Memeli embriyolarının vitrifikasyonu için spatula Montevideo cihazı

Geraldine Schlapp; María Noel Meikle; Lucía Goyeneche; Pedro Dos Santos Neto; Martina Crispo

doi:10.3791/68176

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Memeli embriyolarının vitrifikasyonu için spatula Montevideo cihazı

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68176

⸱

6 Haziran 2025

Geraldine Schlapp^*¹ , María Noel Meikle^*¹ , Lucía Goyeneche² , Pedro Dos Santos Neto³ , Martina Crispo¹

¹Laboratory Animal Biotechnology Unit, Institut Pasteur de Montevideo, ²Centro de Esterilidad Montevideo, ³Fundación IRAUy, Instituto de Reproducción Animal de Uruguay

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, ev yapımı bir spatuladan oluşan ve ev yapımı solüsyonlar kullanan fare ve koyun implantasyon öncesi embriyoları vitrifikasyon için Spatula Montevideo protokolünü sunuyoruz. Embriyolar, artan konsantrasyonda iki kriyoprotektan çözelti içinde hızla dengelenir, spatula üzerine yüklenir, sıvı nitrojene daldırılır ve son olarak 0.5 mL'lik bir samanla kapatılır.

Özet

Bu çalışma, Spatula Montevideo (MVD) olarak bilinen fare ve koyun embriyosu kriyoprezervasyonu için verimli ve uygun maliyetli bir vitrifikasyon yöntemini tanımlamaktadır. Bu protokol, taşıyıcı cihaz olarak bir jel yükleyici ucu ile hazırlanan ev yapımı bir spatula kullanır. Embriyolar, artan konsantrasyonda iki ev yapımı kriyoprotektan çözeltisi içinde hızla dengelenir, spatulaya yüklenir ve daha sonra doğrudan sıvı nitrojene daldırılır. Yaklaşık 30-40 implantasyon öncesi aşamadaki fare embriyosu, daha sonra 0.5 mL'lik bir pipetle kapatılan spatula üzerine yüklenebilir. Vitrifiye embriyoları saklamak için sıklıkla kullanılan kriyotüpler yerine spatulaların kullanılması, sıvı nitrojen dewarlarındaki alanı optimize eder. Ek olarak, ısınma işlemi, embriyoları yeniden sulandırmak ve morfolojilerini eski haline getirmek için yalnızca azalan konsantrasyona sahip ev yapımı bir sükroz çözeltisi gerektirir. Laboratuvarımız, 10 yılı aşkın bir süredir fare ve koyun implantasyon öncesi embriyoları için Spatula Montevideo'yu başarıyla kullanmaktadır. Spatula Montevideo, fare embriyolarında ortalama %84'lük bir iyileşme oranı (kurtarılmış/vitrifiye edilmiş embriyolar) ve %97'lik bir hayatta kalma oranı (canlı/iyileşmiş embriyolar) göstermiştir. Üreme sonuçlarında (gebelik, doğum ve doğum oranları) herhangi bir fark gözlenmemesine rağmen, murin embriyolarının vitrifikasyonu yavaş dondurmadan daha iyi sonuçlar vermiştir. Koyun embriyolarında, ticari bir cihaza kıyasla Spatula Montevideo ile benzer sağkalım ve embriyo gelişim oranları elde edilmiştir. Ticari cihaz için gebelik oranı daha yüksek olmasına rağmen, kuzu sağkalım oranı cihazlar arasında anlamlı olarak farklı değildi. Spatula Montevideo vitrifikasyon yöntemi, fazla embriyoları saklamak, genetiği değiştirilmiş fare hatlarını ve koyun modellerini yedeklemek ve dünya çapındaki araştırmacılar arasında değişimini kolaylaştırmak için kullanılabilecek basit bir kriyoprezervasyon tekniğidir.

Giriş

Genetiği değiştirilmiş (GM) hayvan üretiminin etkinliği, endonükleaz bazlı yöntemlerin, özellikle CRISPR/Cas9'un geliştirilmesi nedeniyle önemli ölçüde artmıştır. Dünya çapında birçok laboratuvar, genetik sürüklenmeyi önlemek ve orijinal fenotip^1'in bütünlüğünü korumak için dondurularak saklanması gereken çeşitli GM fare ve sıçan hatları üretir. Ek olarak, arşivleme, genellikle aşırı hayvan sayısıyla sonuçlanan sürekli üreme ihtiyacını ortadan kaldırır. Bazı laboratuvarlar, GM fare hatlarını dondurularak saklanmış embriyolar veya spermler olarak uluslararası depolara göndererek, canlı hayvanların taşınmasını önlerken bu modellerin değişimini ko....