Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sprague-Dawley (SD) Sıçanlarından Primer Retinal Müller Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68129

⸱

17 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Sichuan Province Ophthalmopathy Prevention & Cure and Visual Function Protection with TCM Laboratory, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Retinal Image Technology and Chronic Vascular Disease Prevention & Control and Collaborative Innovation Center, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ophthalmology, Ziyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Ophthalmology, Ineye Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Bu makale, neonatal Sprague-Dawley (SD) sıçanlarından primer retinal Müller hücrelerinin izole edilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Prosedür, göz kürelerinin enükleasyonunu, retina dokusunun diseksiyonunu, hücrelerin çıkarılmasını ve tanımlanmasını ve sonraki hücre kültürü için temel hususları içerir.

Özet

Retinal Müller hücreleri (RMC'ler), retina içinde yapısal destek sağlamada ve çeşitli işlevleri düzenlemede çok önemli bir rol oynar. Retinal mikroçevrenin temel bir bileşeni olarak, RMC'ler birkaç hayati işlevi yerine getirir. Bol miktarda iyon kanalları, ligandlar, reseptörler, transmembran taşıyıcılar ve enzim sistemleri aracılığıyla bu hücreler, nörotransmitter ve trofik faktör sekresyonuna katkıda bulunur, retina metabolizmasını düzenler ve su iyonu homeostazını korur. Özellikle, RMC'ler son zamanlarda endojen retinal rejeneratif kök hücrelerin önemli bir kaynağı olarak tanımlanmıştır ve retinal dejeneratif hastalıkların tedavisi için yeni terapötik hedefler sunmaktadır. Bu nedenle, RMC'leri incelemek, retina bozukluklarının altında yatan patolojik mekanizmaları anlamak için gereklidir. Bu çalışma, tripsin sindirimi ve primer RMC'lerin saflaştırılmasını, ters optik mikroskopi ve hematoksilen ve eozin (HE) boyaması kullanılarak morfolojik gözlemi, immünofloresan boyama yoluyla spesifik protein tanımlamasını ve akış sitometrisi yoluyla hücre saflığı analizini içeren standart bir deneysel protokolü sistematik olarak oluşturmaktadır. Bu protokol, RMC'lerle ilgili hem temel araştırmalar hem de klinik uygulamalar için değerli bir referans görevi görür, retina hastalıklarında mekanizmalarının araştırılmasını destekler ve terapötik stratejilerin geliştirilmesini ilerletir.

Giriş

Retinadaki baskın makroglia olan retinal Müller glial hücreleri (RMC'ler), retinal nörovasküler üniteninçekirdeğini oluşturur 1,2. Neredeyse tüm retina kalınlığını kaplayan RMC'ler hemen hemen tüm retina nöronlarını ve mikrovasküler sistemi kaplar. İşlemleri, apikal uç ayaklar oluşturan iç sınırlayıcı zara (ILM) yukarı doğru uzanır ve aşağıya doğru dış sınırlayıcı zara (OLM) kadar uzanır ve burada özel mikrovilluslar3 geliştirirler. Bu benzersiz mimari, RMC'lerin retina organizasyonu 4,5 için birincil yapısal iskele olarak işlev görmesini sağlar.

RMC'ler iyon kanalları, ligandlar, reseptörler, transmembran taşıyıcılar ve enzimler6 ile zenginleştirilir ve glikoliz7 yoluyla retinal glukoz metabolizmasına katılırlar. Potasyum iyon kanalları (Kir2.1, Kir4.1) ve su kanalı proteinleri (AQP4, AQP9, AQP11), retinal fizyolojik dengeyi koruyarak hücre zarı boyunca iyon ve su homeostazını işbirliği içinde düzenler7. Ek olarak, RMC'ler glutamat, γ-aminobütirik asit (GABA) ve glisin 7,8 dahil olmak üzere nöronlar tarafından salınan nörotransmiterleri emer ve temizler.

Diyabetik retinopati7, glokom9 ve retinitis pigmentosa10 gibi patolojik durumlar RMC'lere zarar verebilir, kan-retina bariyerini bozabilir, iltihabı tetikleyebilir, vasküler geçirgenliği artırabilir ve retina fonksiyonunu bozabilir. RMC'ler ayrıca retinal rejeneratif hücrelerin gizli içsel kaynakları olarak kabul edilmektedir11,12. Balıklarda ve bazı amfibilerde, RMC'ler, yaralanma nedeniyle kaybedilen nöronların yerini alan retinal progenitör hücrelere farklılaşabilir13. Yetişkin memeli retinalarında, RMC'ler kök hücre ile ilgili işaretleyici proteinleri14,15 eksprese eder, bu da onlara retinal nöronlara farklılaşma ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu, glokom ve diyabetik retinopati gibi dejeneratif hastalıklarda hasarlı hücrelerin yerini alma potansiyeli verir16. Primer RMC'ler in vivo durumlarını yakından taklit eder ve retinal dejeneratif hastalıkların incelenmesinde ve tedavisinde çok değerlidir. Bununla birlikte, literatür, özellikle neonatal Sprague-Dawley (SD) sıçanlarından primer RMC'leri izole etmek ve kültürlemek için az sayıda yerleşik yöntem içermektedir.

Bu protokolde cinsiyet tercihi olmaksızın 3-5 günlük neonatal SD sıçanlar kullanılır. Steril koşullar altında, gözbebekleri enüklee edilir ve retina dokusu tripsin kullanılarak sindirilir. Birincil RMC'ler daha sonra sonraki kültür ve pasaj için santrifüjleme ve saflaştırma yoluyla izole edilir. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama ile birlikte ters optik mikroskopi kullanılarak yapılan morfolojik analiz, izole edilen hücrelerin karakteristik RMC özellikleri sergilediğini ortaya çıkardı. İmmünofloresan boyama, glutamin sentetaz (GS), hücresel retinaldehit bağlayıcı protein (CRALBP), Vimentin, aquaporin-4 (AQP4) ve içe doğrultucu potasyum kanalı 4.1 (Kir4.1) dahil olmak üzere RMC'ye özgü protein belirteçlerinin ekspresyonunu doğruladı. GS ve CRALBP antikorları ile etiketlemeden sonra akış sitometrik analizi, RMC bazlı biyolojik deneyler için belirlenen kriterleri karşılayan ve sonraki fonksiyonel çalışmalar için uygunluğu sağlayan %≥90'lık bir hücre saflığı gösterdi. Deneysel süreç sırasında, dördüncü geçitteki hücreler, kültür şişesine daha az bağlılık, morfolojik değişiklikler ve yaşlanma belirtileri gösterdi ve sonuçta hücre ölümüne yol açtı. Bu nedenle, sonraki deneylerde sadece ilk üç pasajdaki hücreler kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin ARVO Beyanı'na uygun olarak yürütülmüş ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi (Etik Numarası: 2024069) tarafından onaylanmıştır. Çalışmada elli spesifik patojen içermeyen (SPF) Sprague-Dawley sıçan (3-5 günlük, cinsiyet belirtilmemiş, vücut ağırlığı 7-10 g) kullanıldı. Hayvanlar ticari olarak elde edildi ve standart laboratuvar koşulları altında Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nde (Tesis Kullanım Lisansı No.: SYXK [Sichuan] 2024-049) barındırıldı. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Birincil RMC'lerin izolasyonu ve kültürü

  1. Deney maddelerinin hazırlanması
    1. Aşağıdaki öğeleri kullanmadan önce temiz tezgahta en az 30 dakika ultraviyole ışık altında sterilize edin: T25 kültür şişeleri, santrifüj tüpleri ve rafları, pipetler ve sehpalar, sıvı atık kapları, çakmaklar, ispirto alkol lambaları ve işaretleyiciler.
    2. Kullanmadan önce aşağıdaki öğeleri otoklavlayarak sterilize edin: 1 mL pipet uçları, bükme plakası, kapaklı cam Petri kapları, kavisli cımbız, 45 μm naylon ağ (300 göz), dişli cımbız, dişsiz cımbız ve mikro kornea makası.
  2. Çevresel hazırlık: Göz küresi diseksiyonu için çevreyi ve ameliyat masasını ultraviyole ışıkla 30 dakikadan fazla dezenfekte edin. Temiz tezgaha girmeden önce ve çıktıktan sonra her seferinde deneyi yapan kişinin ellerine alkol püskürtün. İnkübatörü 37 °C ve %5 CO2'ye ayarlayın. Kuluçka makinesini açmadan önce ve sonra deneycinin ellerine alkol püskürtün.
  3. Çözelti hazırlama: D-Hank çözeltisi, fosfat tamponlu salin (PBS), Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM yüksek glikoz), fetal sığır serumu (FBS, ısıyla inaktive edilmiş), penisilin / streptomisin çözeltisi (100x) ve% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi.
    NOT: Kullanmadan önce DMEM ve FBS'yi 37 °C su banyosunda ısıtın.
    1. Sırasıyla 10 mL D-Hank veya PBS çözeltisine 100 μL penisilin / streptomisin çözeltisi ekleyerek% 1 penisilin / streptomisin içeren D-Hank ve PBS çözeltilerini hazırlayın.
    2. 10 mL yüksek glukozlu DMEM'e 100 μL penisilin / streptomisin çözeltisi ve 2 mL FBS ekleyerek tam kültür ortamını hazırlayın.
      NOT: Solüsyonları laboratuvar temizliğinde bir tezgahta hazırlayın ve mümkünse hemen kullanın. Tüm kültür ortamını 4 ° C'de saklayın ve her kullanımdan önce 37 ° C'ye ısıtın. Bir haftadan fazla saklanırsa atın.
  4. Göz kaldırma
    1. Neonatal SD sıçanları, kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek sterilize edilmiş bir tezgah üzerinde servikal çıkık (CO2 boğulması olmadan) ile ötenazi yapın. Dezenfeksiyon için vücutları 5 dakika boyunca% 75 alkole batırın, ardından steril kavisli bir tabağa aktarın.
    2. D-Hank'in solüsyonunu iki adet 10 cm'lik cam kültür kabına dökün.
    3. Göz küresini ortaya çıkarmak için palpebral fissür boyunca göz kapağını yırtmak için dişli cımbız kullanın.
    4. Orbitali aşağı bastırmak için açık ve palpebral fissüre paralel tutulan dişsiz cımbız kullanın. Optik sinire ulaşıldığında ve göz küresi açığa çıktığında, göz küresini kaldırmak ve çıkarmak için cımbızı kapatın.
    5. Göz küresini D-Hank solüsyonu ile bir cam kültür kabına koyun, durulayın ve taze D-Hank solüsyonu ile başka bir kaba aktarın.
      NOT: Göz küresinin sağlam kaldığından emin olun. İdeal olarak, retina dokusunun ayrılmasını kolaylaştırmak için optik sinirin bir kısmı bağlı kalmalıdır.
  5. Retina diseksiyonu
    1. Sterilize edilmiş, kapaklı boş bir kültür kabı hazırlayın ve mikroskobu ayarlayın.
    2. Adım 1.4.5'teki cam kültür kabını mikroskobun altına yerleştirin. Korneayı açığa çıkarmak için kornea ile optik sinir arasındaki bölgeyi nazikçe sabitlemek için kavisli oftalmik mikro forseps kullanın.
    3. Mikro kornea makası kullanarak korneoskleral bileşkeyi delin. Limbus boyunca dairesel bir şekilde kesin, ardından yaklaşık 2 mm uzunluğunda simetrik skleral kesiler yapın. Forsepsleri serbest bırakın ve optik sinir ile skleranın birleştiği yerde yeniden kelepçeleyin.
    4. Optik sinir kökünün yakınına hafifçe bastırmak için ikinci bir forseps kullanın ve basıncı kornea-optik sinir arayüzüne doğru yönlendirin. Lens dokusu göründüğünde, dikkatlice çıkarın ve retina dokusu ortaya çıkana kadar bastırmaya devam edin.
      NOT: Yanlışlıkla retina dokusunun çıkarılmasını önlemek için lensi dikkatlice çıkarın.
    5. Ayrılan retina dokusunu forseps kullanarak başka bir steril kültür kabına aktarın. Çanağın üzerini örtün, üzerine alkol püskürtün ve temiz tezgahın üzerine koyun.
  6. Birincil RMC'lerin çıkarılması
    1. Temiz tezgah havalandırma anahtarını açın.
    2. Kültür kabı kapağını açın. Retina dokusunu küçük parçalara ayırmak için yaklaşık 15 kez yukarı ve aşağı pipetlemek için 1 mL uçlu bir pipet kullanın. 1 mL %0.25 tripsin ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
    3. Kültür kabını inkübatörden çıkarın ve temiz tezgahın üzerine yerleştirin. 2 mL tam ortam ekleyin ve sindirimi durdurmak için hafifçe pipetleyin.
      NOT: Sindirimi sonlandırmak için tripsin hacminin iki katı kullanın. Örneğin, 1 mL tripsin kullanılmışsa, 2 mL tam ortam ile sonlandırın.
    4. Hücre süspansiyonunu 300 gözenekli bir naylon elekten 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. Çanağı hazırlanmış PBS ile yıkayın ve kalan süspansiyonu toplayın.
    5. Tüpü oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 878 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve atın. Peleti 2 mL tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri saflaştırmak için 878 x g'da 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    6. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın. Hücreleri 2 mL tam ortamda yeniden süspanse edin. Önceden her bir T25 şişesine 3 mL tam ortam ekleyin, ardından 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Şişeyi çapraz şekilde sallayın ve inkübatöre yerleştirin.
    7. İlk ortam değişimini 48 saatlik inkübasyondan sonra gerçekleştirin. Şişeyi inkübatörden çıkarın ve temiz tezgahın üzerine yerleştirin. Harcanan ortamı atın ve hücreye yapışan yüzeyi 1 mL PBS ile üç kez yıkayın.
      1. 5 mL taze tam ortam ekleyin. Hücre birleşmesi %90'ı aşana kadar ortamı her gün değiştirmeye devam edin, ardından alt kültürlemeye devam edin.

2. RMC'lerin Geçişi

NOT: Birleşme %90'ı aştığında hücreleri geçirin. Bu protokolde, birincil kültürler tipik olarak izolasyondan 5-6 gün sonra pasaj gerektirir. İlk geçişin zamanlaması, kaplama yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir. Hücre yoğunluğunu 4 x 103 hücre / mL'ye ayarlayın ve hücreleri T25 kültür şişelerine tohumlayın. 3-4 gün sonra izdiham %>90'a ulaştığında, geçişe devam edin.

  1. T25 kültür şişesini inkübatörden çıkarın. Kültür ortamını atın ve hücreleri% 1 penisilin / streptomisin içeren 1 mL PBS çözeltisi ile üç kez yıkayın.
  2. Şişeye 1 mL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 1 dakika ve 30 saniye inkübe edin.
  3. Şişeyi ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler yuvarlak, ayrılmış göründüğünde ve yüzmeye başladığında, şişeyi inkübatörden çıkarın. Temiz tezgaha aktarın ve sindirimi sonlandırmak için 2 mL tam kültür ortamı ekleyin.
  4. Hücre süspansiyonunu aspire etmek için bir pipet kullanın. Kalan yapışkan hücreleri çıkarmak için şişe duvarına hafifçe pipetleyin.
  5. Tüm hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Şişe duvarını %1 penisilin / streptomisin içeren 2 mL PBS ile durulayın ve aynı tüpe ekleyin. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 878 x g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı atın. Hücre peletini uygun bir hacimde tam ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri gerektiği gibi 1:2 veya 1:3 oranında geçirin.
    NOT: Aşağı akış deneyleri için 2. geçitteki (P2) hücreleri kullanın (Şekil 1).

3. Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyama

  1. Tohum geçişi 2 (P2) hücreleri, oyuk başına 2 x 105 hücre yoğunluğunda önceden yerleştirilmiş steril lameller içeren 6 oyuklu bir plakada. Her oyuğa 2 mL tam kültür ortamı ekleyin. Hücreler yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını atın ve her bir kuyuyu 1 mL PBS ile iki kez nazikçe durulayın.
  2. Her oyuğa 1 mL% 4 paraformaldehit fiksatif ekleyin ve hücreleri sabitlemek için 30 dakika inkübe edin. Sabitleyiciyi atın ve hücreleri 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  3. Her oyuğa 1 mL hematoksilen boyası ekleyin ve 15 dakika inkübe edin. Boyama solüsyonunu atın ve kuyuları 1 mL PBS ile 2-3 kez durulayın.
  4. Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Hematoksilen lekesi çok koyu görünüyorsa, fazla sitoplazmik lekeyi ayırt etmek ve çıkarmak için% 1 hidroklorik asit alkol kullanın. 1 mL PBS ile 2-3 kez yıkayın.
  5. Her oyuğa 1 mL eozin boyama solüsyonu ekleyin. Mikroskop altında lekelenmeyi yaklaşık 30 saniye veya istenen renk yoğunluğu elde edilene kadar gözlemleyin. Kuyuları 1 mL PBS ile 2-3 kez durulayın. Lamelleri nötr reçine kullanarak slaytlara monte edin.

4. İmmünofloresan boyama

  1. Oyuk başına 2 x 105 hücre yoğunluğunda önceden yerleştirilmiş steril lameller içeren 6 oyuklu bir plakadaki tohum P2 hücreleri. Her oyuğa 2 mL tam kültür ortamı ekleyin.
    1. Hücreler yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını atın. Lameli çıkarın ve bir boyama kavanozuna koyun. Lameli her seferinde 5 dakika olmak üzere 1 mL PBS ile üç kez yıkayın.
  2. Hücreleri kaplamak için yaklaşık 50 μL geçirgenlik çözeltisi (Triton X-100: PBS = 1: 200) ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, ardından her seferinde 5 dakika olmak üzere 1 mL PBS ile üç kez yıkayın. Yaklaşık 50 μL% 3 BSA bloke edici çözelti ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  3. Engelleme solüsyonunu yavaşça atın. Slaytı kaplamak için PBS'de hazırlanan yaklaşık 200 μL primer antikor çözeltisi ekleyin: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) veya Vimentin (1:200). Lameli nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  4. Lameli her seferinde 5 dakika olmak üzere 1 mL PBS ile üç kez yıkayın.
  5. Yaklaşık 200 μL FITC etiketli keçi anti-tavşan IgG ikincil antikoru17 ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 50 dakika inkübe edin. Lameli her seferinde 5 dakika olmak üzere 1 mL PBS ile üç kez yıkayın.
  6. Çekirdekleri DAPI ile 10 dakika boyayın. Her seferinde 5 dakika olmak üzere 1 mL PBS ile üç kez yıkayın.
  7. Slayta bir damla solmaya karşı koruma sağlayan montaj ortamı ekleyin. Lameli hücre tarafı aşağı bakacak şekilde monte edin. Kapatın ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin.

5. Akış Sitometrisi

  1. Akış sitometrisi boyama tamponu kullanarak hücre konsantrasyonunu 1.0 x 107 hücre / mL'ye ayarlayın.
  2. Tek hücreli süspansiyonun 100 μL'sini koşul başına iki ayrı numune tüpüne ayırın. Bir tüpü negatif (lekesiz) kontrol olarak belirleyin.
  3. Her tüpe 100 μL geçirgenlik ortamı A (ticari olarak elde edilen kitten, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Yavaşça karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  4. Her tüpe 3 mL önceden soğutulmuş akış sitometrisi boyama tamponu ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  5. Her tüpe 100 μL geçirgenlik ortamı B (ticari olarak elde edilen kitten) ekleyin ve karıştırmak için girdap yapın. Belirlenen numune tüplerine 0.1 μL CRALBP antikoru ve karşılık gelen tüplere 0.8 μL GS antikoru ekleyin. Negatif kontrol tüpüne herhangi bir antikor eklemeyin. Karanlıkta 4 °C'de 30-60 dakika inkübe edin.
  6. Her tüpe 3 mL akış sitometrisi boyama tamponu ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  7. Her tüpü 100 μL akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Her CRALBP lekeli tüpe 1 μL FITC konjuge keçi tavşan önleyici IgG (H & L) ve her GS lekeli tüpe 1 μL PE konjuge keçi tavşan önleyici IgG (H & L) ekleyin. Negatif kontrol tüpüne herhangi bir antikor eklemeyin. Karanlıkta 4 °C'de 30-60 dakika inkübe edin.
  8. Her tüpe 3 mL akış sitometrisi boyama tamponu ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  9. Her tüpü 300 μL akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Hemen akış sitometrisi analizine devam edin; alternatif olarak, 500 μL% 1 -% 4 paraformaldehit içinde yeniden süspanse edin, karanlıkta 2-8 ° C'de saklayın ve 24 saat içinde analiz edin.
  10. Akış sitometrisi yazılımını kullanarak negatif ve pozitif örnekleri analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Birincil hücreler kültür şişesine tohumlandıktan sonra, sonraki ortam değişiklikleri ve pasaj, zayıf yapışan RMC'leri ortadan kaldırmaya ve pasgeçirme sırasında oluşan hücresel kalıntıları gidermeye yardımcı olur, böylece kültürdeki RMC popülasyonunu zenginleştirir. RMC'ler, ters optik mikroskop (Şekil 1) ve hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması (Şekil 2) kullanılarak morfolojilerine göre tanımlandı. Protein ekspresyonunu gözl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, primer RMC'leri neonatal SD sıçanlardan izole etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Protokol, deney öncesi hazırlıklar, göz küresi enükleasyonu, retina dokusu izolasyonu ve RMC ekstraksiyonu, kültür, paslama ve tanımlama için adım adım prosedürler dahil olmak üzere tüm aşamaları kapsar. Ayrıca, ilgili araştırmalar için standartlaştırılmış teknik rehberlik sunarak, tüm hücre kültürü süreci boyunca gözlemlenmesi gereken temel hususları vurgular.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarların bu makalenin içeriği ile ilgili bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sichuan İl Doğa Vakfı Fonu (2023NSFSC0690) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.1 Triton X-100SolarbioT8200
% 0.25 Tripsin-EDTAHidroklonu SH30042.01B
% 1 hidroklorik asit alkolüBIOSYSTEMS3803651E%
4 ParaformaldehitSolarbioP1110
45μ m naylon örgü (300 ağ)SolarbioYA0926
6 oyuklu plakaServicebioIMC202302001
6 cm Cam Petri KabıNormax5058541
%75 AlkolKESHIGEA004
Aquaporin-4 (AQP4)Proteintech Group, Inc16473-1-AP
BSAServicebioGC305010
Hücre kültürü inkübatörüTermoFORMA311
hücresel retinaldehit bağlayıcı protein (CRALBP)HUABOIHA721330
SantrifüjHunan XiangyiTDZ5-WS
Temiz tezgahZHICHENGZHJH-C12
Kornea makasıJinzhongBXGJ
DAPISolarbioG1012
D-Hank çözümüSolarbioH1045
DMEM  yüksek glikozlu ortamGibcoC11995500BT
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sbjbio yaşam BilimleriBC-SE-FBS01
DÜZELTME & PERM Medium AMultiSciencesGAS006/2
DÜZELTME & PERM Medium BMultiSciencesGAS006/2
akış sitometrisi boyama tamponuMultiSciencesS1001
Fluoromount-G Floresan montaj ortamıSourthernBiotech0100-01
Glutamin Sentetaz Poliklonal AntikorProteintech Group, IncPTG-11037-2-AP-50ul
Keçi 324 Anti-Tavşan IgG H & L PEBiossbs-0295G-PE
Keçi Anti-323 Tavşan IgG H & L FITCBiossbs-0295G-FITC
Hematoksilen-eozin (HE) boyama kitiSolarbioG1120
yüksek basınçlı dezenfeksiyon makinesizealway (xiamen) enstrüman IncGI80DS
Ters floresan mikroskobuNikon & nbsp;
Ters faz kontrast mikroskobuLeica DMIL
içe doğrultucu potasyum kanalı 4.1 (Kir4.1)Proteintech Group, Inc12503-1-AP
Nötr reçineSolarbioG8590-100
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (100 kez;)HycloneSV30010
Fosfat Tampon salin (PBS) (pH7.2- 7.4)SolarbioP1020-500ml
İkincil antikor (FITC etiketli keçi anti-tavşan)ServicebioGB22303
Sprague-Dawley sıçanları Chengdu Dashuo Deney Hayvanları Co., Ltd.Üretim Lisans No.: SCXK [Sichuan] 2020-0030
T25 Kültür şişesiCornning 
Kasırga Tüpleri: 15mLWHB ve nbsp;WHB-15-1
Kasırga Tüpleri: 50mLWHB WHB-50-1
ultraviyole dezenfeksiyon sterilizatörüGEMEISIxd06
VimentinAbcamab92547
SMZ1500430639

Kaynaklar

  1. Bringmann, A., Pannicke, T., Grosche, J., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  2. Kugler, E. C., Greenwood, J., MacDonald, R. B. The "neuro-glial-vascular" unit: The role of glia in neurovascular unit formation and dysfunction. Front Cell Dev Biol. 9, 732820(2021).
  3. Reichenbach, A., Bringmann, A. Glia of the human retina. Glia. 68 (4), 768-796 (2020).
  4. Subirada, P. V., Paz, M. C., Ridano, M. E., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. Eur J Neurosci. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  5. Wang, J., O'Sullivan, M. L., Mukherjee, D., et al. Anatomy and spatial organization of Müller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
  6. Beverley, K. M., Pattnaik, B. A. Inward rectifier potassium (Kir) channels in the retina: Living our vision. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (3), C772-C782 (2022).
  7. Lai, D., Wu, Y., Shao, C., et al. The role of Müller cells in diabetic macular edema. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (10), 8(2023).
  8. Coughlin, B., Schnabolk, G., Joseph, K., et al. Systemic complement inhibition reduces intraocular inflammation and retinal cell death in murine models of glaucoma. J Neuroinflammation. 16, 212(2019).
  9. Alarcon-Martinez, L., Shiga, Y., Villafranca-Baughman, D., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  10. Strong, S., Liew, G., Michaelides, M. Retinitis pigmentosa-associated cystoid macular oedema: Pathogenesis and avenues of intervention. Br J Ophthalmol. 101 (1), 31-37 (2017).
  11. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).
  12. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. J. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).
  13. Norrie, J. L., et al. Latent epigenetic programs in Müller glia contribute to stress and disease response in the retina. Dev Cell. 60 (8), 1199-1216.e7 (2025).
  14. Too, L. K., Gracie, G., Hasic, E. Adult human retinal Müller glia display distinct peripheral and macular expression of CD117 and CD44 stem cell-associated proteins. Acta Histochem. 119 (2), 142-149 (2017).
  15. Bhatia, B., Jayaram, H., Singhal, S. Differences between the neurogenic and proliferative abilities of Müller glia with stem cell characteristics and the ciliary epithelium from the adult human eye. Exp Eye Res. 93 (6), 852-861 (2011).
  16. Grigoryan, E. N. Cell sources for retinal regeneration: Implication for data translation in biomedicine of the eye. Cells. 11 (23), 3755(2022).
  17. Dong, S., Li, X., Chen, Z. MMP28 recruits M2-type tumor-associated macrophages through MAPK/JNK signaling pathway-dependent cytokine secretion to promote the malignant progression of pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 60(2025).
  18. Vardimon, L., Ben-Dror, I., Havazelet, N. Molecular control of glutamine synthetase expression in the developing retina tissue. Dev Dyn. 196 (4), 276-282 (1993).
  19. Xu, Q. A., Boerkoel, P., Hirsch-Reinshagen, V. Müller cell degeneration and microglial dysfunction in the Alzheimer's retina. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 145(2022).
  20. Bunt-Milam, A. H., Saari, J. C. Immunocytochemical localization of two retinoid-binding proteins in vertebrate retina. J Cell Biol. 97 (3), 703-712 (1983).
  21. Masri, R. A., et al. Immunohistochemistry and spatial density of Müller cells in the human fovea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 46(2025).
  22. Kolesnikov, A. V., Kiser, P. D., Palczewski, K. Function of mammalian M-cones depends on the level of CRALBP in Müller cells. J Gen Physiol. 153 (1), e202012675(2021).
  23. Xue, Y., Shen, S. Q., Jui, J. CRALBP supports the mammalian retinal visual cycle and cone vision. J Clin Invest. 125 (2), 727-738 (2015).
  24. Pereiro, X., Beriain, S., Rodriguez, L. Characteristics of whale Müller glia in primary and immortalized cultures. Front Neurosci. 16, 854278(2022).
  25. Tran, T. L., Bek, T., Holm, L. Aquaporins 6-12 in the human eye. Acta Ophthalmol. 91 (6), 557-563 (2013).
  26. Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (2), 42-47 (2015).
  27. Zeng, Q., Xia, X. B. Study on the differentiation of retinal ganglion cells from rat Müller cells in vitro. Yan Ke Za Zhi. 46 (7), 615-620 (2010).
  28. Backstrom, J. R., et al. Phenotypes of primary retinal macroglia: Implications for purification and culture conditions. Exp Eye Res. 182, 85-92 (2019).
  29. Liu, X., Tang, L., Liu, Y. Mouse Müller cell isolation and culture. Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).
  30. Pereiro, X., et al. Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice Müller glia in order to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 14 (7), (2020).
  31. Wang, M., Ma, W., Zhao, L. Adaptive Müller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. J Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  32. Tomaszewski, R., Gad, M. S., Negoita, P. Isolation of primary mouse retinal glial Müller cells. J Vis Exp. (210), e66237(2024).
  33. Li, Q., Cheng, Y., Zhang, S. TRPV4-induced Müller cell gliosis and TNF-α elevation-mediated retinal ganglion cell apoptosis in glaucomatous rats via JAK2/STAT3/NF-κB pathway. J Neuroinflammation. 18 (1), 271(2021).
  34. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  35. Reichenbach, A., Wolburg, H., Richter, W. Membrane ultrastructure preservation and membrane potentials after isolation of rabbit retinal glial (Müller) cells by papain. J Neurosci Methods. 32 (3), 227-233 (1990).
  36. Harstad, H. K., Ringvold, A. Scanning and transmission electron microscopy of Müller cells isolated from rabbit retina. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 223 (1), 29-34 (1985).
  37. Guidry, C. Isolation and characterization of porcine Müller cells. Myofibroblastic dedifferentiation in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (5), 740-752 (1996).
  38. Qiu, A. W., Wang, N. Y., Yin, W. J. Retinal Müller cell-released exosomal miR-92a-3p delivers interleukin-17A signal by targeting Notch-1 to promote diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 1(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Primer H cre K lt rRetinal DiseksiyonTripsin SindirimiSprague Dawley S anlarmm nofloresan BoyamaAk SitometrisiHematoksilin Eozin BoyamaGlutamin SentetazRetinal K k H creler
Sprague-Dawley (SD) Sıçanlarından Primer Retinal Müller Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.