Method Article

Aktif Aktin Bazlı Montajların Kasılma ve Deformasyon Modlarının In Vitro Olarak Ayarlanması: İki Boyutlu Aktif Ağlardan Sıvı Kristal Damlalara

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, saflaştırılmış proteinlerden yarı iki boyutlu (2D) dolaşık, çapraz bağlı ve sıvı kristal aktin düzeneklerinin hazırlanması için yöntemler sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktin hücre iskeleti bazlı malzemeler, şekil düzenleme ve kuvvet üretimi gibi hücre mekaniğinin fiziksel mekanizmalarını ve ayrıca ilgi çekici yumuşak polimerik malzemeleri aydınlatmak için model hücresel malzemeler olarak geniş çapta araştırılmaktadır. Bu yöntemde, floresan mikroskobu çalışmaları için saflaştırılmış protein kullanarak in vitro aktin bazlı düzenekler oluşturmayı detaylandırıyoruz. Uzun aktin filamentlerini bir numune odasında polimerize ediyoruz ve filamentleri bir yüzey aktif madde tabakası ile pasifleştirilmiş bir yüzeye karşı iki boyutlu (2D) dolaşık bir ağa sıkıştırmak için bir polimer tükentici kullanıyoruz. Adenozin trifosfat (ATP) varlığında iskelet kası miyozin II filamentlerinin eklenmesi, aktin ağının kasılmasına neden olur. Aktin filamentlerini bir çapraz bağlayıcı ile demetleyerek, bükülen bir malzemeden mikro ölçekte kayan bir malzemeye geçiş yaparak düzeneğin kasılmalarını ayarlıyoruz. Kapatma proteini varlığında aktini kopolimerize ederek aktin filamentlerinin uzunluğunu azaltarak, malzemeyi 2 boyutlu bir ağ olmaktan sıvı bir kristale ayarlıyoruz. Dağılmış kısa aktin filamentlerinin çapraz bağlanması, üç boyutlu (3D) sıvı kristal damlacık oluşumu ile sonuçlanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktif biyolojik malzemeler, hücre içi taşıma, hücre göçü, hücre şeklinin düzenlenmesi ve biyolojikkuvvet üretimi dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde mekanik süreçlerin altında yatan 1,2,3. Tampon içinde kendi kendine bir araya getirilen saflaştırılmış ve tasarlanmış protein bileşenlerinden yapılan hücre iskeleti sistemlerinin in vitro düzenekleri, temel biyofiziksel ve biyokimyasal süreçleri karakterize etmek için yerleşik bir araçtır 4,5,6,7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Proteinler ve etiketleme: Bu protokolün amaçları doğrultusunda, araştırmacının, floresan mikroskobu araştırması için uygun olduğunda floresan olarak etiketlenen saflaştırılmış protein stokları ile başladığı varsayılmaktadır. Bu proteinler satın alınabilir veya saflaştırılabilir ve laboratuvar 31,32,33,34,35,36,37'de floresan olarak etiketlenebilir. Bu protokolde, sıvı nitrojen içinde dondurulan ve -8....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemlerde açıklanan genel stratejiyi izleyerek, saflaştırılmış proteinler kullanılarak model sistemlerde çok çeşitli aktin düzenekleri oluşturulabilir, burada aktin, montaj mimarisini değiştiren aksesuar proteinlerin varlığında filamentler halinde polimerize edilir (Şekil 1). Aktin, çapraz bağlayıcılar veya kapak proteini olmadan filamentler halinde polimerize edildiğinde, dolaşık filament ağları oluşturur (Şekil 1A). Dolaşık ağlara çapraz bağlayıcı eklemek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekrarlanabilir aktin düzenekleri üretmek için birçok husus vardır. Tekrarlanabilir, analiz edilebilir veriler üretmek için en kritik olanlardan biri, numune odasının kapak camı yüzeyidir. İn vitro aktin numunelerindeki proteinler, özellikle miyozin, son derece yapışkandır ve işlenmemiş veya kötü muamele görmüş cam yüzeylere yapışarak kullanılamaz bir numune oluşturur (Şekil 5A). Silinize bir lamel bir yağ yüzey aktif madde tabakası ile pasifleştiri.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todd Thorenson, Mike Murrell, Jennifer Ross, Patrick McCall ve Gardel ve Kovar laboratuvarlarının (Chicago Üniversitesi) diğer üyelerine, yöntemleri geliştirirken faydalı tartışmalar için teşekkür ederiz. M.A.C. ve S.R. kısmen Clemson Üniversitesi Mühendislik Koleji Bilgisayar ve Uygulamalı Bilimler Lisans Araştırma Fırsatı Hibeleri tarafından desteklenmiştir ve V. J.A., DBI ve EPSCoR programlarından sağlanan finansmanla NSF Ödülü #2349368 kapsamında Clemson Biophysics REU tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda kısmen NSF Ödülü #OIA-1655740 kapsamındaki Ulusal Bilim Vakfı EPSCoR Programı tarafından, kısmen ve kısmen de Cl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.6 mL mikrosantrifüj tüpüFisher Scientific05-408-123
008-Florosüraktif maddeRAN Biyoteknolojileri00115081361-6525Önceden karıştırılmış çözeltiye alternatif
008-RAN Biyoteknolojilerinde HFE7500 FloroYüzey Aktif Madde008-FloroYüzey Aktif Madde 008-FluoroSurfactant-2wtH-50GÖnceden karıştırılmış çözelti
2-merkaptoetanol (β-merkaptoetanol)Sigma Aldrich63689CAS Numarası: 60-24-2
Stok çözeltisi: MilliQ suda 25 mM, 4 &°C'de saklanır; C4
- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etan-sülfonik asit (HEPES)Sigma AldrichH3375CAS Numarası: 7365-45-9
5 dk EpoksiDevcon14250
Aktin Hücre İskeleti, Inc.AKL99-A>99% saf tavşan iskelet kası
(Saflaştırmaya alternatif)
Aktin (rodamin etiketli)Cytoskeleton, Inc.AR05-ATavşan iskelet kası
(Saflaştırmaya alternatif)
Adenozin 5&prim;-trifosfat (ATP)Sigma AldrichA6419CAS Numarası: 34369-07-8
Stok çözeltisi: MilliQ suda 25 mM, -20 °C'de saklayın; C
Hidrolizi önlemek için donmuş halde tutun
Kalsiyum Klorür (CaCl2)Sigma AldrichC5670CAS Numarası: 10043-52-4
Kapak Proteini (Fare)E.coli'de aşırı ekspresyondan saflaştırılmış HisTag
ile Stok çözeltisi: -80 °C'de protein tamponunda 20 mM; Sığır
karaciğerinden C KatalazSigma AldrichC9322CAS Numarası: 9001-05-2
Stok çözeltisi: 85 ku/mL, -20 ° C'de glikoz oksidaz ile saklanın; C
Kapak CamıFisherbrand12544CBorosilikat, #1.5, 24 mm x 40 mm
Fisherbrand değil Fisher En İyi
D-(+)-GlikozSigma AldrichG8270CAS Numarası: 50-99-7
Stok çözeltisi: MilliQ suda 225 mg/mL, -20 °C'de saklayın; C
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPCAS Numarası: 3483-12-3
Stok çözeltisi: MilliQ suda 1 M, -20 ° C'de saklayın; C
Çift Taraflı Bant3M3136
Etil alkolol 200 KorumalıPHARMCO111000200CAS Numarası: 64-17-5
200 kanıt
Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve asal;, N ve asal;-tetraasetik asit (EGTA)Sigma AldrichE3889CAS Numarası: 67-42-5
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma AldrichE9884CAS Numarası: 60-00-4
Glikoz OksidazSigma Aldrich345386CAS Numarası: 9001-37-0
Stok çözeltisi: MilliQ suda 135 mg / mL, -20 ° C'de katalaz ile aliquoted olarak saklayın; C
GliserolSigma Aldrich356352MCAS Numarası: 56-81-5
İmidazolFisher Biyoreaktifleri BP305-50CAS Numarası: 288-32-4
Magnezyum Klorür (MgCl2< / sub>)Fisher Bioreagents BP214CAS Numarası: 7786-30-3, 7791-18-6
MetilselülozSigma AldrichM0512CAS Numarası: 9004-67-5
15 centipoise
Mikroskop Slaytları Düz ElektronMikroskobu Bilimleri / Altın Mühür63710-05& nbsp; 3 "x1", 1 mm kalınlığında
MilliQ suKırlangıçCUFBI001Ultra saf su
Novec-7500 Mühendislik Sıvısı3M7100134816Önceden karıştırılmış çözeltiye alternatif
Potasyum Klorür (KCl)Sigma AldrichP3911CAS Numarası: 7447-40-7
Potasyum Fosfat (KPO4)Sigma AldrichP3786CAS Numarası: 7758-11-4
Tavşan İskelet Kası Aseton TozuPel-Freez Biologicals41995-1Aktini saflaştırırken kullanılır (satın almaya alternatif)
-80 ° C'de aktin Tamponu G'de yaklaşık 30 mM saklayın; C
Sodyum AzideSigma Aldrich71289CAS Numarası: 26626-22-8
Tetrametilrodamin-C6-maleimidAnaSpecAS-81445CAS Numarası: 174568-68-4 Aktini saflaştırırken kullanılır (satın almaya alternatif)
-80 ° C'de aktin Tamponu G'de yaklaşık 30 mM saklayın. Aktin etiketlenirken kullanılır (satın almaya alternatif)
Tris Hidroklorik Asit (Tris HCl)Sigma Aldrich648317CAS Numarası: 1185-53-1
Ultrasonik BanyoEmerson Branson 
CPX2800H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

Related Articles