Aktif Aktin Bazlı Montajların Kasılma ve Deformasyon Modlarının In Vitro Olarak Ayarlanması: İki Boyutlu Aktif Ağlardan Sıvı Kristal Damlalara

Summary

Burada, saflaştırılmış proteinlerden yarı iki boyutlu (2D) dolaşık, çapraz bağlı ve sıvı kristal aktin düzeneklerinin hazırlanması için yöntemler sunuyoruz.

Abstract

Aktin hücre iskeleti bazlı malzemeler, şekil düzenleme ve kuvvet üretimi gibi hücre mekaniğinin fiziksel mekanizmalarını ve ayrıca ilgi çekici yumuşak polimerik malzemeleri aydınlatmak için model hücresel malzemeler olarak geniş çapta araştırılmaktadır. Bu yöntemde, floresan mikroskobu çalışmaları için saflaştırılmış protein kullanarak in vitro aktin bazlı düzenekler oluşturmayı detaylandırıyoruz. Uzun aktin filamentlerini bir numune odasında polimerize ediyoruz ve filamentleri bir yüzey aktif madde tabakası ile pasifleştirilmiş bir yüzeye karşı iki boyutlu (2D) dolaşık bir ağa sıkıştırmak için bir polimer tükentici kullanıyoruz. Adenozin trifosfat (ATP) varlığında iskelet kası miyozin II filamentlerinin eklenmesi, aktin ağının kasılmasına neden olur. Aktin filamentlerini bir çapraz bağlayıcı ile demetleyerek, bükülen bir malzemeden mikro ölçekte kayan bir malzemeye geçiş yaparak düzeneğin kasılmalarını ayarlıyoruz. Kapatma proteini varlığında aktini kopolimerize ederek aktin filamentlerinin uzunluğunu azaltarak, malzemeyi 2 boyutlu bir ağ olmaktan sıvı bir kristale ayarlıyoruz. Dağılmış kısa aktin filamentlerinin çapraz bağlanması, üç boyutlu (3D) sıvı kristal damlacık oluşumu ile sonuçlanır.

Introduction

Aktif biyolojik malzemeler, hücre içi taşıma, hücre göçü, hücre şeklinin düzenlenmesi ve biyolojik^{kuvvet üretimi dahil} olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde mekanik süreçlerin altında yatan ^1,2,3. Tampon içinde kendi kendine bir araya getirilen saflaştırılmış ve tasarlanmış protein bileşenlerinden yapılan hücre iskeleti sistemlerinin in vitro düzenekleri, temel biyofiziksel ve biyokimyasal süreçleri karakterize etmek için yerleşik bir araçtır 4,5,6,7. Bu basitleştirilmiş model sistemleri, proteinlerin hücresel ortamların karmaşıklığı olmadan incelenmesine izin vererek, tek tek bileşenlerin rollerinin tanımlanmasına izin verir. Temel biyolojik çalışmaları desteklemenin yanı sıra, in vitro hücre iskeleti düzenekleri, sıvı kristal ve aktif veya denge dışı malzemeleri^araştırmak için deneysel sistemler olarak da yaygın olarak geliştirilmektedir 8,9,10,11,12,13,14,15.

Aktin, hücre iskeleti düzeneklerinde, motor ve polimerizasyon güdümlü kuvvetler aracılığıyla hücre mekaniğini ve dinamiğini düzenleyen önemli bir biyopolimerdir ^3,16. Floresan mikroskobu deneyleri, motor tahrikli kasılma ve çapraz bağlanan proteinlerle aktin demetlenmesi gibi süreçler sırasında aktin ağı yapısal değişikliklerinin görselleştirilmesine izin verir. Gömülü motor proteinler tarafından yeniden şekillendirilirken üç boyutlu aktin ağlarının görüntülenmesi, aktin çapraz bağlayıcılarının ağ kasılması ve model oluşumu için rolünü aydınlatmıştır 12,17,18,19. Bununla birlikte, yarı iki boyutlu aktin ağları, ağ yapısal değişikliklerini yakalamak için yeterli uzay-zamansal çözünürlükle görüntülemedeki zorlukların üstesinden gelir. Ek olarak, yüksek yoğunluklu, yarı iki boyutlu aktin yapıları, bir hücrenin²⁰ hücresinin yoğun aktin korteksi gibi hücresel düzeneklerin daha yakın bir taklididir. Yarı iki boyutlu aktin yapıları üretme stratejileri, aktin çekirdekleyici proteinlerin bir lamel ^21,22'ye bağlanmasını, aktinin bağlayıcı moleküller^10,23,24 yoluyla bir yüzeye bağlanmasını, bir lamel yüzeyinde boncuklara bağlı yoğun aktin demetlerinin oluşumunu^(25,26) ve moleküler kalabalık ajanlarla bir lamel yüzeyinde aktin filamentlerinin konsantrasyonunu^{10 içermektedir,27}.

Burada, tekrarlanabilir model aktin tabanlı montajlar oluşturmak için bir yöntemi ve aktif ağlardan yarı 2D sıvı kristallere ve nematik damlacıklara kadar varyasyonlar hazırlamak için nasıl değiştirileceğini detaylandırıyoruz. Çapraz bağlayıcı ilavesi¹¹ ile kısa aktin filamentlerinin faz ile ayrılmış sıvı kristal damlacıklarının oluşumunu incelemek için daha önce benzer yöntemler kullanmıştık, filament çapraz bağlama ve bağlantı²⁸ ile miyozin II tarafından oluşturulan aktin ağı deformasyon modlarındaki değişiklikler (örneğin, filament burkulması veya nispi kayma), değişen aralık ve uyumluluk²⁹ ile aktin demetleri üzerindeki miyozin II tarafından üretilen kuvvetlerdeki farklılıklar, ve miyozin II taşınması³⁰. Çapraz bağlama proteinlerinin ve aktin kapatma proteinlerinin kullanılması, aktin filament uzunluğunun ve montaj mimarisinin sistematik varyasyonuna izin verir.

Protocol

NOT: Proteinler ve etiketleme: Bu protokolün amaçları doğrultusunda, araştırmacının, floresan mikroskobu araştırması için uygun olduğunda floresan olarak etiketlenen saflaştırılmış protein stokları ile başladığı varsayılmaktadır. Bu proteinler satın alınabilir veya saflaştırılabilir ve laboratuvar 31,32,33,34,35,36,37'de floresan olarak etiketlenebilir. Bu protokolde, sıvı nitrojen içinde dondurulan ve -80 °C'de saklanan protein stokları kullanılmıştır. Proteinler tipik olarak benzer yöntemlerle etiketlenebilir. Protein, bir saflaştırma aşaması olarak veya donmuş bir stoktan etiketlenebilir. Etiketlemeye devam etmeden önce donmuş protein stoklarını buz üzerinde çözdürün. Aşağıdakiler, iskelet kası miyozin II'yi (miyozin) maleimid ile işlevselleştirilmiş bir florofor (^38'den uyarlanmıştır) ile floresan olarak etiketlemek için bir yöntemdir.

1. Floresan etiketli miyozin hazırlayın

1. 5-10 mg / mL konsantrasyonda ~ 2 mL miyozin ile başlayın.
   NOT: Bu protokolde iskelet kası miyozini II, yayınlanmış yöntemler kullanılarak tavuk kasından saflaştırılmış³⁵ adet kullanılmıştır. Miyozin, Miyozin depolama tamponunda (25 mM KPO₄, 0.6 M KCl, 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1 mM ditiyotreitol (DTT), pH 6.6) ya saflaştırmadan hemen sonra ya da donmuş stoktan saklanır. Motor aktivite kaybını önlemek için miyozini her zaman soğuk tutmak önemlidir.
2. Çözülmüş miyozin çözeltisine 10 mM'lik bir nihai konsantrasyona DTT ekleyin. Hacmi sınırlamak için 1 M DTT stok çözeltisi kullanın.
   NOT: DTT, miyozin proteinindeki sisteinler üzerindeki tiyol grubunu azaltır ve onları etiketleme için maleimid ile reaksiyona girmeye hazırlar.
3. Etiketleme reaksiyonuna müdahaleyi önlemek için, 50 ° C'de 50 mM HEPES, 500 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 7.6'da gece boyunca diyalize ederek DTT'yi çıkarın.
4. Diyalizden sonra, herhangi bir agregayı peletlemek için miyozin çözeltisini 100.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı topla.
5. Bir spektrofotometre kullanarak süpernatanttaki miyozin konsantrasyonunu belirleyin. İskelet kası miyozini 38 için ~ 148.000 ^{M-1 cm-1 280} nm'de bir yok olma katsayısı kullanarak miyozin konsantrasyonunu tahmin edin. Bu yok olma katsayısı, bir ağır zincir, bir temel hafif zincir ve bir düzenleyici hafif zincirden oluşan bir "monomer" olduğunu varsayar.
6. Toz haline getirilmiş floroforu kuru dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 5 mM florofor konsantrasyonuna yeniden süspanse ederek etiketleme reaksiyonu için florofor hazırlayın.
   NOT: Maleimid reaktif gruba sahip herhangi bir florofor çalışmalıdır. Alexa 647 maleimid kullanıldı. DMSO higroskopiktir ve su biriktirir. "Kuru" DMSO, su birikimini önlemek için bir ortamda depolanan DMSO'yu ifade eder. Çözücünün kuru DMSO olduğundan emin olmak için, bu adım için yeni açılmış bir DMSO ampulü kullanıldı. DMSO çözeltilerini buza koymayın. DMSO'nun erime noktası 19 °C'dir, bu nedenle pipet³⁹ için oda sıcaklığında (veya biraz daha sıcak) olmalıdır.
   DİKKAT: DMSO eldivenlere nüfuz edebilir, bu nedenle çift nitril eldiven giymek ve dökülmeleri önlemek için özen göstermek iyi bir uygulamadır.
7. Miyozini florofor eklemeye hazırlamak için, miyozin çözeltisini buzdan kısa bir süre alın ve oda sıcaklığına (RT) ısınmasına izin verin.
   NOT: Miyozini RT'de gerekenden daha uzun süre bırakmayın. Florofor DMSO'da askıya alındıktan sonra bu adımı yapın.
8. Miyozin çözeltisi RT'ye yaklaşır yaklaşmaz, florofor çözeltisini miyozine ekleyin ve 5: 1 molar florofor oranı olacak şekilde hızlı bir şekilde karıştırın: miyozin. Miyozin çözeltisini florofor ile karıştırılır karıştırılmaz buzun üzerine yerleştirin.
9. Işıktan korunarak 1 saat buz üzerinde inkübe edin, ardından 1 mM'lik bir konsantrasyona DTT ekleyerek reaksiyonu durdurun. Eklenen hacmi en aza indirmek için 1 M DTT stoğu kullanın.
10. Reaksiyona girmemiş floroforları çıkarın. Aşağıda açıklanan iki yöntemden birini kullanın:
    1. Seçenek 1:
       1. Miyozini bir F-tamponuna (10 mM İmidazol, 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 4 mM ATP, pH 7.5) yavaşça seyrelterek polimerize edin. Bu, adım 1.8'de eklenen boya hacmine bağlı olarak yaklaşık 10x'lik bir seyreltmedir.
       2. 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. Soğutmalı bir santrifüjde 8.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca pelet haline getirin.
       3. Serbest boya içeren süpernatanı atın ve miyozini Miyozin depolama tamponu ile yeniden süspanse edin / depolimerize edin (Adım 1'den itibaren). Kalan boyayı çıkarmak için, 5 mM 2- [4- (2-sülfoetil) piperazin-1-il] etansülfonik asit (PIPES), 0.45 M KCl, pH 7.0 (>100 kat hacim fazlalığı) içine diyaliz edin, her biri 10 kD'lik bir kesme diyaliz kabı kullanarak 15 dakika boyunca.
    2. Seçenek 2:
       1. 5 mM BORULAR, 0,45 M KCl, pH 7.0'a kolon üreticisinin standart protokolü ile tampon değişimi için bir tuz giderme kolonu kullanın.
11. Miyozin ve florofor konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçerek, 280 nm'de miyozin ve üretici tarafından bildirilen florofor için yok olma katsayılarını kullanarak florofor-protein oranını tahmin edin. 2-4 arası bir oran tipiktir.
    NOT: Etiketli miyozin artık sıvı nitrojen içinde alikotların dondurulması için hazırdır. Alikotlar uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanır.

2. İsteğe bağlı: Aktif olmayan miyozini çıkarma prosedürü

NOT: Miyozin, deneylerde doğrudan çözülmüş bir alikottan kullanılabilir, ancak miyozinin bir kısmı inaktif olacaktır. Aşağıdaki prosedür, aktif olmayan miyozinin nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Bu isteğe bağlı bir adımdır, ancak tekrarlanabilirlik için çok önemli olabilir. Miyozin alikotları çözüldükten sonra yaklaşık 3 gün kullanılır, 4 ° C'de veya buz üzerinde saklanır.

1. Etiketlenmemiş, falloidin ile stabilize edilmiş aktini polimerize edin:
   1. 10 μL 10x F-tamponu, 1 μL 100 mM ATP ve ddH₂O'yu son hacim (adım 2.1.2'deki aktin dahil) bir mikrosantrifüj tüpünde 100 μL olacak şekilde karıştırın.
   2. 20 μM'lik bir nihai konsantrasyona aktin monomeri ekleyin ve pipet karıştırın.
   3. Aktin filamentlerini stabilize etmek için, metanol ve pipet karışımında 100 μM'lik bir phalloidin stoğu kullanarak 6.7 μM'lik bir nihai konsantrasyona falloidin ekleyin.
      DİKKAT: Phalloidin bir toksin^40'tır. Dökülmeleri ve kirlenmeyi önleyin.
   4. Aktinin polimerize olmasına izin vermek için buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Polimerizasyondan sonra, gelecekteki spin-down'lar için aktini 4 °C'de saklayın.
2. Pipet karışımı 10 μL falloidin ile stabilize edilmiş aktin, 3 μL 10x F-tamponu, 0.3 μL 100 mM ATP, 6 μL 2 M KCl ve ddH₂O'yu 30 μL'lik bir nihai hacme (bir sonraki adımda miyozin eklenmesiyle ilişkili hacim dahil) buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde.
3. Hazırlanan stoktan dimerik etiketli miyozini istenen konsantrasyona ekleyin, miyozinin aktin ≤ 1: 6'lık bir molar oranını koruyun.
4. Elde edilen çözeltiyi 30 dakika boyunca 100.000 x g'da soğuk (4 ° C) santrifüjleyin. Aktif olmayan miyozin, aktin filamentlerine bağlanacak ve bağlı kalacaktır. Aktif olmayan miyozin ve aktin filamentleri, santrifüjleme sırasında bir pelet oluşturacaktır.
5. Süpernatanı (aktif miyozin içeren) çıkarın ve deneylerde kullanmak için 4 ° C'de saklayın.
6. Etiketlemeden sonra miyozin konsantrasyonunu ölçmek için aynı spektrofotometrik yöntemi kullanarak miyozin konsantrasyonunu tahmin edin.
   NOT: Süpernatantta kalan protein ve ATP konsantrasyonlarında, 280 nm absorbans zirvesi, 260 nm ATP absorbans zirvesi tarafından gizlenir, bu nedenle florofor veya nispi floresan ölçümü ile ilişkili absorbans yoluyla konsantrasyonun ölçülmesi daha doğrudur.

3. Yüzey aktif madde çözeltisi hazırlayın

NOT: Yüzey aktif madde çözeltisi önceden karıştırılmış ve kullanıma hazır olarak da satın alınabilir.

1. Temiz bir cam şişe ile başlayın. Yüzey aktif madde için bir çözücü olan yağdaki potansiyel kirleticileri gidermek için şişeyi su ve etanol ile durulayın. Politetrafloroetilen (PTFE) astarlı kapaklı borosilikat cam şişeler kullanın.
2. Bir pipet ucu kullanarak 5-20 mg florosürfaktan alın ve bir cam şişenin dibine yakın bir yerde biriktirin. Yüzey aktif madde miktarını miligramın altında hassasiyete sahip bir terazi kullanarak ağırlıkça ölçün.
3. Ağırlıkça% 2'lik bir çözelti yapmak için uygun hacimde florlu yağı pipetleyin ve şişeyi kapatın.
   NOT: Yağ uçucudur, bu nedenle ölçümden hemen sonra şişeyi kapatın.
4. Karıştırmak için düşük hızda girdap.
   NOT: Çözelti artık birkaç hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. Yüzey aktif madde yaşı ve kalitesi, aktinin hem kalabalıklaşmasını hem de görünümünü etkileyebilir. Benekli görünen, yüzeye yapışmış veya yüzeye yapışmayan aktin, taze bir yüzey aktif madde çözeltisinin gerekli olduğunu gösterebilir. Azot gazı altında depolama raf ömrünü uzatabilir.

4. Numune haznesini hazırlayın (Üç seçenek)

NOT: Bu bölüm, mikroskopi için numune hazırlamak için kullanılan üç standart numune odası oluşturmak için bir prosedür sağlar. Aşağıdaki iki bölüm, gerçek numunenin hazırlanmasını ve numune yükleme için numune haznesinin pasifleştirilmesini kapsar.

1. Seçenek 1: Akış hücresi
   NOT: Basit bir akış hücresi, birçok laboratuvarda mikroskop örnekleri oluşturmanın standart bir yoludur. Bu protokol için, özellikle emülsiyon damlaları ile kaplanmış numuneler için uygundur. Bu protokolde açıklanan yüzey aktif madde yüzey kaplaması ile geniş, düz görüş alanları elde etmek zor olabilir, bu nedenle 2D numuneler için seçenek 2 ve 3 genellikle daha tekrarlanabilirdir. Kanal geometrisi ayrıca miyozin gibi daha sonraki zamanlarda eklenen bileşenlerin eşit olmayan şekilde karışmasına neden olabilir.
   1. Akış hücresi kanalının sınırlarını oluşturmak için mikroskop lamının genişliği boyunca birbirine paralel 2 parça çift taraflı bant yerleştirin. İki bant parçası arasında oluşan kanal yaklaşık 2 mm genişliğinde olmalıdır.
      NOT: Daha küçük kanallar, emülsiyonların kanalın başlangıç kısmında sıkışmasını önlemeye yardımcı olur. İyi bir sızdırmazlık sağlamak için, cam kızağın genişliğinden biraz daha uzun bant parçaları kullanın ve akış hücresini oluşturduktan sonra düzeltin.
   2. Lameli bant kanalının üzerine yerleştirin. Lamelin mikroskop lamına dik olduğundan emin olun. Bu amaç için 30 mm x 40 mm'lik bir lamel kullanın, çünkü bir kızak üzerine yerleştirildiğinde küçük bir çıkıntı sağlar.
   3. İyi bir sızdırmazlık oluşturmak ve bant ile lamel arasındaki hava ceplerini ortadan kaldırmak için, lamel çift taraflı bantla temas eden alanına bastırın.
      NOT: Kenarlara bastırırken lamel kırmamaya dikkat edin. Alanı, kapaklı bir kalemin ucu gibi yuvarlak bir nesneyle ovalamak, bandı aşağı bastırmak için iyi sonuç verir.
   4. Bir tıraş bıçağı kullanarak, mikroskop lamı ve lamel üzerindeki fazla bandı, tek görünür bant numune kanalının içinde olacak şekilde kesin.
      NOT: Bandı çıkarmaya çalışırken lameli yanlışlıkla kırmak kolay olduğundan, bu adımı tamamlarken dikkatli olun.
2. Seçenek 2: İşlenmemiş bir lamel üzerinde silindir
   NOT: Bu seçenek, 2D düzlemsel numuneler için uygundur. Mikroskopi deneyleri sırasında farklı zamanlarda bileşen eklemek için uygundur. Bu numune haznesi, tortu yerine krem haline gelen emülsiyonlar için kullanılmamalıdır ve görüntülemeyi zorlaştırır.
   1. Lameli ve cam klonlama silindirini su, etanol ve su ile durulayın. Havayla kurutun.
   2. 5 dakikalık ince bir epoksi tabakası kullanarak cam klonlama silindirini lamel üzerine yapıştırın.
      NOT: Epoksi kururken silindirin üzerine temiz bir cisim koyarak silindire kuvvet uygulamak faydalı olacaktır. Küçük bir Petri kabı kapağı veya lamel kutusu iyi çalışabilir.
3. Seçenek 3: Silan kaplı lamel üzerinde silindir
   NOT: Bu seçenek, tekrarlanabilir bir şekilde haznenin merkezinde geniş, düzlemsel bir bölge ile sonuçlanır ve numunenin toplu akışını azaltır. Bunu başarmak için, lamel üzerinde hidrofilik bir bölge ile çevrili hidrofobik bir bölge oluşturuldu, bu da aktinin odanın kenarındaki hidrofilik bölgelere tutturulduğu pasifleştirilmiş, sınırlı bir bölge üzerinde bir aktin ağına sahip nihai bir numune ile sonuçlandı. Bu numune haznesi, tamponda tortu yerine krema haline gelen emülsiyonlar için kullanılmamalıdır ve bu da görüntülemeyi zorlaştırır.
   1. Hidrofobik hale getirmek için silan kaplamalı lameller hazırlayın.
      1. Temiz cam lameller paslanmaz çelik bir rafa yükleyin. İstenirse deterjan veya etanol içinde sonikasyon ile camı önceden temizleyin.
      2. Bir cam boyama kabında, trimetoksi (oktil) silanı izopropanol içinde% 2'lik bir çözeltiye seyreltin.
      3. Lamelleri 10 dakika boyunca solüsyona daldırın.
      4. Durulamak için çözeltiyi suyla değiştirin. Lamel raflarını altı kez kaldırın ve yeniden daldırın. Arada su değişimleri ile işlemi dört kez daha tekrarlayın.
      5. Lamelleri tozdan korumak için rafları alüminyum folyo ile örtün ve 25-30 °C'de kurutun.
   2. Bir cam Petri kabının veya ultraviyole (UV) ozon temizleyiciye sığacak başka bir açık cam kabın dibine oktil-silan ile muamele edilmiş bir lamel yerleştirin.
   3. Forseps kullanarak, aşağıdaki UV ozon tedavisi için maske görevi görecek lamel üzerine 2 mm x 2 mm'lik bir PTFE kare (bir tabakadan kesilmiş) yerleştirin.
   4. Lameli 10 dakika boyunca UV-ozon ile tedavi edin. Bu işlem, PTFE maskesi tarafından kapsanmayan maruz kalan bölgelerde camı hidrofilik hale getirir.
   5. Lameli veya PTFE kareyi bozmadan çanağı dikkatlice çıkarın. 5 dakikalık epoksi kullanarak lamel üzerine bir cam klonlama silindiri yapıştırın. Silindirin, epoksi kuruduktan sonra forseps ile çıkarılabilen PTFE karesini çevrelediğinden emin olun.
      NOT: PTFE kare gelecekteki deneylerde yeniden kullanılabilir.

5. Aktin ağının montajı

NOT: Aşağıdakiler 50 μL'lik bir numunenin hazırlanması içindir. Silindir numuneleri için daha büyük bir hacim menisküsün etkilerini azaltabilir ve numune stabilitesini artırabilir.

1. Bir mikrosantrifüj tüpüne, 5 μL 10x F tamponu, son hacmi 50 μL'ye getirmek için gerekli ddH₂O, 1 μL hacimce %25 beta-merkaptoetanol, 1 μL 225 mg/mL glikoz, 1 μL glikoz oksidaz (135 mg / mL) ve katalaz (85.000 birim / mL), 1 μL 25 mM ATP karışımı ekleyin, ve 10 μL ağırlıkça %2 15 santipoise metilselüloz. Pipet iyice karıştırın.
   NOT: Beta merkaptoetanol bir toksindir. Dökülmeleri ve kirlenmeyi önleyin. Glikoz oksidaz, katalaz, glikoz ve beta-merkaptoetanol reaktifleri, bir oksijen süpürücü sistem oluşturmak için numunede bulunur. Metilselüloz stok çözeltisi 4 °C'de karıştırılarak hazırlanır ve 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir. Metilselüloz çözeltiden çökelebilir ve görünür çökelti varsa veya aktin kalabalığı zayıfsa yeniden hazırlanmalıdır.
2. İsteğe bağlı: Çapraz bağlama proteini ekleyin (her 1 aktin monomeri için 0.1-1 çapraz bağlayıcı protein). Pipet karışımı.
   NOT: Çapraz bağlama protein(ler)i, aktin polimerizasyonundan sonra da eklenebilir ve miyozin eklenmeden önce 10-20 dakika bağlanmasına izin verilebilir. Bu, aktin filamentlerini demetlemek için yeterince yüksek olan çapraz bağlayıcı konsantrasyonları için tercih edilir - demetler, yüzey aktif madde-su arayüzünde daha eşit ve tekrarlanabilir bir şekilde dağıtılır. Silindir numune odası, aktin polimerize olduktan sonra bir çapraz bağlayıcı eklemeye uygundur.
3. İstenirse falloidin (her 1-3 aktin monomeri için 1 falloidin) ekleyin. Pipet karışımı.
4. Ayrı bir tüpte, etiketsiz ve etiketli aktini, aktin karışımının tümü 50 μL numuneye eklendiğinde toplam konsantrasyon 2.64 μM olacak şekilde karıştırın. Her 9 etiketsiz aktin monomeri için 1 etiketli aktin monomer oranı kullanın. Pipet karışımı.
   NOT: Aktin monomerleri, numune çözeltisine eklendikten sonra polimerleşmeye başlayacaktır. Aktin etiketli ve etiketsiz aktinin ayrı ayrı eklenmesi, tek bir filamentin konturu boyunca koyu ve flüoresan bölgelerle benekli görünen aktin ile sonuçlanabilir. Aktin monomer stokları, düzgün bir şekilde etiketlenmiş aktin filamentleri sağlamak için karıştırılır. Aktin saflaştırma ve etiketleme^31'de açıklanmıştır.
5. İsteğe bağlı: Kısa aktin filamentleri kullanarak sıvı kristaller veya başka deneyler yapmak için, adım 5.4'ten itibaren aktin karışımına kapatma proteini ekleyin. Kapatma proteininin tam miktarı, proteinin aktif fraksiyonuna ve hedeflenen aktin filamentlerinin uzunluğuna bağlıdır, ancak tipik olarak, sıvı kristal deneyleri için kısa filamentler oluşturmak için yaklaşık% 1-10 mol kapatma proteini (aktine göre) yeterlidir. Kapak proteini saflaştırması^36'da açıklanmıştır.
6. Aktini polimerize etmeye başlamak için, aktin karışımını F-tampon çözeltisine ve pipet karışımına ekleyin.
7. Aktini RT'de mikrosantrifüj tüpünde polimerleşmeye bırakın ve ardından 10-30 dakika sonra numune hücresine ekleyin.
8. İsteğe bağlı: Bir silindir numunesi hazırlıyorsanız, silindir numune haznesinin yüklenmesinin 7.4. adımında pipetlemeye hazır olması için tüm çözeltiyi bir pipet ucuna çekin.

6. İsteğe bağlı: Emülsiyonları hazırlayın

NOT: Bu numuneleri, kapalı bir numune odası sağlayan emülsiyonlarda hazırlamak bazen uygun olabilir. Emülsiyonlar, Chowdhury ve diğerleri ile benzer reaktifler kullanılarak hazırlanır, bu da yüzey aktif madde aracılı sulu emülsiyon damlaları^41'e sahip bir sürekli yağ fazı ile sonuçlanır. Bu protokolde kullanılan metilselüloz gibi bir tükenme maddesinin varlığında, aktin numuneleri bu emülsiyonun sulu arayüzüne kalabalıklaşacaktır. Bu protokolün dayandığı numuneler için, aktinin emülsiyonlara eklenmeden önce veya sonra polimerize edilmesi arasında bir fark görülmez; Bununla birlikte, bazı kapsülleme deneylerinde polimerizasyon aşamasının dikkate alınmasının önemli olduğu bildirilmiştir⁴².

1. Bir mikrosantrifüj tüpüne 3,5 μL yağ yüzey aktif madde ekleyin. Bu adım için şeffaf, açık renkli veya şeffaf bir mikrosantrifüj tüpü kullanın.
2. Karıştırmadan, yağ yüzey aktif madde tabakasının üstüne 5 μL aktin çözeltisi ekleyin. Mikrosantrifüj tüpünü kapatın.
3. Mikrosantrifüj tüpünün üst kısmını tutarken, başlangıçta görünür emülsiyonlara sahip bir köpük oluşturmak için tüpün alt kenarını hafifçe vurun. Köpük, arkadan aydınlatıldığında mikroemülsiyonları gösteren ayırt edilebilir bir özellik göstermeyene kadar tüpü sallamaya devam edin.
   NOT: Emülsiyonlarda bir numune hazırlarken, aktin numunesini yapmadan önce bir akış hücresi veya başka bir numune odası hazır olmalıdır. Cam silindir numune haznesi, emülsiyonlar için iyi çalışmaz, çünkü bunlar kapak camı yüzeyine tortu yerine hava arayüzüne krema yapar.

7. Numune haznesini yükleyin (Silindir hazneleri)

1. 5 μL yağ yüzey aktif madde solüsyonunu cam silindir haznesinin dibine pipetleyin
   NOT: Alternatif olarak, desteklenen bir lipid çift tabakası ^11,29,30 ile yüzey pasifleştirilerek numuneler yapılabilir.
2. Lameli eğin ve lamel yüzeyi ve alt silindir yüzey aktif madde çözeltisi ile kaplanacak şekilde yavaşça döndürün.
3. Uçucu olan yağın tamamen buharlaşmasına izin vermeden mümkün olduğunca ince bir yağ tabakası elde etmek için fazla yağ yüzey aktif madde çözeltisini bir pipetle çıkarın.
4. Adım 5.7'deki numune çözeltisini hemen hazneye ekleyin.
5. Buharlaşmayı ve akışı önlemek için hazneyi küçük bir parça PTFE bantla örtün.

8. Alternatif: Numune odasını yükleyin (akış hücresi)

1. Akış hücresini yüklemeye hazırlanmak için az miktarda 5 dakikalık epoksi karıştırın. Tipik olarak 0,5^cm2'den daha az bir alana sahip bir damla yeterlidir.
2. Numuneyi akış hücresine yerleştirmek için, kanalı ıslatan küçük bir çözelti tıkaç oluşturmak için önce akış hücresinin numune kanalına 1-3 μL yağ yüzey aktif madde solüsyonu pipetleyin.
3. Kanalı doldurmak için hemen bir hacimde numune çözeltisi veya emülsiyon süspansiyonunu akış hücresinin girişine yavaşça pipetleyin. Tipik olarak, yaklaşık 2 mm olan bir kanal için hacim yaklaşık 8 μL'dir. Giriş, yağ yüzey aktif madde çözeltisinin eklendiği taraftır.
   1. Numune hacmi akış hücresi hacmini aşarsa, kanalın diğer ucuna tüy bırakmayan bir mendil veya filtre kağıdı yerleştirerek numuneyi akış hücresinden geçirin.
   2. Yağ yüzey aktif madde çözeltisinin menisküsü geri çekildiyse ve bu da bir hava boşluğuna neden olduysa, numuneyi eklemeden önce girişteki hava boşluğunu gidermek için önce akış hücresini eğin.
4. Gerekirse, kanalda hava artık görünmeyene kadar veya numuneyi (özellikle emülsiyonlar için) kanalın içine daha fazla itmek için ilave yağ yüzey aktif madde çözeltisi ekleyin.
5. Kanalın her iki tarafını 5 dakikalık epoksi ile kapatın (akış hücresini yüklemeden hemen önce karıştırın).

9. Görüntüleyin ve miyozin ekleyin

1. Numuneyi mikroskoba monte edin ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yeterince geniş bir sayısal diyafram açıklığı sağlamak için yağa veya suya daldırılarak 20x, 40x, 60x veya 100x objektif kullanarak aktinin hızlandırılmış görüntülemesini başlatın. Numune haznesinde polimerizasyon yapılıyorsa, ~30 dakika veya artık görünür filament uzaması veya hareketi kalmayana kadar polimerizasyona izin verin.
2. İsteğe bağlı: Çapraz bağlayıcı ekleyin.
3. Aşağıdaki 1 veya 2 numaralı seçenekler aracılığıyla miyozin ekleyin.
   1. Numunenin üstüne pipetlenmiş bir dimer olarak miyozin ekleyin (miyozin dimer yayılacağı için karıştırmaya gerek yoktur).
   2. Önceden polimerize filamentler olarak miyozin ekleyin. Pipet, kalabalık aktini rahatsız etmemek için toplam hacmin yaklaşık yarısını çok yavaş karıştırın.
      NOT: Lamel yüzeyinde istenen filament yoğunluğunu veya boyutunu elde etmek için miyozin ilavesi için ideal yöntem, farklı aktin mimarileri için değişebilir ve deneysel olarak belirlenmesi gerekir.
4. Zaman atlamalı görüntülemeyi başlatın.

Results

Bu yöntemlerde açıklanan genel stratejiyi izleyerek, saflaştırılmış proteinler kullanılarak model sistemlerde çok çeşitli aktin düzenekleri oluşturulabilir, burada aktin, montaj mimarisini değiştiren aksesuar proteinlerin varlığında filamentler halinde polimerize edilir (Şekil 1). Aktin, çapraz bağlayıcılar veya kapak proteini olmadan filamentler halinde polimerize edildiğinde, dolaşık filament ağları oluşturur (Şekil 1A). Dolaşık ağlara çapraz bağlayıcı eklemek...

Discussion

Tekrarlanabilir aktin düzenekleri üretmek için birçok husus vardır. Tekrarlanabilir, analiz edilebilir veriler üretmek için en kritik olanlardan biri, numune odasının kapak camı yüzeyidir. İn vitro aktin numunelerindeki proteinler, özellikle miyozin, son derece yapışkandır ve işlenmemiş veya kötü muamele görmüş cam yüzeylere yapışarak kullanılamaz bir numune oluşturur (Şekil 5A). Silinize bir lamel bir yağ yüzey aktif madde tabakası ile pasifleştiri...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL mikrosantrifüj tüpü	Fisher Scientific	05-408-123
008-Florosüraktif madde	RAN Biyoteknolojileri	00115081361-6525	Önceden karıştırılmış çözeltiye alternatif
008-RAN Biyoteknolojilerinde HFE7500 FloroYüzey Aktif Madde		008-FloroYüzey Aktif Madde 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G	Önceden karıştırılmış çözelti
2-merkaptoetanol (β-merkaptoetanol)	Sigma Aldrich	63689	CAS Numarası: 60-24-2 Stok çözeltisi: MilliQ suda 25 mM, 4 &°C'de saklanır; C4
- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etan-sülfonik asit (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375	CAS Numarası: 7365-45-9
5 dk Epoksi	Devcon	14250
Aktin Hücre İskeleti	, Inc.	AKL99-A	>99% saf tavşan iskelet kası (Saflaştırmaya alternatif)
Aktin (rodamin etiketli)	Cytoskeleton, Inc.	AR05-A	Tavşan iskelet kası (Saflaştırmaya alternatif)
Adenozin 5&prim;-trifosfat (ATP)	Sigma Aldrich	A6419	CAS Numarası: 34369-07-8 Stok çözeltisi: MilliQ suda 25 mM, -20 °C'de saklayın; C Hidrolizi önlemek için donmuş halde tutun
Kalsiyum Klorür (CaCl2)	Sigma Aldrich	C5670	CAS Numarası: 10043-52-4
Kapak Proteini (Fare)			E.coli'de aşırı ekspresyondan saflaştırılmış HisTag ile Stok çözeltisi: -80 °C'de protein tamponunda 20 mM; Sığır
karaciğerinden C Katalaz	Sigma Aldrich	C9322	CAS Numarası: 9001-05-2 Stok çözeltisi: 85 ku/mL, -20 ° C'de glikoz oksidaz ile saklanın; C
Kapak Camı	Fisherbrand	12544C	Borosilikat, #1.5, 24 mm x 40 mm Fisherbrand değil Fisher En İyi
D-(+)-Glikoz	Sigma Aldrich	G8270	CAS Numarası: 50-99-7 Stok çözeltisi: MilliQ suda 225 mg/mL, -20 °C'de saklayın; C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	3860-OP	CAS Numarası: 3483-12-3 Stok çözeltisi: MilliQ suda 1 M, -20 ° C'de saklayın; C
Çift Taraflı Bant	3M	3136
Etil alkolol 200 Korumalı	PHARMCO	111000200	CAS Numarası: 64-17-5 200 kanıt
Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve asal;, N ve asal;-tetraasetik asit (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889	CAS Numarası: 67-42-5
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884	CAS Numarası: 60-00-4
Glikoz Oksidaz	Sigma Aldrich	345386	CAS Numarası: 9001-37-0 Stok çözeltisi: MilliQ suda 135 mg / mL, -20 ° C'de katalaz ile aliquoted olarak saklayın; C
Gliserol	Sigma Aldrich	356352M	CAS Numarası: 56-81-5
İmidazol	Fisher Biyoreaktifleri	BP305-50	CAS Numarası: 288-32-4
Magnezyum Klorür (MgCl2< / sub>)	Fisher Bioreagents	BP214	CAS Numarası: 7786-30-3, 7791-18-6
Metilselüloz	Sigma Aldrich	M0512	CAS Numarası: 9004-67-5 15 centipoise
Mikroskop Slaytları Düz Elektron	Mikroskobu Bilimleri / Altın Mühür	63710-05	& nbsp; 3 "x1", 1 mm kalınlığında
MilliQ su	Kırlangıç	CUFBI001	Ultra saf su
Novec-7500 Mühendislik Sıvısı	3M	7100134816	Önceden karıştırılmış çözeltiye alternatif
Potasyum Klorür (KCl)	Sigma Aldrich	P3911	CAS Numarası: 7447-40-7
Potasyum Fosfat (KPO4)	Sigma Aldrich	P3786	CAS Numarası: 7758-11-4
Tavşan İskelet Kası Aseton Tozu	Pel-Freez Biologicals	41995-1	Aktini saflaştırırken kullanılır (satın almaya alternatif) -80 ° C'de aktin Tamponu G'de yaklaşık 30 mM saklayın; C
Sodyum Azide	Sigma Aldrich	71289	CAS Numarası: 26626-22-8
Tetrametilrodamin-C6-maleimid	AnaSpec	AS-81445	CAS Numarası: 174568-68-4 Aktini saflaştırırken kullanılır (satın almaya alternatif) -80 ° C'de aktin Tamponu G'de yaklaşık 30 mM saklayın. Aktin etiketlenirken kullanılır (satın almaya alternatif)
Tris Hidroklorik Asit (Tris HCl)	Sigma Aldrich	648317	CAS Numarası: 1185-53-1
Ultrasonik Banyo	Emerson Branson