Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Gerçek Zamanlı PCR Kullanılarak SNP Genotipleme ile Caenorhabditis elegans Mayozunda Çaprazlama Sıklığı ve Dağılımı

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68183

⸱

11 Temmuz 2025

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Caenorhabditis elegans'ta mayoz bölünme sırasında çaprazlama frekanslarını ve dağılımını ölçmek için bir yöntem sağlar. Kromozomların kökenini belirlemek için gerçek zamanlı PCR ile tek nükleotid polimorfizm genotiplemesi kullanıldı. 4 noktalı haritalama, her kromozomun sol kol, merkez ve sağ kol bölgelerinin çapraz dağılımlarını belirlemeye izin verdi.

Özet

Caenorhabditis elegans , mayoz bölünmeyi incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Kısa bir üreme döngüsü, birçok döl ve görüntüleme için şeffaf bir gövde gibi genel avantajlara ek olarak, altı çift homolog holosentrik kromozom vardır. Güçlü çaprazlama girişimi ve çaprazlama dağılımının düzenlenmesi vardır. Çaprazlama frekansını ölçmek için, görünür belirteç haritalaması, snip-SNP haritalaması ve çaprazlama oluşumunun öncüleri olarak sitolojik belirteçlerin nicelleştirilmesi geliştirilmiştir. Burada, C. elegans oogenezisindeki çaprazlama frekansını ve dağılımını ölçmek için modifiye edilmiş bir SNP genotipleme yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem, kısıtlama, sindirim ve jel elektroforezinin zahmetli adımlarını atlayabilir ve kesilmemiş DNA bantlarının belirsiz yargısını önleyebilir. Tek nükleotid polimorfizmi (SNP) genotiplemesi, Bristol/Hawaii hibrid suşu kullanılarak gerçekleştirilir. Hermafroditleri myo-3p::GFP eksprese eden erkeklerle çaprazlamak, oogeneze odaklanmamızı sağlar. Tek bir solucan lizatı, altı kromozomun tümü için yeterli DNA şablonu üretir. 5' eksonükleaz bazlı TaqMan kimyası ve SNP'ye özgü küçük oluk bağlayıcı (MGB) probları, SNP'nin yaklaşık% 97.7'lik bir genotipleme oranında hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. C. elegans'ta çaprazlama frekansını ölçmek için SNP'lerin doğru tespitini kullanıyoruz. Bu yöntem aynı zamanda erkek veya çaprazlama kusurlu mutantlarda çaprazlama frekansını belirlemek için ve ayrıca daha spesifik kromozomal aralıklar için de uygulanabilir.

Giriş

Homolog kromozomlar arasındaki çaprazlama oluşumu, kromozomların uygun şekilde ayrılması ve ayrıca genetik çeşitliliğin oluşturulması için gereklidir1. Çaprazlama oluşumundaki hatalar anöploidiye neden olur, bu da kısırlığa, düşüklere ve doğum kusurlarına yol açabilir2. Çaprazlama sıklığı kromozom bölgesine, mutant tipine, yaşa ve cinsiyete göre değişir ve bu koşulların her biri altında çaprazlama sıklığını doğru bir şekilde ölçme ihtiyacının altını çizer 3,4,5. Bu yöntemin genel amacı, her bir kromozomal alanın çaprazlama frekansını doğru bir şekilde ölçmek ve böylece C. elegans kromozomunun tüm uzunluğu boyunca çaprazlamaların dağılımını doğru bir şekilde belirlemektir.

Geleneksel olarak, 6,7,8,9,10 geçiş frekansını ölçmek için morfolojik belirteçler kullanan iki noktalı haritalama kullanılmıştır. C. elegans'ta, kromozom haritaları oluşturmak için genellikle dumpy, short, fat body (Dpy) ve uncoordinated movement (Unc) fenotiplerikullanılır6. Bu yöntemin avantajları, düşük maliyeti ve birçok nesli analiz etme yeteneğidir. Bu yöntemlerin dezavantajları, ilgilenilen odakları seçmenin sınırlandırılmasını ve fenotipleri görünür olmadığı için ölümcül döllerin kullanılamadığını içerir. Yer seçiminin zorluğunun üstesinden gelmek için, Tc1 transpozonları polimorfik dizi etiketli siteler (STS) için işaretleyici olarak kullanılmıştır11,12. Tc1'ler PCR ve elektroforez kullanılarak tespit edilebilir. Standart Bristol N2 suşu 30 kopya Tc1 transpozonuna sahipken, Fransa'daki Bergerac'tan (RW7000 ve DP13) C. elegans izolatları 500 kopya Tc1'e sahipti. Bu nedenle, Tc1 transpozonlarının sayısı ve dağılımı izolatlar arasında değişir ve bu, PCR ile izolatlar arasındaki hibrit solucanların soylarının kromozomlarını analiz etmek için kullanılır. Daha sonra, SNP'ler çaprazlama frekansını ve dağılımını ölçmek için de kullanıldı13,14. Bristol N2 ve Hawaii CB4856 suşları arasındaki SNP, her 1.000 bp'debir 15,16'da bir ortaya çıktı. SNP'ler, PCR, kısıtlama sindirimi ve elektroforez kullanılarak kısıtlama fragmanı uzunluk polimorfizmleri (RFLP) olarak tespit edilir. Son zamanlarda, Bristol N2 ve Hawaiian CB4856 arasındaki SNP'lerin yanı sıra küçük ekleme/silme (InDel) bölgeleri daha verimli belirteçler olarak önerilmiştir17. Bununla birlikte, Tc1, RFLP ve InDel kullanılarak geçiş frekansının ölçülmesi, PCR, restriksiyon enzimi tedavisi ve elektroforez gibi emek yoğun süreçler gerektirir. Her bir süreç büyük ölçekli bir analizde optimize edilmezse, PCR'nin doğruluğu, kullanılan restriksiyon enziminin türü, DNA bölünmesinin etkinliği ve elektroforez sırasında bantların netliği ve ayrılması gibi faktörler nedeniyle sonuçlar yanlış yorumlanabilir. Buna karşılık, önerilen yöntem, doğru ve kesin miktar tayinini kolaylaştırmak için gerçek zamanlı PCR ile SNP genotiplemesini kullanır.

Çaprazlamalar kromozomlar boyunca rastgele dağılmaz. C. elegans'ta, tekli geçişler kollarda daha sık oluşma eğilimindedir ve merkezde bastırılır 3,5. Morfolojik iki noktalı haritalama, işaretleyici genlerin dışında çaprazlamaların nerede meydana geldiğini belirleyemez. Tersine, SNP haritalaması, belirteçlerde bir artışa izin verir ve tüm kromozom 5,14,18 boyunca bir çaprazlamanın tam bölgesinin belirlenmesini kolaylaştırdığı gösterilmiştir. Bu çalışmada, Rockman ve Kruyglyak5 tarafından önerilen kromozomal alan sınırlarını kullandık ve analiz için dört SNP seçtik: kromozomun her iki ucunda ve merkez / kol sınırlarının her iki ucunda.

Önceki yöntemlerden yararlanarak, her bir kromozomun sol kolu, merkezi ve sağ kolu arasındaki geçişi ölçmek için TaqMan, 5' nükleaz19 kullanarak gerçek zamanlı PCR ile doğru ve hızlı bir SNP tespit yöntemi önerdik. Yöntemimizin alternatif teknolojilere göre avantajları, öncekiçalışmalara kıyasla 20,21,22, doğruluk ve basitliktir. Bu yöntem, C. elegans için qPCR uygulanan bir çapraz analiz yöntemidir ve mayoz bölünme üzerine çalışan araştırmacılar için yaygın olarak uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İlk genetik çaprazlama

  1. 35 mm'lik tabakta küçük bir OP50 noktası (~ 5 mm çapında) ile normal Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakalarını içeren eşleşen plakalar hazırlayın.
  2. Bir çiftleşme plakasına Bristol N2 suşunun üç L4 hermafroditini (veya Bristol kökenli mutantları) ve Hawaii CB4856 suşunun dokuz genç yetişkin erkeğini ekleyin (Şekil 1A).
    NOT: Yüksek embriyonik ölümcüllüğe sahip mutantları analiz etmek için, bu çaprazlamada hem Bristol hem de Hawaii geçmişine sahip dengeli mutantları kullanmak gerekir. Hawaii geçmişine sahip mutantları elde etmek için, Bristol mutantları, tüm SNP ilgi alanları Hawaii geçmişine sahip olana kadar Hawaii suşu ile en az altı kez çaprazlanmalıdır. Sonuç olarak, Hawaii mutantı sadece mutasyona uğramış bölgede ve dengeleyici kromozomda Bristol arka planı içerir.
  3. İki suşu eşleştirmek için plakayı 20 ° C'de 1,5 gün inkübe edin. Her hermafroditi OP50 ile yeni bir ayrı NGM plakasına aktarın.
  4. Döllenmiş yumurtaları bırakmalarını sağlamak için plakaları 1 gün boyunca 20 °C'lik bir kuluçka makinesine koyun. Her hermafroditi OP50 ile yeni bir ayrı NGM plakasına aktarın.
  5. Döllenmiş yumurtaların tekrar bırakılmasını sağlamak için plakaları 1 gün boyunca 20 °C'lik bir kuluçka makinesine koyun. Hermafroditleri çıkarın. Dölleri L4'e büyütmek için plakaları 20 ° C'lik bir inkübatörde 0,5 - 1 gün tutun.

2. İkinci çarpı

  1. Altı çaprazlanmış L4-hermafrodit (Bristol/Hawaii melezleri) ve 12-15 ccIs4251[(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitokondriyal GFP + dpy-20(+)] I (TTS24) Bristol erkeklerini yeni bir çiftleşme plakasına seçin (Şekil 1B).
    NOT: ccIs4251 yerleştirilen suş, Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden elde edilmiştir ve vahşi tip N2 suşu ile altı defadan fazla çaprazlanmalıdır.
  2. Plakayı çiftleşmek için bir kuluçka makinesinde 20 °C'de 1,5 gün tutun. Her hermafroditi OP50 ile yeni bir NGM plakasına aktarın.
  3. Döllenmiş yumurtaları bırakmalarını sağlamak için plakaları 1 gün boyunca 20 °C'lik bir kuluçka makinesine koyun. Her hermafroditi OP50 ile yeni bir ayrı NGM plakasına aktarın.
  4. Plakaları tekrar döllenmiş yumurta bırakmalarını sağlamak için 20 °C'lik bir kuluçka makinesinde 1 gün bekletin. İlk çaprazlamanın başarılı olup olmadığını kontrol etmek için her ebeveyn hermafroditini 3 μL lizis tamponu içeren bir PCR tüpüne aktarın.
  5. Kromozom V'in bir bölgesinde PCR ile bir Bristol / Hawaii melezi olarak ebeveynlerin genotiplerini kontrol edin. Bantları% 2.5 agaroz jel elektroforezi ile ayırın.
    1. SNP, WBVar01973670'de, Bristol genomundan PCR amplikonunun uzunluğu 220 bp'dir ve Hawaii genomundan 196 bp'dir. PCR sonuçları ebeveynlerin Bristol homozigotları olduğunu gösteriyorsa, bunun nedeni ilk çaprazlamanın kendi kendine döllenmesidir. Daha fazla analiz için bu solucanların soylarını kullanmayın.

3. Örnekleme

  1. Solucan lizis tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın: 50 mM KCL, 10 mM Tris pH 8.2, 2.5 mM MgCl2, %0.45 IGEPAL CA-630 (NP-40), %0.45 Tween 20 ve %0.01 jelatin. Süzülerek sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın. Kullanmadan hemen önce, 1 mL lizis tamponuna 3 μL 20 mg / mL proteinaz K (H2O cinsinden) ekleyin ve -20 ° C'de alikotlarda saklayın.
  2. Solucanları tek tek PCR tüplerine eklemeden önce floresan diseksiyon mikroskobu ile ikinci çaprazın döllerinin vücut duvarı kasındaki GFP'nin ekspresyonunu kontrol edin. Büyütme 6.1-55x ve kullanılan dalga boyu 440-460 nm'dir.
  3. GFP pozitif tek bir solucan seçin ve 3 μL solucan lizis tamponu içeren her bir PCR tüpüne ekleyin (Şekil 1C). 360 PCR tüpünün her birinde toplam 360 (90 x 4 biyolojik kopya) yetişkin erkek çapraz döl toplayın.
    NOT: Kendi kendine döllenmiş yavruların toplanmasını önlemek için, örnekleme için GFP pozitif solucanlar seçilmelidir. L4'ten daha genç eşleşmemiş hermafroditler de otozomların analizi için mevcuttur, ancak farklı sayıda X kromozomuna sahip oldukları için, erkekler ve hermafroditler L4'e büyüdükten sonra tanımlanmalı ve X kromozomu analiz edilirken örneklenmelidir.
  4. Numuneleri -80 °C'lik bir dondurucuda 5 dakika bekletin. Numuneler, lizis başlayana kadar -80 °C'de saklanabilir.
  5. Yüksek embriyonik ölümcüllüğe sahip mutantları analiz ederken, tarafsız sonuçlar elde etmek için canlı larvalar yerine ölü embriyoları toplayın. Embriyoları toplamak için 0.5 μL kitinaz çözeltisi (20 mg / mL kitinaz, 50 mM NaCl, 70 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2) içeren bir pipet ucu kullanın. Embriyoları yumurtladıktan sonraki 4 saat içinde toplayın.
    NOT: 4 saatten daha uzun bir süre önce bırakılan ölü embriyolar, muhtemelen genomik DNA'nın bozulması nedeniyle PCR analizi için uygun değildir.

4. Numune lizisi

  1. PCR tüplerini termal döngüleyicide 1 saat boyunca 60 °C'ye, ardından 95 dakika boyunca 15 °C'ye ayarlayın. Her tüpe 100 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve iyice karıştırın.
  2. Gerçek zamanlı PCR ile SNP genotiplemeye başlayana kadar numuneleri -20 °C'de saklayın.

5. SNP genotiplemesi

  1. Aşağıdaki gibi bir karışım yapın (Şekil 2). 1.5 mL'lik bir tüpe 125 μL Master Mix, 6 μL SNP Genotipleme Testi (40x), 280 μL Damıtılmış su (DW), İleri astar (450 nM), Ters astar (450 nM), Prob 1 (100 nM), Prob 2 (100 nM).
    NOT: Problar ve primerler Tablo 1'de listelenmiştir.
  2. Homojen bir konsantrasyon sağlamak için birkaç kez pipetleyerek iyice karıştırın. 12 kanallı bir mikropipet ile destek tabanındaki 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna 4 μL karışım ekleyin.
  3. Her bir genomik DNA'yı içeren 1 μL lizattan her bir oyuğa ekleyin ve birkaç kez pipetleyerek karıştırın.
  4. Pozitif kontroller, yani Bristol homozigotları, Hawaii homozigotları ve Bristol/Hawaii melezleri ve negatif kontroller olarak üç şablonsuz kontrol hazırlayın (Şekil 3A).
  5. Plakayı optik bir yapışkan filmle kapatın. Bir aplikatör kullanarak her bir kuyucuğun kenarlarına odaklanarak filmi bastırın.
  6. Alttaki sıvıyı toplamak ve sıvıdaki hava kabarcıklarını çıkarmak için plakayı kısa bir süre santrifüjleyin.
  7. Plakayı gerçek zamanlı PCR cihazına yükleyin. Tıkla Yeni Deney Oluştur yazılımdaki düğmesine basın.
  8. Özellikler ayarında, Enstrüman türü'nü QuantStudio 1 Sistemi, Blok türü'nü 96 kuyucuklu 0,2 mL Blok, Deneysel tür'ü Genotipleme, Kimya'yı TaqMan Reaktifleri ve Çalıştırma modu'nu Hızlı olarak ayarlayın.
  9. Yöntem ayarında, Hacmi 5 μL'ye (doğru reaksiyon hacminin kurulumla eşleştiğinden emin olun), Döngü Sayısını 40 döngüye (varsayılan) ayarlayın. Sıcaklık ve zaman ayarlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: Ön Okuma Aşaması 30 saniye boyunca 25 °C'de, Tutma Aşaması (enzim aktivasyonu, sıcak başlatma) 20 saniye boyunca 95 °C'de, PCR Aşaması 95 saniye boyunca 1 s, 60 °C'de 20 saniye ve Okuma Sonrası Aşama 25 s boyunca 30 s boyunca.
  10. Plaka ayarında, numunelerin ve kontrollerin konumlarını yazılım ekranındaki her bir kuyucukla eşleştirin.
  11. Deneyi bir USB cihazına kaydedin, gerçek zamanlı PCR cihazına yükleyin ve Çalıştır düğmesine tıklayın.

6. Veri analizi

  1. Sonuçları bir USB'ye kaydedin ve veri analizi için bir bilgisayara aktarın.
  2. Aşağıdaki formülü kullanarak Gerçek Zamanlı delta Rn (dRn) Verilerini analiz edin, burada Rn (normalleştirilmiş raportör), pasif referans boyası ROX'un floresan sinyaline bölünerek normalleştirilen raportör boyası, VIC ve FAM'den gelen floresan sinyalidir.
    dRn = Rn - taban çizgisi
  3. Alelik ayrımcılık grafiğini gözden geçirin.
  4. Kümelerin ayrılmasını onaylayın (Şekil 3B). Alel ayrım grafiğinde, Bristol homozigotları sağ alt köşede, Bristol/Hawaii melezleri sağ üst köşede, Hawaii homozigotları sol üst köşede ve negatif kontroller sol alt köşede gruplandırılmıştır. Aşağıdaki renk kodlarını kullanın:
    Kırmızı: Bristol aleli
    Mavi: Hawaii aleli
    Yeşil: Heterozigot
    Siyah: Negatif kontrol
  5. Sonuçları bir elektronik tablo dosyasına aktarın ve dört SNP konumunun tümünden genotipleme verilerini birleştirin. Art arda dört konumda belirsiz çağrılar varsa, verileri N değerinden hariç tutun. Analiz için plaka başına 90 numune kullanın.
    1. Çaprazlamaları aşağıdaki gibi tanımlayın: #1 konumundaki SNP bir Bristol/Hawaii melezi ise ve #2-#4 konumlarının tümü Bristol homozigotları ise [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] veya konum #1 bir Bristol homozigotudur ve #2-#4 konumunun tümü Bristol/Hawaii melezleridir [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], Bu sonuçlar, #1 ve #2 pozisyonları arasında (kromozomun sol kolunda bir yerde) tek bir geçişi göstermektedir. Benzer şekilde, [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] veya [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H] durumunda, #2 ve #3 arasında (kromozomun merkezi bölgesinde bir yerde) tek bir çaprazlama meydana gelir ve [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H] durumunda, # 3 ve # 4 arasında (kromozomun sağ kolunda bir yerde) tek bir çaprazlama meydana gelir.
      NOT: Altı adet çift çaprazlama modeli vardır. Sol ve sağ: [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B] ve [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], sol ve orta: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] ve [B/H]-[B/B]-[B/H]-[B/H], orta ve sağ: [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H].

7. İstatistiksel analiz

  1. Değerleri SPSS Statistics yazılımına (IBM) ekleyin. Sol kol, orta bölge ve kromozomların sağ kolundaki çaprazlama dağılımının karşılaştırılması için, sol kolda çaprazlama ile 82 kromozom, orta bölgede çaprazlama ile 20 kromozom ve sağ kolda çaprazlama ile 68 kromozom yerleştirin.
  2. ANOVA ve Bonferroni düzeltmesi yapın ve iki kuyruklu bir p değeri kullanarak istatistiksel anlamlılığı belirleyin. Sol kola karşı merkez veya WT'ye karşı mutant gibi gerektiği kadar karşılaştırma yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

C. elegans'ta kromozom II üzerindeki dört SNP bölgesini, sol kolda, orta bölgede ve sağ kolda kromozomun tam uzunluğu başına çaprazlama oluşumunu ölçmek için SNP genotipleme testi ile tespit ettik. SNP'lerin tespiti, üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilir. Ana karışım, Taq DNA Polimeraz, Isıya kararsız urasil-N-glikosilaz (UNG), dUTP'li dNTP ve Pasif referans ROX boyası içerir. Taq DNA polimeraz 95 °C'de aktive edilir ve düşük sıcaklıklarda spesifik olmayan amplifikasyonun inhibisyonunu sağlar. UNG ve dU...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, Bristol/Hawaii melez türlerinden çaprazlanmış döllerin SNP genotiplemesine dayalı olarak C. elegans mayozunda çaprazlama frekansını ve dağılımını ölçmek için bir yöntem tanıttık. Konvansiyonel snip-SNP yöntemi (RFLP) PCR'den sonra jel elektroforezi gerektirirken ve DNA bantlarının tespiti bir jel dokümantasyon sistemigerektirirken 14,18, gerçek zamanlı PCR kullanılarak 5' nükleaz testi ile SNP genotiplemesi zahme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Suşlar, NIH Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından nazikçe sağlandı. Saito Laboratuvarı üyelerine bu çalışmayla ilgili yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği (JSPS) KAKENHI Hibe JP23K05868 tarafından TTS'ye desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
101-1000μ l Pipet UcuQSP111-N-Q
0,5 mol/I-EDTA Çözeltisi (pH 8,0)Nacalai tesque14347-21
10mol/I-Sodyum Hidroksit ÇözeltisiNacalai tesque94611-45
10X DreamTaq Yeşil TamponThermo Fisher Scientific EP0713
10μ L, Uzun Uçlu, GörkemliFUKAEKASEI, WATSON110-207C
200μ L, Standart Uç, DereceliFUKAEKASEI, WATSON110-705C
Agar TozuNacalai tesque01028-14
AgarozPH JaponyaPH108 Serisi
Otoklav TOMY model ES-215 Yüksek Basınçlı Buhar SterilizatörüTOMY SEIKOES-215
Bacto Pepton Proteinin Enzimatik SindirimiThermo Fisher Scientific 211677
Borik asitNacalai tesque05215-05
Caenorhabditis elegans Bristol yabani-tip Caenorhabditis Genetik MerkeziN2
Caenorhabditis elegans Hawaii vahşi tipiCaenorhabditis Genetik MerkeziCB4856 Serisi
Kalsiyum klorürNacalai tesque06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitokondriyal GFP + dpy-20(+)] ISaito laboratuvarıTTS24aslen PD4251'den
KolesterolNacalai tesque08721-62
Özel TaqMan SNP Genotipleme TestleriThermo Fisher Scientific 4332077
Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti KarışımıNew England BiyolaboratuvarlarıN04470
DigPrint Doküman Tablet DP-T130zBiyo AraçlarDP-T130z
di-Potasyum HidrojenfosfatNacalai tesque28726-05
Diseksiyon MikroskobuNikonSMZ-745 C-DS
Rüya Taq DNA PolimerazThermo Fisher Scientific EP0713
Etidyum Bromür ÇözeltisiNacalai tesque14631-94
WBVar01973670 için İleri PrimerIDT103988736atgtctcacccaaggttgaa
jelatinNacalai tesque166-31
Gilson PIPETMAN Klasik PipetThermo Fisher Scientific 
IGEPAL CA-630Sigma-Aldrich18896
Magnezyum Sülfat HeptahidratNacalai tesque21003-75
MicroAmp Optik 96 Kuyulu Reacton PlakasıThermo Fisher Scientific N8010560
MicroAmp Optik Yapıştırma FilmiThermo Fisher Scientific 4311971
Mini Amp  termal döngüleyiciThermo Fisher Scientific Mini Amfi
Mini-Sub Cell GT Yatay Elektroforez Sistemi, 7 x 10 cm tepsiBio-Rad Laboratuvarları1704466
Nichipet EXIINichiryo00-NPX2-2
Nichipet EXII ÇOKLUNichiryo00-NPM-12VP
Pippete Mate NEONichiryo00-PMNEO
Potasyum klorürNacalai tesque285-38
Potasyum DihidrojenfosfatNacalai tesque28720-65
Proteinaz KThermo Fisher Scientific EO0491
QuantStudio 1 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi, 96 oyuklu, 0,2 mLThermo Fisher Scientific A40426 Serisi
Hızlı Yüklenen Mor 1kb Plus DNA MerdiveniNew England BiyolaboratuvarlarıN0550S
WBVar01973670 için Ters PrimerIDT103988737Tggctactcctagtcactga
Sodyum KloridlerNacalai tesque31319-45
TaqPath ProAmp Ana KarışımıThermo Fisher Scientific A30866 Serisi
TC Çanak 35, StandartSARSTEDT83.3900
Tris (hidroksimetil) aminometanNacalai tesque35406-75
Trizma tabanıSigma-Aldrich  T1503-1KG
Ara 20Yoneyama Reaktifi03706
WormStuff Solucan SeçimiGenesee Bilimsel59-AWP
WormStuff Solucan Seçim Uçları(90/10% Pt/Ir, 30 Gauge)Genesee Bilimsel59-30PI36

Kaynaklar

  1. Jones, G., Kleckner, N., Zickler, D. Meiosis through three centuries. Chromosoma. 133 (2), 93-115 (2024).
  2. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: Recombination and human aneuploidy. Prenat Diagn. 41 (5), 584-590 (2021).
  3. Barnes, T. M., Kohara, Y., Coulson, A., Hekimi, S. Meiotic recombination, noncoding DNA and genomic organization in caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (1), 159-179 (1995).
  4. Lim, J. G., Stine, R. R., Yanowitz, J. L. Domain-specific regulation of recombination in Caenorhabditis elegans in response to temperature, age, and sex. Genetics. 180 (2), 715-726 (2008).
  5. Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5 (3), e1000419(2009).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Li, W., Yanowitz, J. L. Atm and atr influence meiotic crossover formation through antagonistic and overlapping functions in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 431-443 (2019).
  8. Rose, A. M., Baillie, D. L. The effect of temperature and parental age on recombination and nondisjunction in Caenorhabditis elegans. Genetics. 92 (2), 409-418 (1979).
  9. Villeneuve, A. M. A cis-acting locus that promotes crossing over between X chromosomes in Caenorhabditis elegans. Genetics. 136 (3), 887-902 (1994).
  10. Youds, J. L., et al. Rtel-1 enforces meiotic crossover interference and homeostasis. Science. 327 (5970), 1254-1258 (2010).
  11. Emmons, S. W., Yesner, L., Ruan, K. S., Katzenberg, D. Evidence for a transposon in Caenorhabditis elegans. Cell. 32 (1), 55-65 (1983).
  12. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131 (3), 609-624 (1992).
  13. Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. Chromosome-wide control of meiotic crossing over in C. elegans. Curr Biol. 13 (18), 1641-1647 (2003).
  14. Wicks, S. R., Yeh, R. T., Gish, W. R., Waterston, R. H., Plasterk, R. H. Rapid gene mapping in Caenorhabditis elegans using a high-density polymorphism map. Nat Genet. 28 (2), 160-164 (2001).
  15. Campos, T. L., Korhonen, P. K., Sternberg, P. W., Gasser, R. B., Young, N. D. Predicting gene essentiality in Caenorhabditis elegans by feature engineering and machine-learning. Comput Struct Biotechnol J. 18, 1093-1102 (2020).
  16. Fay, D., Bender, A. Snps: Introduction and two-point mapping. WormBook. , (2008).
  17. Hwang, H. Y., Wang, J. Fast genetic mapping using insertion-deletion polymorphisms in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 11 (1), 11017(2021).
  18. Davis, M. W., et al. Rapid single nucleotide polymorphism mapping in C. elegans. BMC Genomics. 6, 118(2005).
  19. Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
  20. Li, Q., et al. The tumor suppressor BRCA1-BARD1 complex localizes to the synaptonemal complex and regulates recombination under meiotic dysfunction in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 14 (11), e1007701(2018).
  21. Saito, T. T., Lui, D. Y., Kim, H. M., Meyer, K., Colaiacovo, M. P. Interplay between structure-specific endonucleases for crossover control during Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genet. 9 (7), e1003586(2013).
  22. Saito, T. T., Youds, J. L., Boulton, S. J., Colaiacovo, M. P. Caenorhabditis elegans him-18/slx-4 interacts with slx-1 and xpf-1 and maintains genomic integrity in the germline by processing recombination intermediates. PLoS Genet. 5 (11), e1000735(2009).
  23. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  24. Kutyavin, I. V., et al. 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at pcr extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28 (2), 655-661 (2000).
  25. Hammarlund, M., Davis, M. W., Nguyen, H., Dayton, D., Jorgensen, E. M. Heterozygous insertions alter crossover distribution but allow crossover interference in Caenorhabditis elegans. Genetics. 171 (3), 1047-1056 (2005).
  26. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  27. Meneely, P. M., Farago, A. F., Kauffman, T. M. Crossover distribution and high interference for both the X chromosome and an autosome during oogenesis and spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 162 (3), 1169-1177 (2002).
  28. Nabeshima, K., Villeneuve, A. M., Hillers, K. J. Chromosome-wide regulation of meiotic crossover formation in Caenorhabditis elegans requires properly assembled chromosome axes. Genetics. 168 (3), 1275-1292 (2004).
  29. Phillips, C. M., Dernburg, A. F. A family of zinc-finger proteins is required for chromosome-specific pairing and synapsis during meiosis in C. elegans. Dev Cell. 11 (6), 817-829 (2006).
  30. Mancera, E., Bourgon, R., Brozzi, A., Huber, W., Steinmetz, L. M. High-resolution mapping of meiotic crossovers and non-crossovers in yeast. Nature. 454 (7203), 479-485 (2008).
  31. Qi, J., et al. Characterization of meiotic crossovers and gene conversion by whole-genome sequencing in Saccharomyces cerevisiae. BMC Genomics. 10, 475(2009).
  32. Miller, D. E., et al. A whole-chromosome analysis of meiotic recombination in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2 (2), 249-260 (2012).
  33. Carlton, P. M., Farruggio, A. P., Dernburg, A. F. A link between meiotic prophase progression and crossover control. PLoS Genet. 2 (2), e12(2006).
  34. Tsai, C. J., et al. Meiotic crossover number and distribution are regulated by a dosage compensation protein that resembles a condensin subunit. Genes Dev. 22 (2), 194-211 (2008).
  35. Bhalla, N., Wynne, D. J., Jantsch, V., Dernburg, A. F. Zhp-3 acts at crossovers to couple meiotic recombination with synaptonemal complex disassembly and bivalent formation in C. elegans. PLoS Genet. 4 (10), e1000235(2008).
  36. Yokoo, R., et al. Cosa-1 reveals robust homeostasis and separable licensing and reinforcement steps governing meiotic crossovers. Cell. 149 (1), 75-87 (2012).
  37. Almanzar, D. E., et al. Meiotic DNA exchanges in C. elegans are promoted by proximity to the synaptonemal complex. Life Sci Alliance. 6 (4), e202301906(2023).
  38. De Los Santos, T., et al. The mus81/mms4 endonuclease acts independently of double-holliday junction resolution to promote a distinct subset of crossovers during meiosis in budding yeast. Genetics. 164 (1), 81-94 (2003).
  39. Saito, T. T., Colaiacovo, M. P. Regulation of crossover frequency and distribution during meiotic recombination. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 82, 223-234 (2017).
  40. Zalevsky, J., Macqueen, A. J., Duffy, J. B., Kemphues, K. J., Villeneuve, A. M. Crossing over during Caenorhabditis elegans meiosis requires a conserved mutS-based pathway that is partially dispensable in budding yeast. Genetics. 153 (3), 1271-1283 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Krossover FrekansıMayoz RekombinasyonKromozom HaritalamaTaqMan KimyasıOogenez AnaliziGenetik MutantlarKrossover Dağılımı
Gerçek Zamanlı PCR Kullanılarak SNP Genotipleme ile Caenorhabditis elegans Mayozunda Çaprazlama Sıklığı ve Dağılımı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.