Method Article

İnsan CD14+ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farmakolojik ajanların naif monosit türevli dendritik hücrelerden in vitro olarak tolerojenik dendritik hücreler üretme kapasitesini değerlendirmek ve otolog düzenleyici T hücresi üretimi ile potansiyellerini doğrulamak için bir prosedür tanımladık.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tolerojenik dendritik hücreler (tolDC'ler), naif T hücrelerini düzenleyici bir T hücresi (Treg) fenotipine doğru etkilediği bilinen dendritik hücrelerin (DC'ler) bir alt kümesidir. TolDC'ler şu anda hem hücre tedavisi hem de endojen DC'lerden tolDC'leri indüklemek için bir yöntem olarak otoimmünite ve transplantasyon tedavileri olarak araştırılmaktadır. Bununla birlikte, bugüne kadar, naif DC'lerden tolDC'leri indüklemek için bilinen ajanların sayısı nispeten azdır ve in vivo Treg'leri üretme potansiyelleri, özellikle endojen DC'lerden tolDC'leri indükleyen tedaviler tutarsız olmuştur. Bu, tolerans oluşturmak için yeni bileşikleri keşfetme fırsatı sağlar.

Burada, monositten türetilmiş DC'ler (moDC'ler) üzerinde yeni immünomodülatör bileşikleri in vitro olarak test etmek ve otolog Treg'ler oluşturmak için işlevselliklerini doğrulamak için bir yöntem açıklıyoruz. İlk olarak, PBMC'leri elde ediyoruz ve ticari olarak temin edilebilen manyetik ayırma kitlerini kullanarak CD14 + monositleri ve CD3 + T hücrelerini izole ediyoruz. Daha sonra, monositleri moDC'lere ayırıyoruz, bunları 24 saat boyunca rapamisin, deksametazon, IL-10 veya D3 vitamini gibi yerleşik bir immünomodülatör ile tedavi ediyoruz ve protokolün bir doğrulaması olarak tolerojenik belirteçlerdeki değişikliklerini test ediyoruz. Son olarak, anti-CD3/CD28 stimülasyonu varlığında indüklenen tolDC'leri otolog T hücreleri ile birlikte kültürledik ve Treg popülasyonlarındaki ve T hücresi proliferasyonundaki değişiklikleri gözlemledik. Bu protokolün, halihazırda farklılaşmış DC'leri tolDC'ye doğru yeniden programlamak için yeni immünomodülatör ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılmasını öngörüyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritik hücreler (DC'ler), doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık arasında kritik aracılardır. Esas olarak mukozal membranlarda, deride ve lenfoid dokuda bulunan DC'ler, birincil antijen sunan hücrelerdir (APC'ler)1. DC'ler yabancı proteinleri alır ve bunları işler ve majör histouyumluluk (MHC) proteinleri üzerinde naif T hücrelerine sunar. DC'ler, insanlarda insan lökosit antijeni-DR (HLA-DR) gibi MHC sınıf II proteinlerini spesifik olarak eksprese eder. Antijen maruziyeti üzerine DC'lerin aktivasyon durumu, aşağı akış T hücresi yanıtı2 için kritiktir. Olgunlaşmamış DC'ler, bakteri duva....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm insan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örnekleri, Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu'ndan (IRB) hasta rızası ile önceden onay alınarak, kimliği belirsiz donörlerden Pennsylvania Üniversitesi İnsan İmmünolojisi Çekirdeği'nden elde edildi.

İsteğe bağlı: Bu yöntemde akademik bir laboratuvardan elde edilen taze izole edilmiş PBMC'ler kullanılırken, PBMC'ler tam kandan veya lökoferezden zenginleştirilmiş kan ürünlerinden izole edilebilir. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme yöntemini kullanmanızı öneririz, çünkü bu, başka bir yerde açıklanan köklü ve güvenilir bir yöntemdi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan PBMC'leri için bir protokol tanımladık, ticari olarak temin edilebilen manyetik ayırma kitlerini kullanarak hem CD3 + T hücrelerini hem de CD14 + monositlerini izole ettik, monositleri GM-CSF ve IL-4 kullanarak CD14-, HLA-DR +, CD141 +, CD1c + moDC'lere farklılaştırdık, 24 saat tedavi ettik ve 72 saat boyunca anti-CD3 / CD28 stimülasyonu ile otolog T hücreleri ile kokültür yaptık. Deneysel bir şema Şekil 1'de gösterilmiş.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, moDC'lerden tolDC'leri indüklemek için immünomodülatör ajanların işlevselliğini değerlendirmek ve ex vivo otojenik T hücrelerinden Treg'ler oluşturmak için işlevselliklerini doğrulamak için güvenilir ve çok yönlü bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, monositler herkesin bildiği gibi hassas hücrelerdir ve en iyi sonuçlar için taze, daha önce dondurulmamış PBMC'lerden elde edilmelidir. Monositler mümkün olan en kısa sürede izole edilm.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağışçılardan taze insan PBMC'leri sağladığı için Pennsylvania Üniversitesi İnsan İmmünolojisi Çekirdeğine (HIC) teşekkür ederiz. HIC, kısmen NIH P30 AI045008 ve P30 CA016520 tarafından desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 ve mikro; L Filtrelenmiş Pipet uçlarıVWR76322-158Genel Hücre Kültürü
1.5 mL Santrifüj TüpüVWR77508-358Genel Hücre Kültürü
10 mL Serolojik PipetlerVWR414004-267Genel Hücre Kültürü
100-1000 &mikro; L Filtreli Pipet uçlarıVWR76322-164Genel Hücre Kültürü
15 mL Konik TüpVWR77508-212Genel Hücre Kültürü
20-200 & mikro; L Filtreli Pipet uçlarıVWR76322-160Genel Hücre Kültürü
2-MerkaptoetanolMP Biyomedikal194834T Hücre Kültürü
50 mL Konik BoruVWR21008-736Genel Hücre Kültürü
60 x 15 mm Çanak, Nunclon DeltaThermo Fischer150326Genel Hücre Kültürü
96 Kuyu Konik (V) Alt Plaka, İşlem Görmemiş YüzeyThermo Fischer277143Genel Hücre Kültürü
96 kuyulu Düz Tabanlı PlakaThermo Fischer161093Genel Hücre Kültürü
APC / Siyanin7 anti-insan CD272 (BTLA) AntikorBiyoefsanesi344518Akış Sitometrisi
Attune NxT (Kırmızı / Mavi Lazer, 7 Kanal)Thermo FischerA24863Akış Sitometrisi
BSAThermo Fischer15260-037Genel Hücre Kültür
CD14 Monoklonal Antikor (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Flow Sitometri
CD1c Monoklonal Antikor (L161), PE-Siyanin7Thermo Fischer25-0015-42Akış Sitometrisi
CD209 (DC-SIGN) Monoklonal Antikor (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Flow Sitometri
CD25 Monoklonal Antikor (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Akış Sitometrisi
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoklonal Antikor (MIH1), PETermo Fischer12-5983-42Akış Sitometrisi
CD4 Monoklonal Antikor (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Akış Sitometrisi
CD40 Monoklonal Antikor (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Akış Sitometrisi
CD40 Monoklonal Antikor (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Flow Sitometri
CD69 Monoklonal Antikor (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Flow Sitometri
CD86 Monoklonal Antikor (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Flow Sitometri
CD8a Monoklonal Antikor (RPA-T8), PE-Siyanin7Thermo Fischer25-0088-42Flow Sitometri
Konik Alt (V-kuyulu) 96 Kuyulu PlakaThermo Fischer2605Akış Sitometrisi
Kriyojenik Şişeler, 2 mLThermo Fischer430488T Hücre Kültürü
Dimetilsülfoksit (DMSO), Sıralama SınıfıThermo Fischer20688Genel Hücre Kültürü
DPBSThermo Fischer14200166Genel Hücre Kültürü
EasySep İnsan Monosit İzolasyon KitiKök Hücre Teknolojileri19359Hücre Ayırma
EasySep İnsan T Hücre İzolasyon KitiKök Hücre Teknolojileri17951Hücre Ayırma
EasySep MıknatıslıKök Hücre Teknolojileri18000Hücre Ayırma
EDTAThermo FischerAIM9260GGenel Hücre Kültürü
Falcon Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüpler, 5 mLKök Hücre Teknolojileri38025Hücre Ayırma
Fc Reseptör Bağlanma İnhibitörü Poliklonal AntikorThermo Fischer14-9161-73Akış Sitometrisi
Fetal Sığır SerumuThermo FischerA5670701Genel Hücre Kültürü
Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Akış Sitometrisi
Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon SetiThermo Fischer00-5523-00Akış Sitometrisi
FOXP3 Monoklonal Antikor (PCH101), PE-Siyanin5.5Thermo Fischer35-4776-42Akış Sitometrisi
HBSSThermo Fischer14170-112Genel Hücre Kültürü
Isıyla İnaktive Edilmiş Fetal Sığır SerumuThermo FischerA5670801Genel Hücre Kültürü
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Hücresi Kültür
HLA-DR Monoklonal Antikor (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Akış Sitometrisi
İnsan CD3 / CD28 / CD2 T Hücre AktivatörüKök Hücre Teknolojileri10970T Hücre Kültürü
İnsan GM-CSF Rekombinant ProteinThermo Fischer300-03moDC Hücre Kültürü
İnsan IL-10 ELISA Kiti, Yüksek HassasiyetliThermo FischerBMS215-2HSELISA (ELISA)
İnsan IL-4, Hayvansız Rekombinant ProteinThermo FischerAF-200-04moDC Hücre Kültürü
İnsan PBMC (Taze İzole)UPenn HICN/AHücreleri
İnsan TNF alfa ELISA KitiThermo FischerBMS223-4ELISA
Işık Mikroskobu (DMi1)Lucia391240Genel Hücre Kültürü
Lipopolisakkarit (LPS)İnvivojentlrl-eblpsmoDC Hücre Kültürü
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke KitiThermo FischerL34975Akış Sitometrisi
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)Thermo Fischer11140050T Hücre Kültürü
Penisilin-Streptomisin (100x)Thermo Fischer15140122Genel Hücre Kültürü
Pipet Kontrol CihazıVWR77575-370Genel Hücre Kültürü
Rapamisin, %98+Thermo FischerJ62473. MFmoDC Hücre Kültürü
RPMI 1640, GlutamaxThermo Fischer61870-036ile Genel Hücre Kültürü
Ayırma TamponuKök Hücre Teknolojileri20144Hücre Ayırma
T Hücre Stimülasyon Kokteyli (500x)Thermo Fischer00-4970-93T Hücre Kültürü
UltraComp eBead Plus KompanzasyonBoncukları Thermo Fischer01-3333-41Akış Sitometri
Değişken Pipet SetiFischer Scientific05-403-152Genel Hücre Kültürü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsMonocyte Derived Dendritic CellsImmunomodulatory AgentsRegulatory T CellsCD14 Positive MonocytesFlow CytometryMagnetic Cell SeparationT Cell ProliferationImmunomodulator TreatmentFoxp3 Treg Induction

Related Articles