Method Article

Dekontamine Balgam Örneklerinde Hedeflenen Yeni Nesil Dizileme için Matris Tabanlı DNA Ekstraksiyonu

DOI:

10.3791/68147

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Biology and Human Genetics, SAMRC Centre for TB Research, DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical TB Research, Department of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 2National Health Laboratory Service, Green Point Tuberculosis Laboratory, 3Division of Medical Microbiology, Department of Pathology, University of Cape Town, 4Division of Medical Microbiology, Department of Pathology, University of Cape Town, 5Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, University of California, San Diego, School of Medicine, 7Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), Campus Biotech

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium tuberculosis'in aşağı akış hedefli yeni nesil dizilemesi için manyetik boncuk saflaştırması ile birleştirilmiş matris tabanlı bir ekstraksiyon yöntemi kullanarak dekontamine balgamdan DNA ekstraksiyonu için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni nesil dizileme (NGS) artık zamanında ve doğru ilaca dirençli tüberküloz (DR-TB) teşhisi için güçlü bir araç olarak kabul edilmektedir. Hedefli NGS (tNGS), ilaç direnci ile ilişkili belirli genlere odaklanarak, haftalar arasında değişen geri dönüş süreleri ile geleneksel kültür tabanlı yöntemlere olan ihtiyacı atlayarak kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunar. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), özellikle kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda tedaviyi yönlendirmek ve tedavi sonuçlarını iyileştirmek için tüberküloz (TB) teşhisini iyileştirmek için değerli bir strateji olarak tNGS'yi önermiştir. DSÖ tarafından önerilen tNGS testleri arasında, hızlı ve kapsamlı ilaç duyarlılık testi, soy belirleme ve suş tiplemesi sağlayan bir yöntem seçtik. Standartlaştırılmış DNA ekstraksiyon yöntemleri mevcut olsa da, bunlar zaman alıcı ve emek yoğun olabilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, manyetik boncuk saflaştırma ile birlikte basitleştirilmiş, matris tabanlı bir DNA ekstraksiyon protokolünü optimize ettik. Bu yöntem, DNA'nın doğrudan dekontamine edilmiş balgam çökeltilerinden çıkarılması için hızlı ve verimli bir yaklaşım sunar ve hızlı aşağı akış tNGS analizine olanak tanır. Balgam tortusundan DNA ekstraksiyon sürecini düzene sokarak, bu protokol rutin klinik ortamlarda tNGS'nin daha geniş çapta benimsenmesini kolaylaştırabilir, sonuçta hasta sonuçlarının iyileştirilmesine katkıda bulunabilir ve küresel TB kontrol çabalarına katkıda bulunabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2023 yılında dünya çapında tahmini 3,7 milyon tüberküloz hastası teşhis edilmedi ve tedavi edilmedi ve bu da tüberkülozun küresel sağlık için oluşturduğu önemli tehdidi vurguladı1. DSÖ, 2023 yılında yaklaşık 400.000 kişinin rifampisine dirençli (RR-TB) veya çoklu ilaca dirençli TB (MDR-TB) geliştirdiğini tahmin etmektedir1. TB ve DR-TB'nin hızlı bir şekilde teşhis edilmesi ve tedavi edilmesi, TB insidansını ve mortalitesini azaltmaya yönelik kilometre taşlarına ve hedeflere ulaşmak için çok önemlidir1.

Konvansiyonel kültür yöntemlerine ve fenotipik ilaç duyarlılık testine (pDST) güvenmek, klinik izolatların ve tedavinin direnç profilinin belirlenmesini geciktirir, geri dönüş süreleri 6-8 haftadır ve karmaşık biyo-muhafaza altyapısı gerektirir. Rutin tanı testleri, DR-TB'nin NGS'si ile kombinasyon halinde, kapsamlı bir ilaç direnç profili sağlayabilir ve ÇİD-TB rejimlerinin kişiselleştirilmesini iyileştirebilirken, aynı zamanda etkili tedavi süresini haftalar veya aylardan günlere indirebilir 2,3,4.

2023 ve 2024'te DSÖ, birinci ve ikinci basamak anti-TB ilaçlarına duyarlılığı hızlı bir şekilde belirlemek için tNGS'nin yeni bir tanı sınıfı olarak kullanılmasını önerdi5. Bu, onu biyogüvenlik seviye 3 (BSL-3) laboratuvarlarında Mycobacterium tuberculosis (MTB) kültürüne ihtiyaç duymadan tedavi kararlarına rehberlik etmek için değerli bir araç haline getirir. Bir tNGS yaklaşımı, dizilemeden önce ilaca direnç kazandıran gen hedeflerini amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanan yoğunlaştırılmış bir dizileme şeklidir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından önerilen tNGS testleri arasında, rifampisin, izoniazid, etambutol, pirazinamid, florokinolonlar, amikasin, streptomisin, linezolid, bedaquilin ve klofazimine direnç tespiti için sınıf bazlı kriterleri karşıladığı bildirilen Deeplex Myc-TB testini seçtik. Bu testi, bu protokol kullanılarak ekstrakte edilen DNA'nın aşağı akış tNGS'si için uygunluğunu değerlendirmek için kullanıyoruz.

Ek olarak, DSÖ, MTB'de ilaç direnci ile ilişkili mutasyonlar kataloğunun 2. baskısını yayınlayarak, ilaç duyarlılığını tahmin etmek ve tedaviye rehberlik etmek için tüm genom dizileme (WGS) ve tNGS'nin kullanımı için bir yol haritası sağlamıştır6. Yakın zamanda yapılan bir sistematik inceleme ve meta-analiz, tNGS'nin, pDST7'ye

figure-introduction-1

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Stellenbosch Üniversitesi'nde Araştırma Etik Kurulu: Biyolojik ve Çevresel Güvenlik (REC: BES): BES-2024-25384 ve İnsan Araştırmaları Etik Kurulu: N21/09/093 ve N09/11/296 tarafından onaylanmıştır.

1. Balgam tortusu numunesi hazırlama

NOT: Aşağıdaki adımlar, DNA ekstraksiyonundan önce bir biyogüvenlik seviyesi üç (BSL3) laboratuvarında gerçekleştirilmelidir.

  1. 500 μL-2 mL'yi 1.5 mL veya 2 mL'lik düşük bağlı bir tüpe aktararak daha önce N-asetil-L-sistein (NALC) ve sodyum hidroksit (NaOH) (NALC/NaOH) kullanılarak dekontamine edilmiş balgam tortu örneğinin bir alikotunu hazırlayın.
  2. Balgam tortu örnekleri içeren tüpleri bir tüp rafına dik olarak yerleştirin ve örnekleri 80 °C'de bir fırına koyun ve mikobakterileri ısıl işlemle etkisiz hale getirmek için 1 saat inkübe edin.
  3. 1 saat sonra, numunelerin bulunduğu tüp rafını çıkarın, tüp yüzeylerini silin ve bunları biyogüvenlik seviyesi iki (BSL2) laboratuvarına taşınmak üzere uygun bir kaba koyun.
    NOT: Daha fazla işlem veya saklamadan önce numunelerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

2. Matris süspansiyonu ve yüksek hızlı homojenizatör kullanılarak DNA ekstraksiyonu (Şekil 2)

  1. Başlamadan önce, 1,5 veya 2 mL vidalı kapaklı tüplere, gevşek kapaklı tüplere ve otoklava (ideal olarak DNA ekstraksiyonundan en az bir gün önce) 2 mm çapında üç cam boncuk ekleyin.
  2. Matris süspansiyonunu buzdolabından çıkarın ve reaktifi oda sıcaklığına getirmek ve reaktifi karıştırmaya başlamak için manyetik bir karıştırıcıya (reaktif şişesine bir mıknatıs dahildir) yerleştirin.
  3. Isıtma bloğunu açın ve 56 °C'ye ısıtın (iki ısıtma bloğu varsa, ikincisini 100 °C'ye ısıtın.
    NOT: Aşağıdaki adımlar, bir BSL2 tesisindeki bir laboratuvar tezgahında gerçekleştirilebilir:
  4. Isıyla etkisiz hale getirilmiş balgam tortusu örneğini 16.800 × g'da (veya tam hızda) 15 dakika santrifüjleyin. 20-200 μL'lik bir pipet ile süpernatanı nazikçe aspire edin ve atın, böylece peletin bozulmadan kalmasını sağlayın.
  5. Matris süspansiyonunu hafifçe sallayarak karıştırın (girdap yapmayın) ve peleti yeniden süspanse etmek için 200 μL iyi karıştırılmış matris ekleyin.
  6. Tam hacmi, 1.5 mm çapında önceden sterilize edilmiş üç cam boncuk içeren 2 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpe pipetleyin.
  7. Numuneleri bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve 56 °C'de 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Numuneyi ısıtma bloğundan çıkardıktan hemen sonra, yalnızca bir ısıtma bloğu mevcutsa, ısıtma bloğunu adım 100'den sonra 2.7 °C'ye ayarlayın.
  8. Hücreleri dağıtmak için 10 saniye boyunca bir girdap kullanarak numuneleri homojenize edin.
  9. Numuneleri bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve 100 °C'de 10 dakika inkübe edin.
  10. Numuneleri aşağıdaki parametrelere sahip yüksek hızlı bir homojenizatör kullanarak homojenize edin: 4,0 m/s'de 60 s'lik bir döngü.
  11. 12.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. 130 μL DNA içeren süpernatanı, peleti bozmadan (hücre kalıntısı olan matris) 1.5 mL'lik düşük bağlayıcı yeni bir tüpe aktarın. Matrisi ve hücre kalıntılarını içeren ilk tüpü atın.
    NOT: GÜVENLI DURMA NOKTASI. Duruyorsa, DNA saflaştırmasına devam etmeye hazır olana kadar numuneleri -20 °C'de dondurun.
  12. Manyetik boncuklar kullanarak DNA saflaştırmasına devam edin.

figure-protocol-1
Şekil 2: Yüksek hızlı homojenizatör ile birleştirilmiş matris bazlı DNA ekstraksiyon yöntemi. Kısaltma: HSH = yüksek hızlı homojenizatör. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Manyetik boncuklar kullanarak DNA saflaştırması (Şekil 3)

NOT: DNA saflaştırmasına devam etmeden önce 3.1 ve 3.2 adımlarını uygulayın.

  1. Manyetik boncukları buzdolabından çıkarın ve dengelemek için kabı 30 dakika oda sıcaklığında bekletin. Alternatif olarak, tüm boncukları yeniden süspanse etmek için manyetik boncuk stok şişesini girdaplayın ve 1.280 μL'lik bir alikotu yeni bir tüpe (21 numunenin saflaştırılması için) aspire edin ve dengelemek için oda sıcaklığına yerleştirin.






figure-protocol-2

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnek açıklama
Mikroskopide en az 165+ bakteri yüküne sahip aside dayanıklı basil (AFB) için pozitif olan toplam 1 balgam tortusu örneği, Ulusal Sağlık Laboratuvarı Hizmetleri (NHLS) Green Point, Cape Town, Güney Afrika tarafından rutin olarak toplandı ve işlendi. DNA, balgam sediment örneklerinden iki farklı hacim [yaklaşık 2 mL (n = 102) ve 500 μL (n = 63)] kullanılarak ekstrakte edildi. Bu karşılaştırma, daha küçük tortu numune hacminin aşağı akış tNGS için yeterli DNA verip veremeyeceğini değerlendirmek için yapılmıştır.

Şekil 4, farklı balgam yayma derecelerinde (1+, 2+ ve 3+) ve balgam tortu hacimlerinde (2 mL ve 500 μL) toplam DNA konsantrasyonunun (ng/μL) bir kutu grafiği karşılaştırmasını göstermektedir. Ekstraksiyon için 500 μL tortu kullanıldığında DNA verimi genellikle genel olarak azalır ve smear dereceleri arasında değişkenlik gösterir. Bu nedenle, en az 2 mL hacme sahip tortu örneklerinden ekstrakte edilen ortalama DNA konsantrasyonları, numunenin AFB'si ile tabakalandırılan 500 μL çökeltiden ekstrakte edilen DNA konsantrasyonundan ortalama olarak daha yüksekti.

figure-results-1
Şekil 4: Balgam tortu hacminin yayma dereceleri boyunca DNA verimi üzerindeki etkisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5, iki farklı giriş hacminden (2 mL ve 500 μL) işlenen farklı yayma derecelerine (1+, 2+ ve 3+) sahip balgam tortu örnekleri için tüm hedeflerin ortalama sıralama okuma sayısını (ortalama kapsama derinliği) gösteren kutu çizimlerini göstermektedir. Aykırı değerler tek tek noktalarla temsil edilir ve y ekseni, kapsamdaki varyasyona uyum sağlamak için logaritmik bir ölçekte görüntülenir. 500 μL'lik çökeltilerden ekstrakte edilen 3+ numune için yüksek çeyrekler arası aralık, daha yüksek bakteri yükleri ile daha fazla değişkenlik olduğunu düşündürür.

figure-results-2
Şekil 5: Smear dereceleri ve numune giriş hacimleri boyunca tüm hedefler için ortalama sıralama okuma sayısının (kapsama derinliği) karşılaştırılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6, ilgili web uygulamasının biyoinformatik boru hattı kullanılarak sıralama sonuçlarının kabul edilebilirliğinin değerlendirilmesini göstermektedir. Sıralama kalite puanları +++ (yüksek kabul edilebilir), ++ (kabul edilebilir), + (marjinal olarak kabul edilebilir), - (kabul edilemez) ve ND (belirlenmedi) olarak kategorize edilmiştir. Grafikte bir çubuğun olmaması, söz konusu kategori için hiçbir sonuç elde edilmediğini gösterir. Smear grade 1+, 500 μL giriş hacmi numune seti için smear grade 2+ ve 3+'ya kıyasla daha yüksek oranda kabul edilemez ve ND sonuçları gösterir. 500 μL balgam tortusundan ekstrakte edilen numuneler, 2 mL balgam tortusundan ekstrakte edilen numuneler için 4.810'a kıyasla ortalama 4.316 sıralama kapsama derinliğine sahipti. Bu, balgam tortusundan ekstrakte edilen DNA'nın, giriş hacminden bağımsız olarak aşağı akış tNGS'sini gerçekleştirmek için yeterli olduğunu göstermektedir.

Sekanslama sonucunun kabul edilebilirliğinin dağılımına bağlı olarak, smear derecesi 3+ olan numuneler, 1+ ve 2+ smear dereceli numunelere kıyasla çoğu numune dizisi ++ ve +++ olarak puanlanarak en yüksek başarı oranına sahipti. 500 μL girdi numuneleri için, - ve + kategorilerindeki numunelerin oranı, 2 mL girdi numunelerine kıyasla tüm smear derecelerinde nispeten daha yüksektir. Bu, daha fazla numunenin 500 μL giriş için daha düşük kaliteli, daha az kabul edilebilir kategorilere girdiğini göstermektedir. 2 mL girdi numuneleri için, özellikle smear derecesi 3+ için, daha yüksek kalite, ++ ve +++ kategorilerinde daha yüksek bir numune oranı vardır. Bu, 2 mL girdili numunelerin, 500 μL girdili olanlara kıyasla daha iyi dizileme kalite puanları üretme olasılığının daha yüksek olduğunu göstermektedir.

figure-results-3
Şekil 6: Kalite puanlarının smear derecesine ve numune giriş hacimlerine göre dağılımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek hızlı homojenizatör ile birleştirilmiş matris bazlı ekstraksiyon yönteminin kombinasyonu ilk olarak Shea ve ark.9 tarafından yayınlanmıştır. Bu yöntem, MTBC kültürlerinden ekstrakte edilen DNA'nın WGS'si için geliştirilmiş ve optimize edilmiştir 9,10. Bu yöntemi bir MTB tNGS testi ile kullanım için optimize ettik. 21 numunenin DNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması, inkübasyon ve santrifüjleme adımları dahil olmak üzere 4 saat 40 dakikalık birleşik bir geri dönüş süresine sahipti. Açıklanan protokolün güvenilirliği, 1+ ila 3+ arasında değişen smear derecelerine sahip numunelerden DNA ekstraksiyonu için bir boncuk temizleme ile birleştiğinde, ortalama verim (Şekil 4), birleştirilen tüm hedeflerin genel kapsama derinliği (Şekil 5) ve ilgili web uygulaması tarafından belirlenen sıralama sonucu kabul edilebilirlik puanına (Şekil 6) dayalı olarak gösterilmiştir.

Yakın zamanda yapılan bir çalışma, smear derecesi ile DNA konsantrasyonu veya sıralama okuma derinliği arasında tutarlı bir ilişki bulamadı. Yazarlar, numune işleme ve temizleme adımlarındaki değişkenliğin, özellikle kirleticiler verimli bir şekilde uzaklaştırılmadığında, yüksek bulaşma dereceli numunelerde performansı etkileyebileceğini öne sürmüşlerdir. Ek olarak, hedef olmayan DNA'nın MTB DNA11 ile rekabet edebileceği DNA havuzunun karmaşıklığı nedeniyle balgam tortusundan dizileme zor olmaya devam etmektedir. Giriş DNA konsantrasyonu ile dizileme derinliği arasında net bir korelasyon gözlemlememiş olsak da, PCR inhibisyonuna yol açabileceğinden, üreticinin talimatlarına göre hedef PCR'den önce DNA girişinin 100 ng'yi aşmaması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Ek olarak, daha yüksek bakteri yükü, 2+ ve 3+ balgam tortusu örnekleri, insan DNA'sı, hücre kalıntıları ve diğer inhibitörler gibi daha fazla kirletici içerebilir ve bu da PCR amplifikasyonu ve kütüphane hazırlığına müdahale edebilir.

Saflaştırma aşaması aynı zamanda bir konsantrasyon adımı olarak da işlev görür ve tNGS'den önce mikobakteriyel DNA verimini arttırır. Bu yöntem, düşük bakteri yüküne sahip numunelerin işlenmesi için etkilidir ve 500 μL kadar küçük hacimlerde güvenilir performans göstermiştir, bu da onu sınırlı numune hacminin mevcut olduğu rutin ayarlar için uygun hale getirir. Uygulaması, kliniklere takip ziyaretleri ihtiyacını azaltabilir ve böylece takip için hasta kaybı riskini en aza indirebilir. Ek olarak, yöntem basittir ve gelişmiş laboratuvar uzmanlığı gerektirmez, bu da kaynakların sınırlı ortamlara entegrasyonunu daha da destekler.

Ancak protokol ile ilgili bazı noktalara dikkat edilmelidir. Numuneler, 80 °C'de inkübasyondan hemen sonra dondurulmamalı veya soğutulmamalıdır. Isıl işlemden hemen sonra hızlı soğutma, tüpün iç yüzeylerinde yoğuşma oluşmasına neden olarak numunenin seyreltilmesine ve potansiyel olarak aşağı akış DNA ekstraksiyonunu etkilemesine neden olabilir. Ek olarak, ani soğutma, ısıl işlem sırasında tamamen etkisiz hale getirilmemiş olabilecek nükleik asit parçalanmasını veya enzimatik aktiviteyi teşvik ederek numune bozulması riskini artırabilir. Bu hususlar, MTB tespiti için balgam numuneleri işlenirken özellikle önemlidir. Dünya Sağlık Örgütü'nün Ziehl-Neelsen boyama tavsiyelerine göre, 1+ smear derecesi, 100 yağa daldırma alanı başına 10-99 AFB'ye, 2+ en az 50 alanda alan başına 1-10 AFB'ye ve 3+ en az 20 alanda alan başına 10'dan fazla AFB'ye karşılık gelir12.

Bu yöntemin bir sınırlaması, yüksek hızlı bir homojenizatör veya boncuk çırpma cihazı kullanılarak manuel homojenizasyon gerekliliği nedeniyle otomasyon eksikliğidir. Bunu ele almak için devam eden çabalar, daha kısa kuluçka sürelerini, daha düşük kuluçka sıcaklıklarını ve yüksek hızlı homojenizasyona alternatif yaklaşımları test ederek protokolün iyileştirilmesine odaklanmaktadır.

Bu nedenle, yüksek hızlı bir homojenizatör ile birleştirilen bu matris bazlı DNA ekstraksiyon yöntemi, metaller ve proteinler gibi PCR inhibitörlerini aynı anda uzaklaştırırken genomik DNA'yı serbest bırakmak için ısı ve boncuk çırpma kullanan hızlı bir DNA ekstraksiyon tekniğidir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar T. R., UC San Diego ile bir hizmet sözleşmesi aracılığıyla FIND'den finansman desteği alıyor. Yazar TR, ilaca dirençli TB (R01AI176401) için bir tNGS çözümü geliştirmek ve değerlendirmek için NIH'den hibe fonu aldı. Yazar T. R., Verus Diagnostics Inc.'in kurucu ortağı, yönetim kurulu üyesi ve ücretsiz hissedarıdır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, teknik yardım sağladıkları için NHLS - Green Point, Güney Afrika'daki TB laboratuvar ekibine teşekkür eder. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Yenilikçi Yeni Teşhis Vakfı (FIND), TS ELiOT projesi Hibe Kimliği: R01AI153213, Unitaid Hibe Kimliği: 2019-32-FIND MDR tarafından desteklenmiştir. Figürler BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alternatif: Benchmark BeadBlaster 24Karşılaştırma BilimselD2400 Serisi
AMPure XP Boncuk Bazlı ReaktifBeckman CoulterA63881 Serisi
Otoklavlanmış veya steril cam kürecikler (2 mm)Sigma-AldrichZ273627-1EA
Etil alkol, Saf Sigma-AldrichE7023-500ML
Filtre pipet uçları (10 µ L)Biyo-Akıllı BilimselFT-10-R
Filtre pipet uçları (1000 µ L)Biyo-Akıllı BilimselFT1000-R Serisi
Filtre pipet uçları (20 µ l)Biyo-Akıllı BilimselFT20-R Serisi
Filtre pipet uçları (200 &mikro; L)Biyo-Akıllı BilimselFT200-R Serisi
Isıtma bloğu 37 &derece; C'den 100 &dereceye; C Eppendorf Belediyesi5382000031
FastPrep-24 olarak yüksek hızlı homojenizatör (HSM)MP Biyomedikal116005500
İnkübatör 80 &derece; CLasec GrubuIBLPDHG-9030A
InstaGene MatrisiBio-Rad Laboratuvarları A.Ş.BBRD7326030
Düşük bağlayıcı mikrotüpler (1,5 mL veya 2 mL)Eppendorf BelediyesiEP0030108051-250 EA
1.5 &ndash için manyetik raf; 2 mL'lik tüplerThermo Fisher Bilimsel A.Ş.12321D
Manyetik karıştırıcıMerckZ671886
MikrosantrifüjEppendorf Belediyesi5406000046
Milli-Q IX 7015 Saf Su Arıtma SistemiMerckZIX7015T0C
Nükleaz içermeyen su (NFW), moleküler sınıfThermo Fisher Bilimsel A.Ş.AM9937 Serisi
Pipetler (P10, P20, P200 ve P1000)Eppendorf BelediyesiEP3123000918-1 ŞERH
Qubit Test TüpleriThermo Fisher Bilimsel A.Ş.Q32856 (İngilizce)
Qubit dsDNA HS Test KitiThermo Fisher Bilimsel A.Ş.Q33231 (İngilizce)
Qubit florometre cihazıThermo Fisher Bilimsel A.Ş.Q33226
Vidalı kapaklı tüpler (1,5 mL)Bilimsel Uzmanlıklar A.Ş.P2TUB056C-0001.5ST
GirdapLasec GrubuWMBB0L0E0216

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global Tuberculosis Report 2024. Geneva: WHO. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024 (2024).
  2. De Araujo, L., et al. Implementation of targeted next-generation sequencing for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis in low-resource settings: a programmatic model, challenges, and initial outcomes. Front Public Health. 11, 1204064(2023).
  3. Murphy, S. G., et al. Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing. Front Public Health. 11, 1206056(2023).
  4. Kambli, P., et al. Targeted next generation sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drug resistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127, 102051(2021).
  5. WHO Consolidated Guidelines on Tuberculosis.Module 3: Diagnosis. Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Third edition. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/376221/9789240089488-eng.pdf?sequence=1 (2024).
  6. Catalogue of mutations in Mycobacterium tuberculosis. complex and their association with drug resistance. Second edition. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/374061/9789240082410-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  7. Schwab, T. C., et al. Targeted next-generation sequencing to diagnose drug-resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 24 (10), 1162-1176 (2024).
  8. Deeplex Myc-TB manual version 5. , GenoScreen. https://acrobat.adobe.com/link/track?uri=urn%3Aaaid%3Ascds%3AUS%3A67c2b53f-c91d-3a73-a6ea-4769e7c8fe57 (2023).
  9. Shea, J., et al. Comprehensive whole-genome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).
  10. Conceição, E. C., et al. Mycobacterium tuberculosis. DNA extraction using InstaGene Matrix and high-speed homogenizer from clinical primary culture. , https://www.protocols.io/view/mycobacterium-tuberculosis-dna-extraction-using-in-dhvs366e (2024).
  11. Nilgiriwala, K., et al. Genomic sequencing from sputum for tuberculosis disease diagnosis, lineage determination, and drug susceptibility prediction. J Clin Microbiol. 61 (3), e0157822(2023).
  12. Laboratory Services in Tuberculosis Control Part II: Microscopy. Geneva: WHO. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/65942/WHO_TB_98.258_(part2).pdf?sequence=2 (1998).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA ExtractionNext Generation SequencingTargeted NGSDrug Resistant TuberculosisSputum SamplesMagnetic Bead PurificationDecontaminated SputumDrug Susceptibility TestingLineage DeterminationStrain Typing

Related Articles