Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketleme Uygulaması

2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68193

⸱

13 Haziran 2025

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, D. melanogaster yumurtalıkta TurboID tabanlı yakınlık etiketlemesi (PL) için, biyotin takviyesi ve yumurtalık diseksiyonundan transgen ekspresyonunun doğrulanmasına ve kütle spektrometresi için biyotinile peptitlerin zenginleştirilmesine kadar olan adımları kapsayan ayrıntılı bir protokol oluşturuyoruz.

Özet

Yakınlık etiketleme (PL), protein-protein etkileşim ağlarını haritalamak için güçlü bir yöntemdir. Etiketleme enzimlerindeki, özellikle TurboID'deki gelişmeler, biyolojik sistemler arasında kullanımını genişletmiştir. TurboID, sağlamlığı, toksik olmaması ve kullanım kolaylığı nedeniyle in vivo uygulamalar için özellikle avantajlıdır. Bu enzim, proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere yakındaki biyomolekülleri, biyotin varlığında yaklaşık 10 nm'lik bir aralıkta rastgele biyotinillenir. Bu yöntemi, Drosophila melanogaster yumurtalığının germ hattı hücrelerinde dış mitokondriyal membran (OMM) üzerinde piwi etkileşimli RNA (piRNA) biyogenezinde önemli bir faktör olan Kabak (Zuc) etkileşimini araştırmak için uyguladık. Germ hücrelerinde Zuc-TurboID'yi eksprese ederek ve biotin ile takviye ederek, Zuc-proksimal proteinlerin biyotinilasyonunu indükledik. Biyotinile peptitlerin zenginleştirilmesini takiben kütle spektrometresi analizi, piRNA biyogenezinde iyi bilinen interaktörler de dahil olmak üzere Zuc'a yakın proteinleri tanımladı. İlginç bir şekilde, Zuc'un protein katlanması, zar organizasyonu ve vezikül kaçakçılığı ile ilgili yeni interaktörlerini keşfettik.

Giriş

Afinite saflaştırma-kütle spektrometresi (AP-MS) ve maya-2-hibrit (Y2H) sistemleri gibi geleneksel protein-protein etkileşimi (PPI) haritalama yöntemleri genellikle düşük bollukta, geçici olarak eksprese edilen veya zara bağlı proteinleri yakalayamaz. Bu sınırlama, canlı bir hücrenindoğal fizyolojik koşullarını kopyalayamamalarından kaynaklanmaktadır 1,2,3. Bu zorlukların üstesinden gelmek için PL, in vivo olarak alt organel düzeyinde yüksek çözünürlüklü proteom haritalaması için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. PL, rastgele bir enzimin yem proteini ile füzyonundan yararlanır ve enzimin kısa ömürlü reaktif moleküllerin oluşumunu katalize etmesini sağlar1. Biotin gibi bu reaktif moleküller, füzyon proteini4'ün birkaç nanometre içindeki proteinleri kovalent olarak etiketler. Daha sonra, biyotinile proteinler, büyük ölçekli protein tanımlamasını kolaylaştırmak için kütle spektrometresi ile izole edilir ve analiz edilir 5,6.

Geçtiğimiz yıllarda, PL tekniklerini ilerletmek için çeşitli rastgele enzimler geliştirilmiştir. Yaygın olarak kullanılan iki enzim, Escherichia coli'den türetilmiş R118G mutant biyotin ligaz (BioID) ve bezelye türevi askorbat peroksidaz enzimi 2'dir (APEX2). BioID, biyotin ve ATP'yi biyotinil-5'-adenilat (bioAMP)1'e dönüştürür. Bu reaktif molekül, 10 nm'lik ± yarıçap içinde yakındaki proteinlerin lizin kalıntılarına kovalent olarak bağlanır. BioID tabanlı PL'nin önemli bir avantajı biotin kullanımıdır. Canlı organizmalarda doğal olarak oluşan ve toksik olmayan bir biyomoleküldür, bu da güvenli in vivo etiketlemeyeizin verir 6. Bununla birlikte, BioID'nin yavaş etiketleme kinetiği (18-24 saat) ve optimum katalitik aktivite için yüksek sıcaklık (37 °C) gereksinimi dahil olmak üzere sınırlamaları vardır4. Bu özellikler, dinamik biyolojik süreçlerin incelenmesinde uygulanmasını engelleyebilir. Bu arada, APEX2, biyotin-fenol ve hidrojen peroksit (H2O2)7 varlığında biyotin-fenoksil radikallerinin oluşumunu katalize eder. Bu radikaller esas olarak tirozin gibi elektron bakımından zengin amino asitlerin yan zinciri ile reaksiyona girer ve ayrıca sistein, histidin ve triptofan8'i bağlayabilir. Peroksidaz enziminin hızlı etiketleme özelliği (< 1 dakika), dinamik ve geçici PPI'leri yakalamak için uygundur9. Ayrıca, biyotin ligazdan daha geniş bir algılama aralığına (20 nm'ye kadar) sahiptir. Bununla birlikte, APEX2 bazlı PL'nin, toksik bir oksitleyici ajan olan H2O2 gereksinimi ve in vivo10'da uygulanabilirliği sınırlayan biyotin-fenolün düşük geçirgenliği dahil olmak üzere dezavantajları vardır.

2018'de Branon ve ark. BirA'nın ( E. coli'de bulunan biyotin ligaz) 35 kD mutant bir versiyonu olan TurboID adlı yeni bir biyotin ligaz geliştirdi4. Bu enzim, BirA'ya göre diğer 15 mutasyonla birlikte R118 pozisyonunda (R118S) bir mutasyon içerir. BioID'den iki kat daha yüksek katalitik aktivite sergiler. 10 dakikada TurboID ile indüklenen biyotinilasyon, BioID ile 18 saatlik etiketleme ile karşılaştırılabilir bir boyut ve özgüllüğe sahip proteomik veriler üretir. Ayrıca, 30 °C'de mükemmel etiketleme aktivitesi gösterir4. Bu nedenle TurboID, genellikle sırasıyla 25 °C ve 20 °C'de yetiştirilen Drosophila veya Caenorhabditis elegans gibi organizmalarda uygulama için daha uygundur.

Bu çalışmada, Drosophila over hastalığında interaktom çalışması için TurboID tabanlı PL'nin kullanılması amaçlanmıştır. Burada açıklanan protokoller, germ hattı hücrelerinde Zuc'un etkileşimini haritalamak için kullanılır. Zuc, genom bütünlüğünün korunması için kritik olan küçük kodlamayan RNA'larolan piRNA'ların biyogenezine aracılık eden dış mitokondriyal zar (OMM) üzerinde lokalize bir endonükleazdır 11,12,13. Zuc-TurboID analizinden tanımlanan biyotinile proteinleri iki ek kontrolden, NES-TurboID ve Tom20-TurboID'den gelenlerle karşılaştırarak, farklı Zuc etkileşimli adayları tanımladık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yetişkin sineğinde 1. PL

  1. Biyotinli gıdaların hazırlanması
    1. 10 M NaOH stoğunu üçlü damıtılmış suda (TDW) seyrelterek 1 M NaOH çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) saklayın. 0.0049 g biotin tozunu 20 mL TDW içinde çözerek 1 M biotin stok çözeltisi hazırlayın. Biyotin çözünürlüğünü artırmak için 150-200 μL 1 M NaOH ekleyin. Çözeltiyi homojenize etmek için girdap. Biyotin stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.
    2. Şişeden sinek yemini çıkarın ve eriyene kadar 2 dakika mikrodalgada pişirin.
      NOT: Standart sinek yemi %5 mısır unu, %3 maya, %10 sukroz, %1 agar, %0.3 propiyonik asit ve %0.3 metil 4-hidroksibenzoat13 içerir.
    3. Erimiş yiyeceğe 100 μM'lik bir son konsantrasyonla biyotin stoğu ekleyin, ardından girdaplama ile karıştırın. Serolojik bir pipet kullanarak her boş şişeye hemen 4.5 mL biyotin takviyeli gıda dağıtın. Yiyecekleri 30 dakika soğumaya bırakın, şişenin üzerine pamuklu bir kapak yerleştirin ve ardından biyotin yemini 4 °C'de saklayın.
      NOT: Gıda soğumadan ve sertleşmeden önce biyotin eklenmelidir.
  2. Biyotin besleme
    1. TurboID füzyon proteinini doku veya hücreye özgü GAL4 sinekleri ile aşırı eksprese eden transgenik sinekleriçaprazlayın 14,15,16. Negatif bir kontrol olarak, biyotinilasyon indüksiyonu olmamasını sağlamak için GAL4 sürücü sinekleri ile çapraz vahşi tip sinekler.
    2. Geçişten yaklaşık 10 gün sonra döller yumurtadan çıkmaya başlayacaktır. Kuru maya tozunu TDW'de eritin ve pürüzsüz bir macun haline getirin. Yeni bir şişenin duvarına bir laboratuvar kaşığı maya macunu uygulayın. Alttaki sinekleri toplamak için yumurtadan yeni çıkmış sinekleri içeren eski şişeye hafifçe vurun. Eski şişeyi maya macunu içeren yeni şişenin üzerine ters çevirin ve sineklerin kaçmasını önlemek için her iki şişenin kenarlarının hizalandığından emin olun.
    3. Sinekleri eski şişeden yeni şişenin alt kısmına aktarmak için bu şişeleri birbirine vurun. Sinekler transfer edildikten sonra, pamuklu kapakları hem yeni hem de eski şişelere güvenli bir şekilde geri yerleştirin. 3 gün bekleyin. Maya macunu RT'de birkaç gün saklanabilir.
      NOT: Sinek transferinin mümkün olduğunca çabuk yapılması gerekir çünkü sinekler yalnızca geçici olarak sersemletilecektir.
    4. 250 μL propiyonik asit stoğunu 50 mL TDW'de seyrelterek% 0.5 propiyonik asit çözeltisi hazırlayın. RT'de saklayın.
    5. 3. günde, 1 M biyotin stoğunu TDW'de seyrelterek 100 μM biyotin çalışma çözeltisi hazırlayın, ardından 500 μL% 0.5 propiyonik asit ekleyin. Biyotin çalışma solüsyonunu kuru maya tozu ile karıştırın ve bir macun haline gelene kadar karıştırın. Biyotin gıda şişesinin duvarına bir laboratuvar kaşığı biyotin-maya macunu ekleyin. Biyotin-maya macunu RT'de birkaç gün saklanabilir.
    6. Sinekleri iki gruba ayırın. Bir grubu kontrol olarak normal gıda şişesinde tutun ve biyotinilasyonu başlatmak için diğer grubu biyotin gıda şişesine (biyotin-maya macunu eklendi) aktarın. 16 saatlik biyotinilasyondan sonra, sinekleri yeni bir normal gıda şişesine aktarın.
      NOT: Daha önce 4 saat, 8 saat ve 16 saat boyunca bir biyotin besleme testi gerçekleştirdik. Biyotinilasyon sinyali 16 saatlik beslenmeden sonra en güçlüydü, bu yüzden ardışık deneyler için bu zaman noktasını seçtik.
  3. Drosophila yumurtalık koleksiyonu
    1. Sinekleri CO2 sinek pedine koyun, dişileri tutun ve erkekleri atın. Sinekler uygun şekilde uyuşturulduktan sonra (artık hareket etmiyor), 1 mL soğuk Grace'in böcek ortamını diseksiyon kabına pipetleyin.
    2. İnce uçlu forseps kullanarak diseksiyon çanağına bir sinek atın ve ortama daldırılmasına izin verin. Sinek toraksını forseps ile tutun, vücudu ezmemeye dikkat edin. Ardından, arka karın ucunun ucunu (genital bölgenin bulunduğu yer) nazikçe çıkarmak için başka bir forseps kullanın.
    3. Yumurtalıkları yavaşça sıkmak için forsepsleri kullanın (üst karın bölgesinden aşağıya doğru).
    4. Dışarı çıktıklarında, yumurtalıkları çevreleyen kas ağlarını ve diğer dokuları çıkarın. Yumurtalıklara zarar vermemeye dikkat edin.
    5. Temiz yumurtalıkları forseps kullanarak dikkatlice 1.7 mL'lik bir tüpe aktarın; Tüpü buz üzerinde tutun. Sonraki sinekler için 1.3.2 - 1.3.4 adımlarını tekrarlayın.
    6. Tüpü 4 °C'de 30 saniye boyunca 3.500 x g'da döndürün, ardından kalan ortamı çıkarmak için mikropipet uçları kullanın. Yumurtalıklara dokunmamaya dikkat edin.
    7. Tüpü sıvı nitrojenle dondurun, ardından yumurtalıkları -80 °C'de saklayın. Yumurtalık örnekleri 1 yıl boyunca stabildir.

2. Western blot testi ile transgen ekspresyonu ve biyotinillenmiş protein tespiti

NOT: Western blot testi için, numune başına yaklaşık beş yumurtalık çifti toplayın.

  1. Doku lizisi
    1. Donmuş yumurtalık dokusunu çözün. 50 μL RIPA lizis tamponu (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, %0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS), %0.5 sodyum deoksikolat, %1 Triton X-100) ekleyin, 1x proteaz inhibitörü (PI) kokteyli ve 1 mM Fenilmetansülfonil Florür (PMSF) ile desteklenmiştir. RIPA lizis tamponunu (1x PI kokteyli ve 1 mM PMSF olmadan) 4 °C'de saklayın.
      NOT: PI kokteyli ve PMSF sadece deneyden hemen önce eklenmelidir.
    2. Plastik bir havaneli (tüp başına 1 dakika) ile birleştirilmiş elde tutulan bir homojenizatör kullanarak yumurtalıkları parçalayın. Tam lizizi sağlamak için 10 dakika boyunca buz üzerinde bir doku lizis işlemi ve ardından homojenizasyon gereklidir.
    3. Protein lizatını döküntülerden ayırmak için 13.500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    4. Berrak protein lizatını yeni bir 1.7 mL'lik tüpe pipetleyin (lipid tabakasını üstüne almaktan kaçının), ardından lizatı daha fazla kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
  2. Bikinkoninik asit (BCA) testi ile protein konsantrasyonu ölçümü
    1. Bikinkoninik asit (BCA) çalışma reaktifini (WR) reaktif A ve reaktif B'yi 50:1 oranında karıştırarak hazırlayın. 1 μL lizat veya seyreltilmiş BSA standardını 200 μL WR ile 96 oyuklu bir plakada (kopyalar halinde) karıştırın, ardından plakayı 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
      1. Bu formülü kullanarak ne kadar WR gerektiğini hesaplayın:
        (# standartlar + # örnekler) × (# çoğaltılır) × (örnek başına WR hacmi)
        Bir dizi protein standardı oluşturmak için, nihai konsantrasyonları 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 ve 2000 μg / mL olan RIPA lizis tamponunda (PI kokteyli ve PMSF olmadan) 2 mg / mL sığır serum albümininin (BSA) birkaç dilüsyonunu hazırlayın.
    2. 495 nm dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı ölçün. BSA absorbans değerlerinden standart bir eğri oluşturun, ardından protein konsantrasyonunu belirleyin.
  3. Batı leke tahlili
    1. Jel elektroforezi
      1. 2x SDS yükleme tamponuna 30-50 μg protein lizat ekleyin. Son 2 μg/μL protein konsantrasyonu ve 1x SDS son konsantrasyonu yapmak için TDW (gerekirse) ekleyin, ardından numuneyi 95 °C'de 10 dakika kaynatın.
      2. 1x konsantrasyonda çalışma tamponu yapmak için 25 mL 20x MOPS tamponunu 500 mL TDW ile karıştırarak çalışan tamponu hazırlayın. RT'de saklayın.
      3. Bis-Tris jel kuyucuklarını 1 mL çalışma tamponu (3x) ile durulayın, ardından Bis-Tris jeli elektroforez odasına yerleştirin. Haznenin ön tarafını, tüm kuyucuklar suya batırılana kadar (± 250 mL) yeni çalışma tamponu ile doldurun. Haznenin arka tarafını kullanılan çalışma arabelleği ile doldurun (kullanılan yeni çalıştırma arabelleğinin hacminin yarısı yeterlidir).
      4. Numuneyi Bis-Tris jel üzerine yükleyin ve işaretleyici olarak 4 μL önceden boyanmış protein merdiveni kullanın. Elektroforez yapın (200 V, 30 dk). Jeli kasetten çıkarın ve TDW ile durulayın.
    2. Membran lekeleme
      1. 430 mL TDW'ye 20 mL transfer tamponu (25x stok) ve 50 mL metanol ekleyerek transfer tamponu yapın.
      2. Bir leke modülünde kurutma pedleri, filtre kağıdı, jel ve nitroselüloz membrandan oluşan bir sandviç düzenleyin. Yeni bir katmanı istiflemeden önce, baloncukları çıkarmak için bir rulo kullanın.
      3. Blot modülünü transfer haznesine takın, ardından hazneyi 500 mL transfer tamponu ile doldurun. Proteinleri 175 mA'da 1 saat boyunca aktarın.
        NOT: Transfer tamponu deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır.
    3. Engelleme
      1. %10 Tween20 stok çözeltisi elde etmek için 45 mL TDW'ye 5 mL Tween20 stoğu ekleyin. İki fosfat tamponlu salin (PBS) tabletini 400 mL TDW'de çözün. 4 mL çözeltiyi çıkarın, ardından 1x PBST çözeltisi yapmak için 4 mL %10 Tween20 (son konsantrasyon %0.1) ekleyin. RT'de saklayın.
      2. Lekeli zarı transfer haznesinden çıkarın, ardından 1x PBST ile durulayın.
        NOT: Membranın farklı antikorlarla inkübe edilmesi gerekiyorsa, blokaj adımını gerçekleştirmeden önce beklenen protein boyutlarına göre temiz bir paslanmaz çelik bıçakla kesin.
      3. Gen ekspresyonlarını kontrol etmek için, blokaj adımı (1 saat, RT) için 1x PBST'de %2 BSA kullanın. 50 mL 1x PBST'ye 1 g BSA ekleyerek %2'lik BSA çözeltisi yapın. Biyotinile protein tespitleri için, 1x PBST'de (gece boyunca, 4 °C) %3 BSA kullanarak blokaj gerçekleştirin. % 3'lük bir BSA çözeltisi elde etmek için 1.5 g BSA tozunu 50 mL 1x PBST içinde çözün. Engelleme solüsyonlarını 4 °C'de saklayın.
        NOT: Kullanılan BSA, BCA testinde kullanılandan farklıdır. BCA testi için BSA, BCA kitinin bir parçasıdır.
    4. Birincil antikor inkübasyonu
      1. 10 mL% 2 BSA (1: 10.000) içinde 1 μL α-V5 ve% 2 BSA'da (1: 1.000) 10 μL temizlik geni α-HSP90 seyreltin. 0.3 μg / mL SA-HRP çözeltisi yapmak için 9 mL 1x PBST çözeltisine 2.7 μL streptavid-yaban turpu peroksidaz konjugatı (SA-HRP) ekleyin.
      2. Gen ekspresyonlarını kontrol etmek için, zarı gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor ile inkübe edin. Biyotinile protein tespitleri için, membranı 4 °C'de 1 saat inkübe edin. Primer antikoru 4 °C'de saklayın. Birden çok kez kullanılabilir.
      3. Membranı 1x PBST ile RT'de 3x için 15 dakika yıkayın.
    5. İkincil antikor inkübasyonu
      1. 10 mL% 2 BSA'ya (1: 5.000) 2 μL Keçi anti-tavşan veya anti-fare IgG (yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge) ekleyerek ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
        NOT: SA-HRP için ikincil bir antikora gerek yoktur. Doğrudan görselleştirme adımına geçin. İkincil antikorlar deneyden önce taze seyreltilmelidir.
      2. Membranı RT'de 40 dakika boyunca ikincil antikor çözeltisinde inkübe edin. Membranı 1x PBST ile RT'de 3x için her biri 15 dakika boyunca yıkayın.
    6. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) yöntemi ile protein tespiti
      1. 750 μL luminol ve 750 μL HRP solüsyonunu (1:1 oran) karıştırın. Karışımı hazırlarken membranı yıkama tamponunda nemli tutun.
        NOT: Bu karışım deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır. Kimyasallar ışığa duyarlı olduğundan, onları güneş ışığından veya diğer yoğun ışık kaynaklarından uzak tutun (laboratuvar aydınlatmasına kısa süreli maruz kalmak iyidir).
      2. Membranı 30 saniye boyunca solüsyona batırın, ardından şeffaf plastik tabakaların arasına yerleştirin. Bir Chemidoc aleti ile lekeli protein bantlarını gözlemleyin.

3. İmmünofloresan boyama ile transgen ekspresyonu ve lokalizasyon doğrulaması

NOT: Gen ekspresyonunu ve lokalizasyonunu kontrol etmek için, maya macunu ile beslenen 2 günlük dişilerden numune başına yaklaşık beş yumurtalık çiftini inceleyin. Genç yumurtalıklar ağırlıklı olarak, hemşire hücrelerinin (germ hattı hücreleri) bolluğu ve nispeten geçirgen zarları nedeniyle immünofloresan boyama için ideal olan yumurta odalarının erken aşamalarını içerir17. Yumurta odalarının geç aşamaları, 918. aşamada başlayan yumurta kabuğu kompleksinin oluşumu nedeniyle daha sert ve nüfuz etmesi zordur. Protein biyotinilasyon testi için, adım 1.2'de açıklandığı gibi, biotin ile beslenen 4 günlük dişilerden numune başına yaklaşık beş yumurtalık çiftini inceleyin.

  1. Numune hazırlama
    1. Diseke edilmiş bir yumurtalığın arka kısmını forseps kullanarak yerinde tutun. Yumurtalığı nazikçe tek tek yumurta odalarına ayırmak için başka bir forseps kullanın. Yumurta odalarının yırtılmasını önlemek için dikkatli çalışın. Yumurta odası izolasyon protokolü19'da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Yumurta haznelerini dikkatlice 1,7 mL'lik bir tüpe pipetleyin, ardından 1 mL 1x PBS (RT) ile yıkayın. Yumurta haznelerinin uçlara sıkışmasını önlemek için pipetlemeden önce pipet uçlarının kenarını kesin.
      NOT: Yalnızca ≤. aşamada 9. aşamada (şeffaf olanlar) yumurta haznelerini kullanın. Olgun oositleri ve geç evre yumurta odalarını atın ≥ 10. Pipetleme, yumurta odalarının çözelti içinde yüzmesine neden olur. Bu nedenle, sonraki adımlara geçmeden önce yumurta odalarının dibe oturmasına izin verin (5 dakika).
  2. Fiksasyon
    1. % 5'lik bir FA çözeltisi yapmak için 3.125 mL %16 formaldehit (FA) stoğunu 6.875 mL 1x PBS içinde seyreltin. RT'de saklayın.
      NOT: FA ışığa duyarlıdır, bu nedenle ışıktan uzak tutun.
    2. Oosit içeren tüpe 1 mL %5 Formaldehit (FA) pipetleyin. Tüpü çoklu döndürücüye yerleştirin, ardından oositleri 30 dakika boyunca sabitleyin.
      NOT: Fiksasyondan nükleer boyama adımına kadar, deneyler hafif dönüşlü bir çoklu döndürücü üzerinde gerçekleştirilir.
    3. 190 mL 1x PBS'ye 10 mL %10 Triton X-100 stoğu ekleyerek yıkama solüsyonu olarak 1x PBS'de (1x PBT) %0,5 Triton X-100 hazırlayın. RT'de saklayın.
    4. Sabit yumurta haznelerini 1 kez durulayın, ardından 3 kez RT'de 10 dakika yıkayın. Hem durulama hem de yıkama adımları için 1 mL 1x PBT kullanın.
  3. Engelleme
    1. 4.75 mL 1x PBT'ye 250 μL FBS stoğu ekleyerek% 5 fetal sığır serumu (FBS) hazırlayın.
      NOT: Bu çözelti deneyden önce taze olarak yapılmalıdır.
    2. Tüpe 1 mL% 5 FBS ekleyin ve RT'de 1 saat boyunca bloke etme adımını gerçekleştirin. Oositleri 1 kez durulayın.
  4. Birincil antikor inkübasyonu
    1. Transgen ekspresyonunu ve lokalizasyonunu kontrol etmek için, 2 μL α-V5 ve 2 μL α-ATP5A veya α-Tom20'yi (mitokondriyal belirteç olarak) 400 μL 1x PBT'de (1:200 oran) seyreltin.
      NOT: Bir numuneyi boyamak için iki antikor birlikte kullanılabilse de, konakçılarının farklı olması gerekir. Sonraki ikincil antikorların üst üste binmesini önlemektir.
    2. Yumurta odalarını 400 μL seyreltilmiş primer antikor çözeltisi (gece boyunca, 4 °C) ile inkübe edin.
      NOT: Western blot testine benzer şekilde, primer antikorlar immün boyama için birden çok kez kullanılabilir. Bir antikor çözeltisini geri saklamadan önce, herhangi bir yumurta odası içermediğinden emin olun.
    3. Yumurta haznelerini 1 kez durulayın, ardından 3 kez RT'de 10 dakika yıkayın.
  5. İkincil antikor inkübasyonu
    1. 2 μL Keçi α-Rb IgG Alexa Fluor 488 ve 2 μL Goat α-M IgG Alexa Fluor 594'ü 400 μL 1x PBT'de (1:200 oran) seyreltin. Yumurta odalarını RT'de 2 saat boyunca 400 μL seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ile inkübe edin. Biyotinilasyon tespiti için, 2 μL streptavidin konjuge Alexa Fluor 594'ü 1x PBT'ye (1:200 oranında) ekleyin ve ikincil bir antikor ile birlikte inkübe edin.
      NOT: Bu adımdan itibaren numuneyi ışıktan koruyun. İkincil antikorlar deneyden önce taze seyreltilmelidir. Birden fazla ikincil antikor birlikte kullanılabilir, ancak örtüşen sinyalleri önlemek için her bir birincil antikor, farklı konaklardan kaynaklanan farklı floroforlara da atanmalıdır. Örneğin, 488 Keçi α-Rb, tavşan α-V5'e bağlanacaktır. Fare α-ATP5A'ya gelince, tamamlayıcı ikincil antikoru olarak 594 Goat α-M kullanılır. Biyotinilasyon tespiti durumunda, streptavidin konjugatı ile aynı dalga boyuna sahip diğer boyaların kullanımı ihmal edilmelidir.
    2. Yumurta haznelerini 1 kez durulayın, ardından 3 kez RT'de 10 dakika yıkayın.
  6. Nükleer boyama
    1. 1 μL DAPI'yi 1 mL 1x PBS (1: 1.000 oran) içinde seyreltin. Yumurta odalarını 1 mL seyreltilmiş DAPI çözeltisi ile RT'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: DAPI, deneyden önce taze seyreltilmelidir.
    2. Yumurta haznelerini 1 kez durulayın, ardından 3 kez RT'de 10 dakika yıkayın.
      NOT: Yumurta odaları, montajdan önce birkaç saat boyunca 4 ° C'de 1x PBS solüsyonunda saklanabilir, ancak mümkün olan en kısa sürede devam edilmesi önerilir.
  7. Sürgülü montaj
    1. Cam slaytı tüy bırakmayan mendille temizleyin, ardından üzerine örnek bilgileri yazın. 1x PBS'yi tüpten çıkarın, ancak kuruluğu önlemek için küçük bir miktar bırakın.
    2. Mikropipet uçlarının kenarını kesin, ardından yumurta haznelerini cam slayta dikkatlice pipetleyin. Yumurta odalarını cam slayt üzerine dikkatlice dağıtmak için forseps kullanın ve herhangi bir topaklanmayı önleyin. Yumurta odalarının eşit olarak dağıldığından emin olmak için slaytları mikroskop altında gözlemleyin (2x büyütme yeterlidir).
    3. Kalan PBS'yi bir mikropipet kullanarak cam slayttan çıkarın. Cam lam üzerine 15-30 μL antifade solüsyonu (ışığa duyarlı) pipetleyin ve tüm yumurta hazneleri ile temas ettiğinden emin olun.
    4. Sürgülü kapak kenarını tutmak için forseps kullanın, ardından yumurta odalarını kaplayacak şekilde cam sürgünün üzerine (bir kenardan diğer kenara) yerleştirin. Herhangi bir kabarcık oluşmaması için yavaşça yapın. Fazla solüsyonu tüy bırakmayan mendille kurulayın, ardından lamel kenarlarını oje kullanarak kapatın. Ojenin düzgün bir şekilde kurumasını bekleyin (± 5 dakika).
    5. Slaytları konfokal bir mikroskopla görüntüleyin. Slaytları -20 °C'de saklayın.

4. Kütle spektrometresi analizi için biyotinile peptit zenginleştirme

NOT: Kütle spektrometresi numunesi için yaklaşık 3 mg proteine ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu miktarı elde etmek için yaklaşık 100 yumurtalık çiftini inceleyin.

  1. Doku lizisi
    1. Donmuş yumurtalık dokusunu çözün. Bu arada, 1 TBS tableti 500 mL TDW içinde çözerek 1x Tris tamponlu salin (TBS) çözeltisi hazırlayın. RT'de saklayın. 4 mL %10 SDS stoğunu 16 mL 1x TBS'de seyrelterek lizis tamponu olarak 1x TBS'de %2 SDS hazırlayın. RT'de saklayın.
    2. Yumurtalık içeren tüpe 1x TBS'de (1x PI kokteyli ile desteklenmiş) 500 μL% 2 SDS ekleyin. Hücreler parçalanana ve çözelti yapışkan hale gelene kadar birkaç dakika bekleyin.
    3. Uyarlanabilir odaklanmış akustik (AFA) lifi içeren 1 mL boyutlu militube'a pipet lizatı. Kullanmadan önce pipet uçlarını kesin. Verimli sonikasyon sağlamak için, tüp başına maksimum 500 μL lizat aktarın.
    4. Aşağıdaki koşullarla sonikasyon gerçekleştirin: tepe olay gücü 75 W, görev faktörü% 10, patlama başına döngü 200, zaman 180 s, sıcaklık 6 °C.
      NOT: Bir numunenin birden çok kez sonikasyona tabi tutulması gerekiyorsa, aşırı ısı oluşmasını önlemek için aralarında bazı aralıklar ayarlayın.
  2. Aseton çökeltme
    1. Lizatı 5 mL'lik düşük bağlayıcı bir tüpe taşıyın, ardından numune hacminin 6 katı kadar tüpe soğuk aseton ekleyin. Örneğin, 500 μL lizata 3 mL aseton ekleyin.
      NOT: Aseton kullanmadan önce -20 °C'de önceden soğutulmalıdır.
    2. Vorteks tüpü, çoklu döndürücüye yükleyin ve gece boyunca (± 16 saat) -20 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Bu bir durma noktasıdır, yani bu adımdan sonra deney anlık olarak duraklatılabilir.
    3. Pelet, proteinleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15.000 x g'da çökeltilmiş proteinler. Süpernatanı atın, ardından tüpü 4 °C'de döndürün.
    4. % 90 soğuk aseton ve% 10 1x TBS'den oluşan 2 mL karışım çözeltisi ekleyin. Pelet ve çözeltiyi karıştırmak için yukarı ve aşağı hareketlerle pipetleyin. Kullanmadan önce pipet uçlarını kesin.
    5. Vorteks tüpü, daha sonra çoklu döndürücüye yükleyin ve -20 ° C'de 2 saat inkübe edin.
    6. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15.000 x g'da pelet proteinleri. Süpernatanı atın, ardından tüpü 4 °C'de döndürün. Tüpü açın ve peleti 10 dakika havayla kurutun.
      NOT: Peletleri aşırı kurutmayın çünkü daha sonra yeniden askıya almak zor olacaktır.
    7. 0.7906 g ABC'yi 20 mL TDW içinde çözerek 500 mM amonyum bikarbonat (ABC) stok çözeltisi hazırlayın. 3 mL 500 mM ABC stok çözeltisini 27 mL TDW içinde seyrelterek 50 mM ABC çalışma çözeltisi yapın.
    8. 1 mL 50 mM ABC'ye 0.4805 g üre ekleyerek 8 M üre çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Üre çözeltisi deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır.
    9. Protein peletini 500 μL 8 M üre içinde yeniden süspanse edin. Protein konsantrasyonunu artırmak için 8 M üre hacmi azaltılabilir.
    10. Yeniden süspansiyon proteinini AFA lifi içeren 1 mL boyutlu militube'a aktarın, ardından adım 4.1.4'te açıklanan aynı koşullarla sonikasyon gerçekleştirin.
    11. Protein konsantrasyonunu belirlemek için BCA testi yapın. Bu adım bir durma noktasıdır. Protein örneğini daha fazla kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
  3. Tripsin sindirimi
    1. Toplam 500 μL çözelti elde etmek için 3 mg proteini TDW ile (gerekirse) 5 mL'lik düşük bağlayıcı bir tüpte karıştırın.
    2. 37 ° C'de 1 saat boyunca 450 rpm'de termoblok kullanarak proteinleri denatüre edin.
    3. 10 mM DTT'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için tüpe 5 μL 1 M DTT (TDW'de çözülmüş) ekleyin, ardından 37 ° C'de 1 saat boyunca 450 rpm'de bir termoblok kullanarak proteinleri azaltın.
    4. 0.0111 g iyodoasetamidi 150 μL ABC içinde çözerek 400 mM iyodoasetamid hazırlayın. Tüpe 55 μL 400 mM iyodoasetamid ekleyin (son konsantrasyon 40 mM), ardından proteinleri 37 ° C'de 1 saat boyunca 450 rpm'de termoblok kullanarak alkilleyin.
      NOT: İyodoasetamid ışığa duyarlıdır ve tüm iyodoasetamid çözeltileri deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır.
    5. Toplam hacim 4 mL'ye ulaşana kadar 50 mM ABC çözeltisi ekleyerek numuneyi seyreltin. Seyreltmeden sonra, çözeltideki üre konsantrasyonu 1 M civarındadır.
    6. 1.1098 g CaCl2'yi 10 mL TDW'de çözerek 1 M CaCl2 stok çözeltisi yapın. 1 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için tüpe 4 μL 1 M CaCl2 stoğu ekleyin, ardından çözeltiyi homojenize etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.
    7. 1 mL ABC'ye 0.001 g tripsin ekleyerek 1 mg / mL tripsin stok çözeltisi hazırlayın. Tüpe 150 μL tripsin ekleyin (tripsin: numune = 1:20 oranı). 37 ° C'de 16 saat boyunca 450 rpm'de termoblok kullanarak proteini sindirin.
      NOT: Tripsin, deneyden önce taze olarak çözülmelidir. Bu adım bir durma noktasıdır. Sindirilmiş peptitleri daha fazla kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.
  4. Biyotinile peptit zenginleştirme
    NOT: Yıkama ve elüsyon tamponları deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır.
    1. 10 mL 1x TBS'ye 1.2012 g üre ekleyerek 1x TBS çözeltisinde 2 M üre hazırlayın.
    2. 3 mg numune başına 150 μL streptavidin konjuge manyetik boncuk kullanın. Streptavidin boncuklarını 1x TBS'de 1 mL 2 M üre ile yıkayın. Bu adımı 4 kez tekrarlayın. Her yıkamadan sonra, tüpü 1 dakika boyunca manyetik bir rafa koyun, ardından yıkama tamponunu atın.
      NOT: Pierce Streptavidin Manyetik Boncuklar, kütle spektrometresi sonuçlarında PEG benzeri arka plan sinyallerini en aza indirdikleri için önerilir.
    3. 1 mL sindirilmiş peptitleri boncuk içeren tüpe pipetleyin, hafifçe karıştırın ve ardından karışımı kalan numune ile 5 mL'lik düşük bağlayıcı bir tüpte birleştirin. Tüpü çok döndürücü üzerine yerleştirin ve RT'de 1 saat inkübe edin.
    4. Karışımın 1 mL'sini 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 1 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Süpernatanı atın. Tüm boncuklar toplanana kadar bu adımı tekrarlayın.
    5. 0.7207 g üreyi 6 mL 50 mM ABC'de çözerek 50 mM ABC'de 2 M üre hazırlayın. Boncukları 50 mM 2x'te 1 mL 2 M üre ve bir kez 1 mL TDW ile yıkayın. Her yıkamadan sonra, tüpü 1 dakika boyunca manyetik bir rafa koyun, ardından yıkama tamponunu atın.
    6. 1 mL formik asidi 9 mL TDW içinde çözerek %10 formik asit stok çözeltisi hazırlayın. TDW'de %80 asetonitril ve %0.1 formik asitten oluşan elüsyon tamponunu hazırlayın. Örneğin, 1.5 mL elüsyon tamponu yapmak için 1.2 mL asetonitril, 15 μL %10 formik asit stoğu ve 285 μL TDW'yi karıştırın.
      DİKKAT: Asetonitril ve formik asit, uçucu özelliklerinden dolayı zararlıdır, bu nedenle maske takın ve bunları tutarken dikkatli olun.
    7. Tüpe 100 μL elüsyon tamponu pipetleyin, nazikçe homojenize edin ve ardından peptitleri 60 ° C'de 5 dakika boyunca 300 rpm'de bir termoblok kullanarak elüte edin. Elüsyondan sonra, tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve elüatı 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. Elüatı aktarırken boncuk almaktan kaçının. Bu adımı 5 kez tekrarlayın.
    8. 500 μL elüat içeren tüpü 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin, ardından boncukların tamamen çıkarılmasını sağlamak için 1,5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. Ayrıştırılan numuneler daha sonra kurutulabilir ve kütle spektrometresi analizi için kullanılabilir.
    9. Zenginleştirilmiş peptit örneklerinin LC-MS/MS analizi ve MS veri işleme hakkında ek bilgi için Nguyen ve ark.20'ye bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Örnek çıktılar Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4'te daha önce Nguyen ve ark.20 tarafından yayınlanmıştır. Şekil 1, Drosophila yumurtalığında TurboID tabanlı PL'nin deneysel prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, Zuc ve TurboID'yi birleştiren bir yapı oluşturuldu (Zuc-V5-TurboID). Nükleer ihracat sinyali (NE...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, Drosophila yumurtalığında TurboID tabanlı yakınlık etiketleme (PL) için çeşitli zorlukların üstesinden gelmek için kapsamlı sorun giderme yoluyla geliştirilen kapsamlı bir prosedür sunuyoruz. Farklı füzyon düzenleri protein ekspresyonunu ve biyotinilasyon verimliliğini önemli ölçüde etkilediğinden, önemli bir konu genetik yapıları içeriyordu. Örneğin, NES-V5-TurboID, diğer transgenlere kıyasla daha zayıf ekspresyon ve biyotinilasyon sergiledi ve bazen aşağı akış tahlille...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Laboratuvar üyelerine tartışmaları ve yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) tarafından desteklenmiştir (RS-2024-00345327 - ML; RS-2023-00219563 ila ML).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antikorlar< / güçlü >
Keçi anti-fare IgG (H + L) ikincil antikor, HRPInvitrogen31430Analitik dereceli, ışığa duyarlı
Keçi tavşan önleyici IgG (H + L) yüksek çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, alexa fluor plus 488InvitrogenA32731Analitik dereceli, ışığa duyarlı
Keçi anti-tavşan IgG (H + L) ikincil antikoru, HRPInvitrogen31460Analitik sınıf, ışığa duyarlı
HSP90 antikoru (tavşan)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi4874Poliklonal antikor
Pierce Streptavidin proteini, HRPThermo Fisher Scientific21126Analitik sınıf
Streptavidin, Alexa Fluor 594 konjugeInvitrogenS11227Işığa duyarlı, analitik sınıf
V5-etiket antikoru (fare)İnvitrojenR960-25Monoklonal antikor
V5-etiket antikoru (tavşan) (D3H8Q)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi13202Monoklonal antikor
Sinek HatlarıŞirketKatalog NumarasıYorumlar/Açıklama
pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3Kore Drosophila Stok Merkezi2373-2Fly stok
pUASp Kabak V5-TurboID/CyoKore Drosophila Stok Merkezi2188Fly stok
pUASP_attB_V5-TurboID-NES / CyoKore Drosophila Stok Merkezi2635-4Fly stok
w [*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stok Merkezi7062Fly stok
Ekipmanlar ve Malzemeler<strong>CompanyKatalog NumarasıYorumlar/Açıklama
Analitik TeraziMettler ToledoME2040.1 mg okunabilirlik
Amersham Protran 0.45 NC nitroselüloz batı kurutma membranları (300 mm ve kez; 4 m)Cytiva
10600002-Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock Mikrosantrifüj TüpüCorningMCT-175-CKo-polimer
MARKA  Kapak Camı (22 mm x 22 mm)Sigma-AldrichBR470055Borosilikat cam
Toplu Pipet Uçları (10 & mikro; L)Vertex4110N00Propilen
Toplu Pipet Uçları (1000 & mikro; L)Vertex4330N00Propilen
Toplu Pipet Uçları (200 & mikro; L)Vertex4230N00Propilen
Hücre Kültürü Plakası (96 oyuklu)SPL300096Polistiren, düz tabanlı
tip Santrifüj (1.5-2 mL tüp boyutunda rotorlu)Eppendorf5424 RSabit açılı, soğutmalı
Santrifüj (5 mL tüp boyutunda rotorlu)Eppendorf5425 RSabit açılı, soğutmalı
Kimyasal Kaşık-- Paslanmaz çelik
ChemiDoc Görüntüleme sistemiBiorad12003153Western blot görüntüleme sistemi
CO2< / sub> sinek pedi-Anestezik levha
CO2< / sub> tankı ve regülatör-Yüksek basınçlı gaz ve baş dönmesine dikkat
Kompakt inkübatörJSRJSGI-10TYüksek uyarı sıcaklık
Konfokal lazer tarama mikroskobuZeissLSM 710Yoğun lazer ışınına dikkat
Konik tüp (15 mL)SPL50015Polipropilen / Yüksek yoğunluklu polietilen 
Konik boru (50 mL)SPL50050Polipropilen /Yüksek yoğunluklu polietilen 
Dijital denge--
Dijital zamanlayıcı--
Diseksiyon çanağı--Silikon
Dumont #5SF Forseps Güzel Bilim Araçları11252-00Süper ince uçlar, keskin nesnelerin dikkati
DynaMag-2 mıknatısInvitrogen12321D1.5-2 mL boyutlu mikrosantrifüj tüpleri için
Fisherbrand  Superfrost Plus mikroskop slaytları (25 mm x 75 mm)Fisher Scientific12-550-15Keskin cisimlere dikkat
Fly gıda şişeleri (kağıt tapalı)Hansol TechFFB-21010-Fly
gıda şişeleri (pamuk kapaklı)Hansol TechFFV-11010-Odaklanmış
ultrasonikCovarisM220Ultrasonik dalga
Jel bıçakInvitrogenEI9010Plastik saplı paslanmaz çelik
Sınıf 3MM Chr kurutma kağıdı (46 cm ve kez; 57 cm)Cytiva3030-917Whatmann kağıdı
El tipi homojenizatör ve plastik tokmakKimble749540-0000Akülü motor
Isı bloğuİnce PCRALB6400Yüksek sıcaklıkta
Tüy bırakmayan dokuyaYuhan-Kimberly41112-
Sıvı azot-Donma ve yanık uyarısı
Mikroplaka spektrofotometresiAgilent TechnologiesEpochMonokromatör tabanlı optikler
Mikrodalga-Yüksek sıcaklığa dikkat
milliTUBE 1 mL AFA fiberCovarisPN 520135Cam
Mini jel tankıThermo Fisher ScientificA25977Yüksek sıcaklıkta
NuPAGE Bis-tris mini protein jellerine dikkat edin, 4– %12, 1.0– 1,5 mm, 10 oyukluInvitrogenNP0323BOXPoliakrilamid içerir, toksisite uyarısı
NuPAGE Bis-tris mini protein jelleri, 4– %12, 1.0– 1,5 mm, 15 oyukluInvitrogenNP0321BOXPoliakrilamid içerir, toksisite uyarısı
Boya fırçası (Ø 1,8 mm)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006MMetal ejektörlü tek kanallı mikropipet
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005MMetal ejektörlü tek kanallı mikropipet
Pipetman L ( P20L)GilsonFA10003MMetal ejektörlü tek kanallı mikropipet
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001MMetal ejektörlü tek kanallı mikropipet
Güç kaynağıBaşlıca bilimMP-310Yüksek voltajlı elektriğe dikkat
Programlanabilir döndürücüBiosanRS-24-Protein
LoBind  tüplerEppendorf30108302-Tıraş
bıçağıDorco304020Paslanmaz çelik, keskin nesnelere dikkat
Rulo--
Serolojik pipet (10 mL)SPL91010Polistiren
Serolojik pipet (25 mL)SPL91025Polistiren
Serolojik pipet (5 mL)SPL91005Polistiren
Serolojik pipet (50 mL)SPL91050Polistiren
Çıtçıtlı kapaklı düşük retansiyonlu mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL)Thermo Scientific3451PK
Polipropilen Sünger pedInvitrogenEI9052-Stereo
mikroskopZeissStemi 508-Stereo
mikroskop Leica
ThermoMixer  CEppendorf53820000151,5 ve 5 mL boyutlu bloklarla
CımbızAven Araçları18526Plastik, düz uçlar
Vorteks karıştırıcıScientific IndustriesSI-0236-XCell
II Leke modülüInvitrogenEI9051Yüksek sıcaklığa dikkat
XCell  SureLock mini hücreliInvitrogenEI0001Yüksek sıcaklık
Kimyasallar< / güçlü > <güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >< güçlü > Yorumlar / Açıklama< / güçlü >
AsetonSigma-Aldrich650501Analitik sınıf
AsetonitrilSupelco1.00029.1000LC-MS derecesi, soluma toksisitesi ve yanıcı
Albümin standart ampullerine dikkat (% 0.9 salin ve% 0.05 sodyum azid içinde 2 mg / mL'de sığır serum albümini (BSA) içerir)Thermo Scientific23209Pierce BCA Protein Test Kitlerinin Bir Parçası (Thermo Scientific, 23225)
Albümin, sığır serumuBioshopALB001Analitik sınıf
Amonyum bikarbonatSigma-Aldrich09830Analitik sınıf
Biotin Sigma-AldrichB4639Hücre ve doku kültürü sınıfı
Kalsiyum klorür (CaCl2)Sigma-AldrichC5670Hücre kültürü sınıfı
Netlik batı ECL substratıBiorad1705060Analitik sınıf
DAPISigma-AldrichMBD0015Işığa duyarlı, analitik sınıf
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861Analitik sınıf
Fetal sığır serumuCorning35-015-CVHücre kültürü sınıfı
Formik asitSigma-AldrichF0507Reaktif sınıfı, soluma toksisitesine dikkat
Grace'in böcek ortamıGibco11595030Hücre kültürü sınıfı
Anında kuru mayaMarka YokN1019-
İyodoasetamidSigma-AldrichI1149Işığa duyarlı, analitik sınıf
MetanolCarlo Erba41484Analitik sınıf
Oje-Şeffaf tip
Novex Tris-glisin SDS numune tamponu (2X)InvitrogenLC2676Analitik sınıf
NuPAGE MOPS SDS Koşu Tamponu (20X)InvitrogenNP0001Analitik sınıf
PageRuler Önceden boyanmış protein merdiveniThermo Fisher Scientific26616Analitik sınıf
Fenilmetansülfonil florür ve nbsp;Thermo Fisher Scientific36978Analitik sınıf
Fosfat tampon salinSigma-AldrichP4417Analitik sınıf
Pierce %16 Formaldehit (w/h)Thermo Fisher Scientific28908Analitik sınıf, ışığa duyarlı
Pierce BCA protein test kitleriThermo Scientific23225Analitik sınıf
Pierce BCA reaktifi A (0.1 M sodyum hidroksit içinde sodyum karbonat, sodyum bikarbonat, bikinkoninik asit ve sodyum tartrat içerir)Thermo Scientific23228Pierce BCA Protein Test Kitlerinin Bir Parçası (Thermo Scientific, 23225)
Pierce BCA reaktifi B (%4 bakır sülfat içerir)Thermo Scientific1859078Pierce BCA Protein Test Kitlerinin Bir Parçası (Thermo Scientific, 23225)
Propiyonik asitSigma-Aldrich402907ACS sınıfı
Proteaz inhibitörü kokteyl seti IIICalbiochem539134Hücre ve doku kültürü sınıfı
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36936Işığa duyarlı
Sodyum klorür (NaCl)BioneerC-9025Analitik sınıf
Sodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750Analitik sınıf
Sodyum dodesil sülfatSigma-Aldrich71736Moleküler sınıf
Sodyum hidroksit (NaOH)BiosesangSR2018-100-00Analitik sınıf
Üçlü damıtılmış su-Ultra saf (tip 1)
Tris tamponlu salinSigma-Aldrich94158Analitik sınıf
Tris-glisin transfer tamponuKoma BiotechK0341001Analitik sınıf
Tris-HCl, pH 8BioneerC-9006Analitik sınıf
Triton x-100Sigma-Aldrich93443Moleküler sınıf
TripsinThermo Fisher Scientific20233Hücre kültürü sınıfı
Tween 20Sigma-AldrichP9416Moleküler sınıf
ÜreSigma-AldrichU5378Moleküler & hücre kültürü sınıfı
uyarısı dikkat

Kaynaklar

  1. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
  2. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by turboid. eLife. 8, e47864(2019).
  3. Qi, Y., Katagiri, F. Purification of low-abundance Arabidopsis plasma-membrane protein complexes and identification of candidate components. Plant J. 57 (5), 932-944 (2009).
  4. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  5. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  6. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  7. Quantitative Proteomics. , https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics (2025).
  8. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Meth. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  9. Ummethum, H., Hamperl, S. Proximity labeling techniques to study chromatin. Front Genet. 11, 450(2020).
  10. Han, S., Li, J., Ting, A. Y. Proximity labeling: Spatially resolved proteomic mapping for neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 50, 17-23 (2018).
  11. Nishimasu, H., et al. Structure and function of zucchini endoribonuclease in pirna biogenesis. Nature. 491 (7423), 284-287 (2012).
  12. Zamudio, N., et al. DNA methylation restrains transposons from adopting a chromatin signature permissive for meiotic recombination. Genes Dev. 29 (12), 1256-1270 (2015).
  13. Cha, S. J., et al. Therapeutic modulation of gsto activity rescues fus-associated neurotoxicity via deglutathionylation in als disease models. Dev Cell. 57 (6), 783-798.e8 (2022).
  14. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing Drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. J Undergrad Neurosci Educ. 11 (1), A139-A148 (2012).
  15. Feizy, N., et al. In vivo identification of Drosophila rhodopsin interaction partners by biotin proximity labeling. Sci Rep. 14 (1), 1986(1986).
  16. Zhang, B., Zhang, Y., Liu, J. L. Highly effective proximate labeling in Drosophila. G3. 11 (5), jkab077(2021).
  17. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  18. Waring, G. L. Morphogenesis of the eggshells in Drosophila. Int Rev Cytol. 198, 67-108 (2000).
  19. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), e3679(2012).
  20. Nguyen, T. T. M., et al. In vivo profiling of the zucchini proximal proteome in the Drosophila ovary. Development. 150 (4), dev201220(2023).
  21. Ahmadi, S., Winter, D. Identification of poly(ethylene glycol) and poly(ethylene glycol)-based detergents using peptide search engines. Anal Chem. 90 (11), 6594-6600 (2018).
  22. Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. Airid-based proximity labeling for protein-protein interaction in plants. J Vis Exp. (187), e64428(2022).
  23. Fang, B., et al. Lowering sample requirements to study tyrosine kinase signaling using phosphoproteomics with the tmt calibrator approach. Proteomics. 20 (24), 2000116(2020).
  24. Park, N., et al. One-stage tip method for tmt-based proteomic analysis of a minimal amount of cells. ACS Omega. 8 (22), 19741-19751 (2023).
  25. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. J Vis Exp. (159), e60728(2020).
  26. Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Res. 8, Faculty Rev-135 F1000(2019).
  27. Wei, X. F., Li, S., Hu, J. L. A turboid-based proximity labelling approach for identifying the DNA-binding proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102139(2023).
  28. Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update. WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).
  29. Rayaprolu, S., et al. Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain. Nat Commun. 13, 2927(2022).
  30. Uckun, E., et al. In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain. J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).
  31. Xiong, Z., et al. In vivo proteomic mapping through gfp-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish. Elife. 10, e64631(2021).
  32. Holzer, E., Rumpf-Kienzl, C., Falk, S., Dammermann, A. A modified turboid approach identifies tissue-specific centriolar components in C. elegans. PLoS Genet. 18 (4), e1010150(2022).
  33. Artan, M., et al. Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling. J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).
  34. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity. Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).
  35. Baumgartner, L., et al. The Drosophila zad zinc finger protein kipferl guides rhino to pirna clusters. eLife. 11, e80067(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

TurboID Yak nl k EtiketlemeProtein Etkile im HaritalamaBiotinillenmi PeptitlerK tle SpektrometrisiGerm Hatt H creleriProtein KatlanmasMembran OrganizasyonuVezik l Ta n mKonfokal G r nt leme
In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketleme Uygulaması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.