Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Solanum nigrum'da Agrobacterium tumefaciens'in Aracılık Ettiği Genetik Dönüşüm

907 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68212

⸱

24 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

Bu makalede

Özet

Bu makale, transgenik Solanum nigrum üretmek için Agrobacterium tumefaciens'in aracılık ettiği genetik dönüşüm yönteminin ayrıntılı bir protokolünü sunmaktadır.

Özet

Solanum nigrum, patates ve domatesin yetim bir solanlı akrabasıdır ve taze meyvesi besleyici ve lezzetli bir meyvedir. S. nigrum bitkisinin tamamı ilaç olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, vahşi S. nigrum bazı istenmeyen özellikleri barındırır. Neyse ki, genetik mühendisliği teknikleri, özellikle CRISPR / Cas9 gibi gen düzenleme teknolojileri, bu eksiklikleri gidererek S. nigrum'u hızla geliştirmek için değerli fırsatlar sunmaktadır. Çoğu bitkide, gen düzenleme teknolojisi yoluyla bitki ıslahı, Agrobacterium tumefaciens aracılı genetik dönüşüm yoluyla sağlanır. Bu yazıda S. nigrum'da A. tumefaciens'in aracılık ettiği genetik transformasyon protokolleri ayrıntılı olarak anlatılmıştır. S. nigrum fidelerinin kotiledonları ve hipokotilleri, genetik transformasyon için eksplant olarak kullanılmıştır. S. nigrum kanamisine dirençli olduğundan, DsRed geni transgenik bitkileri tanımlamak için görsel bir belirteç olarak kullanılmıştır. S. nigrum'un genetik transformasyonu bu operasyon protokollerine göre verimli bir şekilde tamamlanabilir. T1 transgenik bitkilerin tespiti, PCR tanımlamasına gerek kalmadan kırmızı floresan yayıp yaymadıklarına göre doğrudan tanımlanabilir.

Giriş

Solanum nigrum (siyah itüzümü olarak bilinir, 2n = 6x = 72), patates ve domates1'in solanlı bir akrabasıdır. Meyve, olgunlaştıktan sonra siyaha dönen küresel bir meyvedir. Taze meyve besleyici ve lezzetli bir meyvedir. S. nigrum'un tüm bitkisi, kan stazını dağıtma, şişliği azaltma, ısıyı temizleme ve detoksifiye etme etkileri ile ilaç olarak kullanılabilir. S. nigrum, yaygın bir kolesterol öncüsünden iki farklı özel metabolit sınıfı sentezler: yapraklarındaki steroidal saponinler ve meyvelerindeki steroidal glikoalkaloidler (SGA'lar). S. nigrum'dan türetilen steroidal bir saponin olan Uttroside B, yakın zamanda ABD Gıda ve İlaç Dairesi tarafından hepatosellüler karsinom2'nin tedavisi için yetim bir ilaç olarak onaylanmıştır. S. nigrum'daki GAME15 geninin nakavtlanması, bitkilerin hem saponinlerden hem de steroidal alkaloidlerden yoksun olmasına neden oldu ve ayrıca steroidal saponinlerin ciddi tarımsal böcek zararlılarını kontrol ettiğini ortaya çıkardı2. S. nigrum'daki polifenoller, adipositleri ve lipid metabolizmasını etkileyerek kilo ve vücut yağını azaltır3. S. nigrum kadmiyumu zenginleştirebilir ve kadmiyum zenginleştirmesini incelemek için model bir bitki olarak kullanılır 4,5. S. nigrum evcilleştirilmemiş bir bitkidir ve araştırma temeli nispeten zayıftır. S. nigrum ile ilgili araştırmaların son yıllarda giderek artması ilham vericidir. Hekzaploid S. nigrum'un genomu yakın zamanda bir araya getirilmiştir ve S. nigrum, diploid Solanum americanum'dan (2n = 2x = 24)6,7 evrimleşmiş olabilir. Bu nedenle, S. nigrum hem tıbbi hem de yenilebilir değere sahip bir bitkidir. S. nigrum üzerine yapılan araştırmalar, yalnızca insan hastalıklarının tedavisindeki potansiyel uygulamalarının daha derin bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunmakla kalmaz, aynı zamanda tarımsal üretimin artırılmasına ilişkin değerli bilgiler sağlar. Bu nedenle, S. nigrum'da bir genetik dönüşüm sistemi kurmak, transgenik ve gen düzenleme teknolojisi yoluyla genetik iyileştirmenin temelini oluşturur.

S. nigrum 8,9,10,1 1'in Agrobacterium tumefaciens aracılı genetik dönüşümüne odaklanan birkaç rapor vardır. Önceki çalışmamızda, S. nigrum için bir A. tumefaciens LBA4404 aracılı genetik dönüşüm sistemi kurduk ve AcMYB110'u S. nigrum'a dönüştürerek antosiyanin içeriği artmış1 S. nigrum'un yeni germplazmlarını elde ettik. Transgenik ve gen düzenlenmiş S. nigrum bitkileri, A. tumefaciens EHA105 aracılı genetik transformasyon10 ile elde edilmiştir. Farklı floresan proteinler yeşil, kırmızı, sarı, turuncu ve mavi floresan emisyonlarına sahiptir ve hücresel yaşam aktivitelerini göstermede yaygın olarak kullanılmaktadır12. Bitkilerin genetik dönüşüm sürecinde, kırmızı floresan genler genellikle genetik olarak değiştirilmiş olayları genetik olarak değiştirilmemiş olaylardan ayırt etmek için raportör genler olarak kullanılır13. DsRed geninin bir raportör gen olarak kullanılması, transgenik olayların uygun bir şekilde ayırt edilmesine izin verirken, R2R3-MYB transkripsiyon faktörünün bir raportör gen olarak kullanılması, bitkilerin genotipinden etkilenebilir14. Transgenik döllerde, transgenik bitkiler, optik aletler (örneğin, floresan mikroskopları veya görüntüleme sistemleri) kullanılarak transgenik olmayan bitkilerden kolayca ayırt edilebilir ve bu da PCR tabanlı tanımlama ihtiyacını ortadan kaldırır. Floresan protein raportör geninin CRISPR gen düzenleme teknolojisi ile entegre edilmesiyle, mısırdaki doğurganlık genleri hassas bir şekilde silindi ve bu da bir nükleer steril hattın ve kontrollü bir nükleer steril bakım hattının15 oluşturulmasıyla sonuçlandı. Bakım bitkilerinin kendi kendine tozlaşması ve meyve vermesi, 1: 1 oranında koruyucu ve steril hatlar üretecektir. Farklı ışıldayan özelliklere bağlı olarak, koruyucu ve steril hat tohumlarının tahribatsız bir şekilde sınıflandırılması, görsel veya makine tanıma yoluyla sağlanabilir15. Bu nedenle, floresan protein geninin bir raportör gen olarak kullanılması, PCR analizine gerek kalmadan transgenik tohumların veya bitkilerin tanımlanmasını basitleştirir. Bu, genetik dönüşüm alanında önemli bir avantajı temsil eder. Bu yöntem, S. nigrum'da Agrobacterium tumefaciens aracılı genetik transformasyon protokolünü, kırmızı floresan geni DsRed'i bir raportör gen olarak kullanarak tanımlamayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Aseptik fide yetiştiriciliği

NOT: Aşağıdaki adımlar süper temiz bir tezgah üzerinde gerçekleştirilir.

  1. Çin'in Liaocheng Şehrinde S. nigrum'un yabani tohumlarını toplayın ve onlara Snlc1 adını verin. 50 yabani S. nigrum tohumu alın ve bunları 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun. 1 mL% 5 gibberellini 30 dakika beklettikten sonra, gibberellin çözeltisini atın.
  2. 1 mL %75 etanol ekleyin, 1 dakika çalkalayın ve ardından etanolü atın.
  3. 1 mL% 2 sodyum hipoklorit çözeltisi ekleyin ve tohumların yüzeyini 10 dakika dezenfekte edin. Tohum yüzeyini sterilize etmek için santrifüj tüpünü iyice çalkalayın. 10 dakika sonra sodyum hipokloriti atın.
  4. Artık sodyum hipokloriti çıkarmak için tohumları 5 kez sterilize suyla yıkayın. Tohumları, 1/2 MS katı ortam içeren 90 mm çapında Petri kaplarına yerleştirin. Plakaları bir bitki büyüme odasında 25 ° C'de 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık fotoperiyot altında kültürleyin (Şekil 1A).

2. A. tumefaciens LBA4404 Kültürü

  1. Kırmızı bir floresan geni olan DsRed2 ile barındırılan pRed130516 ikili vektörünü, MicroPulser ile elektroporasyon yoluyla A. tumefaciens'e dönüştürün LBA4404 parametrelerle: Gerilim 1800 V, Kapasitans 25 μF, Direnç 200 Ω, Küvet 1 mm. Bakterileri katı LB ortamında 50 mg / L kanamisin ve 50 mg / L rifampisin ile 28 ° C'de 48 saat boyunca kültürleyin.
  2. pRed1305 içeren bir LBA4404 klonu alın ve 12 saat boyunca 28 ° C'de 180 rpm'lik bir masa yoğunlaştırıcıda 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 50 mg / L kanamisin ve 50 mg / L rifampisin içeren 1 mL sıvı LB ortamında kültürleyin.
  3. 1 mL bakteri çözeltisine aynı antibiyotikle 50 mL sıvı LB ekleyin ve ardından 6 saat boyunca 28 ° C'de 200 rpm'lik bir masa yoğunlaştırıcıda kültürleyin.
  4. Bakteri kültürü ortamının OD600'ü 0.4 olduğunda kültürlemeyi durdurun ve ardından bakteri çözeltisini 25 ° C'de 10 dakika boyunca 2200 x g'da santrifüjleyin.
  5. Santrifüjlenmiş bakterileri enfeksiyon solüsyonu (IS: M519 4.43 g/L, sükroz 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, AS, 100 μmol/L, pH 5.8) ile tekrar süspanse edin ve bakteri solüsyonu konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile OD600= 0.6'ya ayarlayın.

3. A. tumefaciens ile eksplant enfeksiyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar süper temiz bir tezgah üzerinde gerçekleştirilir.

  1. Fide kotiledonları açılana kadar tohumları 7 gün boyunca büyütün (Şekil 1B). Fidelerden yaklaşık 1 cm uzunluğundaki iki kotiledon ve hipokotili, sterilize edilmiş, keskin bir neşter ile bakteri IS ile nemlendirilmiş filtre kağıdı ile bir kültür kabında kesin ve birincil kökleri atın. Neşter kullanırken dikkatli olun.
  2. Eksplantları enfeksiyon solüsyonunda 30 dakika boyunca demleyin. Eksplantın yüzeyindeki bakteri çözeltisinin emilmesine izin vermek için eksplantları kuru filtre kağıdına yerleştirin.
  3. Eksplantları IS katı ortama yerleştirin (% 0.7 Agar; Şekil 1C). Eksplantları 19 ° C'de ışıksız bir bitki büyüme odasına yerleştirin ve 3 gün boyunca kültürleyin.

4. Eksplantların farklılaşması

NOT: Aşağıdaki adımlar süper temiz bir tezgah üzerinde gerçekleştirilir.

  1. Eksplantları bitki büyüme odasından 19 °C'de toplayın. Eksplantları sterilize su 5x kullanarak yıkayın ve eksplantları kuru, sterilize edilmiş filtre kağıdına yerleştirin.
  2. Eksplantları sürgün farklılaşması (SD) ortamına yerleştirin (SD: M519 4.43 g / L, sükroz 30 g / L, 6-BA 2 mg / L, ZT 0.5 mg / L, Cef 100 mg / L, Karbonhidrat 100 mg / L, 0.7 g / L Agar, pH 5.8) ve 4 hafta boyunca 25 ° C'de kültürleyin (Şekil 1D, E).
  3. El tipi bir floresan lambanın yeşil uyarma ışığı altında kırmızı floresan gösteren eksplantların nasırlarını/tomurcuklarını bir neşter kullanarak kesin ve ardından bunları yeni bir SD ortamına aktarın ve 25 ° C'de 4 hafta boyunca kültüre devam edin (Şekil 1F, G).

5. Köklenme ve nakli

  1. Kırmızı floresan gösteren tomurcukları el tipi bir floresan lamba ile kesin, köklendirme ortamına aktarın (RM: M519 4.43 g / L, sükroz 30 g / L, 6-BA 2 mg / L, ZT 0.5mg / L, Cef 100 mg / L, Karbonhidrat 100 mg / L, 0.7 g / L Agar, pH 5.8) ve kök üretimini teşvik etmek için 25 ° C'de 2-4 hafta boyunca kültürleyin.
  2. Kök uzunluğu 2 cm'den fazla olan kırmızı floresan gösteren fidanları toprağa nakledin ( Şekil 1H-K). Transplantasyondan önce, köklerde aşırı bakteri üremesini önlemek için agarı köklerden elle çıkarın.

6. Genetiği değiştirilmiş T0 bitkilerinin PCR amplifikasyonu ile test edilmesi

  1. Setil Trimetil Amonyum Bromür (CTAB) yöntemini17 kullanarak bağımsız bir transgenik hattın genomik DNA'sını çıkarın.
  2. 7.5 μL 2x PCR Master Mix ve her primerden 0.3 μL (10 μmol / L) içeren 15 μL'lik bir reaksiyon hacminde şablon olarak 10 ng genomik DNA kullanarak primer seti, RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') ve RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') ile DsRed genini amplifiye edin. Beklenen DNA parçası 393 bp idi. Transgenik bitki olup olmadıklarını belirlemek için PCR ürünlerini %1 agaroz jel elektroforezine tabi tutun.

7. T1 neslindeki transgenik bitkilerin floresan lamba ile tanımlanması

  1. Rengi tamamen siyah-mor olan T0 transgenik S. nigrum bitkilerinin meyvesini hasat edin ve ardından meyvenin içindeki tohumları elle sıkın. Doğal olarak tohumları oda sıcaklığında yaklaşık 1 hafta havayla kurutun.
  2. Kurutulmuş tohumları bu protokolün 1.1 ila 1.4 adımlarına göre 1/2 MS ortamında kültürleyin ve 1 hafta boyunca bir bitki büyüme odasına koyun. Transgenik fideleri ve transgenik olmayan fideleri el tipi bir floresan lamba ile ayırt edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Transgenik S. nigrum üretmek için Agrobacterium tumefaciens'in aracılık ettiği genetik dönüşüm.
S. nigrum fidelerinin kotiledonlarını ve hipokotillerini A. tumefaciens ile enfekte ettikten sonra, DsRed'in raportör gen olarak kullanılması nedeniyle Agrobacterium enfeksiyonunun başarılı olup olmadığını belirleyebildik. Enfeksiyondan 3-4 hafta sonra y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Şimdiye kadar, A. tumefaciens'in aracılık ettiği S. nigrum için genetik transformasyon yöntemleri farklı laboratuvarlarda kurulmuştur8,9,10,11. Bu transformasyon yöntemlerinin çoğu, 8,9,10,11 seçim maddesi olarak kan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Liaocheng Üniversitesi (318012028) Araştırma Fonu ve Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2020MC034) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2X SanTaq PCR Master Karışımı (Mavi Boya ile)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5320612X SanTaq PCR Karışımı, MgCl?, dNTP'ler, Taq DNA Polimeraz, PCR tamponu, yükleme boyası ve PCR arttırıcı içerir.
6-BASangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd.C14819266Yapay sitokininler
AgarTianjin Damao Kimyasal Reaktif Ortaklığı Kurumsal (Sınırlı Ortaklık)CAS NO: 9002-18-0Katılar
ASSangon Biotech (Şangay) Co., Ltd.K914BA0002'nin verimli ekspresyonunu indükleyin
.Antibiyotik
CefSangon Biotech (Şangay) Co., Ltd.I526BA0010Antibiyotik
gibberellinSangon Biotech (Şangay) Co., Ltd.K514BA0009Tohum çimlenmesini teşvik eder
kanamisinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I614BA0013Antibiyotik
LB ortamıSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113Bakterileri büyütün
MicroPulser (Gene Pulser Xcell)Bio-Rad, US617BR1 06783Gene Pulser Xcell
MS katı ortaphytotech Co., Ltd., USHCA0519228A  Murashige & Vitaminler ile Skoog Bazal Ortam, M519
plastik kutuLiaoSu, ÇinT909HBitki dikim kutusu
rifampisinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.S180305Antibiyotik
sükrozSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.CAS NO: 57-50-1 & nbsp;    Karbon kaynağı olarak
Tanon-5200Multi makineTanon Co., Ltd., Çin5200MultiLiaocheng
'de toplananyabani Solanum nigrum
.J921BA0014Bitki büyüme düzenleyicileri
Agrobacterium Carb Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Şehri ZT Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.hızlandırılmış ayırma

Kaynaklar

  1. Wang, X., et al. Ectopic overexpression of AcMYB110 causes significantly increased content of anthocyanins in Solanum nigrum. Biologia plant. 67, 200-203 (2023).
  2. Boccia, M., et al. A scaffold protein manages the biosynthesis of steroidal defense metabolites in plants. Science. 386 (6728), 1366-1372 (2024).
  3. Peng, C. H., et al. Solanum nigrum polyphenols reduce body weight and body fat by affecting adipocyte and lipid metabolism. Food Funct. 11 (1), 483-492 (2020).
  4. Wang, J., et al. Influence of Cd toxicity on subcellular distribution, chemical forms, and physiological responses of cell wall components towards short-term Cd stress in Solanum nigrum. Environ Sci Pollution Res. 28 (11), 13955-13969 (2021).
  5. Wang, J., et al. Comparative cytology combined with transcriptomic and metabolomic analyses of Solanum nigrum L. in response to Cd toxicity. J Hazardous Mater. 423, 127168(2022).
  6. Lee, E. S., et al. Engineering homoeologs provide a fine scale for quantitative traits in polyploid. Plant Biotech J. 21 (12), 2458-2472 (2023).
  7. Lin, X., et al. Solanum americanum genome-assisted discovery of immune receptors that detect potato late blight pathogen effectors. Nat Genetics. 55 (9), 1579-1588 (2023).
  8. Bhattacharya, A., et al. Engineering gibberellin metabolism in Solanum nigrum L. by ectopic expression of gibberellin oxidase genes. Plant Cell Rep. 31 (5), 945-953 (2012).
  9. Chhon, S., Jeon, J., Kim, J., Park, S. U. Accumulation of Anthocyanins through Overexpression of AtPAP1 in Solanum nigrum Lin (Black Nightshade). Biomolecules. 10 (2), 277(2020).
  10. Park, S., et al. Rapid generation of transgenic and gene-edited Solanum nigrum plants using Agrobacterium-mediated transformation. Plant Biotech Rep. 14 (4), 497-504 (2020).
  11. Peng, W., et al. A convenient, reliable and directly visual selection marker for identifying transgenic lines of Solanum nigrum. Plant Cell Tiss Organ Cult. 152 (2), 369-375 (2023).
  12. Schlechter, R. O., et al. Chromatic Bacteria - A Broad Host-Range Plasmid and Chromosomal Insertion Toolbox for Fluorescent Protein Expression in Bacteria. Front Microbio. 9, 3052(2018).
  13. Hao, H., et al. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Lotus corniculatus using DsRed2 positive selection and vermiculite-based rooting method. Plant Cell Tiss Organ Cult. 156 (2), 58(2024).
  14. Fan, Y., et al. a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Meth. 16 (1), 94(2020).
  15. Qi, X., et al. Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology. Mol Plant. 13 (9), 1262-1269 (2020).
  16. Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell Tiss Organ Cult. 141 (1), 207-216 (2020).
  17. Schenk, J. J., Becklund, L. E., Carey, S. J., Fabre, P. P. What is the "modified" CTAB protocol? Characterizing modifications to the CTAB DNA extraction protocol. Appl Plant Sci. 11 (3), e11517(2023).
  18. Li, Q., et al. An Improved and Simplified Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation Protocol for Solanum nigrum with a Shorter Growth Time. Plants. 13 (15), 2015(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Gen D zenlemeCRISPR Cas9Bitki IslahTransgenik BitkilerG rsel BelirteDsRed GeniK rm z Floresan

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.