Subaraknoid virüs infüzyonu kullanan adeno ilişkili virüsün yaygın olarak verilmesi için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Bu yöntem sadece fare neokortikal nöronlarının yüzeysel katmanlarda yaygın olarak transdüksiyonunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda seçici olmayan bir promotör kullanıldığında bile beşinci katman piramidal nöronlarında transgenin seçici ekspresyonu ile sonuçlanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
AAV2'nin Subaraknoid Enjeksiyonu ile Fare Neokortikal Nöronlarının Yaygın Transdüksiyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Rekombinant adeno ile ilişkili virüsler, deneysel biyolojinin birçok alanında, özellikle sinirbilimde ilgilenilen çeşitli genlerin verilmesi ve ekspresyonu için esnek ve güçlü bir araçtır. Belirli bir beyin bölgesinde istenen bir transgenin ekspresyonunu sağlamak için en popüler yöntem, bir AAV vektörünü doğrudan beyin parankimine enjekte etmektir. Bununla birlikte, bu yöntem, bazı in vivo deneyler için gerekli olan yaygın nöronal transdüksiyona izin vermez. Bu makalede, beynin subaraknoid boşluğuna viral infüzyona dayalı olarak fare neokorteksinde yaygın gen ekspresyonu için yeni bir teknik sunuyoruz. Bu nöronal etiketleme yöntemi, yalnızca yetişkin fare yüzeysel neokortikal tabakalarında nöronların yaygın olarak transdüksiyonunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda CAG gibi güçlü bir seçici olmayan promotör kullanıldığında bile yüksek özgüllüğe sahip beşinci katman piramidal nöronların geniş bir popülasyonunda transgenin ekspresyonu ile sonuçlanır. Ayrıca, hücre transdüksiyonu enjeksiyon bölgesinden önemli bir mesafede gerçekleştiğinden, bu yöntem nöronal aktivitenin sonraki optik veya elektrofizyolojik kayıtları için beyin dokusunun korunmasına yardımcı olabilir.
Giriş
Memeli beyni, trilyonlarca sinaps ile devrelere bağlı birçok inhibitör, uyarıcı ve modülatör hücreden oluşur1. Sinirbilimin temel zorluklarından biri, beyin devrelerinin ve davranışlarının organizasyonu ve işlevinde farklı hücre tiplerinin rolünü çözmektir. Beyindeki genetik olarak tanımlanmış hücreleri manipüle etmek, transgenleri tanıtmak ve ifade etmek için yöntemler gerektirir. Viral tabanlı gen dağıtım sistemleri, merkezi sinir sistemine gen iletimi için açık ara en etkili ve basit yöntemdir2. Viral dağıtım sistemleri, genetik bilgiyi bir konakçı hücreyeiletme
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneyler, her iki cinsiyetten 2-4 aylık yetişkin C57Black/6 fareleri üzerinde gerçekleştirildi (Pushchino Yetiştirme Merkezi, RAS Shemyakin-Ovchinnikov Biyoorganik Kimya Enstitüsü Şubesi). Fareler, yiyecek ve su ad libitum ile sıcaklık kontrollü bir vivaryumda (22 ° C ± 2 ° C, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü, ışıklar 08.00 saatte açık) barındırıldı. Tüm deneysel prosedürler, hayvan deneyleri için ARRIVE yönergelerine ve 2010/63/EU Direktifine uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma protokolü, IHNA RAS Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (01.02.2022 tarihli protokol N1). Hayvanların çektiği acıyı en aza indirmek ve sonuçların....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bir pilot deney serisinde, CaMKII promotörü altında EGFP floresan proteini ile kaynaşmış hızlı channelrhodopsin (oChIEF) genini taşıyan AAV2 ile fare neokorteksindeki beşinci katman piramidal nöronları dönüştürmek için geleneksel intrakortikal enjeksiyon yöntemini kullandık. AAV212'nin karakteristik özelliği ile tutarlı olarak, genişliği 1 mm'yi geçmeyen nispeten küçük bir enfeksiyon alanı elde ettik (Şekil 1A). Bununla birlikte, bazı deneylerde, bazı durumla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Beynin subaraknoid boşluğuna AAV2 viral partiküllerinin bir süspansiyonunu enjekte ederek fare neokortikal nöronlarını dönüştürmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Bu, aynı miktarda virüs doğrudan beyin parankimine enjekte edildiğinde enfekte olan doku hacminden neredeyse dört kat daha büyük olan yaygın virüs dağılımı sağlar.
Virüs vektörlerinin farklı yollarla (örneğin, intraserebroventriküler, intratekal veya intrasisternal) doğrudan beyin omurilik sıvısına.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Çalışma, Rusya Bilim Vakfı'nın 20-15-00398P hibesinin mali desteği ile gerçekleştirildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman | |||
| 10 &mikro; L Gaz Geçirmez Şırınga Model 1701 RN (5 uL 75 RN Hamilton mikro şırınga) | Hamilton Şirketi | Parça/REF # 7634-01, Hamilton veya cat no. HAM7634-01, Merck | |
| 33 G RN iğne, sivri uçlu 3 | Hamilton Şirketi | Parça/REF # 7803-05, Hamilton | |
| Binoküler Mikroskop | Nikon veya Micromed | MC-4 ZOOM modeli | |
| Cerna tabanlı lazer taramalı konfokal mikroskop | ThorLaboratuvarları | ||
| Soğuk ışık kaynağı | Geri sar | Ürün Kodu: 76312 | |
| Leica VT1000 S Titreşimli bıçak mikrotomu | Leica Biyosistemleri | 76001-014 | |
| Başlangıç kitli Düşük Akışlı Anestezi Sistemi | Kent Bilimsel Şirketi | 13-005-111 (Model SomnoSuite) | |
| Mekanik Pipet 0.1 – 2.5 &mikro; L Eppendorf Araştırma artı | Eppendorf Belediyesi | 3123000012 | |
| Mekanik Pipet 10 – 100 &mikro; L Eppendorf Araştırma artı | Eppendorf Belediyesi | 3123000047 | |
| Fare Tıraş Makinesi | Geri sar | CP-5200 Modeli | |
| Matkap uçlu mikro matkap (0,5 mm, yuvarlak) | Geri sar | 78001, 78040 | |
| veya Desctop Dijital Stereotaksik Alet, Fare anestezi Maskesi, Fare kulak çubukları (60 Derece) | Geri sar | 68027, 68665, 68306 Modelleri | |
| Hava kompresörü | Bambi | BB8 | |
| Tek Kanallı Manuel Pipet 0.5-10 µ L | YAĞMUR | 17008649 | |
| Küçük Hayvan Stereotaksik Enstrümanı | KOPF | 962 Modeli | |
| Stereotaksik Enjektör | Çalmak | 10-000-004 | |
| Cerrahi Aletler (Aletler) | |||
| 30 G diş iğnesi (Ni-pro) | Biodent Ltd. Şti. | Dura'yı kesmek için | |
| Kemik kazıyıcı | Güzel Bilim Araçları | 10075-16 | |
| Kemik pensesi | Güzel Bilim Araçları | 16025-14 | Kafatası kemiğini çıkarmak için |
| Kavisli spatula | Mozhaisk Tıbbi Malzeme Fabrikası | Beyni kafatası kasasından çıkarmak için | |
| Diş frezi | DRENDEL + ZWEILING | Kraniyotomi için; Şekil: armut biçimli/yuvarlak uçlu silindir/yuvarlak; Uç Çapı: 0,55-0,8 mm çap | |
| İğne tutucu (Halsey Mikro İğne Tutucu) | Güzel Bilim Araçları | 12500-12 | |
| Polipropilen Cerrahi Sütür veya Cerrahi Sütür Vicryl (5-0, emilebilir) | Walter Ürünleri (Ethicon) | S139044 (W9442) | |
| Neşter bıçaklı neşter sapı (#3) (#11) | Güzel Bilim Araçları | 10003-12, 10011-00 | |
| Makas (Ekstra Dar Makas) | Güzel Bilim Araçları | 14088-10 | cildi kesmek için |
| Makas (İnce Makas) | Güzel Bilim Araçları | 14094-11 | dikişi kesmek için |
| Cerrahi sütür PROLENE (Poliproptlen) | Ethicon (Johnson & Johnson) | ||
| Cımbız (Forseps #5) | Güzel Bilim Araçları | 11252-20 | |
| Cımbız (Cilalı Inox Forseps) | Güzel Bilim Araçları | 11210-20 | |
| Tek kullanımlık | |||
| 1 mL insülin şırıngası | SİTE BÖLÜMÜ | Vazelin yağını bir mikro şırıngaya yüklemek, ilaç vermek için | |
| Hücre Kültürü Plakası | SPL Yaşam Bilimleri | ||
| Pamuklu çubuklar | |||
| Kapak Camları | Fisher Bilimsel | 12-545E | |
| İnsülin şırınga iğnesi (27 G) | SİTE BÖLÜMÜ | Debrileri bir delikten çıkarmak için (kraniyotomi) | |
| Tüy bırakmayan mendiller CLEANWIPER | Ağ Bağlantısı | ||
| Mikroskop Slaytları | Fisher Bilimsel | 12-550-15 | |
| Kağıt havlular | Parlak tarama | ||
| Parafilm | İstatistik Laboratuvarı | STLPM996 | |
| Steril Cerrahi Eldivenler | Dermagrip | ||
| Steril Şırınga Filtresi (0.2 μ m) | Corning | 431229 | |
| İlaçlar/Kimyasallar (Reaktifler) | |||
| %10 tamponlu formalin veya %4 paraformaldehit | Thermo Scientific Kimyasallar | J61899. AK | |
| İyotun alkol çözeltisi (%5)) | Yenileme | ||
| Antibiyotik merhem Baneocin (basitrasin + neomisin) | Sandoz | Harici kullanım için antibakteriyel ajan | |
| Aqua Çoklu Montaj | Çoklu bilimler | 18606-20 | |
| Carbomer Göz Jeli Vidisic (Oftalmik jel) | BAUSCH+LOMB (Santen) | ||
| Karboksilatla Modifiye FluoSphere Mikroküreler (kırmızı) | Thermo Fisher Bilimsel | F-8801 Serisi | |
| Deksametazon (4 mg/mL) | Ellara (KRKA) | Sentetik glukokortikoid | |
| Damıtılmış H2O | |||
| Etanol (%70) | |||
| Fleksoprofen %2,5 (Ketoprofen) | VİC | Steroid Olmayan Antienflamatuar İlaçlar (NSAID'ler) | |
| Glikoz çözeltisi %5 | Solopharm | ||
| Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe Edilmiş, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Bilimsel | A-11010 | |
| İzofluran | Karizoo | ||
| Lidokain çözeltisi (%2 / %4) | Solopharm | ||
| Normal Keçi Serumu (NGS) | Abcam | AB7481 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Eko-servis | ||
| Tavşan Anti-Parvalbümin Antikoru | Merck Millipore | AB15736 | |
| Tavşan Rekombinant Monoklonal anti-Calbindin antikoru | Abcam | AB108404 | |
| Salin (H2O'da %0,9 NaCl) | Solopharm | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 50-178-1844 | |
| Vazelin yağı | Genel |
Kaynaklar
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
- Sena-Esteves, M., Gao, G. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (8), (2020).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
