Yöntem makalesi

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

DOI:

10.3791/68171

⸱

8 Temmuz 2025

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri < gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinanın karmaşık laminer yapısı, kapsamlı uzamsal moleküler haritalama için önemli zorluklar sunar. Doku mimarisini ve moleküler etkileşimleri araştırmak için mevcut teknikler, mekansal ilişkileri tehlikeye atan veya moleküler profillemeyi kısıtlayan teknik kısıtlamalarla sınırlıdır. Kesit oluşturma, tüm montaj hazırlıkları, kimyasal veya mekanik ayrışmalar ve kalın yüz kesitleri gibi mevcut yöntemler ya doku bütünlüğünü bozar, kritik uzamsal bağlamı kaybeder ya da çoğu zaman yüksek boyutlu uzamsal dizileme platformlarıyla uyumsuzdur.

Bu çalışma, retina hücresi dağılımlarını haritalamak için gerekli olan uzamsal ilişkileri korurken ince (<20 μm) yüz kesitleri üreten bir kriyoseksiyon tekniğini tanıtmaktadır. Yöntem, yüksek verimli moleküler analiz platformlarıyla uyumlu bölümler oluştururken RNA bütünlüğünü ve doku mimarisini korur. RNA bütünlüğü korunur, çünkü bu teknik, uzamsal transkriptomik platform üreticilerinin post-fixed dokuya göre resmi olarak desteklediği taze donmuş dokuyu bölümlere ayırır. Bu yaklaşımı, hem manuel RNAscope in situ hibridizasyon (12 hedef) hem de Xenium uzamsal dizileme (300 hedef) ile başarılı entegrasyon gösteren çoklu moleküler profilleme yöntemleri kullanarak doğruluyoruz. Teknik, bu hassas moleküler uygulamalar için uygun RNA kalitesini korurken, numuneler arasında doku mimarisini tutarlı bir şekilde korur.

Bu metodolojik ilerleme, retina hücre tipi dağılımları, laminalar arasındaki moleküler gradyanlar ve retina patolojisinin uzamsal yönleri hakkında yeni araştırmalar yapılmasını sağlar. Tekniğin çok yönlülüğü ve modern mekansal biyoloji platformlarıyla uyumluluğu, retinanın karmaşık hücresel organizasyonunun kapsamlı moleküler haritalaması için bir temel sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinal nöronlar, bilgi işlemeyi kolaylaştıran uzamsal topografyalar geliştirmiştir, bu da birçok türde fovealar, alan centralis ve çizgiler gibi brüt uzmanlaşmalarla sonuçlanır 1,2,3. Fotoreseptör dağılımının iyi anlaşılmış çeşitliliğinin aksine, Retinal Ganglion Hücreleri (RGC'ler) tarafından oluşturulan retina çıktısının uzamsal özelleşmesi daha az belirgindir. Çoğu tür için, RGC'lerin mekansal dağılımları tamamen bilinmemektedir. Fare için bile, tartışmasız en iyi çalışılmış omurgalı görsel fonksiyon modelinden biri olmasa da, RGC alt tiplerinin üçte birinden daha azı, tüm dağ immünohistokimyası2 gibi geleneksel tekniklerle haritalanmıştır. Bu teknikler başarısız olur, çünkü çoğu RGC alt tipi spesifik bir genetik belirteçte sahip değildir. Bunun yerine, tek hücreli RNA dizilimi 5,6,7 yoluyla doğru RGC sınıflandırması4 için daha yüksek boyutlu moleküler bilgiye ihtiyaç vardır.

Farede gözlemlenen topografyalar, RGC yerleşimi ile görsel işlev arasında açık ekolojik ilişkiler gösterdiğinden, RGC dağılımı hakkında bilgi önemlidir. En çarpıcı örnek, temporal retinada kümelenen ɑON-S RGC'lerin uzamsal organizasyonudur. Bu bölge, avlanma davranışları 9 sırasında avın8 görüntüsünüalır. RGC alt tiplerinin hastalığa10 farklı şekilde duyarlı olduğu ve glokom gibi bazı yaygın hastalıkların ilerlemelerinde mekansal bir bileşene sahip olduğu da iyi takdir edilmektedir11,12. Bu nedenle, alanın karşı karşıya olduğu önemli bir soru şudur: RGC alt tiplerinin retina1'i döşerken mekansal organizasyonu nedir? Bilgideki bu boşluk şu anda görsel olarak yönlendirilen diğer davranışlar ve hastalıklar hakkındaki içgörüleri sınırlamaktadır.

Mevcut yöntemin odak noktası, yüksek çözünürlüklü moleküler analize olanak tanırken mekansal ilişkileri koruyan bir yüz kriyoseksiyon yaklaşımı yoluyla bu moleküler bilgi boşluklarını ele almaktır. 10X'in Xenium'u gibi modern mekansal dizileme platformları, doku organizasyonu ve hücresel etkileşimler hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sunarak moleküler profillemede dönüştürücü bir ilerlemeyi temsil ediyor. Bununla birlikte, bu platformlar, RNAscope gibi daha düşük pleks teknikler ve Vium gibi uzamsal olarak barkodlu dizileme yöntemleriyle birlikte kritik bir teknik kısıtlamayı paylaşır: 20 μm'den daha ince doku kesitleri gerektirirler. Bu gereklilik, tipik olarak 200 μm kalınlığında olan retina dokusu için özel bir zorluk teşkil eder.

Bugüne kadar, araştırmacılar bu teknolojileri retina dokusuna uygularken öncelikle kesitlere güvendiler13. Kesitler, dikey devreler bağlamında nükleer ve pleksiform katmanlar içindeki moleküler ilişkileri etkili bir şekilde ortaya çıkarırken, tüm montaj preparatlarının geleneksel olarak ortaya çıkardığı retina hücrelerinin daha geniş uzamsal dağılımlarını yakalamak için daha az uygundurlar8. Son zamanlarda yüzey kesit alma girişimleri, kesit kalınlığı kısıtlamaları ile sınırlı kalmıştır ve çalışmalar, modern yüksek pleks moleküler analiz platformları için 14 çok kalın olan yalnızca50 μm'lik kesitler elde etmiştir. Bireysel retinal laminaları incelemek için kullanılan ancak modern uzamsal dizileme teknikleriyle uyumlu olmayan diğer tarihsel yaklaşımlar arasında mekanik ayrışma 15,16 ile birlikte enzimatik sindirim veya tek başına mekanik ayrışmalar 17,18,19,20. Burada, bu sınırlamaların üstesinden gelen ince, kavisli retina dokusu için özel olarak tasarlanmış yeni bir kriyoseksiyon tekniği sunuyoruz. Kısaca bizim yöntemimiz, gözün arka kamarasının çıkarılmasını, hem retina hem de sklerada kabartma kesikler oluşturulmasını, iç retina ile dokunun bir örtü camına karşı düzleştirilmesini, dokunun OKT'ye gömülmesini ve son olarak dıştan iç retinaya doğru kriyoseksiyonu içerir (Şekil 1). Yöntemimiz, hem manuel RNAscope (12 hedef) hem de otomatik Xenium platformu (300 hedef) ile başarılı bir şekilde uygulanarak doğrulandığı üzere, yüksek boyutlu uzamsal biyoloji araçları için yeterince ince (<20 μm) kesitler üretirken uzamsal ilişkileri korur ve moleküler analizin farklı karmaşıklık ölçeklerinde uyumluluğu gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Colorado Üniversitesi tarafından denetlenen bu yöntemleri onaylayan ilgili kurumsal yönergelere uygun olarak ve bunların onayı ile gerçekleştirilmiştir. Hayvan kullanımı ve ötenazi ile ilgili tüm adımlar yerel düzenlemelere ve deneysel izinlere uygun olmalıdır. Tüm fareler, yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan akredite bir veterinerlik tesisinde standart bakımla barındırıldı. Bu yüz kriyoseksiyon tekniği, C57BL/6 fareler için optimize edilmiş standart retina diseksiyon tekniklerine dayanmaktadır. Bu tekniği geliştirmek için, yaşları 6 hafta ile 2 yaş arasında değişen her iki cinsiyetten yaklaşık 150 fare kullanıldı. Burada iletilen son teknik, farenin demografik özelliklerinden bağımsız olarak yaklaşık% 95'lik bir başarı oranına sahiptir. Bir adım için bir sıcaklık listelenmemişse, yaklaşık 20-25 °C'lik oda sıcaklığının beklendiğini unutmayın. Listelenen sıcaklığı olmayan çözeltiler soğutulduğunda çalışır ve bu nedenle çözeltiler için çalışma sıcaklığı aralığı 4-25 °C'dir.

1. Diseksiyon

  1. Fareyi izofluran ile uyuşturun ve anesteziyi ayak parmağı çimdikleme ile doğrulayın veya diğer yöntemler eşit derecede uygun olduğundan anesteziyi indüklemek ve onaylamak için yerel kuralları ve düzenlemeleri izleyin.
  2. Fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın: farenin kafasını bir elinizle ve kuyruğun tabanını diğer elinizle sabitleyin, ardından zıt yönlere çekin. Dekapitasyon ile ikincil ötenazi gerçekleştirin.
  3. Oryantasyonu korumak ve diseksiyon için zayıf bir nokta oluşturmak için kürenin temporal kutbunu kornea üzerine sürün (Şekil 2B ve Şekil 3A).
  4. Küreyi, bir parça filtre kağıdı (küreden daha büyük ancak tabaktan daha küçük) içeren bir tabağa Ames çözeltisine batırın.
    NOT: Ames dışındaki solüsyonların kullanılması retinada bozulmaya neden olacaktır (Şekil 4A).
  5. Keskin #5 forseps ve iris makası kullanarak, sklerayı delmeden (Şekil 2D) tüm kas sistemini, fasyayı, damar sistemini ve sinirleri küreden dikkatlice çıkarın (Şekil 2E, F ve Şekil 3B).
    NOT: Bu adım sırasında skleranın delinmesi (Şekil 4B) doku fıtıklaşmasına neden olacaktır (Şekil 4C).
  6. Bir iris makas bıçağının ucunu, optik sinir kafasına paralel makasla kornea markasına dik olarak konumlandırın. Bu konumda küreyi delin (Şekil 3C,D).
  7. Kornea ve limbus boyunca tek bir temiz kesi yapın, sklera ve retinaya optik sinir başına doğru devam edin (Şekil 3E).
    NOT: Optik sinir başını kesmeyin, aksi takdirde sklera ve retina ayrılır. Bu kesinin tam uzunluğu, yaşlı ve genç hayvanlar arasında ve ayrıca vahşi tip hayvanlara göre bazı Cre hatlarında önemli ölçüde değişebilen dünyanın boyutuna bağlı olarak değişecektir. Bu kesinin en derin kısmı ile optik sinir başı arasında yaklaşık 1 mm'lik bir doku bırakılmasını öneriyoruz.
  8. Bıçağı ilk kesime dik olarak (Şekil 3F,G), limbusun yaklaşık 1 mm arkasına yerleştirin (Şekil 2C). Sklera ve retinayı radyal olarak kesmeye başlayın.
    1. Küreyi yönlendirmek ve döndürmek için keskin forsepsler kullanarak limbusun arkasında ve paralelinde tutarlı bir kesme çizgisi koruyun. Kesimleri en aza indirmek ideal olsa da, temiz bir radyal yolu korumaya öncelik verin. Retina ve sklera ayrılırsa, iris makas bıçağını birlikte kesmek için yeniden konumlandırın.
      NOT: Limbusun kesilmesi, lens ekstraksiyonu sırasında retinanın skleradan ayrılmasına neden olabilir. Küçük keskin nişancılar ve dönüşler kabul edilebilir. Retina fıtıklaşması riski taşıdığından, sabitlemek için kuvvet uygulamaktan kaçının.
    2. İris makas bıçağının orta genişliğini kullanarak 1 mm arka mesafeyi tahmin edin. Emin olmadığında, retinanın limbusla bağlantısı içe doğru kıvrıldığı için daha arka bir pozisyona doğru hata yapın. Daha arkada bir kesi, düz retina ekstraksiyonunu kolaylaştırır.
  9. Limbusa paralel radyal kesimi tamamladıktan sonra, kalan retina bağlantılarını kontrol edin. Ön ve arka küre bölümleri ayrılana kadar bunları iris makasıyla dikkatlice kesin.
  10. İki çift keskin #5 forseps kullanarak, dünyanın ön ve arka kısımlarını nazikçe ayırın (Şekil 3H). Daha yaşlı farelerde, şeffaf lifler lensi retina kabına bağlayabilir; Retinal-skleral ayrımı en aza indirirken bunları iris makasıyla dikkatlice kesin.
    NOT: Lens limbus ve korneaya bağlı kalmalıdır.
  11. Filtre kağıdını bir destek platformu olarak kullanarak, retinayı iris makasıyla yonca yaprağı (demir haç olarak da bilinir) şeklinde kesin (Şekil 3I-K).
    NOT: Yonca yaprağı kesileri, bu dilim ile kayıt oryantasyonu isteniyorsa, başlangıçta limbus yoluyla yapılan birincil yönlendirme insizyonundan daha kısa olmalıdır. Bu üç yeni radyal insizyonun boyutunun, birincil insizyondan yaklaşık 1-2 mm daha kısa olacak şekilde küçültülmesini öneririz. Oryantasyon için opsin gradyanı gibi farklı bir özellik kullanılacaksa, retina ve skleranın ayrılmasını önlemek için insizyonun en derin kısmı ile optik sinir başı arasında her zaman yaklaşık 1 mm doku tutulurken tüm kesilerin aynı uzunlukta olması uygundur.
  12. Diseksiyonu ikinci gözle tekrarlayın. Nekrozu en aza indirmek için, ötenaziden sonraki 10 dakika içinde ikinci gözün ön kamarasının tamamen çıkarılması.

2. Kriyoprezervasyon

  1. Diseke retina ve skleradan (bundan böyle retina olarak anılacaktır) daha büyük bir açıklık oluşturmak için ucu keserek tek kullanımlık bir transfer plastik pipeti hazırlayın.
  2. Retinayı pipete yavaşça emdirin ve bir cam mikroskop lamı üzerine koyun. Bir laboratuvar mendili kullanarak, retina etrafındaki fazla Ames solüsyonunu, artık serbestçe yüzemeyecek ve düzleşebilecek duruma gelene kadar dikkatlice çıkarın.
  3. İki keskin #5 forseps kullanarak retinayı açın ve iç göz kabı yukarı bakacak şekilde düz bir şekilde konumlandırın. Dokunun boyutuna bağlı olarak, retinayı daha da düzleştirmek için her yonca yaprağı segmentinde 0,5-2 mm'lik kabartma kesikleri yapın ve katlanmayı önlemek için dokuyu dikkatlice ayarlayın (Şekil 5A). Sıvı sadece retinaya bitişik kalana kadar ilave Ames solüsyonunu çıkarın.
  4. Bir lamel kullanarak, retinayı (Şekil 5B) çevresindeki sıvıyla birlikte hızlı bir şekilde bastırın ve aktarın, böylece dış sklera yukarı bakar ve iç göz kabı lamel ile temas eder, yani retina ganglion hücreleri yukarı bakar (Şekil 5C).
  5. Retinanın katlanmadığını doğrulayın ve gerektiği gibi ayarlamalar yapın; daha kolay manipülasyon için Ames çözeltisi ekleyin. Fazla sıvı dokunun kıvrılmasına neden olacağından, tüm fazla Ames solüsyonunu çıkarmak için bir laboratuvar mendili kullanın ve retinanın 5-10 saniye kurumasını bekleyin.
    NOT: Kısa bir hava kurumasına izin verilmemesi, kriyoseksiyon sırasında rastgele doku-OCT ayrılmasına neden olabilir. Aşırı hava kurutması, tuz kristali ile ilgili doku hasarına neden olabilir.
  6. Retinayı kaplamak için OCT besiyeri uygulayın ve bu tabakayı lamel boyunca eşit şekilde yaymak için forseps kullanarak retina yüzmesini önleyin. OCT ortamının retinaya nüfuz etmesi için 30 saniye bekleyin.
  7. Sıvı nitrojen buharı ile dolaylı olarak soğutulmuş bir metal plaka kullanarak veya kuru buzla doğrudan temas ettirerek retinayı OCT'de (Şekil 5D) hızlı dondurun.
  8. Retinaları hemen kullanıyorsanız kuru buz üzerinde veya -80 °C'lik bir dondurucuda, uzun süre saklanacaksa plastik bir torba veya kurutucu içeren bir kapta saklayın.

3. Kriyoseksiyon

  1. Kriyostat odasını -18 °C'ye ve aşamayı -12 °C'ye ayarlayın. Sıcaklığa dengelemek için retinayı hazneye yerleştirin.
  2. Numune aynası üzerinde bir OCT kubbesi oluşturun. Aynı model kriyostat kullanıyorsanız, bu kubbenin iç 2-3 halkayı kapladığından emin olun. Dondurulduktan sonra, laminer düzlüğü korumak için ayna üzerindeki bıçağa paralel düz bir sahne yüzeyi oluşturmak için OCT kubbesini düzeltin (Şekil 6A).
  3. Mandren'i kriyostat aşamasıyla ilişkilendiren yönlendirme kılavuzunu oluşturun veya not edin.
    NOT: Önerdiğimiz model kriyostatta, yönlendirme kılavuzu, ayna tutucusunun üzerindeki saat 12 konumuna kazınmış merkezi bir çizgidir, aynanın kendisi ise en dış halkada üçgen bir oyuğa sahiptir. Birlikte, bu özelliklere oryantasyon kılavuzu diyoruz. Kriyostatınız bu tür özelliklere sahip değilse, kendi işaretleyicinizi yapmak için kalıcı bir işaretleyici kullanmanızı öneririz.
  4. Retinayı lateral olarak çevreleyen fazla OCT'yi çıkararak ve ardından retinayı hareketli hale getirmek için lamel den dikkatlice ayırarak retinayı bir tıraş bıçağı kullanarak transfer için hazırlayın.
  5. Mandreni sahneden çıkarın ve hazırlanan düz OCT sahne yüzeyine küçük bir damla sıvı OCT uygulayın.
  6. Önceden soğutulmuş (-18 °C) bir cam slayt kullanarak, retinayı OCT aşamasına karşı donana kadar 10-30 saniye basılı tutun.
  7. Tam yapışmayı sağlamak için retina ve aşama üzerine ek OCT uygulayın. Kriyostatın hızlı donma alanında dondurun. Tam yapışmayı sağlamak için retina / OCT aşamasını kriyostatta en az 30 dakika inkübe edin.
  8. Bölümlere ayırmaya başlayın:
    1. Retina görünür hale gelene kadar fazla OCT'yi dikkatlice kesin (Şekil 6B). Blok kenarlarından fazla OCT'yi çıkarmak için tıraş bıçağını kullanın.
      NOT: Herhangi bir manuel, radyal kırpmadan sonra bölümlere ayırmaya devam etmeden önce her zaman sahneyi geri çekin. Dilimleri yüzden kesmek için, istenen bölümler için kullanılacak olanla aynı kesim kalınlığını kullanmanızı öneririz; Bununla birlikte, kırpma kalınlığı kullanıcı tercihine bağlı olarak 10 μm ile 100 μm arasında olabilir.
    2. Sklera varlığı için bölümleri incelerken kırpmaya devam edin. Sklera görünür olduğunda, sahne açısını gerektiği gibi ayarlayın. Bölümler eşit sklera dağılımı gösterene kadar kesmeye devam edin, bu da her bölümde optimum düzlük ve maksimum yonca yaprağı alanı sağlar.
    3. Doku kesitlerini toplayın (Şekil 6C).
      NOT: Optimum kalınlık, gerçekleştirilen son tahlile bağlı olacaktır ve bu aşağı akış protokolüne uymalıdır. Örneğin, 10X Xenium kullanılıyorsa, 20 μm kalınlığında bölümler öneririz. 10X Vis için ise 15 μm kalınlığındaki bölümler daha uygundur.
    4. Önceden soğutulmuş slaytlar kullanın ve iki boya fırçası kullanarak bölümleri yerlerine yerleştirin.
    5. OCT eriyene ve doku yapışana kadar (yaklaşık 5 s) bölümün altına parmağınızı yerleştirin.
    6. Dokuyu yeniden dondurmak için slaytı soğuk bir yüzeye geri koyun.
      NOT: Küçük alanlarda bölümler toplarken (örn. Xenium için), birden fazla donma-çözülme döngüsü gerekli olabilir. Bu, prob tabanlı teknikleri etkilemese de, tarafsız dizileme yaklaşımları için RNA kalitesini etkileyebilir.
  9. Slaytları hemen kullanım için kuru buz üzerinde, ertesi gün RNAscope için -20 °C'de ve uzun süreli saklama için -80 °C'de saklayın.

4. Hedef tespiti ve mikroskopi

NOT: Teknik diğer moleküler profilleme yöntemleriyle uyumlu olsa da, RNAscope'u doğrulanmış bir örnek olarak detaylandırıyoruz.

  1. Örnek hazırlama:
    1. Slaytları -80 °C'deki depodan çıkarın ve -20 °C'de 1 saat ısıtın.
      NOT: Slaytlar, bu prosedürün geri kalanına başlamadan önce -20 °C'de 12 saate kadar saklanabilir, ancak RNA bozulmasını en aza indirmek için -20 °C'de çok uzun süre bırakılmamalıdır.
  2. Slaytları 37 °C'de 10 saniye boyunca hızlı bir şekilde ısıtın.
  3. Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca taze% 4 PFA'ya batırarak dokuyu sabitleyin.
  4. Slaytları 1x PBS ile iyice yıkayın.
  5. Etanol serisi ile doku dehidrasyonu: 5 dakika boyunca% 50 etanol, 5 dakika boyunca% 70 etanol, 5 dakika boyunca% 100 etanol, 5 dakika boyunca% 100 etanol.
    NOT: Bu, doku montajı için kritik bir kalite kontrol adımıdır. Dehidrasyon sırasında doku ayrılması meydana gelirse, montaj sırasında bitişik bölümlerden OCT örtüşmesini gösterir. Kesit alma ve montaj sırasında fazla OCT'nin dikkatli bir şekilde kesilmesi bu sorunu önler.
  6. Bariyer hazırlığı:
    1. Slaytları tezgah üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika havayla kurutun.
    2. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak, her doku bölümünün etrafına bir bariyer çizin. Bariyerin oda sıcaklığında 5 dakika tamamen kurumasını bekleyin.
  7. Moleküler algılama:
    1. Doku geçirgenliği için Proteaz IV tedavisi uygulayın.
    2. Hedef prob hibridizasyonu, (40 °C'de 2 saat), sinyal amplifikasyon adımları (üç sıralı amplifikatör), florofor tespiti (üç pleks boyama için dört sıralı tur) için üreticinin protokolüyle devam edin.
  8. Görüntüleme:
    1. Her kapak camı montajından önce DAPI nükleer karşı boyama yapın.
    2. Kapak camını antifade montaj ortamını kullanarak monte edin.
    3. Uygun filtre setleri ile floresan mikroskobu kullanılarak görüntü.
    4. Multipleks algılama için, hesaplamalı kayıt için dört algılama turunun tamamında aynı alanı yakalayın.
    5. Doğru sinyal karşılaştırması için turlar arasında tutarlı pozlama ayarlarını koruyun.
      NOT: RNAscope uygulamasıyla ilgili tüm ayrıntılar için üretici protokollerine bakın ( Malzeme Tablosuna bakın). Xenium gibi tam otomatik platformlar için, tüm üretici protokol adımlarını tam olarak sağlandığı gibi izleyin. Tüm protokoller için, bu örnek protokolde belirtildiği gibi, OCT örtüşmesi nedeniyle doku dekolmanı nedeniyle doku dekolmanı nedeniyle başarısızlığın büyük olasılıkla erken bir dehidrasyon veya yıkama adımı sırasında ortaya çıkacağını tahmin edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, retina yüzeyi boyunca uzamsal ilişkileri korurken, çoklu moleküler profilleme yaklaşımları için uygun sağlam yüz retina kesitleri üretir. Protokolün faydasını, geleneksel immünohistokimyadan manuel multipleks RNA tespitine ve otomatik yüksek verimli moleküler profillemeye kadar ilerleyen sistematik bir doğrulama yaklaşımıyla gösteriyoruz.

Protokolümüzün ilk validasyonu, tüm retinal laminalarda doku bütünlüğünü ve yapısal korumayı değerle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntem, modern moleküler profilleme teknolojilerine uygun ince yüz kesitlerinin üretilmesini sağlayarak retinal uzamsal biyolojideki kritik bir teknik engeli ele almaktadır. Protokoldeki en kritik adımlar, ilk diseksiyon sırasında doku işleme ve kriyoprezervasyon ve kesit alma sırasında sıcaklık ve hidrasyonun hassas kontrolü etrafında toplanmaktadır. Başarılı uygulama, özellikle OCT yerleştirmeden önce uygun doku düzleşmesinin sağlanmasına ve kesit alma işlemi bo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Colorado Üniversitesi Kanser Merkezi (P30CA046934) bünyesindeki İnsan Bağışıklık İzleme Ortak Kaynağına (RRID:SCR_021985) 10X Xenium platformunun işletilmesindeki uzman yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01EY035293) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ames ve başbakan; OrtaSigma-AldrichA1420-10X1LBelirli marka önemli değil
Boncuk Ustası İplik Zap, İplik BrülörBoncuk Fabrikası7.90524E+11Alternatif koterizatörler kullanılabilir
KriyostatLeicacm1950Önemli hususlar ayrı ayrı kontrol edilebilir hacim ve sahne sıcaklığıdır.
Kuru BuzNANANA
Güzel Bilim Araçları Dumont #5 ForsepsGüzel Bilim Araçları 1129500NC9889584Belirli marka önemli değil
Fisher Healthcare Tissue-Plus OCT BileşikFisher Scientific23-730-571Belirli bir marka önemli değil
Fisherbrand Yüksek Hassasiyetli Düz İnce Uçlu Cımbız/ForsepsFisher Scientific12-000-127Belirli bir marka önemli değil
Fisherbrand Standart Diseksiyon MakasıFisher Scientific08-951-20Belirli bir marka önemli değil
Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları FisherScientific22-037-246Belirli bir marka önemli değil
Integra Miltex Noyes İris MakasıIntegra Miltex 18151012-460-278Belirli bir marka önemli değil
Olympus IX81 eğirme diski epifloresan mikroskobuŞekil 7
RNAscope HiPlexACDBio
Dikdörtgen Kapaklı GözlüklerFisher Scientific12-541-033Belirli marka önemli değil
Sodyum bikarbonatSigma-AldrichS6014-25GBelirli marka önemli değil
Thermo Scientific Nunc Cam Alt TabaklarFisher Scientific12-567-400Belirli marka önemli değil
Dünya Hassas Alet Hassas Stereo Zoom Trinoküler Mikroskop (IV) Bom Standı ÜzerindeDünya Hassas Aleti PZMTIVBS50-253-8607Belirli marka önemli değil
Zeiss Axio Imager.M2 epifloresan mikroskobu Optik kesit alma etkin (Şekil 8 için)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Heukamp, A. S., Warwick, R. A., Rivlin-Etzion, M. Topographic variations in retinal encoding of visual space. Annu Rev Vis Sci. 6, 237-259 (2020).
  3. Collin, S. P. A web-based archive for topographic maps of retinal cell distribution in vertebrates. Clin Exp Optom. 91 (1), 85-95 (2008).
  4. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. GraSP gene targets to hierarchically infer sub-classes with CuttleNet. bioRxiv. , (2024).
  5. Rheaume, B. A., et al. Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes. Nat Commun. 9 (1), 2759(2018).
  6. Tran, N. M., et al. Single-cell profiles of retinal ganglion cells differing in resilience to injury reveal neuroprotective genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  7. Yan, W., et al. Mouse retinal cell atlas: Molecular identification of over sixty amacrine cell types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  8. Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Curr Biol. 24 (3), 310-315 (2014).
  9. Holmgren, C. D., et al. Visual pursuit behavior in mice maintains the pursued prey on the retinal region with least optic flow. eLife. 10, e70838(2021).
  10. Tapia, M. L., Nascimento-dos-Santos, G., Park, K. K. Subtype-specific survival and regeneration of retinal ganglion cells in response to injury. Front Cell Dev Biol. 10, 956279(2022).
  11. Berchuck, S. I., Mukherjee, S., Medeiros, F. A. Estimating rates of progression and predicting future visual fields in glaucoma using a deep variational autoencoder. Sci Rep. 9 (1), 18113(2019).
  12. de Gainza, A., et al. The trajectory of glaucoma progression in 2-dimensional structural-functional space. Ophthalmol Glaucoma. 3 (6), 466-474 (2020).
  13. Choi, J., et al. Spatial organization of the mouse retina at single cell resolution by MERFISH. Nat Commun. 14 (1), 4929(2023).
  14. Kremers, L., et al. Super-resolution STED imaging in the inner and outer whole-mount mouse retina. Front Ophthalmol. 3, 1126338(2023).
  15. Simon, P., Thanos, S. Combined methods of retrograde staining, layer-separation and viscoelastic cell stabilization to isolate retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci Methods. 83 (2), 113-124 (1998).
  16. Lindqvist, N., Vidal-Sanz, M., Hallböök, F. Single cell RT-PCR analysis of tyrosine kinase receptor expression in adult rat retinal ganglion cells isolated by retinal sandwiching. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 75-83 (2002).
  17. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  18. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. -P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions: Molecular clock in rat photoreceptors. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  19. Jaeger, C., et al. Circadian organization of the rodent retina involves strongly coupled, layer-specific oscillators. FASEB J. 29 (4), 1493-1504 (2015).
  20. Hecht, R. M., Shi, Q., Garrett, T. R., Sivyer, B., Morgans, C. Split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina. J Vis Exp. (203), e65757(2024).
  21. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. A Complete spatial map of mouse retinal ganglion cells reveals density and gene expression specializations. bioRxiv. , (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Uzamsal TranskriptomikRetinal LaminasyonTek H cre DizilemeRNAscope HibritlemeXenium Uzamsal DizilemeRetinal Gangliyon H creleriMultipleks RNA TespitiDoku Mimarisi Korunumu

İlgili makaleler