Aşağıda açıklanan protokol, spesifik retinoid otofloresan kullanarak ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması kullanarak retinoid içeren hücreleri oldukça heterojen akciğer hücresi popülasyonlarından izole etmenin basit ve etkili bir yoludur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Akciğer Retinoid İçeren Hücrelerin Hücre Ayıklama ile İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Retinoidler (A vitamini ve metabolitleri), alveolar mikroçevrenin önemli bir lipid bileşenidir ve gelişmekte olan ve yetişkin akciğerlerin fonksiyonel sağlığını korumak için hücre tipine özgü retinoid metabolizması gereklidir. Akciğer hücreleri, dolaşımdaki retinoidlerin kandan retinol (ROH) olarak verimli bir şekilde alınmasına izin veren spesifik yollar kullanır, ardından ROH'nin hücre içi kademeli olarak transkripsiyonel olarak aktif retinoid türlerine, all-trans-retinoik aside (ATRA) dönüştürülmesine izin verir. ATRA aracılı (veya retinoid aracılı) sinyalizasyon, akciğer alveolarizasyonunu, yüzey aktif madde üretimini, anjiyogenezini, geçirgenliğini ve bağışıklığını düzenlemek için çok önemlidir. Daha da önemlisi, fibroblastlar da dahil olmak üzere spesifik akciğer hücreleri, gerektiğinde komşu hücrelere transfer edilmek üzere ROH olarak depolanabilen veya daha fazla mobilize edilebilen retinil esterler (RE) şeklinde retinoidler biriktirebilir. Akciğer retinoid içeren hücreler, retinoid otofloresan (350 nm'de uyarılma üzerine 455 nm'de emisyon) ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak sindirilmiş akciğerlerin tek hücreli süspansiyonundan izole edilebilir ve toplanabilir. Akciğer hücrelerinin kırmızı floresan proteini ile hücreye özgü ek in vivo etiketlemesi, spesifik retinoid içeren akciğer hücresi popülasyonlarının izole edilmesine ve toplanmasına izin verir. Toplanan hücreler, hücre morfolojisi, gen ekspresyonu ve farmakolojik manipülasyonlara yanıt verme konusunda daha ileri analizler için doğrudan analiz edilebilir veya kültürlenebilir. Bu izolasyon ve uygulama tekniği, akciğerlerdeki retinoid metabolizmasının hücresel yönleri ve lipid aracılı hücresel iletişim hakkında daha derin bir bilgi edinmek için akciğer sağlığı ve akciğer hasarının hayvan modeli çalışmaları için önemlidir.
Giriş
Retinoidler (A vitamini ve metabolitleri), alveolar mikroçevrenin önemli bir lipid bileşenidir ve gelişmekte olan ve yetişkin akciğerinin fonksiyonel sağlığını korumak için hücre tipine özgü retinoid metabolizması ve sinyalizasyonu gereklidir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Farelerle ilgili açıklanan tüm prosedürler ve deneyler, Ulusal Bilimler Akademisi55 tarafından hazırlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda belirtilen kriterlere göre Rutgers Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC ID: PROTO202200111) onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. Deney için dikkat edilmesi gereken hususlar ve hazırlıklar
- Hayvancılık ve manipülasyonlar
NOT: Çalışmalarda üç aylık (10-12 haftalık) erkek ve dişi fareler kullanılabilir. Lesitin: Retinol asiltransferaz eksikliği olan fareler (Lr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Akciğer retinoid içeren hücrelerin izolasyonu
Fare akciğerleri ( Lrat+/+ ve Lrat-/-'den) fareler enzimatik olarak sindirildi ve tek hücreli süspansiyonlar hazırlandı ve yukarıda belirtilen prosedüre göre FACS'ye tabi tutuldu. Hücre sıralama ve veri toplama, 100 μm nozul ve 15 psi basınç kullanılarak SpectroFlo CS yazılım sürümü 1.3.0 tarafından çalıştırılan bir Cytek Aurora™ Hücre Sıralayıcı Sisteminde gerçekleştirildi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İnsan ve hayvan dokularında A vitamini tespiti ve floresan mikroskobu kullanılarak histolojik görselleştirme yeteneği ilk olarak 1940'lar59,60 gibi erken bir tarihte rapor edilmiştir. Retinoid otofloresan fenomeni daha sonra in vitro61 dokularda yüksek konsantrasyonlarda A vitamini bulmayı ve floresan mikroskobu kullanarak hayvan embriyonik dokularının62 morfogenezini karak.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri / Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NIH / NHLBI) R01 HL171112 (IS'ye), Ulusal Sağlık Enstitüleri / Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIH / NIEHS) P30 ES005022 tarafından finanse edilen Rutgers Çevresel Maruziyetler ve Hastalıklar Merkezi'nden bir kariyer geliştirme ödülü (IS'ye) ile finanse edilmiştir. ve Rutgers, New Jersey Eyalet Üniversitesi'nden (I.S.'ye) başlangıç fonları. Yazarlar, Rutgers Kanser Enstitüsü'ndeki Bağışıklık İzleme ve Akış Sitometrisi Ortak Kaynağı personeline (kısmen NCI-CCSG P30CA072770-5920) sağlanan fonlarla desteklenmektedir) bu makalede sunulan çalışmaya ka....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
2+2+2+< / sup> / Mg2+< / sup>Gibco 14175-095 Nalgene Hızlı Akışlı Steril Tek Kullanımlık Şişe Üstü Filtreler ThermoFisher 595-3320 Kırmızı Hücre lizisi
/MgGibco 14925-092 HBSS ile Becton Dickinson akış sitometrisi Ca
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 mL serolojik pipet | Avantor / VWR | 76452-284 | |
| 100 & mikro; m süzgeç | Greiner Bio-One | 542000 | |
| 15 mL şahin tüpü | Corning | 352099 | |
| 40 & mikro; m süzgeç | Greiner Bio-One | 542040 | |
| 50 mL şahin tüpü | Corning | 352070 | |
| Hücre kültürü kabı, 35 mm ve akut; 10 mm | Corning | 430165 | |
| Hücre ayırma ortamı | Gibco | A59688DJ | |
| Kollajenaz tip IV | Worthington Biyokimya Şirketi | LS004188 | |
| Cytek Aurora Hücre Ayırıcı Sistemi | Cytek Biosciences | ||
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Falcon marka 5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı boru, 12 mm ve akut; 75 mm | Corning | 352063 | |
| Falcon marka 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüp, hücre süzgeç kapaklı, 12 mm ve akut; 75 mm | Corning | 352235 | |
| FlowJo yazılımı | Ca | ||
| yazılımı HBSS, | |||
| tampon | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| SpectroFlo CS yazılımı | Cytek Biosciences | Sürüm 1.3.0 | |
| Cerrahi Tasarım Royaltek Paslanmaz Çelik Cerrahi Neşter Bıçakları | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| SYTOX Yeşil ölü hücre lekesi | Invitrogen | S34860 | |
| Tamoksifen | Sigma-Aldrich | T2859 |
Kaynaklar
- Shmarakov, I. O., et al. Retinoids stored locally in the lung are required to attenuate the severity of acute lung injury in male mice. Nat Commun. 14 (1), 851(2023).
- Bogue, C. W., Jacobs, H. C., Dynia, D. W., Wilson, C. M., Gross, I.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
