Penium margaritaceum için Deneysel Tarama Protokolleri, İmmünositokimya ve Mikroskopi Tabanlı Görüntüleme Teknikleri

Summary

Bu rapor, tek hücreli streptofit algi Penium margaritaceum'u kültürlemek ve deneysel olarak manipüle etmek için kullanılan temel yöntemleri açıklamaktadır. Ayrıca, monoklonal antikorlar ve diğer floresan problar ve taramalı elektron mikroskobu ile canlı hücre etiketleme dahil olmak üzere mikroskopi tabanlı görüntülemenin temel protokollerini sağlar.

Abstract

Hücre duvarı, gelişim sırasında ve çevresel abiyotik ve biyotik stres faktörlerine yanıt verirken bir bitki hücresi için sinyal alımı/iletiminin ilk bileşenidir. Hücre, hücre duvarının bütünlüğünü sürekli olarak izler ve strese yanıt olarak onu modüle eder. Hücre duvarında meydana gelen spesifik yapısal ve biyokimyasal modülasyonları aydınlatmak, özellikle çok hücreli bitkiler ve organları/dokuları kullanıldığında zor bir iştir. Bu, karmaşık bir çok hücreli ağın parçası olan tek bir hücrede neyin çözülebileceğine ilişkin sınırlamalardan kaynaklanmaktadır. Tek hücreli streptofit alg, Penium margaritaceum, son zamanlarda pektin dinamiği, hücre duvarı bazlı fenotipik plastisite ve alg hücre biyolojisinin birçok yönünün araştırılmasında kullanılmıştır. Basit fenotipi, özellikle kara bitki hücre duvarlarına benzer birçok bileşene sahip farklı hücre duvarı ve immünositokimyasal ve deneysel çalışmalardaki kolaylığı, onu bitki hücre duvarı biyolojisinde güçlü bir model organizma haline getirmektedir. Bu çalışmanın amacı, uygulanan stresörlerin kültürlenmesi, deneysel manipülasyonu ve taranması için temel teknikleri sağlamaktır. İmmünositokimya için tarama protokolleri, konfokal lazer tarama mikroskobu görüntüleme ve hücre duvarı yapısının taramalı elektron mikroskobu görüntülemesi. Benzer şekilde, tarif edilen tekniklerin çoğu, çok çeşitli diğer hücre ve moleküler çalışmalar için değiştirilebilir.

Introduction

Bir bitkinin hücre duvarı, bir bitki hücresinin¹ yaşamında birden fazla rolü olan karmaşık bir polimerik ağdır. Hücre duvarının bütünlüğü, gelişim sırasında ve çevresel strese yanıt olarak hücre tarafından sürekli olarak izlenir ve buna göre kimya ve yapıda modüle olur. Penium margaritaceum , son zamanlarda Streptofit algleri (Streptophyta, kara bitkileri² ile en yakından ilişkili ve atası olan yeşil alg grubu) çalışmalarında kullanılan tek hücreli yeşil bir algdir.

Son yirmi yılda, P. margaritaceum hücre duvarı ve hücre dışı matris dinamikle....

Protocol

NOT: Penium margaritaceum , Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Göttingen Üniversitesi, SAG'daki Alg Kültür Koleksiyonu'nda elde edilir; Zorlanma #2640.

1. Kültürleri korumak

1. Algleri, toprak suyu özütü ile de desteklenebilen sıvı Woods Hole ortamında (WH¹²) tutun (yani, ortamın L başına 40 mL). 16 h:8 h ışıkla kültürleri 20-25 °C'de koruyun: 3,5 klux (74 μmol foton/^m2/s) soğuk beyaz floresan ışıkla karanlık döngü.
2. Alt kültürleri haftalık olarak hazırlayın ve 10-14 günlük olduklarında hücre kültürl....

Results

Hücre duvarının P. margaritaceum anti-pektin mAbs (örneğin, JIM5) ile etiketlenmesi, düzenli bir desen veya kafes oluşturan kalsiyum kompleksli lifler ve çıkıntılardan oluşan bir ağı ortaya çıkarır (Şekil 1). Pektin, hücre merkezinde veya isthmus'ta biriktirilir ve burada eski pektini kutuplara doğru yer değiştirir (Şekil 2). Farklı bir pektin antikoru benzeri JIM7 ile etiketleme, isthmus'ta dar bir bantta yüksek metil-esterlenmiş pektinin ilk salgılanm.......

Discussion

P. margaritaceum, bitkilerde ve streptofit alglerinde hücre duvarı gelişimi ve ECM salgılanmasının dinamiklerini aydınlatmak için etkili bir organizmadır. Ana özellikler arasında tek hücreli bir alışkanlık ve kültür bakımı ve deneysel manipülasyonda kolaylık, farklı bir dış pektin kafesi ve diğer polimerlere sahip bir birincil hücre duvarı, sonraki gelişimsel ve/veya deneysel çalışmalar için zamanında takip edilebilecek hücre duvarına yönelik mAb'ler ile canlı hücre etiketlemesi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL mikrosent. Tüpler	Fisher Scientific	01-549-740
12 kuyulu mikroplaka	Fisher Scientific	50-233-6077
22 x 22 mm lamel	Fisher Scientific	12-541-016
45x 50 cm lamel	Beyin Araştırması	4550-1.5D
Agar	Sigma Aldrich	A9414
sıçan önleyici FITC	Sigma Aldrich	F6258
sıçan önleyici TRITC	Sigma Aldrich	T4280
kalsiyum klorür	Sigma Aldrich	C4981
Cambbridge saplamaları	EMS	75183-65
Fluoview CLSM	Belirgin	Fluoview 1200
JIM5	Kerafast	ELD004
JIM7	Kerafast	ELD005
Mikrosantrifüj	Fisher Scientific	13-100-675
Mikropipetörler	BioRad	1660499EDU
em>Penium margaritaceum	Sammlung von Algenkulturen der Universitä t Gö ttingen - Gö'da Alg Kültür Koleksiyonu; ttingen Üniversitesi	2640
Polisfer kiti	Polysciences	18336
SEM	ThermoFisher	Quattro SEM
püskürtme kaplayıcı	EMS	Q150V
Vorteks karıştırıcı	Fisher Scientific	02-215-414