Yöntem makalesi

Pentilentetrazol ile İndüklenen Nöbetlerin Davranışsal Karakterizasyonu: Racine Ölçeğinin Ötesine Geçmek

2.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68112

⸱

8 Temmuz 2025

 ,  , 
1Brain Institute, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Bu makalede

Özet

Protokol, farelerde pentilentetrazol kaynaklı nöbetlerle ilişkili davranışları analiz etmek ve görselleştirmek için yenilikçi bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, geleneksel Racine'in puanlarının ötesine geçerek, ictal davranışların çeşitliliği ve zamansal dinamikleri hakkında daha kapsamlı bir değerlendirme sağlar.

Özet

Nöbetlerin ayrıntılı davranışsal karakterizasyonu, epilepsi hayvan modellerinde esastır. Nöbetleri indüklemek için çeşitli protokoller mevcut olmasına rağmen, Racine ölçeği nicelleştirilmesi için en yaygın olarak benimsenen yöntem olmaya devam etmektedir. Başlangıçta, limbik yapıların elektriksel tutuşması sırasında davranışların ilerleyici alımını puanlamak için geliştirilen ölçek, o zamandan beri nöbetleri farklı etiyolojilere sahip modeller arasında sınıflandırmak için standart haline gelmiştir.

Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan bir nöbet modeli olan pentilentetrazol (PTZ) uygulamasını takiben davranışın dikkatli bir şekilde incelenmesi, Racine ölçeğinin bu GABAerjik antagonistin neden olduğu davranış değişikliklerinin tam spektrumunu yakalayamadığını ortaya koymaktadır. Tek bir deri altı yüksek doz PTZ enjeksiyonundan sonra, fareler ilk önce hipotoni, azalmış ambulasyon, davranışsal arrest ve titreme gibi konvülsif olmayan davranışlar sergiler. Bunları, spazmlar, miyoklonik sarsıntılar ve limbik nöbetler dahil olmak üzere iktal davranışlar takip eder, ancak yalnızca ikincisi Racine ölçeği ile ölçülür.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, spazmları ve miyoklonusu limbik nöbetlerden farklı davranışsal ifadeler olarak ayırt etmek için video etiketlemeyi hayvan izleme ile birleştiren rafine bir yaklaşım kullanılır. Bu erken davranışlar, limbik yapıların işe alınmasını kolaylaştırabilir ve sonunda limbik nöbetleri tetikleyebilir. Yöntemin uygulanması kolaydır ve PTZ'nin neden olduğu akut nöbetlerin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar. Faydası, tekrarlanan düşük PTZ dozlarının spazmlarda, miyoklonusta ve limbik nöbet şiddetinde zamansal değişikliklere neden olduğu PTZ çıra protokolünde daha da belirgindir. Bu yaklaşım, nöbet ve epilepsi araştırmalarında tekrarlanabilirliği geliştirme potansiyeline sahiptir.

Giriş

Nöbetlerin davranışsal karakterizasyonu, epilepsi patofizyolojisi ve nöbet aktivitesi ile ilgili çalışmalarda en çok kullanılan okumadır ve yeni nöbet önleyici ilaçlarıntaranması için yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2. Son 50 yılda yayınlanan çalışmaların çoğu, amigdala ve hipokampal çıra sırasında davranışsal nöbet şiddetini tanımlamak için Ronald J. Racine tarafından geliştirilen ilerleyici skor sistemini kullanmıştır3. Racine ölçeği, sıçan3 ve kedi4'te davranış ve elektrofizyolojik paroksismal aktivite arasında güçlü bir ilişki olduğunu gösterdi. Nöbetin davranışsal ifadesini beş aşamalı aşamaya ayırır: "(i) ağız ve yüz hareketleri, (ii) baş sallama, (iii) ön ayak klonusu, (iv) yetiştirme ve (v) yükselme ve düşme"3. Basitliği, kullanım ve yorumlama kolaylığı, skorlama hızı ve tekrarlanabilirliği nedeniyle Racine ölçeğinin epilepsi ve nöbet çalışmalarında kullanımı günümüzde bile artmaya devam etmektedir (Şekil 1).

figure-introduction-1
Şekil 1: Racine'in 1972 çalışmasının aldığı yıllık atıf sayısı. Son 50 yılda atıf sayısındaki istikrarlı artışa dikkat edin. 27 Kasım 2024 tarihinde yapılan bir Web of Science araması, 6.040 alıntı ortaya çıkardı ve 91 kayıt 'yayın yılı' alanında bilgi içermiyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ölçek daha sonra, nöbetleri indüklemek için ilaç kullananlar da dahil olmak üzere, diğer epilepsi ve nöbet hayvan modellerine uygulandı. Kainik asit kaynaklı nöbetler5 ve status epileptikus (SE) 6'nın yanı sıra lokal7 ve sistemik pilokarpin ile indüklenen SE8'in erken tanımları, hem indüklenmiş hem de spontan nöbetleri ölçmek için Racine ölçeğini kullandı. İlginç bir şekilde, bu ilaçlar, elektrikle uyarılan hayvanlarda gözlemlendiği ve Racine tarafından tarif edildiği gibi, yalnızca limbik nöbetlere neden olmadı, aynı zamanda kötü veya daha az sıklıkla tanımlanan farklı bir dizi davranışı da ortaya çıkardılar9.

Racine ölçeğinin iktal davranışların çeşitliliğini kavramak için sınırlamaları, nöbet odağının limbik sistemden başka beyin bölgelerinde bulunduğu nöbet modellerini kullanan araştırmacılar tarafından erken tespit edilmiştir. Örneğin, Garcia-Cairasco, odyojenik nöbetlerdeki(10) davranışı değerlendirmek için etolojik araçları ilk kullananlardan biriydi ve iktal davranışların karmaşıklığını ve zamansal ilerlemesini ortaya çıkardı10,11. Son zamanlarda, Ivan Soltesz, elektrikle tutuşturulan sıçanlarda 'gizli davranışsal parmak izlerini' ortaya çıkarmak için karmaşık video derinliği analizi ve ayrıntılı zamansal kodlama kullandı12. Bu yaklaşımlara dayanarak, farelerde pentilentetrazol ile indüklenen akut nöbetler için burada yeni bir kodlama sistemi tanıtılmıştır.

Pentilentetrazol (PTZ), GABAerjik nörotransmisyonu13 inhibe ederek nöbetlere yol açar, bu da nöronal uyarılabilirliğin artmasına ve nöronal popülasyonların senkronize aktivasyonuna neden olur14,15. Tek bir yüksek doz (40-80 mg / kg) sistemik PTZ'den sonra, kemirgenler azalmış hareketlilik, spesifik olmayan bıyık hareketleri, tüm vücut spazmları ve miyoklonik sarsıntılar, orofasiyal ve pençe klonusları ve tam gelişmiş limbik nöbetler sergiler16. Durum epileptikus modellerinden farklı olarak, PTZ sonrası anormal davranış 1 saate kadar sürer ve kendiliğinden düzelir 16,17,18. Önceki yazarlar, sıçanlar17 ve fareler 18 için Racine ölçeğinin gözden geçirilmiş bir versiyonunu önermişlerdir. İktal davranışların çeşitliliği hakkında yeni içgörüler sağlama girişimlerine rağmen, yeni ölçekleri, vahşi koşu ve/veya atlama (seviye 6, van Erum ve ark.18) ve solunum durmasına yol açan tonik ekstansiyon (seviye 7, van Erum ve ark.18) ile ilişkili bir veya iki yeni seviye içermektedir.

Bu protokol, spazmlar ve miyoklonusa özel olarak odaklanarak, PTZ'nin neden olduğu iktal davranışları ölçmek ve temsil etmek için yeni bir yaklaşım sunar. Bu davranışlar, sistemik PTZ uygulamasını takiben en yaygın olanlar arasındadır, ancak nöbet ve epilepsi çalışmalarında sıklıkla göz ardı edilirler. Bu nedenle, bu yaklaşım, spazmları ve miyoklonusu tanımlamak ve bunları davranışsal olarak limbik nöbetlerden ayırmak için özel kriterler sağlayarak kritik bir metodolojik boşluğu ele alır. Spazmların ve miyoklonusun hem tek hem de tekrarlanan PTZ uygulamalarını takiben farklı zamansal dinamikler sergilediğini göstermektedir. Bu kodlama sisteminin uygulanması kolaydır, anormal aktivitenin yeni parametrelerini mevcut metodolojilere entegre eder ve nöbet oluşturma mekanizmaları hakkında yeni bilgiler sunar. Son olarak, bu yeni strateji, laboratuvarlar arasında iktal davranış ölçümünü standartlaştırma, tekrarlanabilirliği artırma ve nöbet mekanizmalarına ilişkin bakış açılarını genişletme potansiyeline sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Rio Grande do Norte Federal Üniversitesi'nin yerel etik komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası 043/2022, Lisans numarası 307.043/2022). Bu protokolde 3 ila 4 aylık erkek C57BL / 6 fareleri kullanıldı ve yerleşik PTZ indüksiyon protokollerine göre önerilen örneklem büyüklüğü 6-10 hayvan16.

1. Gözlem alanının hazırlanması

  1. En az 10 x 10 cm yüzey alanına ve 30 cm duvar yüksekliğine sahip kare veya dairesel bir arena kullanın. Arenanın iyi aydınlatıldığından emin olun. Gerekirse, doygun görüntü elde etmeyi garanti etmek için kızılötesi aydınlatma kullanın (Şekil 2A).
  2. Arenanın üzerine en az bir video kamerayı, arenanın tüm zemininin ve duvarın en az 10 cm'sinin yukarıdan aşağıya görünümü ile yerleştirin (fare kafasını kırpmadan yetiştirme davranışını yakalamak için, Şekil 2B).
  3. İstenirse, arenanın önden görünümüne sahip ikinci bir video kamera yerleştirin. Bu durumda, arena duvarlarından birinin şeffaf olduğundan emin olun.
  4. Sıcaklık (21-24 °C) ve nemin (P-70) hayvan tesisinin koşullarına uygun olduğundan emin olun, bunları bir termo-higrometre ile izleyin ve gerektiği gibi ayarlayın.
  5. Arenanın altını kaplamak için gerekli yatak takımlarını yerleştirin ve hayvanın arka plandan göründüğünden emin olun. Deneyin tüm süresi boyunca su ve yiyecek peletlerini ücretsiz olarak kullanılabilir hale getirin.
  6. Deneylere tercihen ışık fazının başında başlayın (örneğin, 7:00 ile 10:00 arasında). Deney odasında (900-1,100 lüks) 12/12 saat aydınlık/karanlık döngüsüyle, ışıklar sabah 6'da açıkken tutarlı aydınlatmayı koruyun. Kayıt alanına yakın aydınlatma koşullarını doğrulamak için bir lüks ölçer kullanın ve tek tip video kayıt kalitesi sağlayın.
  7. Videoyu saniyede en az 24 kare (fps) ile elde etmek için kamerayı video kayıt cihazına bağlayın.

2. PTZ çözeltisinin hazırlanması

NOT: İktal davranışlar (ör., spazmlar) 40 mg / kg'dan başlayan dozlarla indüklenebilir. Limbik nöbetler 60 mg / kg ve daha yüksek dozlarda gözlenir. Solunum durması ve ölümle ilişkili tonik nöbetler genellikle 80 mg / kg veya daha yüksek bir dozda görülür. Çıra protokolü için 40 mg / kg'lık bir dozaj kullanıldı.

Doz, farklı fare suşları için değişebilir. Araştırma sorusuna en uygun PTZ dozunu tanımlamak için bir pilot deney yapılması önerilir.

  1. Farelere sistemik enjeksiyonlar yoluyla 10 mL / kg uygulayın. Bu nedenle, 4 veya 6 mg / mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için PTZ tozunu deiyonize suda çözün (sırasıyla 40 ve 60 mg / kg dozları için).
    NOT: Değişkenliği azaltmak için, tüm deney partisi için tek bir PTZ çözeltisi hazırlayın.

3. PTZ'nin Yönetimi

  1. Hayvanı arenaya yerleştirmeden önce, bir ölçek kullanarak vücut ağırlığını ölçün.
  2. Vücut ağırlığına göre her hayvan için gerekli olan PTZ çözeltisinin hacmini hesaplayın.
    NOT: 60 mg / kg'lık bir doz ve 30 g'lık bir vücut ağırlığı için, hayvana 0.3 mL 6 mg / mL PTZ çözeltisi enjekte edin.
  3. PTZ enjeksiyonundan en az 1 saat önce davranışı kaydedin.
    NOT: Bu alışma dönemi, yeniliğe bağlı ambulasyon ve kaygıyı azaltırken, temel aktiviteyi çıkarmak için de kullanılabilir.
  4. PTZ'yi intraperitoneal (i.p.) veya subkutan (s.c.) olarak uygulayın15,16. SC uygulaması için, hayvanı bir elinizle sabitleyin, cildi kürek kemikleri arasında nazikçe sıkıştırın (Şekil 2C).
  5. 26 1/2 G'lik bir iğneye bağlı 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, iğneyi vücudun oryantasyonuna paralel olarak deri altı boşluğun içine sokun ve çözeltiyi deri altı boşluğa yavaşça enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandığında iğneyi nazikçe çıkarın, boşluk basıncı nedeniyle solüsyonun dökülmesini önlemek için cildi iğne çıkışında tutun (Şekil 2C).
    NOT: Enjeksiyonlar çok hızlı uygulanmamalıdır, çünkü çözeltinin hızlı bir şekilde birikmesi, enjeksiyon bölgesinden dökülmeye veya iğne çıkarıldıktan sonra sızıntıya neden olabilir.
  6. İktal davranışların ifadesini etkileyeceği için herhangi bir sızıntıyı not edin. Aynı PTZ çözeltisinden 50 μL daha enjekte etme olasılığını göz önünde bulundurun.
  7. 1 saat kesintisiz video kaydı için hayvanı arenaya geri yerleştirin.
  8. PTZ enjeksiyonundan bir saat sonra (veya daha fazla), kayıtları durdurun ve son işlem için dosyayı kopyalayın (video izleme ve davranışsal kodlama).

figure-protocol-1
Şekil 2: Deney düzeneği ve enjeksiyon prosedürü. (A) PTZ uygulamasından önce ve sonra davranışları kaydetmek ve hayvan pozisyonlarını izlemek için merkezin üzerine yerleştirilmiş yukarıdan aşağıya görüş kameralarına sahip dört şeffaf kare arena kullanıldı. (B) A'da açıklanan kurulumla elde edilen bir temsili videonun anlık görüntüsü. (C) PTZ'nin deri altı enjeksiyonu örneği. İğne, deri altı boşluğunda hayvanın omuz bıçakları arasına yerleştirilir. (D) Bu çalışmada kullanılan davranışsal veri toplama ve analizlerinin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Hayvan refahı

  1. Özellikle tekrarlanan enjeksiyon protokolleri sırasında hücre ölümünü ve beyin dokusu hasarını önlemek için bir nöbet 5 dakikadan fazla sürerse hayvanları çıkarın ve ötenazi yapın.
  2. Deney süresi boyunca hayvanların ağırlığını günlük olarak izleyin.
  3. Yiyecek alımı, hareket, duruş, tımar ve ağrı veya sıkıntı belirtileri dahil olmak üzere hayvanların genel durumunu izleyin.
  4. Gerektiğinde anti-enflamatuar tedavi (Ibuprofen, 5 mg / kg) ve ağrı yönetimi uygulayın. Gerekirse ek gıda veya su sağlayın.
  5. Bireysel takviyeden sonraki 2 gün içinde geri kazanılamayan 'den fazla kilo kaybı, epidermal lezyonlar veya farmakolojik tedaviye yanıt vermeyen herhangi bir kronik ağrı veya rahatsızlık belirtisi gösterirlerse hayvanları çıkarın.
  6. Tüm hayvanları uluslararası ve kurumsal etik yönergelere göre ötenazi yapın.

5. Yazılım kurulumu, yapılandırması ve kullanımı

  1. Bu çalışmada açıklanan analiz için MouseLabTrack19 ve Solomon Coder'ı kullanın. Bunları indirin ve kurulum prosedürünü izleyin (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2).
    NOT: MouseLabTrack, MATLAB çerçevesi altında çalışırken, Solomon Coder, Windows işletim sistemi için bir yürütülebilir dosyadır. Her iki yazılım da açık kaynak kodludur.
  2. Windows Başlat Menüsünde Solomon'a tıklayın veya Solomon Coder'ı arayın ve yazılımı açın.
    1. Bir yapılandırma dosyası mevcutsa (Ek Dosya 3'e bakın), Dosya | Yük Yapılandırması. Ekran önceden tanımlanmış ayarları yükleyecektir.
    2. Kullanılabilir bir yapılandırma dosyası yoksa,
      1. Yeni bir düğme oluşturmak için boş alana sağ tıklayın. Yapılandırma ekranını açmak için yeni oluşturulan düğmeye sağ tıklayın.
      2. Düğme Adı alanında, istenen davranışı temsil etmek için düğmeyi yeniden adlandırın.
      3. Düğme Yüzü Rengi alanında bir renk seçin.
      4. Kategoriler alanında, Varsayılan'ı Davranışlar olarak yeniden adlandırın (bu, sütun adı olacaktır).
      5. Kısayol Tuşu alanında, video analizi sırasında davranışı işaretlemek için bir klavye tuşu atayın (örneğin, "1" tuşu).
      6. (İsteğe bağlı) Olay anlık ise Kısayol Tuşu'nun üzerindeki kutuyu işaretleyin, yani tuşa basıldığında ve bırakıldığında tek bir olay kaydedecektir. İşaretli değilse, anahtar serbest bırakılana kadar davranış kayıtlı kalır.
    3. Bir videoyu açmak için Dosya | Videoyu açın.
    4. Videoyu başlatmak için Oynat'a basın.
    5. Davranışlar gözlemlendiğinde, işaretlemek için farenin sol düğmesine tıklayın veya atanan klavye tuşuna basın.
    6. Verileri virgülle ayrılmış değerler (.csv) dosyası olarak kaydetmek için Analiz | Çıktıyı farklı kaydet. Solomon kodlama sayfasını (.arch) kaydetmek için Dosya | Kodlama Sayfasını Kaydet.
  3. MouseLabTracker'ı açmak ve yüklemek için.
    1. MATLAB'ı açın, konsolda 'main()' yazın ve Enter'a basın.
    2. Videoyu yüklemek için aç düğmesine tıklayın. Yüklemeden sonra, bitişik ekran videoyu yeşil bir arka planla ve hayvanı beyaz olarak gösterecektir.
    3. Videoda analiz edilecek zaman aralığını belirtin. Analizin başlangıcını ayarlamak için Başlat'a tıklayın. Analizin sonunu ayarlamak için Bitir'e tıklayın.
      NOT: Herhangi bir aralık ayarlanmamışsa, yazılım tüm videoyu analiz eder.
    4. İzleme ayarlarını yapılandırmak için İzleme Ayarları sekmesine gidin.
      1. Hayvanın arka plandan daha koyu olduğunu belirtmek için Koyu Nesneler / Açık Arka Plan'ı seçin.
      2. Hayvan sayısını ayarlamak için Konular'a gidin ve sayıyı 1 olarak değiştirin.
      3. Algılama parametrelerini ayarlamak için, Eşik parametre ayarını , yarıçap değerleri 30 ile 40 arasında olacak şekilde değiştirin.
      4. Renk'e tıklayarak ve uygun rengi seçerek hayvanın rengini tanımlayın.
      5. Arenayı tanımlamak için Arenayı Tanımla'ya tıklayın, ardından arenanın sol üst köşesini seçin, ardından arenanın sağ alt köşesini seçin.
    5. İzleme işlemini başlatmak için İzle'ye tıklayın. İlerleme çubuğu 0'e ulaşana kadar bekleyin.
    6. İzleme tamamlandıktan sonra, Sonuçları kaydet'e tıklayarak analizin çıktı dosyasını kaydedin.

6. Kodlama davranışları

  1. İlk olarak, fare gözlem alanına yerleştirildikten sonra video karesinde yeniden göründüğünde PTZ yönetim zamanını etiketleyin. Bu an, gecikme hesaplamaları da dahil olmak üzere diğer tüm davranışlar için zamansal referans görevi görerek sıfır zamanı görevi görür.
  2. PTZ enjeksiyonundan birkaç dakika sonra spazmları ve miyoklonusu gözlemleyin (Şekil 3), ardından olası limbik nöbetler izleyin. Spazmlar, bilateral kulak fleksiyonu, sırt kası kasılması, kuyruk kaldırma (Straub kuyruğu) ve nadiren irkilme sıçrama tepkisi dahil olmak üzere aksiyel kasların kısa, geçici ve hızlı kasılmalarıdır (Şekil 3A). Spazmları ayrı olaylar olarak kodlayın ve bunları süresi olmayan tek bir video karesiyle ilişkilendirin.
    NOT: Spazmların ifadesinde farklı vücut bölümlerinin çeşitliliğini ve kombinasyonunu ölçün (Temsili Sonuçlar bölümüne bakın).
  3. Miyoklonusu kodlamak için 200 ms'den daha uzun olayları gözlemleyin; Baş, boyun ve pençeleri içeren ani, güçlü bir miyoklonik sarsıntı ile karakterize edilirler. Titreme ve vücut duruşu kaybı ile ilişkili olabilir (Şekil 3B). Alt sınıflandırma, titreme veya ileri, sola veya sağa duruş kaybı olan miyoklonusu içerir. Süre tipik olarak 1 ila 2 s arasında değişir. Uzunlukları nedeniyle miyoklonus, tek bir olay için birden çok zaman biriminde kodlama gerektirir.
  4. Limbik nöbetleri kodlamak için, Racine tarafından tarif edilene benzeyen ve Racine ölçeği kullanılarak kodlanabilen olayları gözlemleyin. Tipik olarak davranışsal arrest veya bakma büyüsü ile başlar, ardından koku alma ve tat alma otomatizmaları, orofasiyal hareketler, ön ayak ve / veya baş miyoklonusu, düşerek veya düşmeden yetiştirme, vahşi koşu veya atlama ve solunum durması ile tonik nöbet izler. 10-15 saniyeden fazla süren ve spazmlar ve miyoklonustan ayırt edilebilen limbik nöbetleri alt sınıflandırmak için modifiye edilmiş Racine ölçeği18'i kullanın.
  5. Davranışların daha kapsamlı bir şekilde taranmasına olanak tanıyan deneysel protokole dayalı ek davranış sınıfları ekleyin.
  6. Kayıt oturumunun sonunu tek bir zaman diliminde işaretleyin (PTZ enjeksiyonundan 1 saat sonra). Hayvan bir tonik nöbetten sonra ölürse, ölüm zamanını bitiş işaretiyle tanımlayın.
    NOT: Kodlama sayfası, kodlama işlemi sırasında herhangi bir noktada kaydedilebilir ve devam eden kodlama veya değişiklikler için gerektiğinde yazılım içinde yeniden açılabilir.

figure-protocol-2
Şekil 3: PTZ uygulamasından sonra gözlemlenen iktal davranışların anlık görüntüleri. (A) Bu, PTZ enjeksiyonundan sonra gözlenen ilk spazmlardan birinin temsili bir örneğidir. Tüm kareler gösterilir (örnekleme 30 fps). Spazmın 200 ms'den az sürdüğünü ve rostrokaudal yönde hareket ettiğini unutmayın. Bu örnekte, açık bir kuyruk kaldırma meydana gelmedi. (B) Öne eğilme ile ilişkili temsili bir miyoklonus örneği. Bu örnekte, miyoklonus, birden fazla kuyruk ve ön ayak klonusunun meydana geldiği 1 saniyeden fazla sürdü. (C) Limbik nöbetin temsili örneği. Racine evre 1'den önce, fare, vücut duruşu kaybı da dahil olmak üzere sürekli uzuv miyoklonusu gösterdi. Dizi, geleneksel Racine ölçeğinin beş geleneksel aşamasını da göstermektedir. Bu durumda, fare 5 puan alacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. Veri analizi ve görselleştirme

  1. PTZ enjeksiyon süresini kodlama sayfasında kaydedilen süresinden çıkararak davranış kategorilerinin her birinin (örneğin, Spazm, miyoklonus, Nöbet, vb.) ilk oluşumunun gecikmesini hesaplayın.
  2. Her miyoklonus ve nöbet olayının süresini hesaplayın, ardından her kategori için toplam süreyi elde etmek için bunları toplayın.
  3. Toplam olay sayısını kayıt süresine bölerek her davranış için oluşma oranını hesaplayın.
  4. Ardışık olaylar arasındaki zaman farkını bularak her davranış için olaylar arası aralığı hesaplayın.
  5. Uygun olduğunda, her kayıt oturumunda iktal davranışların zamansal dağılımına göre bölümleri tanımlayın. Her bölüm için yukarıdaki parametreleri hesaplayın.
    NOT: Nöbetlerin sona ermesi, bu protokol için bir bölümün sona erdiğini gösteren bir postiktal baskılama dönemine yol açar. İktal davranışların yeniden ortaya çıkması yeni bir dönemin başlangıcını işaret eder.
    NOT: Nöbet yokluğunda, kayıt oturumunu spazmların ve miyoklonusun zamansal dağılımına göre sınıflandırın.
  6. Her grup için Shapiro-Wilk testini kullanarak normalliği test edin.
  7. Birden fazla grup arasındaki parametrik karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) testi kullanın. Eşleştirilmiş veriler için, veri yapısına bağlı olarak eşleştirilmiş bir t-testi veya tekrarlanan ölçümler ANOVA kullanın.
  8. İstatistiksel anlamlılığı p değerini < 0,05 olarak ayarlayın. Ek olarak, p değerlerini 0,0001'in altına yuvarlayın ve <0,0001 olarak bildirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kodlama stratejisini ve PTZ'nin neden olduğu nöbetler sırasında iktal davranışları detaylandırma yeteneğini değerlendirmek için, ilk olarak üç doz PTZ test edildi ve bunların C57BL / 6 fareleri üzerindeki etkileri gözlendi (sırasıyla 40, 60 ve 80 mg / kg, N = 7, 5 ve 5). Üç doz PTZ'de gözlenen davranışsal sonuçlar, tek bir enjeksiyondan sonra doza bağlı net farklılıklar ortaya çıkardı. 40 mg / kg PTZ ile tedavi edilen hayvanlar spazmlar gösterdi, ancak limbik nöbetler veya miyoklonus yoktu. Buna karşılık, 60 ve 80 mg / k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, nöbet dinamiklerini analiz etmek için daha kapsamlı bir çerçeve sağlamak için motor ifadelere dayalı davranışların bir kategorizasyonunu kullanmıştır. Bu yaklaşım, spazmların, miyoklonusun ve limbik nöbetlerin gecikmesi, süresi ve sıklığı dahil olmak üzere temel parametrelerin ölçülmesini sağlar. Haftalık PTZ enjeksiyonlarından elde edilen sonuçlar, tekrarlanan maruziyetin limbik nöbetlerin zamanlamasını ve sıklığını önemli ölçüde değiştirdiğini, limbik nöbetlerin süresinde b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, hibe numaraları 308110/2020-0 ve 316441/2023-6), Fundação de Amparo e Promoção da Ciência, Tecnologia e Inovação do Rio Grande de Norte (FAPERN, hibe numarası 042/2022) ve Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, hibe numarası #385/2019) ve Propesq-UFRN (hibe numarası PVP18039-2020) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,9 Sodyum Klorür ÇözeltisiFresenius Kabi Brezilya Ltda74MK3168 Serisiİntravenöz kullanım için kapalı sistem; enjekte edilebilir çözelti, 250 mL.
Analitik TeraziŞimadzuATY224Maksimum kapasite: 220 g, Minimum kapasite: 10 mg, Okunabilirlik: 0,1 mg. Seri No: 1311070096
KameraJortanJortan-8816AHDIR CCD kamera, NTSC sistemi, 2.0 MP çözünürlük, 3.6 mm lens, DC 12 V güç kaynağı.
Dijital Lüks ÖlçerMinipaMLM-1011 SerisiIşık yoğunluğunu lüks birimlerle ölçer.
Hipodermik İğneİndir paketi353101Boyut 26.5 g.
Fare--Erkek C57BL/6 vahşi tip fareler. İki-üç aylık.
PentilentetrazolSigma-Aldrich (Merck)P6500-25GToz, CNS uyarıcısı. Satın alındı: 25 gr. Depolama: -25 &dereceC.
Yazılım: MouseLabTracker  Giuliano Vilela-Açık kaynaklı yazılım, referans belgesi: DOI: 10.1016/j.jneumeth.2006.04.005.
Site: https://neuro.ufrn.br/softwares/mouselabtracker
Yazılım: Solomon CoderAndrá s Pé ter-Açık kaynaklı yazılım, v.19.08.02.
Site:  https://solomon.andraspeter.com/
Termo-HigrometreHikariHK-T240 SerisiSıcaklık ve nemi ölçer.

Kaynaklar

  1. Rogawski, M. A., Löscher, W. The neurobiology of antiepileptic drugs. Nat Rev Neurosci. 5 (7), 553-564 (2004).
  2. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  3. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  4. Delgado, J. M. R., Sevillano, M. Evolution of repeated hippocampal seizures in the cat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 13 (5), 722-733 (1961).
  5. Lothman, E. W., Collins, R. C. Kainic acid induced limbic seizures: metabolic, behavioral, electroencephalographic and neuropathological correlates. Brain Res. 218 (1-2), 299-318 (1981).
  6. Lévesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neurosci Biobehav Rev. 37 (10 Pt 2), 2887-2899 (2013).
  7. Castro, O. W., et al. Comparative neuroanatomical and temporal characterization of FluoroJade-positive neurodegeneration after status epilepticus induced by systemic and intrahippocampal pilocarpine in Wistar rats. Brain Res. 1374, 43-55 (2011).
  8. Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
  9. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  10. Garcia-Cairasco, N., et al. New insights into behavioral evaluation of audiogenic seizures. A comparison of two ethological methods. Behav Brain Res. 48 (1), 49-56 (1992).
  11. Garcia-Cairasco, N., Rossetti, F., Oliveira, J. A. C., Furtado, M. deA. Neuroethological study of status epilepticus induced by systemic pilocarpine in Wistar audiogenic rats (WAR strain). Epilepsy Behav. 5 (4), 455-463 (2004).
  12. Gschwind, T., et al. Hidden behavioral fingerprints in epilepsy. Neuron. 111 (9), 1440-1452.e5 (2023).
  13. Macdonald, R. L., Barker, J. L. Specific antagonism of GABA-mediated postsynaptic inhibition in cultured mammalian spinal cord neurons: a common mode of convulsant action. Neurology. 28 (4), 325-330 (1978).
  14. Dhir, A. Pentylenetetrazol (PTZ) kindling model of epilepsy. Curr Protoc Neurosci. 58 (1), 9.37.1-9.37.12 (2012).
  15. Samokhina, E., Samokhin, A. Neuropathological profile of the pentylenetetrazol (PTZ) kindling model. Int J Neurosci. 128 (11), 1086-1096 (2018).
  16. Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-induced kindling mouse model. J Vis Exp. (136), e56573(2018).
  17. Lüttjohann, A., Fabene, P. F., Van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  18. Van Erum, J., Van Dam, D., De Deyn, P. P. PTZ-induced seizures in mice require a revised Racine scale. Epilepsy Behav. 95, 51-55 (2019).
  19. Tort, A. B. L., et al. A simple webcam-based approach for the measurement of rodent locomotion and other behavioural parameters. J Neurosci Methods. 157 (1), 91-97 (2006).
  20. Gelinas, J. N., Khodagholy, D., Thesen, T., Devinsky, O., Buzsáki, G. Interictal epileptiform discharges induce hippocampal-cortical coupling in temporal lobe epilepsy. Nat Med. 22 (6), 641-648 (2016).
  21. Nizinska, K., et al. Behavioral characteristics as potential biomarkers of the development and phenotype of epilepsy in a rat model of temporal lobe epilepsy. Sci Rep. 11 (1), 8665(2021).
  22. Monteiro, ÁB., et al. Pentylenetetrazole: A review. Neurochem Int. 180, 105841(2024).
  23. Barker-Haliski, M., Steve White, H. Validated animal models for antiseizure drug (ASD) discovery: Advantages and potential pitfalls in ASD screening. Neuropharmacology. 167, 107750(2020).
  24. Santucci, V., et al. EEG effects of IV infusion of pentylenetetrazol in rats: A model for screening and classifying antiepileptic compounds. Psychopharmacology. 87 (3), 337-343 (1985).
  25. Swinyard, E. A., Brown, W. C., Goodman, L. S. Comparative assays of antiepileptic drugs in mice and rats. J Pharmacol Exp Ther. 106 (3), 319-330 (1952).
  26. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  27. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  28. McIntyre, D. C., Poulter, M. O., Gilby, K. Kindling: some old and some new. Epilepsy Res. 50 (1-2), 79-92 (2002).
  29. Yuskaitis, C. J., et al. Factors influencing the acute pentylenetetrazole-induced seizure paradigm and a literature review. Ann Clin Transl Neurol. 8 (7), 1388-1397 (2021).
  30. da Silva, L. F., Pereira, P., Elisabetsky, E. A Neuropharmacological analysis of PTZ-induced kindling in mice. Gen Pharmacol. 31 (1), 47-50 (1998).
  31. Copping, N. A., Adhikari, A., Petkova, S. P., Silverman, J. L. Genetic backgrounds have unique seizure response profiles and behavioral outcomes following convulsant administration. Epilepsy Behav. 101, 106547(2019).
  32. Medina, A. E., Manhães, A. C., Schmidt, S. L. Sex differences in sensitivity to seizures elicited by pentylenetetrazol in mice. Pharmacol Biochem Behav. 68 (3), 591-596 (2001).
  33. Pollo, M. L. M., Gimenes, C., Covolan, L. Male rats are more vulnerable to pentylenetetrazole-kindling model but females have more spatial memory-related deficits. Epilepsy Behav. 129, 108632(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pentilentetrazol N betleriLimbik N betlerMiyoklonik OlaylarSpazm AnaliziVideo TakibiEpilepsi Hayvan ModelleriN bet KantifikasyonuGABAerjik Antagonist

İlgili makaleler