Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

AAV2'nin Subaraknoid Enjeksiyonu ile Fare Neokortikal Nöronlarının Yaygın Transdüksiyonu

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68235

⸱

23 Mayıs 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, 2Faculty of Biology and Biotechnology, National Research University High School of Economics

Bu makalede

Özet

Subaraknoid virüs infüzyonu kullanan adeno ilişkili virüsün yaygın olarak verilmesi için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Bu yöntem sadece fare neokortikal nöronlarının yüzeysel katmanlarda yaygın olarak transdüksiyonunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda seçici olmayan bir promotör kullanıldığında bile beşinci katman piramidal nöronlarında transgenin seçici ekspresyonu ile sonuçlanır.

Özet

Rekombinant adeno ile ilişkili virüsler, deneysel biyolojinin birçok alanında, özellikle sinirbilimde ilgilenilen çeşitli genlerin verilmesi ve ekspresyonu için esnek ve güçlü bir araçtır. Belirli bir beyin bölgesinde istenen bir transgenin ekspresyonunu sağlamak için en popüler yöntem, bir AAV vektörünü doğrudan beyin parankimine enjekte etmektir. Bununla birlikte, bu yöntem, bazı in vivo deneyler için gerekli olan yaygın nöronal transdüksiyona izin vermez. Bu makalede, beynin subaraknoid boşluğuna viral infüzyona dayalı olarak fare neokorteksinde yaygın gen ekspresyonu için yeni bir teknik sunuyoruz. Bu nöronal etiketleme yöntemi, yalnızca yetişkin fare yüzeysel neokortikal tabakalarında nöronların yaygın olarak transdüksiyonunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda CAG gibi güçlü bir seçici olmayan promotör kullanıldığında bile yüksek özgüllüğe sahip beşinci katman piramidal nöronların geniş bir popülasyonunda transgenin ekspresyonu ile sonuçlanır. Ayrıca, hücre transdüksiyonu enjeksiyon bölgesinden önemli bir mesafede gerçekleştiğinden, bu yöntem nöronal aktivitenin sonraki optik veya elektrofizyolojik kayıtları için beyin dokusunun korunmasına yardımcı olabilir.

Giriş

Memeli beyni, trilyonlarca sinaps ile devrelere bağlı birçok inhibitör, uyarıcı ve modülatör hücreden oluşur1. Sinirbilimin temel zorluklarından biri, beyin devrelerinin ve davranışlarının organizasyonu ve işlevinde farklı hücre tiplerinin rolünü çözmektir. Beyindeki genetik olarak tanımlanmış hücreleri manipüle etmek, transgenleri tanıtmak ve ifade etmek için yöntemler gerektirir. Viral tabanlı gen dağıtım sistemleri, merkezi sinir sistemine gen iletimi için açık ara en etkili ve basit yöntemdir2. Viral dağıtım sistemleri, genetik bilgiyi bir konakçı hücreyeiletme yeteneğine sahip virüslerin (adenovirüsler, adeno-ilişkili virüsler (AAV'ler), lentivirüsler ve retrovirüsler) replike edilmesine dayanır 2,3.

AAV tabanlı vektörler, hem temel sinirbilim araştırmaları hem de nörolojik hastalıklar için gen terapisi geliştirmek amacıyla, istenen transgenlerin beyindeki hücrelere iletilmesi için en yaygın kullanılan araçlardan biri haline gelmiştir. Diğer virüslerle karşılaştırıldığında, replikasyon kusurlu AAV'ler, onları bu amaçlar için ideal vektörler yapan birçok özelliğe sahiptir. En önemlisi, AAV vektörleri, nöronlar ve glial hücreler gibi bölünmeyen (terminal olarak farklılaşmış) hücreleri verimli bir şekilde dönüştürür ve bu da in vivo2'de yüksek seviyelerde transgen ekspresyonu ile sonuçlanır. Vektörler, in vivo kullanımauygun yüksek fonksiyonel bir titrede kolayca üretilebilir 3,4,5. Daha da önemlisi, adeno ilişkili virüs aracılı gen iletimi in vivo histopatolojik değişiklikler ve vektörle ilişkili toksisite üretmez6. Adenoviral vektörlerin aksine, hayvan modellerinde AAV vektörlerinin in vivo uygulaması genellikle transdüksiyonlu hücrelere karşı konakçı bağışıklık tepkileri ortaya çıkarmaz, bu da beyin parankimi içinde uzun süreler boyunca stabil transgen ekspresyonunu mümkün kılar 2,7,8.

AAV vektörlerinin popülaritesinin bir başka nedeni, benzersiz doku ve hücre tipi tropizmlerine sahip geniş AAV serotipleridizisidir 9,10,11,12,13,14. Farklı AAV serotipleri tarafından eksprese edilen farklı kapsid proteinleri, hücre girişi için farklı hücre yüzeyi reseptörlerinin kullanılmasına ve dolayısıyla spesifik tropizmlereneden olur 10,14.

AAV tropizmi sadece kapsid proteinleri tarafından değil, diğer birçok faktör tarafından da belirlenir14. AAV serotipleri 1, 2, 6, 7, 8 ve 9'un primer kültürde 15,16 hem nöronları hem de astrositleri transdüksiyona uğrattığı, ancak intraparankimal beyin enjeksiyonunu takiben güçlü nöronal tropizm sergilediğigösterilmiştir 17,18. AAV vektör hazırlığı için kullanılan yöntem, aynı serotip için bile sinir hücresi tropizmini etkileyebilir. Örneğin, CsCl ile saflaştırılmış AAV8, intraparankimal beyin enjeksiyonunu takiben güçlü astroglial tropizme sahipken, aynı koşullar altında enjekte edilen iyodiksanol ile saflaştırılmış AAV8, sadece nöronları19 transdüksiyona tabi tuttu. AAV tropizmi, enjekte edilen doz ve hacim14'ten de etkilenebilir. Örneğin, yüksek titreli rAAV2/1, hem kortikal uyarıcı hem de inhibitör nöronları verimli bir şekilde transdüksiyon etti, ancak daha düşük titrelerin kullanılması, kortikal inhibitör nöronların transdüksiyonu için güçlü bir tercihi ortaya çıkardı20.

Bu nedenle, yalnızca kapsid serotipine dayalı olarak sağlam hücre tipi özgüllüğü elde etmek mümkün değildir. Hücre tipine özgü promotörler, AAV kapsidinin geniş doğal tropizminin üstesinden gelmek için kullanılabilir. Örneğin, insan sinapsin I, nöronları21 hedeflemek için kullanılır, CaMKII promotörü, yüksek özgüllüklü20 glutamaterjik uyarıcı nöronlarda transgen ekspresyonunu yönlendirebilir, ppHcrt promotörü, lateral hipotalamus22'deki hipokretin (HCRT) eksprese eden nöronları hedefler, PRSx8 promotörü, dopamin beta-hidroksilaz23'ü eksprese eden noradrenerjik ve adrenerjik nöronları hedefler ve GFAP promotörü, astrosite özgü ekspresyon24'ü çalıştırabilir. Bununla birlikte, bazı hücreye özgü promotörler zayıf transkripsiyonel aktiviteye sahiptir ve yeterli düzeyde transgen ekspresyonusağlayamaz 25. Ayrıca, AAV viral vektörlerine uyan kısa promotörler genellikle hücre tipi özgüllüğünü 1,26 korumaz. Örneğin, bir CaMKII yapısının aynı zamanda inhibitör nöronlarıda dönüştürdüğü gösterilmiştir 12.

Hücre tipi özgüllüğünün (tropizm) yanı sıra, AAV'lerin bir diğer önemli özelliği de transdüksiyon verimliliğidir. Çeşitli AAV serotipleri farklı difüzyon özelliklerine sahiptir. AAV2 ve dört viral vektör beyin parankimi boyunca daha az kolay yayılır ve bu nedenle daha küçük bir alanda transdüksiyona aracılık eder17,27. En yaygın nöronal transdüksiyon AAV serotipleri 1, 9 ve rh.10 11,17,18,19,28 ile gözlenir.

Belirli bir beyin bölgesinde istenen bir transgenin ekspresyonunu sağlamak için en popüler yöntem, AAV vektörünü doğrudan ilgilenilen beyin bölgesine (parankim) enjekte etmektir3. İntraparankimal enjeksiyonu takiben, beyin yoluyla daha etkili difüzyona sahip AAV serotipleri bile tipik olarak enjeksiyon bölgesi 12 çevresinde sadece lokal bir alanı dönüştürür. Ayrıca, intraparankimal enjeksiyon invaziv bir prosedürdür ve ilgilenilen bölgeye bitişik doku hasarına yol açar. Bu nedenle, bu virüs enjeksiyon yöntemi bazı deneysel görevler için uygun değildir. Örneğin, bir veya iki foton mikroskobunun kullanımı da dahil olmak üzere, serbestçe hareket eden hayvanlarda kortikal nöron fonksiyonlarını incelemeyi amaçlayan deneylerde hücrelerin kapsamlı bir şekilde etiketlenmesi oldukça arzu edilir 29,30,31,32.

Burada, yetişkin farelerde neokortikal nöronların yaygın transdüksiyonunu sağlamak ve nöronal aktivitenin müteakip optik veya elektrofizyolojik kayıtları için beyin dokusunu korumak için subaraknoid virüs infüzyonunu kullanan yeni bir adeno-ilişkili virüs enjeksiyon tekniğini açıklıyoruz. Bu yöntem sadece yüzeysel neokortikal katmanlarda nöronların yaygın transdüksiyonunu sağlamakla kalmadı, aynı zamanda CAG gibi güçlü bir seçici olmayan promotör kullanıldığında bile yüksek özgüllüğe sahip beşinci katman piramidal nöronların geniş bir popülasyonunda transgenin ekspresyonu ile sonuçlandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneyler, her iki cinsiyetten 2-4 aylık yetişkin C57Black/6 fareleri üzerinde gerçekleştirildi (Pushchino Yetiştirme Merkezi, RAS Shemyakin-Ovchinnikov Biyoorganik Kimya Enstitüsü Şubesi). Fareler, yiyecek ve su ad libitum ile sıcaklık kontrollü bir vivaryumda (22 ° C ± 2 ° C, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü, ışıklar 08.00 saatte açık) barındırıldı. Tüm deneysel prosedürler, hayvan deneyleri için ARRIVE yönergelerine ve 2010/63/EU Direktifine uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma protokolü, IHNA RAS Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (01.02.2022 tarihli protokol N1). Hayvanların çektiği acıyı en aza indirmek ve sonuçların güvenilirliğini sağlamak için her türlü çaba gösterildi.

1. Ameliyat için hazırlık

  1. Ameliyata başlamadan önce tüm cerrahi aletleri sterilize edin. Ameliyat bölgesini %70 etanol kullanarak temizleyin.
  2. Anestezi sistemindeki izofluran seviyesini kontrol edin ve gerekirse doldurun. İndüksiyon odasının altına temiz bir kağıt havlu yerleştirin.
  3. Stereotaksik çerçeveye bir ısıtma yastığı yerleştirin. Pedi temiz bir kağıt havluyla örtün.
  4. Mikropipet uçlarını, tüpleri, pamuklu çubukları ve virüsle temas eden diğer öğeleri toplamak için %2 çamaşır suyu içeren bir şişe hazırlayın.
  5. -80 °C dondurucudan bir AAV alikotunu çıkarın ve çözülmesi için buzun üzerine koyun.

2. Şırınga hazırlama

  1. 5 μL'lik bir Hamilton mikroşırıngasını 33G künt RN iğnesi ile temizleyin. Aspire edin ve ardından% 70 etanol dağıtın. Taze etanol ile 3x tekrarlayın. Fazla etanolü çıkarmak için şırıngayı damıtılmış suyla durulayın. 3x tekrarlayın.
  2. Pistonu çıkarın ve bir insülin şırıngası kullanarak namluyu flanştan Vazelin yağı ile doldurun. Mikroşırıngada hava kabarcığı olmadığından emin olun.
    NOT: Sıkışan hava sıkıştırılabilir ve şırınganın doğruluğunu ve hassasiyetini etkiler.
  3. Pistonu mikroşırıngaya geri koyun ve bir damla yağ dağıtın. Şırıngayı, dağıtılan çözeltinin hacmini izlemek için ölçek görünecek şekilde stereotaksik enjektöre yerleştirin.

3. Farelerin ameliyat için hazırlanması

  1. Bir fareyi tartın. Fareyi izoflurana bağlı anestezi indüksiyon odasına yerleştirin. %5'e ayarlanmış izofluran buharlaştırıcıyı açın ve akış hızını 250 mL/dk'ya ayarlayın. 5 ila 7 dakika içinde yeterli anestezi derinliğine ulaşılır.
  2. Cerrahi anestezi seviyesini doğrulamak için, arka pençe ağrılı bir tutam sırasında çırpma ve geri çekilme refleksinin olmadığını ve göz temasında göz kırpma olmadığını kontrol edin.
  3. Buharlaştırıcı çıkış valfini indüksiyon odasından stereotaksik maskeye geçirin. İzofluranı %1.8-%2.0'ya düşürün ve akış hızını fare ağırlığına göre ayarlayın (25 ila 35 g ağırlığındaki fareler için 70-90 mL / dak).
  4. Cerrahi anestezi sırasında hipotermiyi önlemek için fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve bir ısıtma yastığının (37 °C) üzerindeki stereotaktik aparata yerleştirin. Ön dişleri diş çubuğuna yerleştirin ve ardından hayvan maskesini monte edin.
  5. Hayvanı dikkatlice kulak çubuklarının üzerine yerleştirin. Stereotaktik aparattaki doğru baş pozisyonu, başın dikey hareketine izin verir, ancak yanal hareketine izin vermez. Hayvanın konumunun sıkıntıya neden olmadığından emin olun. Operasyon boyunca anestezi derinliğini, hayvan solunumunu ve vücut ısısını dikkatlice izleyin.
  6. Kafayı gözlerden kulakların arkasına doğru tıraş edin. Başın traşlı yüzeyini% 70 etanol ile temizleyerek temizleyin, ardından% 5 alkol iyot çözeltisi ile temizleyin.
  7. Göz kurumasını önlemek için oftalmik jel uygulayın. Ameliyata bağlı ağrıyı önlemek ve olası inflamatuar yanıtı azaltmak için topikal olarak% 4 lidokain solüsyonu ve deksametazon (4 mg / mL'de 0.02 mL) deri altına uygulayın.
  8. Steril bir neşter bıçağı ve makasla, kafa derisini açmak için başın orta hattı boyunca 4-5 mm uzunluğunda bir kesi yapın. Kulaklar arasında küçük bir kesi ile başlayın ve ardından kafatasına zarar vermemek için makas kullanarak genişletin.
  9. Stereotaksik yer işaretlerini görselleştirmek için kafatasının yüzeyini az miktarda% 3 hidrojen peroksit ile temizleyin: bregma ve lambda. % 0.9 NaCl salin ile reaksiyonu hemen durdurun. Kafatasının üstündeki dokuları bir kemik kazıyıcı ile kazıyın.
  10. Önceden hazırlanmış motorlu enjektörü Hamilton şırınga ile stereotaksik kol üzerine monte edin. Açıkta kalan kafatasına cerrahi bir ışık kaynağı yönlendirin ve mikroskobu bregma üzerine odaklayın.
  11. Mikroskoptan bakarak, iğnenin üst kısmını doğrudan bregma üzerinde ortalamak için stereotaktik aparatın kolunu manipüle edin.
  12. İğnenin ucunu kullanarak bregma ve lambda'yı yatay olarak hizalayın ve ardından kolu tekrar bregma'ya getirin ve koordinatları kaydedin. Hedeflenen alanın göreli koordinatlarını hesaplamak için bu bregma koordinatlarını ve ilgilenilen bölgenin atlas koordinatlarını kullanın.
  13. İğneyi hedeflenen bölgeye hareket ettirin. İğneyi yeni koordinatlarda indirin ve bu konumu işaretleyin. Virüsün yayılmasını göz önünde bulundurarak hedef bölgeye yakın viral mikroenjeksiyon bölgesini seçin.
    NOT: Bu, ilgilenilen bölgedeki dokuya zarar vermekten kaçınacaktır. İlgilenilen bölge için aşağıdaki koordinatları kullandık: AP-3.4, ML -2.0 ve viral mikroenjeksiyon için: AP-2.0, ML -1.4. Birincil görsel korteks nöronlarının enfekte olması durumunda yukarıdaki koordinatlar en uygunudur.
  14. Mümkünse, büyük kan damarlarının bulunduğu bölgelerden kaçının. Cerrahi mikroskop, parlak, soğuk ışık aydınlatması ve% 0.9 NaCl salin daldırması altında, kafatasındaki ve beyin yüzeyindeki büyük kan damarları belirgin hale gelmelidir.

4. Virüs enjeksiyonu

  1. Steril bir diş frezi alın (0,5 - 0,8 mm çapında). Kafatasının yüzeyini cerrahi mikroskopla görüntülerken, manuel olarak (elle) veya bir mikromatkap kullanarak küçük bir kraniyotomi delin. Kafatasına aşırı baskı uygulamamaya özen gösterin.
  2. Kraniotominin (delik) delinmesi sırasında mikroşırınga iğnesinin hasar görmesini önlemek için kolu yoldan çekin. % 0.9 NaCl tuzlu su daldırması uygulayın ve kemiğin ısınmasını ve dura materyaline zarar vermesini önlemek için aralıklı olarak duraklatın. Kemik tozunu üflemek için basınçlı hava kullanın.
    NOT: Aşağıdaki karbür diş frezleri uygundur: armut biçimli (tercihen), yuvarlak silindir ve yuvarlak.
    1. Kemiği frez ile inceltirken, inceltmenin tüm çevre boyunca eşit olduğundan emin olun. Bu, dura materyale zarar vermeden kemiğin çıkarılmasını kolaylaştıracaktır. Bunu yapmak için, başlangıçta yuvarlak uçlu bir frez ve ardından düz uçlu bir frez kullanın. Frezi kemiğe dik tutun; Aksi takdirde, bir taraf diğerinden daha ince olacaktır.
      NOT: Ek olarak, frezin boyutu ne kadar küçükse ve gerçekleştirilen kraniyotomi ne kadar küçükse, manipülasyon o kadar karmaşık olacaktır. Hayvanı in vivo çalışma için daha fazla kullanırken daha küçük çaplı (0.5-0.6 mm) bir kraniyotomi yapılması önerilir. Hayvanın beynini ex vivo çalışma için kullanmayı planlıyorsanız, prosedürü basitleştirmek için daha büyük bir kraniyotomi çapı kabul edilebilir.
  3. İnceltilmiş kemik yumuşak ve şeffaf olduğunda, delmeyi bırakın. Kemikte yeterince büyük bir girinti oluştuğunda, rotasyonu sık sık durdurun ve kemiğin kalınlığını izleyin. Kemikte çatlakların ortaya çıkması incelmenin yeterli olduğunu gösterir.
  4. Deliği steril tuzlu su ile yıkayın ve ardından fazla tuzlu suyu pamuklu çubukla çıkarın. Kanca şeklinde uçlu 27G'lik bir iğne ve/veya ince uçlu cımbız kullanarak kalan kemik tabakasını çıkarın. Duraya zarar vermekten kaçının.
  5. Kafatasının yüzeyini tuzlu suyla nemlendirilmiş steril bir kağıt havlu parçasıyla örtün. Kağıdın üzerindeki fare kafatası yüzeyine temiz, şeffaf bir film parçası yerleştirin.
  6. Stereotaksik kolu geri hareket ettirin ve mikroşırınga iğnesini doğrudan filmin üzerine yerleştirin. Fazla yağı 2 μL'lik bir hacme ulaşılana kadar dağıtın.
    NOT: Yağın nihai hacmi, mikro şırınganın hacmine göre değişebilir. 5 μL 75-RN Hamilton mikro şırınga kullandık.
  7. Enjekte edilen hacim + 2 μL'ye eşit bir virüs hacmini bir parça şeffaf film üzerine pipetleyin.
  8. Cerrahi mikroskoptan bakarak, iğnenin ucu virüs damlasının merkezinde olana kadar kolu aşağı indirin. Motorlu bir enjektör kullanarak virüsü mikroşırıngaya yükleyin. Mikropipetin ucunu ve şeffaf filmi %2 ağartıcı ile şişeye atın.
  9. Tuzlu su ile nemlendirilmiş kağıdı kafatasının yüzeyinden çıkarın ve kafatasını pamuklu çubukla kurulayın. İğneyi yerleştirme bölgesinin üzerine yerleştirmek için stereotaksik kolu kullanın.
  10. İğnenin tıkalı olmadığından emin olmak için bir damla virüs verin. Kanca şeklinde uçlu 30 G'lik bir iğne kullanarak durada küçük bir yarık açın.
    NOT: Dura mater içinde mümkün olan en küçük yarığı yapmak önemlidir, böylece iğne ile dura mater arasında virüsün sızabileceği bir boşluk bırakmadan iğnenin girmesine izin verilir.
  11. Şırınganın iğnesini duraya kadar indirin ve derinlik için uygun hesaplamaları yapın. İğnenin korteksin yüzeyine ilk temas ettiği noktaya göre yerleştirmenin kortikal derinliğini tahmin edin.
  12. İğne ucunu yavaşça kortekse 300 μm derinliğe kadar sokun. Duranın iğneye yapışmasını sağlamak için 2-3 dakika bekleyin ve ardından iğneyi yavaşça 200 μm derinliğe kadar geri çekin. Beyin dokusunun oturması için 2-3 dakika daha bekleyin. Bu, iğnenin durayı yukarı çekmesine ve virüsün yayılması için subdural bir alan yaratmasına neden olur.
    NOT: Kortikal hasarı en aza indirmek için 33 G'lik bir iğne veya daha düşük G iğneleri kullanın. Ucun iç çapı ne kadar küçükse, doku geri akışının onu tıkama şansının o kadar yüksek olduğunu unutmayın. Eğimli yerine künt bir iğne kullanmak önemlidir, çünkü künt bir iğne daha kontrollü bir viral çözelti damlasını dışarı atar.
    1. İğne 150-200 μm'ye indirildiğinde dura materden geçmezse ve bunun yerine bükülürse, indirmeyi bırakın. İğneyi kaldırın ve dura materyalinde biraz daha büyük bir kesi yapın, ardından iğneyi tekrar indirmeyi deneyin.
    2. İğneyi indirirken beyin omurilik sıvısı kesiden aktif olarak sızmaya başlarsa, sızıntısı durana kadar bekleyin; Aksi takdirde, duradan geçen iğneyi kontrol etmek zordur. Fazla beyin omurilik sıvısını bir doku ucuyla kurulayın. Sıvı akışı durduğunda iğneyi kaldırın ve tekrar deneyin.
  13. Dağıtılan hacmi izlerken viral süspansiyonu 0.06 μL / dak hızında enjekte etmeye başlayın. 1 μL virüs enjekte edin. İğne ve korteks dokusu arasındaki contayı kırmamak için virüsü tek bir derinlikte enjekte edin.
    1. Sorun Giderme: Enjeksiyonun başlangıcında, beyin yüzeyine virüs geri akışı meydana gelebilir. Enjekte etmeyi durdurun, 2-3 dakika bekleyin ve ardından virüs enjeksiyonuna devam edin. Virüs geri akışı durana kadar bu eylemleri (adımları) tekrarlayın. Virüs ve beyin omurilik sıvıları iğneye yapışacak ve geri akışı önleyecektir.
    2. Virüsün geri akışını durdurmanın başka bir yolu, korteksin yüzeyine az miktarda agaroz koymaktır. Korteksin nabzını bastıracak ve ayrıca iğneyi kapatmaya yardımcı olacaktır. Ancak pipetin agaroz tarafından tıkanmadığından emin olun.
    3. İğne indirildiğinde dura materinden tam olarak geçemeyebileceğinden, ancak sadece kısmen, iğnenin bir tarafı duraya sıkıca oturmayabilir ve bu da virüsün geri akışına neden olabilir. Bu durumda, iğneyi dokudan yavaşça çekin ve tekrar indirmeyi deneyin.
  14. İnfüzyon tamamlandıktan sonra, iğneyi 10 dakika daha hedef yerde tutun. Bu, virüsün enjeksiyon bölgesinden uzağa dağılmasını sağlar. Virüsün iğne yolundan geri akmasını önlemek için iğneyi beyinden yavaşça geri çekin.
  15. İğne çekme işlemi tamamlandıktan sonra, küçük bir damla virüs vererek tıkalı olmadığını kontrol edin. Cilt kesisini 5-0 emilebilir veya emilmeyen dikişler kullanarak kapatın.

5. Ameliyat sonrası bakım

  1. Kesi işlemini kapattıktan sonra, topikal olarak antibakteriyel merhem uygulayın. Dehidrasyonu önlemek ve anestezi sonrası iyileşmeyi kolaylaştırmak için deri altına salin (5 mL / kg) ve% 5 glikoz (5 mL / kg) karışımı enjekte edin. Ağrıyı azaltmak için ketoprofen'i kas içine (2.5 mg / kg) enjekte edin.
  2. Hayvanı bir ısıtma yastığının üzerine yeni bir kafese koyun ve anesteziden çıkana kadar izleyin. Fare reaktif olduktan sonra, hayvanı ev kafesine yerleştirin.

6. Histoloji

  1. Virüs enjeksiyonundan en geç 21 gün sonra, fareleri adım 3'te tarif edildiği gibi izofluran ile derinlemesine anestezi altına alın.
  2. Dar bir makas kullanarak göğüs bölgesi boyunca orta hat kesisi (10 -15 mm) yapın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarın. Diyaframı dikkatlice ayırın ve makas kullanarak göğsü açın.
  3. Sol ventriküle 22G 1 1/2 iğne sokun ve sağ atriyumda makasla bir kesi yapın. 50 mL önceden soğutulmuş 100 mM Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ve ardından 100 mL önceden soğutulmuş %10 tamponlu formalin ile perfüz.
  4. Tüm fare beynini dikkatlice çıkarın. Bunu yapmak için, makas kullanarak kafa derisinin merkezi boyunca sagital bir kesi yapın. Daha sonra, sagital ve lambdoid dikişlerin kesişme noktasından başlayarak burun kemiğine doğru ilerleyerek düz uçlu kemik pense kullanarak kafatası kemiğini parça parça çıkarın. Beyin açıkta kaldığında, koku alma ampullerini kesin, kavisli bir spatula ile beyni rahatlatın ve% 10 tamponlu formalin içeren 50 mL'lik bir tüpe bırakın.
  5. Beyni bir gecede düzeltin. Doku yapıştırıcısı kullanarak beyin dokusunu bir Vibratomun metal bir platformuna monte edin. Karbon çelik bıçaklar kullanarak ön kısımları 50 μm kalınlığında kesin.

7. İmmün boyama

  1. 1. Gün
    1. Beyin dilimlerini 3x 5 dakika boyunca her biri% 0.3 Triton X-100 (PBS-T) içeren 1x PBS ile yıkayın. Bölümleri PBS-T'de oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edin.
    2. 1x PBS'de% 5 Normal Keçi Serumu (NGS) ve% 0.3 Triton X-100'den oluşan bir bloke edici tampon kullanarak RT'de 1 saat boyunca spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.
    3. Blokaj tamponunda 1:500 oranında seyreltilmiş parvalbümin veya kalbindin'e karşı birincil antikorlarla bölümleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (1x PBS'de% 5 NGS ve% 0.3 Triton X-100).
  2. 2. Gün
    1. Bölümleri PBS-T'de 3x 10 dakika yıkayın. Bloke edici tamponda 1:500 oranında seyreltilmiş ikincil antikorlarla (Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 546) ile RT'de karanlıkta 2 saat inkübe edin (% 5 NGS ve% 0.3 Triton X-100 1x PBS'de).
    2. Bölümleri 3x PBS'de her biri 5 dakika boyunca 1x yıkayın. Beyin dilimlerini yumuşak bir fırça kullanarak cam slaytlara aktarın.
    3. Hemen her bölüme 0.1 mL antifade montaj ortamı ekleyin. Dilimleri 22 mm x 50 mm lamel ile örtün.
    4. Konfokal mikroskobu 20x veya 60x büyütme (A/1.4, yağ) ile yapılandırın. İlgilenilen beyin bölgelerinin çok kanallı görüntülerini elde etmek için 488 nm ve 594 nm dalga boylu lazerler kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bir pilot deney serisinde, CaMKII promotörü altında EGFP floresan proteini ile kaynaşmış hızlı channelrhodopsin (oChIEF) genini taşıyan AAV2 ile fare neokorteksindeki beşinci katman piramidal nöronları dönüştürmek için geleneksel intrakortikal enjeksiyon yöntemini kullandık. AAV212'nin karakteristik özelliği ile tutarlı olarak, genişliği 1 mm'yi geçmeyen nispeten küçük bir enfeksiyon alanı elde ettik (Şekil 1A). Bununla birlikte, bazı deneylerde, bazı durumla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Beynin subaraknoid boşluğuna AAV2 viral partiküllerinin bir süspansiyonunu enjekte ederek fare neokortikal nöronlarını dönüştürmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Bu, aynı miktarda virüs doğrudan beyin parankimine enjekte edildiğinde enfekte olan doku hacminden neredeyse dört kat daha büyük olan yaygın virüs dağılımı sağlar.

Virüs vektörlerinin farklı yollarla (örneğin, intraserebroventriküler, intratekal veya intrasisternal) doğrudan beyin omurilik sıvısına...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Çalışma, Rusya Bilim Vakfı'nın 20-15-00398P hibesinin mali desteği ile gerçekleştirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman
10 &mikro; L Gaz Geçirmez Şırınga Model 1701 RN (5 uL 75 RN Hamilton mikro şırınga)Hamilton ŞirketiParça/REF # 7634-01, Hamilton veya cat no. HAM7634-01, Merck
33 G RN iğne, sivri uçlu 3Hamilton ŞirketiParça/REF # 7803-05, Hamilton
Binoküler MikroskopNikon veya MicromedMC-4 ZOOM modeli
Cerna tabanlı lazer taramalı konfokal mikroskopThorLaboratuvarları
Soğuk ışık kaynağıGeri sarÜrün Kodu: 76312
Leica VT1000 S Titreşimli bıçak mikrotomuLeica Biyosistemleri76001-014
Başlangıç kitli Düşük Akışlı Anestezi SistemiKent Bilimsel Şirketi13-005-111 (Model SomnoSuite)
Mekanik Pipet 0.1 – 2.5 &mikro; L Eppendorf Araştırma artıEppendorf Belediyesi3123000012
Mekanik Pipet 10 – 100 &mikro; L Eppendorf Araştırma artıEppendorf Belediyesi3123000047
Fare Tıraş MakinesiGeri sarCP-5200 Modeli
Matkap uçlu mikro matkap (0,5 mm, yuvarlak)Geri sar78001, 78040
veya Desctop Dijital Stereotaksik Alet, Fare anestezi Maskesi, Fare kulak çubukları (60 Derece)Geri sar68027, 68665, 68306 Modelleri
Hava kompresörüBambiBB8
Tek Kanallı Manuel Pipet 0.5-10 µ LYAĞMUR17008649
Küçük Hayvan Stereotaksik EnstrümanıKOPF962 Modeli
Stereotaksik EnjektörÇalmak10-000-004
Cerrahi Aletler (Aletler)
30 G diş iğnesi (Ni-pro)Biodent Ltd. Şti.Dura'yı kesmek için
Kemik kazıyıcıGüzel Bilim Araçları10075-16
Kemik pensesiGüzel Bilim Araçları16025-14Kafatası kemiğini çıkarmak için
Kavisli spatulaMozhaisk Tıbbi Malzeme FabrikasıBeyni kafatası kasasından çıkarmak için
Diş freziDRENDEL + ZWEILINGKraniyotomi için; Şekil: armut biçimli/yuvarlak uçlu silindir/yuvarlak; Uç Çapı: 0,55-0,8 mm çap
İğne tutucu (Halsey Mikro İğne Tutucu)Güzel Bilim Araçları12500-12
Polipropilen Cerrahi Sütür veya Cerrahi Sütür Vicryl (5-0, emilebilir)Walter Ürünleri (Ethicon)S139044 (W9442)
Neşter bıçaklı neşter sapı (#3) (#11)Güzel Bilim Araçları10003-12, 10011-00
Makas (Ekstra Dar Makas)Güzel Bilim Araçları14088-10cildi kesmek için
Makas (İnce Makas)Güzel Bilim Araçları14094-11dikişi kesmek için
Cerrahi sütür PROLENE (Poliproptlen)Ethicon (Johnson & Johnson)
Cımbız (Forseps #5)Güzel Bilim Araçları11252-20
Cımbız (Cilalı Inox Forseps)Güzel Bilim Araçları11210-20
Tek kullanımlık
1 mL insülin şırıngasıSİTE BÖLÜMÜVazelin yağını bir mikro şırıngaya yüklemek, ilaç vermek için
Hücre Kültürü PlakasıSPL Yaşam Bilimleri
Pamuklu çubuklar
Kapak CamlarıFisher Bilimsel12-545E
İnsülin şırınga iğnesi (27 G)SİTE BÖLÜMÜDebrileri bir delikten çıkarmak için (kraniyotomi)
Tüy bırakmayan mendiller CLEANWIPERAğ Bağlantısı
Mikroskop SlaytlarıFisher Bilimsel12-550-15
Kağıt havlularParlak tarama
Parafilmİstatistik LaboratuvarıSTLPM996
Steril Cerrahi EldivenlerDermagrip
Steril Şırınga Filtresi (0.2 μ m)Corning431229
İlaçlar/Kimyasallar (Reaktifler)
%10 tamponlu formalin veya %4 paraformaldehitThermo Scientific KimyasallarJ61899. AK
İyotun alkol çözeltisi (%5))Yenileme
Antibiyotik merhem Baneocin (basitrasin + neomisin)SandozHarici kullanım için antibakteriyel ajan
Aqua Çoklu MontajÇoklu bilimler18606-20
Carbomer Göz Jeli Vidisic (Oftalmik jel)BAUSCH+LOMB (Santen)
Karboksilatla Modifiye FluoSphere Mikroküreler (kırmızı)Thermo Fisher BilimselF-8801 Serisi
Deksametazon (4 mg/mL)Ellara (KRKA)Sentetik glukokortikoid
Damıtılmış H2O
Etanol (%70)
Fleksoprofen %2,5 (Ketoprofen)VİCSteroid Olmayan Antienflamatuar İlaçlar (NSAID'ler)
Glikoz çözeltisi %5Solopharm
Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe Edilmiş, Alexa Fluor 546Thermo Fisher BilimselA-11010
İzofluranKarizoo
Lidokain çözeltisi (%2 / %4)Solopharm
Normal Keçi Serumu (NGS)AbcamAB7481
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Eko-servis
Tavşan Anti-Parvalbümin AntikoruMerck MilliporeAB15736
Tavşan Rekombinant Monoklonal anti-Calbindin antikoruAbcamAB108404
Salin (H2O'da %0,9 NaCl)Solopharm
Triton X-100Sigma-Aldrich50-178-1844
Vazelin yağıGenel

Kaynaklar

  1. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
  2. Sena-Esteves, M., Gao, G. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (8), (2020).
  3. Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene Therapy with Viral Vectors. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 43 (1), 413-439 (2003).
  4. Paterna, J. C., Feldon, J., Büeler, H. Transduction profiles of recombinant adeno-associated virus vectors derived from serotypes 2 and 5 in the nigrostriatal system of rats. J Virol. 78 (13), 6808-6817 (2004).
  5. Monahan, P. E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus vectors for gene therapy: more pros than cons. Mol Med Today. 6 (11), 433-440 (2000).
  6. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21 (4), 583-593 (2008).
  7. Jooss, K., Chirmule, N. Immunity to adenovirus and adeno-associated viral vectors: implications for gene therapy. Gene Ther. 10 (11), 955-963 (2003).
  8. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L. 3rd, Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  9. Gao, G., Vandenberghe, L., Wilson, J. New Recombinant Serotypes of AAV Vectors. Curr Gene Ther. 5 (3), 285-297 (2005).
  10. Büning, H., Perabo, L., Coutelle, O., Quadt-Humme, S., Hallek, M. Recent developments in adeno-associated virus vector technology. J Gene Med. 10 (7), 717-733 (2008).
  11. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PloS One. 8 (9), e76310-e76310 (2013).
  12. Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neurosci Res. 93, 144-157 (2015).
  13. de Solis, C. A., et al. Adeno-associated viral serotypes differentially transduce inhibitory neurons within the rat amygdala. Brain Res. 1672, 148-162 (2017).
  14. Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV Tropism in the Nervous System with Natural and Engineered Capsids. Meth Mol Biol. 1382, 133-149 (2016).
  15. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  16. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
  17. Burger, C., et al. Recombinant AAV Viral Vectors Pseudotyped with Viral Capsids from Serotypes 1, 2, and 5 Display Differential Efficiency and Cell Tropism after Delivery to Different Regions of the Central Nervous System. Mol Ther. 10 (2), 302-317 (2004).
  18. Cearley, C. N., Wolfe, J. H. Transduction characteristics of adeno-associated virus vectors expressing cap serotypes 7, 8, 9, and Rh10 in the mouse brain. Mol Ther. 13 (3), 528-537 (2006).
  19. Klein, R. L., Dayton, R. D., Tatom, J. B., Henderson, K. M., Henning, P. P. AAV8, 9, Rh10, Rh43 vector gene transfer in the rat brain: effects of serotype, promoter and purification method. Mol Ther. 16 (1), 89-96 (2008).
  20. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  21. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  22. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  23. Abbott, S. B. G., et al. Photostimulation of retrotrapezoid nucleus phox2b-expressing neurons in vivo produces long-lasting activation of breathing in rats. J Neurosci. 29 (18), 5806-5819 (2009).
  24. Lawlor, P. A., Bland, R. J., Mouravlev, A., Young, D., During, M. J. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Mol Ther. 17 (10), 1692-1702 (2009).
  25. Adamantidis, A. R., Zhang, F., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetics: Opsins and Optical Interfaces in Neuroscience. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (8), (2014).
  26. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat Protoc. 5 (3), 439-456 (2010).
  27. Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene Delivery to the Mouse Brain with Adeno-Associated Virus. Methods Mol Biol. 246, 225-236 (2004).
  28. Davidson, B. L., et al. Recombinant adeno-associated virus type 2, 4, and 5 vectors: Transduction of variant cell types and regions in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci. 97 (7), 3428-3432 (2000).
  29. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  30. Harris, K. D., Shepherd, G. M. G. The neocortical circuit: themes and variations. Nat Neurosci. 18 (2), 170-181 (2015).
  31. Carrillo-Reid, L., Yang, W., Kang Miller, J., Peterka, D. S., Yuste, R. Imaging and Optically Manipulating Neuronal Ensembles. Ann Rev Biophy. 46 (1), 271-293 (2017).
  32. Smirnov, I. V., et al. Plasticity of Response Properties of Mouse Visual Cortex Neurons Induced by Optogenetic Tetanization In Vivo. Curr Issues Mol Biol. 46 (4), 3294-3312 (2024).
  33. Snyder, B. R., et al. Comparison of Adeno-Associated Viral Vector Serotypes for Spinal Cord and Motor Neuron Gene Delivery. Human Gene Ther. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  34. Schuster, D. J., et al. Biodistribution of adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vector after intrathecal and intravenous delivery in mouse. Front Neuroanat. 8, 42(2014).
  35. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral Strategies for Targeting the Central and Peripheral Nervous Systems. Ann Rev Neurosci. 41 (1), 323-348 (2018).
  36. Lo, W. D., et al. Adeno-Associated Virus-Mediated Gene Transfer to the Brain: Duration and Modulation of Expression. Human Gene Ther. 10 (2), 201-213 (1999).
  37. Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., McCown, T. J., Ju de Samulski, R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
  38. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 55-73 (2009).
  39. Daci, R., Flotte, T. R. Delivery of Adeno-Associated Virus Vectors to the Central Nervous System for Correction of Single Gene Disorders. Int J Mol Sci. 25 (2), 1050(2024).
  40. Dasgupta, K., Jeong, J. Developmental biology of the meninges. Genesis. 57 (5), e23288-e23288 (2019).
  41. Mestre, H., Mori, Y., Nedergaard, M. The Brain's Glymphatic System: Current Controversies. Trends Neurosci. 43 (7), 458-466 (2020).
  42. Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
  43. Hordeaux, J., et al. Long-term neurologic and cardiac correction by intrathecal gene therapy in Pompe disease. Acta Neuropathol Comm. 5 (1), 66(2017).
  44. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  45. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood-brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. Mol Ther. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  46. Radhiyanti, P. T., Konno, A., Matsuzaki, Y., Hirai, H. Comparative study of neuron-specific promoters in mouse brain transduced by intravenously administered AAV-PHP.eB. Neurosci Lett. 756, 135956(2021).
  47. Li, X., et al. Skin suturing and cortical surface viral infusion improves imaging of neuronal ensemble activity with head-mounted miniature microscopes. J Neurosci Meth. 291, 238-248 (2017).
  48. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nat Comm. 10 (1), 4174(2019).
  49. Thomson, A. M. Neocortical layer 6, a review. Front Neuroanat. 4, 13(2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

AAV2 Transd ksiyonuFare NeokorteksiN ronal EtiketlemeViral Vekt r letimiPiramidal N ronlarStereotaksik EnjeksiyonKortikal TabakalarGen EkspresyonuFloresan Etiketleme
AAV2'nin Subaraknoid Enjeksiyonu ile Fare Neokortikal Nöronlarının Yaygın Transdüksiyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.