bkz. Ek Şekil 2).
  6. Üreticinin talimatlarına göre, kopyalanan silikon tamamen ayarlanana kadar altın tabaka yukarı bakacak şekilde kurumaya bırakın.
    NOT: Numunenin alt tarafına uygulandığında silikonun nanoyapıları kaplamasına izin vermemeye dikkat edin. Akış hücresinin giriş/çıkış deliklerine veya temizlenmesi zor olabilecek nanoyapılara girebileceğinden, çoğaltıcı silikonu lamel altına zorlamamaya dikkat edin (Ek Şekil 3).

5. Mikroakışkan sisteminin bağlanması

NOT: Sistem için temiz boru kullanıldığından emin olun. Burada, küçük iç çaplı PTFE boru: 0,18 mm iç çap ve büyük iç çaplı PTFE boru : 0,8 mm kullanılacaktır, ancak diğer iç çap değerleri çalışacaktır.

  1. Şırınga pompasını kurun ve büyük PTFE boruyu kullanarak 3/2 solenoid valfe bağlayın. Valfin bir portunu tampon kabına ve diğerini, şırıngaya geri akışı önlemek için büyük ID borusundan yapılmış, hacmi yaklaşık 1 mL olan bir tutma bobinine bağlayın.
    NOT: 3/2 valfi, çözeltinin tampon kabından mı yoksa tutma bobininden mi infüze edildiğini/çekildiğini belirleyen bir valf kontrolörü aracılığıyla kontrol edilebilir.
  2. Tutma bobinini 12/1 döner çift yönlü mikroakışkan valfin merkez valfine bağlayın. Az bulunan veya değerli numuneler için küçük iç çaplı borular ve geri kalanlar için büyük iç çaplı borular kullanarak çözümler için kapları bağlayın. Bir valfi yalnızca bir atık kabına infüze etmek için ve diğerini yalnızca akış hücresine infüze etmek için kullanın; akış hücresi infüzyon valfi için küçük ID tüpü kullanın.
  3. Akış hücresinin çıkışından büyük iç çaplı hortumları atık kabına bağlayın. Şekil 2 , tam bağlı mikroakışkan sistemin bir şemasını göstermektedir.
    NOT: Akış hücresinin alımı ve numunenin tüpte kalacağı daha küçük hacim nedeniyle protein infüzyonu için kullanılacak valfler için küçük ID PTFE boru tercih edilir. Tamponlar gibi daha ucuz veya daha bol malzemeler için büyük iç çaplı PTFE borular tercih edilir. Bu ölü hacmi daha da azaltmak için minimum boru kullanmaya çalışın.

figure-protocol-2
Şekil 2: Mikroakışkan sistem. Şematik, mikroakışkan sistemi göstermektedir. Şırınga pompası, çözeltileri, çözelti kabı veya tutma bobini olmak üzere 3/2 vananın bir portundan infüze eder veya çeker. 12/1 valfe bağlı çözeltiler, geri çekildiğinde her zaman tutma bobininden geçer ve daha sonra istenen kanaldan infüze edilebilir. Akış hücresine bağlı giriş kanalına infüzyon, çözeltiyi akış hücresinden atık kabına itecektir. Kalın ve ince tüpler, protokolden büyük ve küçük ID tüplerini temsil eder. 12/1 valf üzerindeki siyah kapaklar sızdırmaz kanalları temsil eder. Akış yönleri siyah oklarla etiketlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Mikroakışkan sistemin hazırlanması

  1. Mikroakışkan sistem kullanıcı arayüzünü PC'ye yükleyin ve bileşenlerin doğru şekilde bağlandığını kontrol edin. İlgili kullanıcı arayüzlerini açmak için kablonun ve dağıtıcının yanındaki oynat simgesini seçin. 3/2 vanayı atlamak için kablodaki 1 numaralı portu çevirin.
  2. Sistem içinde kullanılacak valflerin izopropanol (IPA) infüze edilerek temizlendiğinden emin olun ve ardından sistem içindeki havayı ve IPA'yı çıkarmak için boruları tercih edilen tampon(lar) veya damıtılmış su ile birden çok kez yıkayın. İnfüzyon, dağıtıcı kullanıcı arayüzünde istenen valfi seçerek ve şırınga pompasını çalıştırarak, demleme/çekmeyi seçerek ve istenen hacim ve akış hızını seçerek (örn., 0.5 mL hacim ve 0.2 mL/dk akış hızı) yapılabilir.
    NOT: IPA'yı akış hücrelerine damlatmayın, çünkü bu hücreyi ve yapıştırıcıyı bozar ve bu da sızıntılara neden olabilir.

7. Akış hücresinin plazmonik nanotcımbızlara monte edilmesi ve sızıntı olup olmadığının kontrol edilmesi

  1. Giriş ve çıkış borularını, altın bir tabaka yukarı bakacak şekilde temiz dokuya yerleştirmeden önce akış hücresinin uygun kısmına takın.
  2. Tamponu akış hücresine yüksek akış hızıyla (~ 0,3 mL / dak) infüz edin ve sıvının akış hücresindeki numune boyunca hareket ettiğini ve akış hücresinin dışında veya altında sıvı görünmediğini kontrol edin. Sızıntı olmaması koşuluyla daha yüksek akış hızları kullanılabilir. Numune sızarsa, bağlantısını kesin ve yeniden monte edin.
  3. Akış hücresini altın tabaka aşağı bakacak şekilde plazmonik nano cımbız aşamasına yerleştirmeden önce 100x objektife 1-2 damla daldırma yağı ekleyin. Akış hücresi mıknatıslarının üzerine metal klipsler yerleştirin ve yerinde kalmasına yardımcı olmak için sahneyi kilitleyin.
    DİKKAT: Objektif yağ tahriş edicidir, sağlık açısından tehlikelidir ve sudaki yaşam için toksiktir, sadece eldivenlerle kullanın.

8. Nanoyapıların numune üzerine yerleştirilmesi

  1. Beyaz ışık kaynağını açın. Kamera yazılımını açın ve nanoyapılar görünene kadar kazanç ve pozlama süresini artırın. Lazeri nispeten yüksek lazer gücüyle açın ve lazer noktası görünene kadar z eksenini manuel olarak ayarlayın. Pozlama süresini artırmaya öncelik verin ve lazer noktasını bulmak için lazer gücünü artırmaya göre kazanç elde edin.
    DİKKAT: Lazerler, kullanıcılar için ciddi bir potansiyel risk oluşturur. Gerekli dalga boyu aralığında yeterli optik yoğunluğa sahip lazer güvenlik gözlükleri gibi uygun KKD'lerin kullanıldığından emin olun.
  2. Piezoelektrik kontrol cihazını açın ve COM bağlantı noktası ve maksimum voltaj için uygun ayarları seçin. x, y ve z eksenlerinin değerlerini, sahneyi her yöne hizalamak için iyi bir aralık sağlamak için maksimum voltajın yarısına ayarlayın.
    NOT: Piezoelektrik denetleyicinin COM bağlantı noktası, bağlantı noktaları sekmesi altındaki aygıt yöneticisinde bulunabilir ve değiştirilebilir.
  3. Ana tabla x, y ve z eksenleri kontrol düğmelerini kullanarak DNH'lerden biriyle üst üste binmek için lazer noktasını hareket ettirin. APD'nin açık olduğundan emin olun ve ardından muhafazayı plazmonik nanotcımbızlara nazikçe kapatın.
    NOT: Varsa, kamera yazılımında bir işaretleme aracının kullanılması, lazer noktasını bir nanoyapı üzerinde hareket ettirmeye yardımcı olacaktır. İşaretleyiciyi lazer noktasının merkezine ayarlayın ve lazeri kapatın, ancak bir nanoyapıya daha kolay hizalama sağlamak için beyaz ışık kaynağını açık bırakın. Çok fazla lazer ışığı ulaşırsa APD aşırı doygun hale gelebilir ve hasar görebilir. Numunenin lazer yolunun yolunda olduğundan emin olun ve doygunluğa ulaşılmamasını sağlamak için lazer gücünü kademeli olarak artırın. Nötr yoğunluk (ND) filtreleri, gerekirse ona ulaşan ışığı azaltmak için APD'den önce yerleştirilebilir.

9. Lazerin istenen nanoyapı ile en uygun şekilde hizalanması

  1. Ev yapımı bir Labview UI gibi APD kaydıyla ilişkili yazılımı açın ve kesme frekansını 1 kHz olarak ayarlayın. İstenen dosya yolunu ve kaydedilecek dosyaların adlandırma biçimini adlandırın ve ayarlayın.
  2. Beyaz ışık kaynağını kapatın ve lazeri tekrar açın. Uygun bir lazer gücüne (örn. ~ 20 mW) ayarlayın ve APD sinyali mümkün olduğunca yüksek olana kadar x, y ve z eksenlerini ayarlamak için piezoelektrik kontrolleri kullanın, APD doygunluğundan kaçının ve minimum standart sapma (SD) ile izin .
    NOT: APD muhtemelen iletim için en uygun hassasiyet aralığına sahip olacaktır (ürün kılavuzuna bakın), örneğin 1000-2000 mV civarında kalmak için idealdir. Şanzımanı bu aralıkta tutmak için ND filtreleri kullanılabilir. Ana husus, iletimin APD doygunluk noktasına yakın olmamasıdır, çünkü sıkışma iletimi doygunluk sınırına kadar artırarak veri kaybına yol açabilir.

10. Proteinlerin akış hücresine aşılanması

  1. Nanoyapıların ömrünü korumak için lazeri kapatın ve valfi ayarlamak ve istenen miktarda proteini (örn. 30 μL) çekmek için şırınga pompası kontrol ünitesini ve distribütör kullanıcı arayüzünü çalıştırın. Küçük ID borusunu kullanarak geri çekmek için, daha düşük bir akış hızı, tüm çözeltilerin geri çekilmesini sağlamaya yardımcı olur (~ 0.01 - 0.1 mL / dak). İstenirse bekleme süresini azaltmak için daha yüksek akış hızları kullanılabilir.
    NOT: Kullanılacak en uygun protein hacmi, proteinin ne kadar değerli olduğuna ve deneyin neyi başarmayı umduğuna bağlıdır. Kullandığımız tipik protein konsantrasyonu 1 μM ve alikot hacmi 100 μL'dir. Protein numunesi bol ise, ortalama yakalama süresini azaltmak için daha yüksek konsantrasyonlar kullanılabilir. Bununla birlikte, konsantrasyonlar çok yüksekse, nanoyapı içinde aynı proteinlerden ikisini yakalama riski artacaktır. Deney, ilk proteini yakaladıktan sonra farklı bir ligand/proteinin infüzyonunu gerektiriyorsa, israfı ve bir sonraki çözeltiyi infüze etmek için geçen süreyi en aza indirmek için daha düşük bir alikot hacmi tercih edilebilir. Sisteme hava girmesini önlemek için borunun çözeltiye batırılmış halde kaldığından emin olun. Hortum kabın dibine ulaşmazsa veya çözelti aşırı çekilirse, protein alikotları için özel dikkat gösterilmelidir.
  2. Mikroakışkanlar kullanıcı arayüzünü kullanarak, protein çözeltisini geri çekilme hızına benzer bir akış hızında (~ 0.01 - 0.1 mL / dak) infüze edin. Protein çözeltisi akış hücresine ulaşana kadar bu hızda demlenmesine izin verin, ardından akış hızını ≤0.001 mL / dk'ya düşürün. Beklenen hacimle eşleştiklerinden emin olmak için şırınga pompasının hacmini ve süresini kontrol edin (örn. 1 mL/dk'da 1 mL hacim için 1 dk).
    NOT: Bunun için gerekli hacim, mikroakışkan sistemden akış hücresine kadar olan borunun hacmine bağlı olarak hesaplanabilir. Borunun uzunluğu ve kimliği biliniyorsa, bir silindirin hacmi için çevrimiçi bir hesap makinesi kullanılabilir. İnfüzyon hızı istenildiği gibi ayarlanabilir, ör., bir tuzak için ortalama bekleme süresini azaltmak için protein infüzyonu için >0.001 mL / dak. Bununla birlikte, akış hızı çok yüksekse dikkatli olunması tavsiye edilir, bu proteinlerin nanoyapıya girmesini engelleyebilir.

11. Veri toplama

  1. Protein çözeltisi akış hücresine infüze edilirken, APD sinyalinin veri kaydını başlatın. Piezoelektrik kontrolör kullanıcı arayüzünü kullanarak x, y ve z eksenlerini gerektiği gibi ayarlayın, çünkü sistem muhtemelen zamanla kayacaktır. İdeal bindirme izleri, Şekil 3'teki izi takip eden tutarlı bir genel desene sahiptir.
  2. Örnek yakalama izine benzer şekilde iletim ve S.D.'de büyük bir değişiklik gözlemledikten sonra, gelecekteki veri sıralaması için bunun meydana geldiği zamanı not edin (Örneğin Bkz. Şekil 4B .).
    NOT: Sistemde sürüklenme, şanzımanda değişikliklere ve bazen oldukça ani bir şekilde S.D.'de bir artışa yol açabilir, bu da bir protein tuzağı ile karıştırılabilir. Sinyal atlamasının, örnek tuzakla aynı modeli gösterdiğinden ve atlama meydana geldiğinde, hizalama kayması veya sistem tarafından alınan yüksek sesler gibi herhangi bir harici parazit bulunmadığından emin olun.
  3. Deneyin bir parçası olarak proteinin serbest bırakılması gerekiyorsa, lazeri ~ 5 s boyunca kapatın ve tekrar açın. İz, iletimde büyük bir değişikliğe ve önemli ölçüde daha düşük bir SD'ye sahip olmalıdır, bu da temel duruma dönüşü gösterir.
    NOT: İletimde ve/veya S.D.'de büyük bir değişiklik gözlenmezse veya proteinin sıkıştığına benzer bir iz gözlenirse, protein muhtemelen numune yüzeyine yapışmıştır (örneğin bkz. Şekil 5B).

12. Numunenin sökülmesi

  1. İstenilen deneyi gerçekleştirdikten sonra lazeri kapatın, akış hücresini 3 eksenli aşamadan çıkarın ve mikroakışkan sistem borusunu ayırın.
  2. Akış hücresini, numunenin altın tabakası yukarı bakacak şekilde temiz doku üzerine yerleştirin. Bir neşter kullanarak, cam lamel altındaki yapıştırıcıyı dikkatlice kesin ve yuvarlak cımbızla yavaşça kaldırın. Belirtilen kırık cam çöp kutusuna atın.
    DİKKAT: Kırık cam ve keskin nesnelerin kullanılması yaralanmaya neden olabilir. Koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyildiğinden emin olun.
  3. Akış hücresini, altın tabaka hala yukarı bakacak şekilde bir açıyla tutun ve numuneyi serbest bırakmak için akış hücresinin alt tarafındaki yapıştırıcıyı dikkatlice çıkarmak için yuvarlak cımbız kullanın. Silikonun kopyalanması, DNH yapılarına zarar vermeden kolayca çıkarılmasını sağlar.
  4. Düz cımbız kullanarak numuneyi alın ve hava tabancasıyla kurutmadan önce IPA ile iyice durulayın, ardından su ile durulayın. Yeniden kullanılabilirse, numuneyi altın tabakası yukarı bakacak şekilde uygun bir kapta saklayın.
    NOT: Nanoyapıların boyutu zamanla değişse de, numuneler uygun şekilde kullanılırsa tipik olarak yaklaşık 1-2 haftalık bir kullanım süresine sahiptir. Aşırı hasar görmüşse, bir sonraki deney için yeni bir numuneye geçin. Hasar, nanoyapıların yakınındaki altın yüzeyde bulunan çizikler şeklinde veya nanoyapıların bozulduğunu gösteren düşük deneysel performanstan kaynaklanabilir, bu da nanoyapıların29 bozulduğunu gösterir.

13. Sistemin ileride kullanılmak üzere hazırlanması

  1. Objektiften yağı bir yönde silmek için katlanmış lens mendili kullanın, kaldırın ve dokunun başka bir temiz parçasıyla tekrarlayın.
    NOT: Objektifler lekelenmeye ve çizilmeye eğilimlidir, bu da performansı önemli ölçüde bozabilir. Temizlik sırasında daima eldiven giyin ve organik maddelere dokunmaktan kaçının. Kontaminasyonu önlemek için yalnızca yeni lens temizleme mendili kullanın ve tek hareketle tek yönde temizleyin. Hasarı en aza indirmek için lensi ve temizleme mendilini ileri geri ovalamaktan kaçının. Kuru temizleme yetersizse, dokuya az miktarda etanol uygulayın, daha önce belirtildiği gibi yağı silin ve kuru doku ile bitirin.
  2. Daha sonra aynı protein/tampon çözeltileri kullanılacaksa, borunun değiştirilmesi gerekmeyebilir. Farklı solüsyonlar kullanılıyorsa, önceki solüsyonlardan kaynaklanan kontaminasyon riskini azaltmak için boruyu değiştirin.
    NOT: Zamanla kirleneceğinden, aynı solüsyonlarla deneyler yapıyor olsanız bile aynı hortumu 1 haftadan fazla kullanmayın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veri toplamanın ardından, APD tarafından toplanan ham verilerden izler oluşturmak için MATLAB kodu kullanılarak ham veriler üzerinde veri analizi yapılabilir. Şekil 3 , lazer tekrar açılmadan önce yaklaşık 0 saniye boyunca kapatılmadan önce iletimde (ΔT/T5) büyük bir değişikliğin gözlemlendiği yakalama olayı ve bindirmeden önceki taban çizgisi de dahil olmak üzere örnek bir yakalama izini göstermektedir. Standart sapmada önemli bir azalma ve iletimin taban çizgisi ile benzer seviyelere geri dönmesi, protein salınımını gösterir. Doğrusal sapma, detrend.m MATLAB işlevi kullanılarak izlemeden kaldırılır ve ardından verilerin ortalama değeri, eğilimi kaldırılmış izlemeye geri eklenir. Bazen, kurulum zaman içinde sürüklendikçe ve iletimde doğrusal bir azalmaya neden olarak izlemeyi trendini kaldırmamız gerekir ( Şekil 3'teki gri ize bakın). Bindirmeden önce ve sonra taban çizgisi izlerindeki küçük değişiklikler, Şekil 4A'da gösterildiği gibi, taban çizgisini minimum standart sapma ile optimize etmek için aşama ayarından kaynaklanmaktadır. Bazen, protein molekülleri, geçen proteinler olarak adlandırılan, tuzağa düşmeden eser içinde görülebilir. Geçen proteinler, tipik bir tuzağa benzer şekilde (Şekil 4B), ancak Şekil 4A'da gösterildiği gibi önemli ölçüde daha kısa bir süreye sahip, iletimde keskin bir değişiklik olarak görünür. Güç spektral yoğunluğu (PSD), çeşitli frekanslarda sinyal gücü sağlayarak protein yakalamayı doğrulamak için başka bir analiz sunar. Protein konformasyonel hareketleri tipik olarak tek molekül spektroskopisi yöntemleriyle >1 μs aralığında görülür40. Şekil 4C , taban çizgisiyle karşılaştırıldığında, bir proteini yakalamanın, en azından 10 kHz aralığında (> 100 μs) daha yüksek sinyal gücüne yol açtığını göstermektedir. Ayrıca, kötü bir taban çizgisi, protein konformasyonel hareketleriyle kaplanmış bir frekans aralığı olan 50-500 Hz arasındaki frekanslarda gürültüyü artırabileceğinden, sahneyi optimize edilmiş bir taban çizgisine hizalamanın önemini vurgulamaktadır.

figure-results-1
Şekil 3: Tek bir protein için tam yakalama izi. Taban çizgisi, bir proteinin yakalanması ve proteinin serbest bırakılması dahil olmak üzere tam bir tuzak için temsili izleme. Bindirmeden önce ve sonra izlemedeki sıçramalar hizalamadan kaynaklanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 4: Yaygın izleme olayları. (A) Kötü bir taban çizgisinden iyi bir taban çizgisine ve sıcak noktaya yakın geçen bir proteine ilişkin örnekler. (B) DNH sıcak noktasının boş olduğu taban çizgisinden proteinin hapsolduğu zamana kadar olan süreci gösteren yakalama izi. (C) ( A)' da gösterilen iyi ve kötü taban çizgileri ile (B)'de hapsolmuş protein arasındaki güç spektral yoğunluğu (PSD) grafiği. Daha yüksek PSD değerleri, belirli frekanslarda daha fazla gürültüyü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çoğu yakalama olayı, Şekil 3'teki izle aynı genel modeli izler, ancak deneyler sırasında ara sıra sorunlar ortaya çıkabilir. Çoğu deney için, istenen deney tamamlandıktan sonra lazer kapatılarak protein manuel olarak serbest bırakılmalıdır. Bununla birlikte, bazı durumlarda, protein, Şekil 5A'da gösterildiği gibi, müdahale olmadan tuzağı terk edebilir. Tersine, bazen proteinler, muhtemelen proteinin numuneye yapışması nedeniyle, lazeri kapattıktan sonra bile yakalama bölgesinde kalabilir. Bu yapışma, lazeri kapatıp açtıktan sonra gürültülü bir ize neden olur (bkz. Şekil 5B). Bunun meydana gelme olasılığı proteine bağlıdır, çünkü bazı proteinler yüzey adsorpsiyonuna daha yatkındır41,42. PEG-tiyol gibi bir kaplamanın kullanılması, proteinin yapışma olasılığını azaltabilir39,43. İstenmediği sürece, örneğin protein-protein etkileşimlerinin incelenmesi gibi, başka bir konu, ilk tuzaktan sonra ikinci bir proteinin hapsedildiği çift tuzaktır. Bu, ilk tuzağa benzer şekilde iletimde başka bir keskin artış ve standart sapmada bir değişiklik ile karakterize edilir (bkz. Şekil 5C).

figure-results-3
Şekil 5: İstenmeyen yakalama olaylarına örnekler. (A) DNH sıcak noktasından bir proteinin istenmeyen salınımı. (B) DNH sıcak noktasında numune yüzeyine takılan protein örneği. (C) İz sıçraması, birincisi hala DNH sıcak noktasında kalırken ikinci bir protein yakalandığında meydana gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bir apo-ferritin molekülüne in situ demir yüklemesi üzerinde gerçekleştirilen temsili bir deney, plazmonik nano cımbızların protein konformasyonel dinamiklerini araştırmak için bir araç olarak kullanımını göstermektedir29. Ferritin, iki durumda bulunan bir demir taşıyıcı proteindir: demir içermeyen apo-ferritin ve demir ile dolu holo-ferritin44,45. Demirli demir, proteine 3 katlı kanallardan girer ve burada ferrik demire oksitlenir ve protein çekirdeğinde46 depolanır. Şekil 6A, protein hapsedilirken 20 dakikadan fazla infüze edilmiş demir çözeltisi ile apo-ferritinin tipik bir yakalama izini göstermektedir. Tüm iz boyunca b-e noktalarında alınan 20 s'lik izler, zaman içinde proteinde meydana gelen değişiklikler hakkında fikir verir. Şekil 6B'de, apo-ferritin standart bir PBS tamponunda hapsedilmiştir ve izde önemli bir değişiklik gözlenmemiştir. Şekil 6C, D, 3 katlı kanallarından proteine demir yüklenmesinin neden olduğu izlerin SD'sindeki dalgalanmaları göstermektedir, bu da kanalların açık olduğu yerlerde daha dinamik bir durum (apo-) ve kanallar kapalıyken daha kompakt bir durum (holo-) ile sonuçlanır. Ferritin molekülü demir ile doldurulduktan sonra, holoformuna geçti ve Şekil 6E'de gösterildiği gibi kararlı bir yakalama izi ile sonuçlandı. Şekil 6B-E'deki olasılık yoğunluk fonksiyonları (PDF), proteinin zaman içinde farklı çözelti koşullarına maruz kaldığında geçirdiği değişiklikleri daha da göstermektedir.

figure-results-4
Şekil 6: Sıkışmış bir apoferritine yerinde demir yüklemesi. (A) Bir apoferritin molekülü hapsedilmiş bir DNH'nin tam iletim izi, ardından ferritinin demir yüklemesi ile ilişkili konformasyonel değişikliklerini gözlemlemek için tuzak bölgesine bir demir çözeltisi enjekte edilmesi. (B) Demirli çözelti sıcak noktaya ulaşmadan önce sıkışmış bir apoferritinin 20 s'lik yakalama izi. (C, D) Apoferritin molekülü demir çözeltisine maruz bırakıldıktan sonra 20 s'lik yakalama izleri. Mavi ve mor segmentler, sırasıyla esnek ve sert ferritin konformasyonlarını gösteren, izin daha yüksek ve daha düşük SD'sini işaretler. (E) Apoferritin >20 dakika boyunca demir çözeltisine maruz bırakıldıktan sonra 20 sn yakalama izi. Sağdaki olasılık yoğunluk fonksiyonu (PDF) grafikleri iletim dağılımını gösterir ve mavi ve mor segmentlere renk kodludur. Bu rakam29'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: 3D baskılı akış hücresine monte edilmiş altın DNH örneği. Numune özel bir yuvaya yerleştirilir ve çift taraflı PET yapışkan bant kullanılarak akış hücresine yapıştırılır. Akış hücresi tasarımımız için temel parametreler ve ilgili ölçümler etiketlenmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Altın DNH numunesi monte edilmiş ve iç duvarı etiketlenmiş akış hücresinin arkası. Numune, çoğaltıcı silikon kullanılarak akış hücresinde kapatılır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Giriş ve çıkış delikleri etiketlenmiş olarak monte edilmiş altın DNH'li akış hücresinin diyagramı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoldeki çok önemli bir adım, akış hücresinin sahneye yerleştirilmeden önce sızıntı yapmamasını sağlamaktır ve bu, önceden yüksek bir akış hızında montajın dışında test edilmelidir. Numune monte edildikten sonra sızıntı, optik bileşenlere, özellikle de alt objektife zarar verebilir.

Hizalama, bir deney sırasında zamanla en uygun konumundan sapabilir ve plazmonik nano cımbızların hassasiyeti nedeniyle sinyal değişimine neden olabilir. Bu meydana geldiğinde, piezoelektrik kontrolleri kullanarak taban çizgisinin maksimum iletimine ve taban çizgisinin minimum standart sapmasına göre yeniden hizalayın, çünkü gürültülü bir taban çizgisi veri kalitesini düşürür. Bir bindirme olayı için kafa karıştırıcı kullanıcı müdahalesi riskini ortadan kaldırmak için hizalamaların ne zaman yapıldığına dair titiz notlar almaya özen gösterilmelidir. Büyük bir kayma meydana gelirse, proteini serbest bırakma riskini en aza indirmek için sahneyi hafifçe hizalayın ve ayarlama zamanını not edin.

Sunulan teknikte değişiklikler ve değişiklikler, belirli deneysel ihtiyaçlara dayalı olarak yapılabilir. Örneğin, sıcaklık kontrollü bir aşama, sıcaklığı31,33 artırmak için lazer ısıtma kullanmak yerine numunenin istendiği gibi soğutulmasına/ısıtılmasına yardımcı olabilir. Diğer teknikler, örneğin, interferometrik saçılma mikroskobu (iSCAT), proteinin DNH'nin saçılma alanı içinde girişimini sağlayabilir ve partikül boyutu47,48 ile ilişkili olan proteinin polarize edilebilirliği ile orantılı ek sinyal elde edebilir.

Plazmonik nano cımbızlar, veriler APD (tek pikselli bir dedektör) tarafından kaydedildiği için tamamen zamansal bir algılama tekniğidir. Bu teknik, proteinin hangi bölgelerinin konformasyonel bir değişikliğe dahil olduğu veya bir ligandın veya başka bir proteinin proteine nerede bağlanabileceği gibi bir proteinin yapısal değişiklikleri hakkında doğrudan bilgi sağlamaz. Ek olarak, teknik, veri toplama kartının örnekleme hızı (1 MHz) nedeniyle >1 μs'lik bir zamansal aralıkla sınırlıdır. Mümkün olan en yüksek aralığın elde etme oranının yarısı olduğu Nyquist frekansı göz önüne alındığında, bu durumda mükemmel koşullar altında 2 μs.

Bu protokolde, tek bir proteini yakalamak ve zaman içinde konformasyonel dinamiklerindeki değişiklikleri izlemek için bir plazmonik nano cımbız deneyi kurma sürecini tanımladık. Teknik, herhangi bir ev yapımı veya ticari mikroskop üzerinde geliştirilebilir. SmFRET ve optik cımbız gibi floresan veya bağlama tabanlı yaklaşımların aksine, teknik, proteinleri etiketler veya bağlar olmadan yakalayabilir ve yine de tek molekül duyarlılığı elde edebilir. Çözelti koşulları, protein bir mikroakışkan sistem kullanılarak tutulurken değiştirilebilir ve bu da farklı çözeltilerin protein üzerindeki etkisinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Bu özellikler, plazmonik nano cımbızları biyofizik ve biyoalgılama alanlarında, özellikle geleneksel tekniklerin kendi doğal hallerinde sorgulamak için mücadele ettiği proteinler için umut verici bir araç haline getirmektedir. Gelecekteki uygulamalar, içsel olarak düzensiz proteinler ve içsel olarak düzensiz bölgeler içeren proteinler gibi daha dinamik proteinlerin ve dinamikleri ve hatta yapısı mevcut tekniklerden kaçan zar proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini çözmeye odaklanacaktır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZ, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Doktora Eğitim Ortaklığı'ndan (BBSRC DTP) (BB/T0083690/1) destek aldığını kabul eder. Yazarlar, Birleşik Krallık-Hindistan Eğitim ve Araştırma Girişimi'nden (UKIERI) fon sağlandığını kabul etmektedir. M.R., Royal Society ve Wolfson Vakfı'nın desteğini takdir ediyor.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x Objektif (NA = 1.25)OlympusPLN100XOYağı sadece lens temizleme mendili ile tek hareketle temizleyin
12-1 döner çift yönlü mikroakışkan valfElveflow
3/2 solenoid valfElveflow
4x Objektif (NA = 0.1)OlympusPLN4XP
Havalı TüfekRS Bileşenleri666-6772
Çığ fotodiyot (APD)ThorlabsAPD120A/MAşırı doygunluk yok, 50 MHz bant genişliği, statik duyarlı
Kelebek lazer diyotThorlabsFPL852S
Şarj bağlantılı cihaz (kamera)HikrobotMV-CE200-10UC
Kristalleşen çanakVWR216-0065
Veri toplama kartı Ulusal aletlerUSB-63612 MHz örnekleme hızı
Çift taraflı bantYapıştırıcı Araştırma A.ŞARcare92712Lazer kesici ile akış hücresi için uygun şekli kesin
EtanolÇeker ocak sadece, eldiven kullanın
Fibreport kolimatörThorlabsPAF2-A7B
Cam mikroskop lameller (kalınlık 0,17 mm)
Yarım dalga plakasıThorlabsAHWP10M-980
Ideal-tek 120 mm, paslanmaz çelik, düz cımbızRS Bileşenleri282-7472Numuneyi tutmak ve çift taraflı bandı soymak için
İzopropanol (IPA)Yalnızcaçeker ocak, eldiven kullanın
Lens temizleme dokusuThorlabsMC-5
Metrosil hızlı kopyalanan silikon parçalar A ve BMetrodentMSILR/1 
Mikroskop slaytları (75 mm x 26 mm)
Modüler Optik Cımbız SistemiThorlabsOTKB/M-CUSTOM
Objektif yağOlympusEldiven kullanın, 2oC-8oC arasında saklayın
Fotodiyot lazer montajıThorlabsCLD1015
Piezoelektrik kontrolörThorlabs
Piezoelektrik aşamaThorlabsNanomax 300
Planokonkav lens (f = -50 mm)ThorlabsLC1715-B
Planokonveks lens (f = 150 mm)ThorlabsLA1433-B
Planokonveks lens (f = 60 mm)ThorlabsLA1134-B
Poli (etilen glikol) metil eter tiyol (PEG-tiyol) 800 MWSigma Aldrich7291082o< / sup>C-8 o< / sup>C
PTFE boru (ID: 0.18 mm)arasında saklayın Vici JourJR-T-6805-M25
PTFE boru (ID: 0.8 mm)Cole-ParmerWZ-21942-72
SEM-FIBZeissKiriş 550Galyum iyon kaynağı
Kısa Geçiş dikroik ayna 805 nmThorlabsDMSP805
Gümüş aynaThorlabsPF-10-03-P01
Şırınga pompasıHarvard Aparatı70-4511
Weller Erem 120 mm paslanmaz çelik, düz, yuvarlak cımbızRS Bileşenleri176-1150Cam lamel tutmak ve akış hücresinden tutkal soymak için
. MDT693B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peter Lu, H. P. Sizing up single-molecule enzymatic conformational dynamics. Chem Soc Rev. 43 (4), 1118-1143 (2014).
  2. Mazal, H., Haran, G. Single-molecule FRET methods to study the dynamics of proteins at work. Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).
  3. Ritchie, D. B., Woodside, M. T. Probing the structural dynamics of proteins and nucleic acids with optical tweezers. Curr Opin Str Biol. 34, 43-51 (2015).
  4. Neupane, K., Solanki, A., Sosova, I., Belov, M., Woodside, M. T. Diverse metastable structures formed by small oligomers of α-Synuclein probed by force spectroscopy. PLoS One. 9 (1), e86495(2014).
  5. Hughes, M. L., Dougan, L. The physics of pulling polyproteins: a review of single molecule force spectroscopy using the AFM to study protein unfolding. Rep Prog Phys. 79 (7), 076601-076601 (2016).
  6. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  7. Schmid, S., Dekker, C. Nanopores: a versatile tool to study protein dynamics. Essays Biochem. 65 (1), 93-107 (2021).
  8. Van Meervelt, V., et al. Real-time conformational changes and controlled orientation of native proteins inside a protein nanoreactor. J Am Chem Soc. 139 (51), 18640-18646 (2017).
  9. Awasthi, S., Ying, C., Li, J., Mayer, M. Simultaneous determination of the size and shape of single α-Synuclein oligomers in solution. ACS Nano. 17 (13), 12325-12335 (2023).
  10. Sµnchez-Rico, C., Von Vithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of fluorophore attachment on protein conformation and dynamics studied by spFRET and NMR spectroscopy. Chemistry. 23 (57), 14267-14277 (2017).
  11. Yin, L., et al. How does fluorescent labeling affect the binding kinetics of proteins with intact cells. Biosens Bioelectr. 66, 412-416 (2015).
  12. Berkovich, R., et al. Rate limit of protein elastic response is tether dependent. Proc Natl Acad Sci. 109 (36), 14416-14421 (2012).
  13. Dahmardeh, M., Mirzaalian Dastjerdi, H., Mazal, H., Köstler, H., Sandoghdar, V. Self-supervised machine learning pushes the sensitivity limit in label-free detection of single proteins below 10 kDa. Nat Meth. 20 (3), 442-447 (2023).
  14. Becker, J., et al. A quantitative description for optical mass measurement of single biomolecules. ACS Photon. 10 (8), 2699-2710 (2023).
  15. Houghtaling, J., et al. Estimation of shape, volume, and dipole moment of individual proteins freely transiting a synthetic nanopore. ACS Nano. 13 (5), 5231-5242 (2019).
  16. Plesa, C., et al. Fast translocation of proteins through solid state nanopores. Nano Lett. 13 (2), 658-663 (2013).
  17. Schmid, S., Stömmer, P., Dietz, H., Dekker, C. Nanopore electro-osmotic trap for the label-free study of single proteins and their conformations. Nat Nanotechnol. 16 (11), 1244-1250 (2021).
  18. Shi, X., Verschueren, D. V., Dekker, C. Active delivery of single DNA molecules into a plasmonic nanopore for label-free optical sensing. Nano Lett. 18 (12), 8003-8010 (2018).
  19. Verschueren, D. V., et al. Label-free optical detection of DNA translocations through plasmonic nanopores. ACS Nano. 13 (1), 61-70 (2019).
  20. Verschueren, D., Shi, X., Dekker, C. Nano-optical tweezing of single proteins in plasmonic nanopores. Small Meth. 3 (5), 1800465(2019).
  21. Peri, S. S. S., et al. Quantification of low affinity binding interactions between natural killer cell inhibitory receptors and targeting ligands with a self-induced back-action actuated nanopore electrophoresis (SANE) sensor. Nanotechnology. 32 (4), 045501(2020).
  22. Leong, I. W., Tsutsui, M., Yokota, K., Taniguchi, M. Salt gradient control of translocation dynamics in a solid-state nanopore. Anal Chem. 93 (49), 16700-16708 (2021).
  23. Juan, M. L., Righini, M., Quidant, R. Plasmon nano-optical tweezers. Nat Photon. 5 (6), 349-356 (2011).
  24. Juan, M. L., Gordon, R., Pang, Y., Eftekhari, F., Quidant, R. Self-induced back-action optical trapping of dielectric nanoparticles. Nat Phys. 5 (12), 915-919 (2009).
  25. Pang, Y., Gordon, R. Optical trapping of 12 nm dielectric spheres using double-nanoholes in a gold film. Nano Lett. 11 (9), 3763-3767 (2011).
  26. Pang, Y., Gordon, R. Optical trapping of a single protein. Nano Lett. 12 (1), 402-406 (2012).
  27. Kotnala, A., Gordon, R. Quantification of high-efficiency trapping of nanoparticles in a double nanohole optical tweezer. Nano Lett. 14 (2), 853-856 (2014).
  28. Booth, L. S., et al. Modelling of the dynamic polarizability of macromolecules for single-molecule optical biosensing. Sci Rep. 12 (1), 1995(2022).
  29. Yousefi, A., et al. Optical monitoring of in situ Iron loading into single, native ferritin proteins. Nano Lett. 23 (8), 3251-3258 (2023).
  30. Yousefi, A., et al. Structural Flexibility and Disassembly Kinetics of Single Ferritin Molecules Using Optical Nanotweezers. ACS Nano. 18 (24), 15617-15626 (2024).
  31. Peters, M., et al. Energy landscape of conformational changes for a single unmodified protein. NPJ Biosens. 1 (1), 14-14 (2024).
  32. Peters, M., McIntosh, D., Branzan Albu, A., Ying, C., Gordon, R. Label-free tracking of proteins through plasmon-enhanced interference. ACS Nanosci Au. 4 (1), 69-75 (2024).
  33. Ying, C., et al. Watching single unmodified enzymes at work. arXiv. , (2021).
  34. Yang-Schulz, A., et al. Direct observation of small molecule activator binding to single PR65 protein. NPJ Biosensing. 2 (1), 1-10 (2025).
  35. Yang, W., van Dijk, M., Primavera, C., Dekker, C. FIB-milled plasmonic nanoapertures allow for long trapping times of individual proteins. iScience. 24 (11), 103237(2021).
  36. Koya, A. N., et al. Novel plasmonic nanocavities for optical trapping-assisted biosensing applications. Adv Optical Mater. 8 (7), 1901481(2020).
  37. Goswami, A., Umashankar, R., Gupta, A. K., Aravindan, S., Rao, P. V. Development of a microstructured surface using the FIB. J Micromanufact. 1 (1), 53-61 (2018).
  38. Onuta, T. D., Waegele, M., DuFort, C. C., Schaich, W. L., Dragnea, B. Optical field enhancement at cusps between adjacent nanoapertures. Nano Lett. 7 (3), 557-564 (2007).
  39. Al-Ani, A., et al. The influence of PEG-thiol derivatives on controlling cellular and bacterial interactions with gold surfaces. Appl Surf Sci. 462, 980-990 (2018).
  40. Schuler, B., Hofmann, H. Single-molecule spectroscopy of protein folding dynamics-expanding scope and timescales. Curr Opin Str Biol. 23 (1), 36-47 (2013).
  41. Kopac, T. Protein corona, understanding the nanoparticle-protein interactions and future perspectives: A critical review. Int J Biol Macromol. 169, 290-301 (2021).
  42. Li, X., Guo, W., Xu, R., Song, Z., Ni, T. The interaction mechanism between gold nanoparticles and proteins: Lysozyme, trypsin, pepsin, γ-globulin, and hemoglobin. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 272, 120983(2022).
  43. Emilsson, G., et al. Strongly stretched protein resistant poly(ethylene glycol) brushes prepared by grafting-To. ACS Appl Mater Inter. 7 (14), 7505-7515 (2015).
  44. Theil, E. C., Liu, X. S., Tosha, T. Gated pores in the ferritin protein nanocage. Inorg Chim Acta. 361 (4), 868-874 (2008).
  45. Theil, E. C., et al. The ferritin iron entry and exit problem. Inorg Chim Acta. 297 (1), 242-251 (2000).
  46. Takahashi, T., Kuyucak, S. Functional properties of threefold and fourfold channels in Ferritin D=deduced from electrostatic calculations. Biophys J. 84 (4), 2256-2263 (2003).
  47. Gemeinhardt, A., et al. Label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iSCAT microscopy. J Vis Exp. (141), e58486(2018).
  48. Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nat Comm. 5 (1), 4495(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasmonic NanotweezersSingle Molecule ProteinsConformational DynamicsLabel Free Protein AnalysisLocalized Surface PlasmonProtein TrappingMicrofluidic SystemAvalanche PhotodiodeProtein Structural ChangesGold Nanostructures

Related Articles