Nörodejeneratif Hastalığın Klinik Öncesi Modelinde Eklem Kinematiğini İncelemek İçin İnce Bir Motor Görevi

Özet

Bu çalışma, makine öğrenimini kullanarak TgF344-AD sıçanı da dahil olmak üzere kemirgen modellerinde motor eksiklikleri incelemek için bir ince motor davranış testini açıklamaktadır.

Özet

Motor disfonksiyon, Alzheimer hastalığı (AD) ve ilgili demanslar gibi nörodejeneratif hastalıkların kritik, ancak genellikle yeterince takdir edilmeyen bir bileşenidir. Yeni araştırmalar, insanlarda ince motor davranış, görsel-uzamsal yetenek ve yürütme işlevini içeren görevlerin erken hastalık tespitinde potansiyele sahip olabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu görevlerin AD ile ilişkili bilişsel ve işlevsel gerilemeyi öngördüğü kesin mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Mevcut yöntemde, ücretsiz, açık kaynaklı makine öğrenimi yazılımı kullanılarak diğer nörodejeneratif hastalıklara ve normal yaşlanmaya göre AD'nin klinik öncesi modellerinde hastalık ilerlemesi boyunca motor yetenekteki değişiklikleri incelemek için bir ince motor görevi olan Kinematik Motor Yetenek Görevi (KINEMAT) oluşturulmuştur. Burada, Harmalin kaynaklı motor bozukluğu olan ve olmayan Fisher 344 CDF sıçanlarının pilot çalışmasında ince motor görevinin tasarımı, test edilmesi ve uygulanması ile kavram kanıtı oluşturulmuştur. Alzheimer hastalığı sıçan modeli (TgF344-AD) ile ek doğrulama, model fizibilitesini ve görev hassasiyetini daha da gösterdi. Sıçanlar, değişen zorluklarla üç kaseden birinden bir şeker peleti almak için odanın önündeki küçük bir yuvaya ulaşmak üzere eğitildi. Pelet alımı, üç sınıflandırmadan biri kullanılarak puanlandı: başarı (şeker peletini başarılı bir şekilde kapmak ve yemek), düşme (kapar ancak kavrandığında ödülü düşürür) veya başarısızlık (pelet tedarik edilmediği erişim, veya kavramaya çalışırken peletler kaseden atılır). Kontrol ve Harmalin ile tedavi edilen sıçanlar arasında motor yetenekte önemli farklılıklar gözlendi, bu da toplam erişimlerin azalması ve pençe poz değişkenliğinin artması ile gösterildi. TgF344-AD sıçanları ayrıca tüm kaselerde azalmış başarıların yanı sıra azalmış toplam erişimler gösterdi. Bunu kemirgenlerde ince bir motor görev olarak doğrularken, zamanla patoloji ve semptomlar ortaya çıktıkça, AD de dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların normal yaşlanma ve klinik öncesi modellerini incelemek için gelecekteki potansiyele sahiptir.

Giriş

Alzheimer hastalığı (AD) veya diğer alt tipler (örneğin, Lewy cisimcikli demans) nedeniyle demansı olan kişilerde motor fonksiyonun bozulduğu gösterilmiştir. Kavrama gücü ve yürüme hızı, bilişsel olarak bozulmuş ve bozulmamış yaşlı yetişkinler ^1,2 arasında ayrım yapabilir, ancak demansın farklı alt tipleri arasında mutlaka ayrım yapamaz (ör., düşük özgüllük)^1,2. Bu nedenle, davranış ve hastalık durumu arasındaki karmaşık kalıpları ve ilişkileri değerlendirmek için muhtemelen makine öğrenimi ile eşleştirilmiş erken demans için yeni tanı araçlarına ihtiyaç duyulmaya devam etmektedir ^3,4. Hayvan modelleri, erken hastalık başlangıcı, davranışsal korelasyonlar ve şiddet ile sunum arasında ayrım yapmak için makine öğrenimini analiz boru hatlarına entegre etmek için nörodejeneratif hastalıkların ilerlemesini araştırmak için değerlidir ^5,6,7.

İnsanlarda yeni davranışsal yöntemler, görsel-uzamsal yetenek ve yürütücü işlev gibi bilişsel işlemenin yanı sıra ince motor beceriyi de içeren görevleri tanımlamıştır ^8,9,10. Örneğin, fonksiyonel bir üst ekstremite görevi, nörodejenerasyon modellerini izleyebilir ve hafif bilişsel bozukluğu (MCI) AD'den ayırt edebilir. Bu görevde, insanlar çiğ barbunya fasulyesini (her seferinde iki tane) bir kaşık kullanarak merkezi bir ev bardağından hedef bir kaba taşırlar. Fasulyelerin kaşıkla elde edildiği görevin aşaması, fasulyelerin hedef bardağa^11,12 taşındığı fazdan daha güçlü biliş (özellikle görsel-uzamsal hafıza) ile daha güçlü ilişkiler gösterir. Kaşık bardağa girdiğinde, fincandaki fasulyeleri rahatsız edebilir, bu da katılımcının hareketlerinin görevi daha zor hale getirebileceği anlamına gelir. Ayrıca, deneme ilerledikçe ve ev fincanındaki fasulye sayısı azaldıkça, görev daha zor hale gelir (yani, fasulyeleri kaşıkla elde etme süresi artar)¹³. Bu görevin AD'ye özgü patoloji (amiloid)^9,14 ve nörodejenerasyon (hipokampal atrofi)^10,15 ile ilişkili olduğu gösterilmiştir, bu da performansının hastalık sürecinin erken dönemlerinde etkilenen nöral devrelere ve davranışsal süreçlere bağlı olabileceğini düşündürmektedir. Hareketin başlatılması, planlanması, yürütülmesi ve düzeltilmesinin, motor korteks de dahil olmak üzere beyinden geçen çeşitli bir ağ tarafından kontrol edildiği ve serebral kortekste bulunan üst motor nöronların hücre gövdelerinin omurilikteki alt motor nöronlar üzerinde sinapping yaptığı bilinmektedir¹⁶. Bu alt motor nöronlar, nöromüsküler kavşaktaki hareketi kontrol etmek için kaslarla doğrudan iletişim kurar. Yükselen yollar, periferden omuriliğe duyusal bilgi taşırken, beyin içindeki inen yollar, kaslara nasıl ve nerede geri dönüleceğine dair yön bilgisi iletir^17,18. Bu yolakların AD patolojisinden seçici olarak nasıl etkilendiğini anlamak, özellikle 3xTg-AD faresi ve TgF344-AD sıçanı da dahil olmak üzere genetik hayvan modelleri daha önce AD genlerinin hareketi, koordinasyonu ve diğer motor bozuklukları nasıl etkilediğini incelemek için kullanıldığından, hastalığın ilerlemesini anlamak için kritik öneme sahiptir ^19,20,21. Tipik olarak, bu görevler tüm vücut hareketiyle ilgili kaba motor bozukluklara odaklanır, ancak insanlarda motor eksiklikler çok daha değişkendir ve bu da kemirgenlerde tanımlanması zor olabilir²². Bu nedenle, bu değişkenliği yakalamak için insan ve hayvan modelleri arasındaki boşluğu kapatmak için yeni görevlere ihtiyaç vardır.

Motor bozukluklar ve titremelerde yaygın olarak rol oynayan bir beyin bölgesi beyinciktir²³. Beyincik, hassas ve koordineli hareketlerin önemli bir düzenleyicisidir ve bu istemli hareketi düzeltmek ve uyarlamak için inen yollar yoluyla geri bildirim sağlamak için duyusal bilgi işlemcisi görevi görür^24,25. AD'li bireylerde serebellar atrofinin tanındığına dikkat etmek önemlidir, ancak hipokampus gibi diğer bölgelerin aksine, serebellumda artmış amiloid birikimi artmış atrofi ile ilişkili değildir²⁶. AD patolojisinin ilerlemesi serebellumda farklı olmakla birlikte, serebellum ve hipokampus arasında MS^27,28,29'da muhtemelen bozulmuş olan multi-sinaptik çift yönlü bağlantılar vardır. Özellikle, serebellar tümör rezeksiyonu 30,31,32,33,34,35,36,37 sonrası hafıza eksikliklerinin meydana geldiği belgelendiğinden, beyincik ve hipokampus arasında fonksiyonel bağlantılar vardır. Kemirgenlerde, hipokampal yer hücreleri serebellar pertürbasyon ile bozulur³⁸. Hafıza, sosyallik ve motor kontroldeki bu örtüşen eksiklikler, bilişsel gerilemeden önce meydana gelen motor yollardaki potansiyel erken değişiklikleri ortaya çıkarmanın önemini vurgulamaktadır^30,31,38,39. Erken AH araştırmalarında ince motor görevlerin uygulanmasıyla, Alzheimer'ın geleneksel anlayışını basit bir bilişsel bozukluk olarak yeniden şekillendirmeye başlayabilir ve tanı çabalarını, hastalığın ilerlemesini öngörebilecek ve bilişsel olarak bozulmuş ve bozulmamış yaşlanan bireyler arasında daha büyük ölçüde ayırt edilebilir olabilecek erken motor değişikliklere yönlendirebiliriz.

İnce motor davranışın beyin yapısındaki değişikliklerin göstergesi olabileceğini anlamak için, yukarıda açıklanan insan görevinin kemirgen bir versiyonu oluşturuldu ve test edildi. Bu kemirgen görevi KINEMAT (KINEmatic Motor Ability Task) olarak adlandırılmıştır ve görevin tüm aşamalarında tutarlı pelet yerleştirmenin bir sonucu olarak tek bir peletin bir kaide veya merdivenden alınmasını ve daha basit puanlamayı gerektiren önceki ulaşma görevlerinden sapmaktadır 40,41,42,43,44,45,46^{, 47,48}. Bu ince motor ulaşma görevi, yeni puanlama yöntemlerini, çeşitli zorluklara sahip çanakları ve insan muadilini taklit etmek için kendi kendini rahatsız eden özellikleri, pelet hareketi ve ardından tasarımın merkezinde yer alan katılımcı stratejisi ayarlamalarını içerir. Bu görev, makine öğrenimi araçlarını, Sosyal LEAP Hayvan Pozlarını Tahmin Ediyor (SLEAP) ve anahtar nokta-MoSeq 49,50'yi kullanarak ince motor yeteneğin ve ulaşma davranışlarının tarafsız ve nicel bir ölçümüne olanak tanır. Kemirgenlerde 44,45,51 vasıflı ulaşma görevleri için diğer dikkate değer hesaplama modelleri geliştirilmiş olsa da, keypoint-MoSeq, hareketin ve kavrama pozlarının⁵⁰ hassas bir şekilde ölçülmesine izin vermek için gürültüyü ortadan kaldırır. Görev performansı ve motor öğrenme stratejisi, Harmaline⁵² kullanılarak tipik ve motor bozulmuş sıçanlarda yüksek performanslı bir yapay görme kamerası kullanılarak yeniden yapılandırıldı. Harmalin, inferior olivary çekirdeğini hiperaktive eder ve glutamaterjik tırmanma lifleri yoluyla serebellar fonksiyonu bozar ^53,54. Ek olarak, ince motor kabiliyet TgF344-AD sıçanlarının bir alt kümesinde incelenmiştir. Bu nedenle, ince motor görevinin, Harmalin ile tedavi edilen ve TgF344-AD sıçanlarında, bir kavram kanıtı olarak tipik muadillerine göre ölçülebilir bozukluklar bulması bekleniyordu. Bu protokol, ince motor görevin oluşturulmasını, hayvanların eğitilmesini ve test edilmesini ve SLEAP ve keypoint-MoSeq kullanılarak ulaşma davranışının ölçülmesini açıklar.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Arizona Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Odanın tasarımı ve inşası

1. Şeffaf, akrilik panelleri hazırlayın. Kutunun şemaları https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask adresinde yer almaktadır. Şeffaf akrilik panelleri aşağıdaki boyutlarda kesin (tüm paneller 1 cm kalınlığındadır):
   1. İki yan paneli kesin: 26 cm × 22 cm.
   2. Bir üst panel kesin: 27 cm × 12 cm.
   3. İlk alt paneli kesin: 26 cm x 10 cm
   4. İkinci alt paneli kesin: 26 cm x 11 cm
   5. Ön panelin kesimi: 20 cm × 11 cm.
   6. Arka paneli kesin: 20 cm x 12 cm
   7. Bir ön panel yuvası (140 mm x 12 mm) kesin. Yuvayı, alt kenarı panelin alt kısmıyla aynı hizada olacak şekilde merkeze yerleştirin.
   8. Bir iç oluk kesin: 1 cm. Yan panellerin iç kenarlarında, ön panelin güvenli bir şekilde içeri ve dışarı kaymasını sağlamak için bir girinti veya oluk oluşturun.
      NOT: Kaydırma özelliği gerekli değilse, yapıyı basitleştirmek için ön panel kalıcı olarak yapıştırılabilir.
   9. Peletlerin düştüğünde düşmesine izin vermek için ikinci alt panele eşit aralıklı delikler (5 mm çapında) delin. Delikleri ızgara şeklinde 1 cm aralıklarla yerleştirin.
2. Hazneyi yapıştırıcı ile birleştirin (Şekil 1A).
   NOT: Akrilik malzemeler için özel olarak tasarlanmış güçlü, şeffaf bir yapıştırıcı kullanın.
   1. Yan paneller: Alt panelin kenarları boyunca sürekli bir yapışkan çizgi uygulayın. Yan panelleri dikey olarak konumlandırın ve sıkıca bastırın. Yapıştırıcının üretim talimatlarına göre kürlenmesine izin verin.
   2. Arka panel: Yan ve alt panellerin arka kenarlarına yapıştırıcı sürün. Arka paneli konumlandırın ve yerine bastırın.
   3. Üst panel: Yan ve arka panellerin üst kenarlarına yapıştırıcı sürün. Üst paneli yerleştirin ve sıkıca bastırın.
   4. Ön panel: Ön paneli, sıkı ama pürüzsüz bir uyum sağlamak için yan panellerdeki oluklara dikkatlice kaydırın veya ön panelin kenarları boyunca yapıştırıcı sürün ve yan, üst ve alt panellere sabitleyin.
      1. Panelin hareketini test edin ve odanın geri kalanıyla tam olarak hizalandığını onaylayın.
3. Kurulum aydınlatması
   1. Kızılötesi (IR) ışığı, odaya bakacak şekilde test odasının karşı ucuna yerleştirin. Işığı aşağı yansıtmak için haznenin üzerine bir sayfa beyaz inşaat kağıdı yerleştirin.
      NOT: Aydınlatma, doğru izleme için kritik öneme sahiptir ve tüm kayıtlar karanlık bir odada IR ışığı altında yapılmalıdır.
4. Eğitim kabını hazırlayın.
   1. Bir 3D yazıcı kullanarak 31 mm yarıçaplı ve 32 mm uzantılı eğitim kasesini üretin. https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask'da mevcut STL dosyası (Şekil 1B: üstte)
   2. Antrenman kasesini haznenin altına, doğrudan yuvanın önüne takın. Kaseyi, tahta parçası gibi destekleyici bir stand kullanarak, üst kenarı hazne içindeki farenin göz seviyesinin kabaca üzerinde olacak şekilde konumlandırın.
5. Test kaselerini hazırlayın (Şekil 1B: orta ve alt).
   1. Sağlanan STL dosyalarını kullanarak kaseleri yazdırın. İki farklı kase tasarımı sağlanmıştır: "Düz-Less" ve "Plinko". (https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. Boyutsal doğruluk ve dayanıklılık açısından kontrol edin (Boyutlar: 50 mm derinlik x 40 mm genişlik).

2. Bilgisayar ve kamera donanımı

1. Kamerayı güvenli bir şekilde monte etmek için bir tripod kullanın.
2. Kamerayı haznenin ön panelinden yaklaşık 15-20 cm uzağa yerleştirin.
   1. Tripod yüksekliğini ve açısını, kamera hem yuvanın hem de kasenin izometrik, 45°'lik bir görüntüsünü yakalayacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Kameranın görüş alanının sıçan pençesini ve tam erişimi, yuvayı ve eğitim veya test kasesini kapsadığından emin olun. Optimum görünürlük elde etmek için gerekirse farklı açıları ve mesafeleri test edin.
3. Davranışsal kayıtlar (https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk) için kamerayla eşleştirmek üzere yazılımı indirin ve davranışı kaydetmek için kamerayı kullanmak üzere yazılımı açın.
   1. Aşağıdaki fotoğraf makinesi ayarlarını kullanın: çekim modu: sürekli, kare hızı: 216 Hz, pozlama modu: zamanlı, otomatik pozlama: kapalı, pozlama süresi: 4430 μs, kazanç otomatik: kapalı, kazanç: 16,85 dB, gama: 0,8.
   2. Kayıt ayarları aşağıdaki gibidir: H264 dosya türü, 5 milyon (5.000.000) bit hızı.
   3. 10 dakika boyunca kayıt yapmak için 130.000 kare girin ve kaydetmek için akış modunu kullanın.
      NOT: Veri depolamak için en az 16 GB RAM ve 1 TB dahili katı hal sabit sürücüsüne sahip özel bir makinenin kullanılması önerilir.

Şekil 1: İnce motor görevinin şeması. (A) Bir farenin bir şeker peleti elde etmek için bir yuvadan ulaştığı ince motor görevinin karikatür temsili. Erişimler, makine öğrenimi analizi için kaydedilir. Kullanılan üç ayrı kase vardır: (sol altta) antrenman kasesi, (alt ortada) Düz/Az kase ve (sağ altta) kırmızı daire içine alınmış engelleri olan Plinko kasesi. (B) (Üst) eğitim kasesi, (orta) Düz/Az kase ve (alt) Plinko kase dahil olmak üzere her kase tasarımının şemaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Hayvan hazırlama

1. Hayvanların en aktif olduğu zamanları test etmeye izin vermek için Fisher 344 CDF sıçanlarını (erkek ve dişi, >3 aylık) ters ışık/karanlık döngüsünde eşleştirin (en azından).
2. Alışkanlığın başlamasından 1 hafta önce tüm kemirgenleri tartın ve hayvanları vücut ağırlığının% 90'ında tutmak için 300 g'dan daha ağır bir kemirgen için ~ 30 g ve 100-300 g kemirgen için ~ 15 g yiyecek sağlayın.
   1. Günlük olarak fareleri tartın ve yiyeceği buna göre ayarlayın, kemirgen vücut ağırlığının% 90'ına ulaşana kadar günde 1-2 g sağlanan yiyecek miktarını azaltın. Günlük kullanım, hayvanların deneyciye alışmasına da yardımcı olacaktır.
   2. Alışkanlık ve test boyunca, ağırlık eşiğin altına düştüğünde veya aştığında yiyecekleri +/- 0,5 g ayarlayarak bu prosedüre devam edin.
   3. Test sırasında, görev başlamadan önce hayvanları tartın, ardından görevin tamamlanmasının ardından kafese döndükten hemen sonra tahsis edilen yiyeceği sağlayın.
      NOT: 1-2 gün içinde herhangi bir ani kilo kaybı (% >15) altta yatan bir soruna işaret edebilir ve bir veterinere danışılmalıdır.

4. Alışkanlık (2 gün)

1. IR ışığını, kamerayı ve bilgisayarı açın.
2. Peletli eğitim kabını açılış yuvasına yerleştirin ve kasenin ucunun aparatın içine hafifçe uzandığından emin olun (başlangıçta yaklaşık 2 cm).
3. Kafesleri test odasına aktarın ve farelerin 5 dakika boyunca alışmasına izin verin.
4. 1. Gün: Odaya çift evli fareler ekleyin ve 20 dakika boyunca keşfetmelerine izin verin. Farelerin peletlere aşina olmasını sağlamak için test sonrası ev kafesine 3-5 şeker peleti yerleştirin.
   NOT: 45 mg'lık pelet boyutu, tek bir pelet alımına izin verir.
5. Hazneyi fareler arasında dezenfektan bir mendille temizleyin. Günün sonunda, dezenfekte etmek için etanol ile püskürtün.
6. 2. Gün: Aynı prosedürü kullanarak kemirgenleri ayrı ayrı cihaza alıştırın (20 dakika). Kemirgenler korkulu görünüyorsa veya cihazın ve kasenin önünden kaçınıyorsa, bu davranış düzelene kadar alışkanlık yapmaya devam edin. Ev kafesinde peletleri ödül olarak vermeye devam edin (3-5 pelet).
   1. Kaseye aşinalığı ve yaklaşımı teşvik etmek için, uzun tüpü alışkanlık boyunca aşamalı olarak aparat kapağına doğru hareket ettirin ve ulaşmayı kolaylaştırmak için ucu kemirgene her seferinde 0,5 cm daha yakın hareket ettirin.
      NOT: Alıştırma, test etme ve eğitim, yeni çevrenin etkisini ortadan kaldırmak için kırmızı ışık altında aynı yerde yapılmalıdır.

5. Şekillendirme (10 gün)

1. IR ışığını, kamerayı ve bilgisayarı açın.
2. Kafesleri odaya aktarın ve farelerin 5 dakika boyunca alışmasına izin verin.
3. Eğitim kasesini kullanarak, uzatma boyunca 1-5 pelet sağlayın ve uzatma ilk gün tamamen aparatın içine yerleştirildi. Hayvanları 10 dakikalık seanslarda eğitin. Şekillendirme sırasında kayıt isteğe bağlıdır.
   NOT: Kemirgenleri peletlerle tanıştırmak için, kasedeki peletlere karşı isteksizliği azaltmak için aparatın içinde birkaç şeker peleti sağlamak önemlidir. Kemirgenler, kolayca temin edilebilecekleri ve kasedeki bu peletleri tanıyacakları için muhtemelen aparat içindeki peletleri yiyeceklerdir. Cihazın doğru yönüne bakmaya alışmaları ve kaseye dokunmaya alışmaları önemlidir.
4. Eğitimin sonraki günlerinde, kase uzantısını cihazdan geri çekmeye başlayın. Bu, kemirgenlerin öndeki aparat açıklığına yaklaşmasını ve aparatın hemen dışındaki uzantı ile etkileşimi teşvik etmesini gerektirecektir.
   1. Tasarım, peletlerin özel olarak yerleştirilmesine izin verir. Örneğin, peletleri kemirgene en yakın kasenin ucuna yerleştirin ve kemirgenin cihazdan dışarı çıkmasını teşvik etmek için yavaş yavaş uzaklaşın.
5. Kemirgenler, uzantıların kenarından pelet almak daha rahat hale geldikçe, sadece ağızdan bile olsa, ulaşma davranışını teşvik etmek için cımbız yoluyla peletleri sokmaya başlayın.
   1. Cihazın hemen dışındaki cımbızda bir pelet tutun ve kemirgenlerin cımbıza kolayca dokunmasına izin verin. Daha fazla ulaşmayı teşvik etmek için bu davranışı hemen ödüllendirin.
   2. Kemirgenler cımbıza dokunmak için daha rahat hale geldikçe, cımbızı cihaz açıklığından biraz daha uzakta tutarak pelete dokunmak veya kavramak için aparatın biraz daha dışına ulaşmalarına izin verin.
      NOT: Tüm hayvan davranışları hakkında, özellikle de hayvanlar kaseden korkuyorsa veya kaseye ulaşamıyorsa, not alın. Bu hayvanların ek şekillendirme günlerine ihtiyacı olabilir.
6. Kemirgenler en az 3 gün boyunca sürekli ve bağımsız olarak ulaştıklarında (Şekil 2A), ulaşma davranışı oluşana kadar Düz kaseye geçiş yapın (günde en az 10 bağımsız erişim ile 3 gün boyunca sürekli uzanma).
   1. Kemirgenleri Düz kaseye sokarken, kemirgenlerin kasenin kenarındaki peletleri görebilmesi için kasenin mümkün olduğunca peletlerle doldurulduğundan emin olun.
      NOT: Bu aşamada cımbız kullanarak teşvik edici erişimler gerekebilir.
7. Hazneyi fareler arasında dezenfektan bir mendille temizleyin. Günün sonunda, dezenfekte etmek için etanol ile püskürtün.

6. Test için hazırlanın:

1. Test 9 gün boyunca tamamlanır (Şekil 2A), her kemirgen kase başına 3 deneme gerçekleştirir ve her 10 dakikalık deneme ardışık günlerde gerçekleşir.
   NOT: Test en iyi sabah yapılır.
2. Testin her gününde, fareleri tartın. Tamamlandıktan sonra, fareler testten önce 30-60 dakika boyunca ev kafeslerinde bırakılır, çünkü tartım strese neden olabilir ve ulaşma davranışını engelleyebilir.
3. Bilgisayarı açın ve kaseyi kurun. Kamerayı ve ışığı prize takın. Kayıt yazılımını açın ve kamera ayarlarını protokolün 2. bölümünde belirtildiği gibi yapın.
   NOT: Tüm pençe hareketlerini yakalamak için saniyede en az 200 kare (fps) kaydetmeniz önerilir.
4. Kaseyi kameranın çerçevesine hizalayın ve oynat düğmesine basarak kayıt yazılımında görselleştirin. Kaseyi, cihaz ve kamera ile aynı hizada, kasenin yan tarafına 45° açıyla yerleştirin.
   1. Tek tek rakam ve avuç içi hareketinin yanı sıra uzanma sırasında avucun kase üzerindeki yüksekliğiyle ilgili hareketi incelemek için uzanmayı doğrudan kafa kafaya yakalamak için kamerayı hareket ettirin.
   2. Kaseye gidiş ve dönüş kol ve el hareketlerini yakalamak için kamerayı kaseye doğrudan dik olarak yerleştirin, ancak rakam yerleşimini veya kavrama davranışıyla ilgili ayrıntıları değil.
      NOT: x, y ve z düzlemleri boyunca hareketi yakalamak için 45°'lik bir açı önerilse de, diğer yapılandırmalar istenen etüt için bilgileri daha kolay yakalayabilir.

7. Test (9 gün)

1. Fareleri 1 saat boyunca alışmak için odaya yerleştirin.
2. İlk kaseyi kase platformuna yerleştirin ve diş mumu ile sabitleyin. Kasenin ön tarafının aparat açıklığı ile aynı hizada ve ortalandığından emin olun.
3. Spinview içindeki video dosyasını fare kimlik numarası, kayıt tarihi ve kayıt saati ile adlandırın.
4. Fareyi aparatın içine yerleştirin. Kapağı kapatın ve ışığı saptırmak için beyaz kartı üstüne yerleştirin.
5. Bu noktada, uygun sahnenin yakalandığından emin olmak için kamera açısını iki kez kontrol edin ve ortalanmamışsa kaseyi ayarlayın.
6. Kaseye doğru miktarda pelet dökün ve Kaydı Başlat'a basın.
   1-3. Gün Düz kase: ~100 pelet
   4-6. Gün Daha az kase: ~50 pelet
   7-9. Gün Plinko kasesi: ~50 pelet
7. Fareyi sürekli olarak izlemek için test boyunca odada kalın, performans ve davranışa ulaşma konusunda notlar alın ve doğru miktarı korumak için gerektiği kadar pelet ekleyin.
   1. Düz kase için, kemirgenlerin kasenin kenarındaki peletleri görebildiğinden ve peletlerin her zaman elde edilebildiğinden emin olun (yani, peletler azaldıkça ve peletler katmanlandıkça deneme boyunca kaseyi doldurun).
   2. Daha Az kase için: peletlerin üst üste istiflenmediğini ve peletler arasında biraz boşluk olduğunu kontrol edin, bu da sıçan ulaşmaya çalıştığında dağılmalarına izin verir.
   3. Plinko kasesi için: engeller arasında erişilebilir olacak kadar pelet olduğundan emin olun.
8. Hayvanı ev kafesine geri koyun ve tahsis edilen yiyeceği sağlayın. Hazneyi fareler arasında dezenfektan bir mendille temizleyin.
9. Günün sonunda, ertesi güne hazırlanmak için tüm odayı dezenfekte etmek için etanol püskürtün.
   NOT: Hem erkek hem de dişi kemirgenleri test ediyorsanız, cinsiyetleri sabahın erken saatlerinde test edilen bazı dişiler ve bazı erkeklerle ve daha sonra test edilen benzer bir karışımla dengelediğinizden emin olun. Tüm deney boyunca test edicilerin sırasını koruyun.

Şekil 2: İnce motor görevini yerine getiren sıçanların eğitimi ve test edilmesi. (A) Deneyin zaman çizelgesi. Sıçanlar iki gün boyunca cihaza alıştırıldı, daha sonra 10 gün boyunca şekillendirme prosedürlerine tabi tutuldu. Hayvanlar, her kasede üç gün boyunca üç kasede de ince motor kabiliyeti açısından test edildi. Daha sonra hayvanlara Harmalin enjekte edildi ve üç gün boyunca her kasede tekrar test edildi. (B) Sıçanlara (n = 6) şekillendirme prosedürleri sırasında iki farklı kase (eğitim kabı ve Düz) uygulandı ve erişimleri iyileştirmek için kase tipi 5. günde değiştirildi. Kriterlere ulaşmak için 10 gün boyunca şekillendirmede önemli bir artış oldu (F(9, 45) = 13.5, p < 0.001). Gri çubuk, orijinal ve mevcut uzatılmış tüp eğitim kabı arasındaki geçişi belirtir. (C) Her üç kaseyi de test etmek için, 9 günlük test boyunca toplam erişimlerde önemli bir fark vardı (F (8, 32) = 3.74, p = 0.003). Not: Sıçan 2 şekillendirildikten sonra çıkarılmıştır. Plinko kasesi, Less (p = 0.001) ve Düz kase (p = 0.027) arasında önemli farklılıklara neden oldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

8. Harmaline kullanarak ince motor bozulmasının modellenmesi

NOT: Motor bozuklukların ince motor görevde ince motor yetenek ve performans üzerindeki etkilerini belirlemek için, sıçanlara monoamin oksidaz-A'nın geri dönüşümlü bir inhibitörü olan ve alt zeytini hedefleyen bir β-karbolin alkaloidi olan Harmalin (10 mg / kg) enjekte edildi 52,55,56,57. Kemirgen modellerindeki harmalin, duruş ve dengeyi etkiler, ince motor koordinasyonu sınırlar ve üst ekstremitelerde motor bozulmaya neden olur.

1. Uygun Harmalin dozunu hesaplamak için fareleri tartın.
2. Sıçanların 1 saat boyunca test odasına alışmasına izin verin.
3. Bilgisayarı açın ve kaseyi kurun. Kamerayı ve ışığı prize takın. Kayıt yazılımını açın ve kamera ayarlarını protokolün 2. bölümünde belirtildiği gibi yapın.
4. Kemirgenlere Harmalin (10 mg / kg, ip) enjekte edin.
5. 15 dakika sonra, peletleri uygun kaseye dökün ve kayda başlayın. Fareyi 3 gün boyunca her kasede test edin.
   1. Gün Düz kase: ~100 pelet
   2. Gün Daha az kase: ~50 pelet
   3. Gün Plinko kasesi: ~50 pelet
   NOT: Enjeksiyondan sonra 3 saate kadar cilt tahrişi, ağrılı davranışlar, ataksi, hipotermi ve duruş değişiklikleri dahil olmak üzere enjeksiyon bölgesini anormallikler açısından izleyin. 3 saatlik pencereleri takiben, yemek veya içmek için gecikmeler veya herhangi bir kalıntı titreme dahil olmak üzere davranıştaki herhangi bir değişikliği izlemeye devam edin.

9. Makine öğrenimini kullanarak video analizi

NOT: Veri toplama ve video kaydının ardından, erişimler elle sayıldı ve şu şekilde puanlandı: Başarı (peleti alın ve tüketin), Damlalar (peleti alır ancak peleti tüketmeden önce düşürür), Başarısızlık (pelet alınamıyor). Bu elle puanlanan veriler, makine öğrenimi analizi için temel gerçek veriler olarak kullanıldı.

1. https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask'da özel Python kodu kullanılarak, erişim performansındaki değişiklikleri belirlemek için Baseline ve Harmalin ile tedavi edilen hayvanlar arasında karşılaştırmalar yapıldı (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6).
2. Erişim yörüngesi, pençe konformasyonu ve pozisyonu ve çeşitli çanak türleri arasında erişim stratejisindeki değişiklikler dahil olmak üzere ulaşma davranışının eklem kinematiğini analiz etmek için, ücretsiz ve açık kaynaklı makine öğrenimi yazılımı Social LEAP Estimates Animal Poses'u (SLEAP) kullanın (daha kapsamlı bir açıklama ve açık kaynaklı programı kullanmaya yönelik adım adım kılavuz için^{https://sleap.ai/ bakın 49}).
   NOT: SLEAP⁴⁹ https://github.com/talmolab/sleap adresinden indirilebilir.
3. Yeni bir proje açın ve ulaşma görevinin 3 videosunu ekleyin.
4. 15 düğümden oluşan bir iskelet oluşturun: 1 üst kol, 1 bilek, 1 avuç içi merkezi, 4 taban, 4 boğum ve 4 parmak ucu düğümü (iskeleti https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask'dan indirin).
5. Düğümler arasına, üst kol bileğe, ardından avuç içi merkezine bağlanacak şekilde kenarlar ekleyin. Avuç içi merkezinden, taban, mafsal ve parmak ucu düğümlerini, avuç içi merkezi her zaman başlangıç düğümü olacak şekilde bağlayın (Şekil 7A).
6. Antrenmanı çalıştırmadan önce en az 50 kare etiketleyin. Burada yeni bir model eğitebilir veya github'da centered ve centroid için modeller kullanılabilir: https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.
7. Model eğitildikten sonra yeni bir video açın ve çıkarımı çalıştırın: trackin.match: açgözlü, n_instances:1, tracking.clean_instance_count: 1, tracking.target_instance_count: 1, tracking.pre_cull_to_target: 1.
   Not: Çıkarım, yerel bir kümede bash betiği olarak çalıştırılabilir. İzlenen videoların düzeltilmesi gerekebilir (düzeltme talimatları için https://sleap.ai/ bakın).
8. Düğümleri daha fazla analiz etmek ve ortak kinematikteki gruplar arasındaki farkları anlamak için ücretsiz ve açık kaynaklı keypoint-MoSeq^50'yi kullanın (indirme ve kullanım talimatlarıyla ilgili ayrıntılar için https://github.com/dattalab/keypoint-moseq bakın).
9. Keypoint-MoSeq⁵⁰ kullanarak ayrı davranış heceleri oluşturun (Şekil 7B). Kase başına Harmaline ve Baseline koşulları arasındaki geçiş sıklığını, olasılığını ve geçiş sıklığındaki değişiklikleri haritalamak için ek analiz yapın (Şekil 7C, D). Analiz kodu için https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask bakın.

Şekil 3: Kaselere ulaşma ve tedavideki değişiklikler. (A) Temel (n = 5) testi için, 3 kasenin tamamında, toplam erişimlerde önemli bir fark vardı (H(df) = 8.48, p = 0.014, Kruskal-Wallis), Plinko kase tipi ile daha fazla erişim meydana geldi (p = 0.011, Bonferroni düzeltmesi ile Post-hoc Dunn testi). (B) Harmalin (n = 5) pertürbasyonu kase tipleri arasında farklılıklara neden olmadı. Hatalar şu şekilde bildirilir: S.E.M. *p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Koşullar arasında ve çanak türleri arasında performansın karşılaştırılması. (A) Temel test sırasında anlamlı bir kase (F (2) = 5.78, p = 0.007) ve sonuç farkı (F (2) = 3.92, p = 0.029) vardı. Kase tipi daha zor hale geldikçe ulaşma girişimleri arttı, ancak harmalin durumundaki tüm kaselerde erişimler taban çizgisinden azaltıldı. (B) Harmalin ile tedavi edilen sıçanlarda kaseler arasındaki erişim sayıları için hiçbir fark bulunmadı. (C) Performansa göre analiz edildiğinde temel test sırasında önemli bir sonuç farkı vardı (F(2) = 2.07, p < 0.001). (D) Harmalin ile tedavi edilen sıçanlarda kase veya sonuç performansı açısından hiçbir fark bulunmadı. Hatalar S.E.M. olarak bildirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Temel ve Harmaline koşullarının karşılaştırılması. (A) Koşullar arasında performans başarısı açısından hiçbir fark yoktu. (B) Başarısızlık sayıları için, Başlangıç ve Harmalin koşulları arasında anlamlı bir fark vardı (H (df) = 4.85, p = 0.028, Kruskal-Wallis) ve Harmalin koşulunda anlamlı bir etki bulundu (p = 0.028, Bonferroni düzeltmesi ile Post-hoc Dunn testi). Hatalar S.E.M. olarak bildirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Öğrenme ve ulaşma oranları. (A) Harmalin hayvanları, temel koşula kıyasla tedirgin bir öğrenme oranına sahipti (t-stat = 2.833, p = 0.022). (B) Dakika başına toplam erişim için, kase (daha az) ve durum (harmalin) (F(1,5) = 9.83, p = 0.002, karışık doğrusal model) ve kase (plinko) ve durum (harmalin) arasında anlamlı bir etkileşim vardı (F(1,5) = 22.67, p < 0.001, karışık doğrusal model). Harmaline, taban çizgisine kıyasla tüm kase türlerinde dakika başına toplam erişimleri azalttı (Daha az: p = 0.01, Plinko: p < 0.001). Hatalar şu şekilde bildirilir: S.E.M. *p < 0.05, ***p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Makine öğrenimi, benzersiz pozları ve görev stratejisini tanımlar. (A) SLEAP kullanılarak etiketlenmiş sıçan pençesindeki düğüm konumları. (B) Ulaşma sırasında keypoint-MoSeq ile tanımlanan hece örnekleri. (C) Ardışık heceler arasındaki bigram geçiş frekansları matrisi. Geçiş olasılıkları, toplam bigram sayısı ile normalleştirilir. (D) Harmaline ve Baseline arasındaki hece geçiş farklılıklarını karşılaştıran bir geçiş grafiği. Grafiğin düğümleri heceleri temsil eder ve kenarlar aralarındaki geçişleri gösterir. Daha belirgin kenarlar, daha yüksek frekanslı hece geçişlerini gösterir. Kırmızı bağlantılar, Harmalin ile tedavi edilen hayvanlarda yukarı regüle edilmiş bir geçişi gösterirken, mavi bir bağlantı, aşağı regüle edilmiş bir geçişi gösterir. Kırmızı daireler yukarı regüle edilmiş kullanımı gösterirken, mavi bir daire, Harmaline ile tedavi edilen hayvanlarda belirtilen hecenin aşağı regüle edilmiş kullanımını gösterir. Frekansı 0.005'ten az olan hece çiftleri hariç tutuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Sıçanlar vücut ağırlığının %90'ı gıda kısıtlamasına ulaştıktan sonra 2 gün odaya alıştırıldı, ardından 1-2 hafta şekillendirme işlemlerine tabi tutuldu. Başarılı, bırakılan ve başarısız erişimlerin sayısı, her koşula kör olan eğitimli bir gözlemci tarafından puanlandı. 9 gün boyunca (Başlangıç), sıçanlar 3 farklı kase konfigürasyonunda (Düz, Daha Az ve Plinko) ince motor kabiliyeti için test edildi. Daha sonra, aynı sıçanlara (grup başına n = 5, hastalık nedeniyle kase şekillendirme eğit...

Tartışma

Kemirgenler için ulaşma görevleri genellikle tek peletlerle sınırlıdır ve nörodejeneratif patolojisi olan hastalar için yaygın mücadeleler olan tıkanıklıkları veya kendi kendini rahatsız eden özellikleri içermez. Burada sunulan yöntem, hem yeniden tasarlanmış bir pelet ulaşma görevini hem de makine öğrenimini kullanarak, bireysel basamak hareketlerine ek olarak poz özelliklerinin ve geçişlerin analizi yoluyla hem koordinasyonu hem de stratejiyi algılayabilir. Burada oluşturulan ince moto...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3D baskı materyali	Amazon (Uvertür)	B07PGY2JP1	PLA Filament 1.75 mm PLA 3D Yazıcı Filamenti, Boyutsal Doğruluk +/- 0.03 mm
Kamera	Edmond Optikleri	BFS-U3-13Y3M-C	1.3 MP, Mono, 170 FPS, ON Yarı PYTHON 1300 x2
Kamera kabloları	Edmond Optikleri	ACC-01-2300	USB 3.1, 3 m, Type-A'dan Micro-B'ye (Kilitli) Kablo
Kamera lensi	Thor laboratuvarları	MVL5WA	4.5 mm EFL, F/1.4, 1/2" Format Makine Görüşü Lensi
Kameradan tripoda bağlantı	Edmond Optikleri	88-210	Kameranın tripoda bağlantısı
Temizleme mendilleri	Amazon (Sani-Cloth)	B00KMZ7KMO	AF3 Yüzey Dezenfektan Temizleyici Mendil Kutusu Hafif Koku 160 Ct P13872
Bilgisayar	Dell	Hassasiyet	Intel Core i7-13700 @ 2.1 GHz, NVIDIA T1000 8 GB, RAM 16 GB
IR ışık	Amazon (Serliyum)	B0BJFDBT44	Kamera IR Light 48 LED IR Aydınlatma Işıkları Su Geçirmez Kızılötesi Gece Görüşü Güvenlik için Güvenlik CCTV Kamerası ve nbsp;
Panel yapıştırıcı	Amazon (Sdintar)	B0B1DLRPNZ	Cam yapıştırıcı
Plexiglass	Amazon (TOOLINHAND  ABD)	B0BRJ1L8TR	12 & Times; 12" Şeffaf Döküm Akrilik/Pleksiglas Levhalar - Şeffaf 1/8" Kalın (3 mm)
Python	Python Yazılım Vakfı	Python 3.7
Spinview	Teledyne Teknolojileri	Sürüm 3.1.0.79
Şeker peletleri (45 mg)	Bioserv	F0023	45 mg, Aromasız 50.000/kutu; İçerikler: Sukroz, Dekstroz, Magnezyum Steat, Kalsiyum Silikat, Mineral Yağ
Tripod	Amazon (YOUYI)	B086PYJF9D	Amazon Esnek Masa Kamera Üçadı'
Cizbit	Güzel Bilim Araçları	11064-07	İris Pensetleri
Wax	Amazon (Ortomekanik)	B00FKDC0UU	Gerçek Orthowax