Yöntem makalesi

Hücrelerin Hedeflenen Frezelenmesi için Kriyojenik Tesadüfi Floresan, Elektron ve İyon Işını Mikroskobu Kullanan İş Akışı

DOI:

10.3791/68238

⸱

17 Ekim 2025

 ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2SLAC National Accelerator Laboratory, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 4Department of Photon Science and Structural Biology, Stanford University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iş akışı, kriyojenik üç tesadüfi görüntüleme platformu kullanarak küçük (eksenel kapsamda <1 μm) ve nadir (hücre başına 1 kopya) floresan etiketli biyolojik yapıları hedefleyen lamel üretimini mümkün kılar. Bu platform, floresan mikroskobu, odaklanmış iyon ışını frezeleme ve taramalı elektron mikroskobunu tek bir odak konumunda birleştirir ve frezeleme sırasında eş zamanlı floresan mikroskobuna olanak tanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Taramalı elektron mikroskobu (CryoFIB-SEM) ile kriyojenik odaklanmış iyon ışını frezeleme, kriyojenik elektron tomografisi (CryoET) için 200 nm'nin altındaki kalınlıktaki hücre lamellerinin hazırlanmasında baskın yaklaşım haline gelmiştir. Son zamanlarda, lamel üretimini floresan etiketli hedeflere yönlendirmek için floresan mikroskobu CryoFIB-SEM sistemlerine dahil edilmiştir. Bununla birlikte, çoğu uygulamada, optik ve iyon ışını görüntüleme sistemleri, vakum odasının farklı bölgelerinde farklı odak düzlemlerine sahiptir ve iki ayrı mikroskop olarak etkin bir şekilde işlev görür. Bu konfigürasyon, genellikle küçük, nadir yapıları yerinde güvenilir bir şekilde hedeflemek için gereken doğruluktan yoksun olan modaliteler arasında görüntü kaydı gerektirir. Eş zamanlı floresan görüntüleme ve odaklanmış iyon ışını frezelemeye olanak tanıyan özelleştirilmiş üç tesadüfi görüntüleme platformuna dayalı bir iş akışı sunuyoruz. Bu, son lamelde ilgilenilen floresan etiketli yapıları korumak için frezelemenin ne zaman sonlandırılacağını belirlemek için kullanılabilecek gerçek zamanlı floresan geri bildirimine izin verir. Bu yaklaşımı kullanarak, vitrifiye makrofajlarda mikrotübül düzenleme merkezini (MTOC) hedefledik ve müteakip kriyojenik elektron tomografisi ve bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu ile doğrulanan %>60'lık bir başarı oranı elde ettik.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyojenik elektron tomografisi (CryoET), biyolojik örneklerin makromoleküler çözünürlükte 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 doğala yakın bir durumda görselleştirilmesini sağlar . Bununla birlikte, ökaryotik hücrelerin kalınlığı - genellikle birkaç mikron - 300 kV elektronların ortalama serbest yolunu (~300 nm) aşar, bu da dağılmamış elektronların penetrasyon derinliğini sınırlar ve böylece kullanılabilir numune kalınlığını kısıtlar. Bunu ele almak için, CryoFIB frezeleme olarak bilinen bir işlemde kriyojenik olarak korunmuş hücrenin çoğunu kesmek için odaklanmış bir iyon ışını (FIB) kullanılabilir ve CryoET görüntüleme 12,13,14,15,16 için yeterince ince lameller üretilir.

Daha önce bildirilen iş akışlarında, numuneler önce daldırmalı dondurma17,18,19 yoluyla vitrifiye buzda korunur ve daha sonra hem CryoFIB hem de taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile donatılmış çift ışınlı bir cihaza yüklenir. SEM görüntüleme, organeller ve hatta bazı proteinli yapılar gibi ilgilenilen hücre altı özellikleri tanımlamak için kullanılabilir20,21. Bu bilgi, CryoET13,14,22'ye uygun 200 nm'nin altında kalınlıkta bir lamel üretmek amacıyla numunenin kademeli bir şekilde kesildiği CryoFIB öğütme sürecini yönlendirmek için kullanılabilir. Ancak bu yaklaşım, mevcut protokolün ele aldığı iki temel zorluğu da beraberinde getiriyor. İlk olarak, genellikle spesifik proteinli yapıların CryoET'sini elde etmek gerekir, ancak SEM zarar verici olabilir ve boyanmamış biyolojik materyali görüntülerken çoğu proteinli yapı SEM tarafından fark edilemez. Öğütme, belirli hücre altı bölgelere veya belirli biyomolekülleri içeren bölgelere hasarsız bir şekilde nasıl doğru bir şekilde yönlendirilebilir? İkincisi, ince lamellerin ve müteakip CryoET'in üretiminden sonra bile, yetersiz çözünürlük, sinyal-gürültü oranı ve/veya kesin tanımlama için gereken kontrast nedeniyle nihai rekonstrüksiyonlarda spesifik biyomolekülleri tanımlamak zor olabilir. Bu biyomoleküllerin uzamsal konumları, kriyo-ET rekonstrüksiyonlarında nasıl belirlenebilir?

Her iki zorluğun da üstesinden gelmek için, alan giderek daha fazla floresan mikroskobuna yöneldi. Hedef proteinleri bağlayan genetik olarak kodlanmış floresan proteinler veya eksojen boyalar, ilgilenilen spesifik biyomolekülleri etiketlemek için rutin olarak kullanılır 5,23,24. Öğütmeden sonra alınan vitrifiye hücrelerin kriyojenik floresan mikroskobu, elde edilen tomogramlarla ilişkilendirilebilir. Kriyojenik bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CryoCLEM) olarak bilinen bu yaklaşım köklüdür ve CryoET rekonstrüksiyonları 5,12,23,24 içindeki spesifik proteinleri lokalize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Son gelişmeler, tamamlayıcı bilgileri ve uzamsal hassasiyeti geliştirmek için floresan biyosensörlerin ve süper çözünürlük yöntemlerinin kullanımını içerir 25,26,27,28,29.

CryoCLEM, yukarıda tanımlanan ikinci zorluğun üstesinden gelmenin bir yoludur ve lamel içindeki spesifik proteinlerin konumunun belirlenmesine izin verir. Bununla birlikte, nihai lamel ilgilenilen proteinleri içermiyorsa, CryoCLEM kullanıcı için hiçbir şey yapmaz. Neyse ki, floresan mikroskobu, frezelemeyi etiketli ilgi alanlarına yönlendirmek için de kullanılabilir. Floresan kılavuzlu FIB frezeleme, yaklaşık on yıl önce ortaya çıkan ilk iş akışları olan CryoCLEM'den daha yeni bir gelişme olsada12, hızlı ve yaygın bir şekilde benimsenmiştir. İlk protokoller, numuneyi CryoFIB-SEM'e aktardıktan sonra SEM ve iyon ışını görüntülerine kaydedilen 2D veya 3D floresan veri kümelerini elde etmek için harici ışık mikroskoplarına dayanıyordu. Daha yakın zamanlarda, floresan mikroskopları doğrudan CryoFIB-SEM vakum odalarına entegre edilmiştir. Bu entegrasyon, transferler sırasında buz kirliliğini azaltır ve nihai lamelin daha kolay görüntülenmesini sağlar. Floresan kılavuzlu frezeleme için floresan mikroskobunu CryoFIB-SEM ile birleştirmek için çeşitli platformlar geliştirilmiştir. Bunlar organelleri ve büyük protein komplekslerini başarıyla hedeflemiştir 5,23,24. Bununla birlikte, birkaç istisna30 dışında, optik yol, vakum odasının FIB-SEM'den farklı bir fiziksel bölgesinde ayrı bir odak düzlemi üretir. Sonuç olarak, tıpkı bağımsız optik mikroskopların kullanımında olduğu gibi, doğrudan frezeleme için floresan ve iyon görüntüleri arasında hassas kayıt hala gereklidir.

Bu kayıt işlemi, üç temel faktör nedeniyle yanlışlığa eğilimlidir: kırılma indisi uyumsuzlukları (belirgin odak kaymalarına neden olur)31,32, frezeleme sırasında numune hareketi ve lokalizasyon hatası. Ayrıca, kayıt tipik olarak hem iyon hem de optik modalitelerde görülebilen ve iyon ve optik görüntüler arasındaki dönüşümleri hesaplamak için hizalama noktası çiftleri olarak kullanılan mikron boyutlu floresan referansları tarafından desteklenir. Bununla birlikte, bu boncuklar numuneden gelen floresan sinyalini gizleyebilir veya onunla rekabet edebilir ve optik ve iyon görüntüler arasında lokalizasyonları ve hizalanmaları yavaş ve kullanıcı yoğundur. Bu sınırlamalar birlikte, küçük ve nadir özelliklerin rutin olarak hedeflenmesini engellemiştir. Şu anda ince lamellerde korunabilen yapılara kesin bir sınır tanımlamak zor olsa da, kayda dayalı yaklaşımların genellikle eksenel boyutları bir mikronun33 altında olan hedefleri yakalamak için etkisiz olduğu düşünülmektedir.

Burada, FIB, SEM ve floresan mikroskobunu tek bir odak konumunda34,35 entegre eden üçlü tesadüfi bir görüntüleme sisteminin kullanımını rapor ediyoruz. Bu konfigürasyon, optik ve iyon görüntülerin kaydedilmesi ihtiyacını ortadan kaldırarak, çakışmayan entegrasyonlara kıyasla daha basit ve daha doğru floresan kılavuzlu frezelemeye olanak tanır. Düşük arka plan ve yüksek sinyalin ideal koşulları altında, 10 nm mertebesinde yönlendirme doğruluğu elde edilebilir36. Ayrıca, son ince lamel de dahil olmak üzere öğütme işlemi boyunca çok renkli kriyojenik floresan mikroskobu verilerinin elde edilmesine izin vererek, alt kırınımla sınırlı hedeflerin35 bağıntılı analizini ve lokalizasyonunu sağlar. Bunu başarmak için, CryoET'in nerede toplanacağını belirlemek amacıyla bu floresan görüntüleri düşük büyütmeli transmisyon elektron mikroskobu ile hassas bir şekilde hizalamak, veri toplamayı kolaylaştırmak ve son tomografik rekonstrüksiyonlarda hedef yakalamayı sağlamak için özelleştirilmiş bir görüntü dönüştürme araç seti kullanıyoruz.

Frezelemeye rehberlik etmek için sistemin floresan yoğunluğundaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izleme yeteneğinden yararlanıyoruz. Hedefimizi bulmak için optik ve iyon görüntüleri hizalamaya çalışmak yerine, kullanıcı sadece numuneden gelen floresan sinyalini izler. Öğütme ilerledikçe, floresan çok karakteristik bir şekilde davranır: önce mikroskop objektifi ile floresan etiketli numune arasındaki karbon destek filmi çıkarıldıkça daha parlak hale gelir, ardından odak dışı otofloresan malzeme frezelendikçe kademeli olarak azalır ve son olarak, etiketli yapının kendisi kısmen çıkarıldıkça keskin bir şekilde azalır. Bu gerçek zamanlı sinyal, kişinin frezeleme işleminin neresinde olduğunu ve frezelemenin ne zaman durdurulacağını tam olarak belirleyerek, ilgilenilen hedefin son lamel37 içinde tutulmasını sağlar. Ayrıntılı protokolde, eksenel boyutu <300 nm olan nesnelere frezelemeyi yönlendirmek için interferometrik etkiler nedeniyle floresan parlaklığındaki salınımları kullanan daha gelişmiş bir yaklaşımı da tartışacağız.

Mikrotübül düzenleme merkezini (MTOC)38 hedefleyerek platformun faydasını gösteriyoruz. MTOC, hücre bölünmesi ve farklılaşmasında rol oynayan kritik bir organeldir. Memeli hücrelerinde, etiketli tübülinin floresan mikroskobu, MTOC'yi canlı hücrelerde yaklaşık 1 μm çapında tek bir floresan punktum olarak ortaya çıkarır. Bu yaklaşım, MTOC'yi vitrifiye hücrelerin ince lamellerine yüksek doğrulukla başarılı bir şekilde lokalize etmek için kullanılmıştır. MTOC'deki mikrotübüllerin ayrıntılı organizasyonu ve diğer organellerle etkileşimleri, sonraki tomografik rekonstrüksiyonlarda ortaya çıkar. Bu iş akışı, kayıt olmadan yüksek hassasiyetli bağıntılı floresan mikroskobu ve CryoFIB-SEM'e olanak tanır, kullanıcı girdisini azaltır ve çakışmayan yaklaşımlarla sağlam bir şekilde yakalamak için daha önce engelleyici derecede küçük olan hücresel yapılara erişimi genişletir.

Tanımlar ve enstrüman açıklaması
Entegre optik mikroskop, Boltje ve ark.35'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve entegre mikroskobun kullanımına ilişkin daha fazla ayrıntı, yakın zamanda yayınlanan bir protokol34'te bulunabilir. Objektif aşağıdan entegre edilmiştir ve FIB-SEM çakışma noktasıyla hizalamayı sağlamak için x, y ve z konumlandırma yetenekleriyle donatılmıştır. Şu anda lamel düzelticili 100x, 0.85 NA objektifle çalışmaktadır. Optik görüntüleme, objektifi sıçrayan malzemeden ve hem FIB hem de SEM'den gelen ışınlamadan koruyan bir kapak camı aracılığıyla gerçekleştirilir. Geniş alan aydınlatması, birden fazla görünür dalga boyunu kapsayan bir dizi LED tarafından sağlanır. Floresan tespiti, bir sCMOS dedektörü kullanılarak gerçekleştirilir. Tanımlanmış üç aşama konumu vardır: yükleme: numunenin yüklendiği aşama konumu; kaplama: gaz enjeksiyon sistemi aracılığıyla kaplama için sahne konumu; 3-Işın: Üç (FIB, SEM ve optik) mikroskobun birlikte hizalanabileceği sahne konumu.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Burada kullanılan üç çakışan sistem, ticari olarak temin edilebilen, çift ışınlı bir FIB-SEM sistemine entegre edilmiş özelleştirilmiş bir kriyojenik floresan görüntüleme bileşenidir. İşlemlerin prensibi ve sırası genel olarak gelecekteki üçlü çakışan uygulamalara uyarlanabilir.

1. Kurulum

  1. Sistemi kriyojenik sıcaklığa soğutun. Sıcaklığı iki sensör kullanarak izleyin: biri numune aşamasında, diğeri odanın içinde bulunur. Numune üzerinde buz oluşumunu en aza indirmek için numune aşamasını hazneden yaklaşık 20 °C daha sıcak tutun (örneğin, ~-170 °C'de tabla, ~-190 °C'de hazne). Soğutma işlemi tipik olarak yaklaşık 1,5 saat sürer.

2. Örnek yükleme

  1. Sistem sıcaklığı kriyojenik sıcaklığa (yaklaşık -167,5 °C) yaklaştığında transfer istasyonunu manuel olarak soğutmak için sıvı nitrojen kullanın. Sistem sıcaklığı, ışık mikroskobu yazılımının sol üst köşesinde görüntülenir.
  2. Kriyojenik ışık mikroskobu sistemi için tasarlanmış numune kasetine kırpılmış bir Autogrid yükleyin. Kaset, yapıştırılmış bir lamel ve bir ara parçadan oluşur ve bunların arasına Autogrid yerleştirilir. Halka vidayı sıkarak kaseti kapatın, ardından aktarma istasyonundaki34 yuvaya yerleştirin.
  3. Transfer istasyonunu sisteme takın ve numune kasetini numune aşamasına yönlendirmek için dahili hazne kamerasını kullanın.

3. Numune kaplama için gaz enjeksiyon sistemi (GIS)

  1. Işık mikroskobu kontrol yazılımını açın ve numune aşamasını Yükleme konumundan Kaplama konumuna getirin.
  2. Kar tanesi simgesine tıklayarak FIB-SEM kontrol yazılımını kullanarak GIS iğnesini takın. GIS kontrolü altında, GIS iğnesi ekle seçeneğini seçin.
  3. Gaz akışını açarak 30 saniye boyunca GIS birikmesine izin verin.
    NOT: Bu, numune türüne bağlı olarak 20 s ile 1 dakika arasında değişir. Bu adımın amacı, sonraki FIB frezeleme prosedürü sırasında numuneyi yeterince korumaktır.
  4. GIS iğnesini geri çekerek numune aşamasını önceden tanımlanmış Yükleme konumuna geri getirin.

4. Üç ışınlı sistem hizalaması

NOT: Bu bölüm Wang39'dan uyarlanmıştır.

  1. Işık mikroskobu yazılımında, numune aşamasını Yükleme konumundan önceden tanımlanmış 3 ışınlı konuma taşıyın.
  2. FIB-SEM yazılımında, sol üst pencereye tıklayın ve SEM'i 100x büyütmeye ayarlayın.
  3. Işık mikroskobu yazılımının Hizalama sekmesinde, ızgaranın SEM atlasını elde etmek için Görüntüle işlevine tıklayın. Bu atlas görüntüsü önceden ayarlanmış parametreleri kullanır.
  4. Kırık karbon filmli kare bir alan belirleyin ve numune aşamasını o konuma taşımak için üzerine çift tıklayın.
  5. FIB-SEM kontrol yazılımına dönün ve görüş alanında ortalanmış seçili kare alana odaklanmak için SEM'i daha yüksek bir büyütmeye ayarlayın.
  6. SEM kırık bir karbon filmin keskin kenarı gibi ayırt edilebilir bir desene odaklanana kadar 4.4 ve 4.5 adımlarını gerektiği kadar tekrarlayın.
  7. Floresan mikroskobunu açın ve x, y, z koordinatlarını SEM görünümüne uyacak şekilde ayarlayın.
  8. FIB ile küçük bir desen frezeleyin, örneğin küçük bir dikdörtgen veya daire.
  9. Desenin hem FIB hem de floresan mikroskop görünümlerinde görünür olduğunu doğrulayın. Gerekirse, gerekirse 4.3-4.7 adımlarını izleyerek hizalamayı ayarlayın.
    NOT: Optik ve iyon mikroskoplarının hizalanması ve kaydı tamamlanmıştır.

5. Hedef yerelleştirme ve frezeleme

NOT: Bu bölüm Wang39'dan uyarlanmıştır.

  1. Işık mikroskobu yazılımındaki Lokalizasyon sekmesine geçin ve uygun uyarma ve filtreleme koşullarını etkinleştirerek floresan kanalları ayarlayın. Her floroforu ayrı bir kanal olarak atayın ve iletilen ışık (veya parlak alan) için ek bir kanal ekleyin.
  2. Her floresan kanalı için LED gücünü ve pozlama süresini ayarlayarak ilgilenilen hedefi belirleyin. Referans olarak, SiR-tubulin'i görüntülerken, 30 mW'lık sabit bir LED güç ayarıyla 1,2 sn'lik bir pozlama kullanın.
    NOT: Parametreler floroforlar arasında değişebilir. Numunede optik yoğunluk ~25-50 W/cm2'nin altında kalmalıdır. Bundan daha büyük bir yoğunluk, numunenin37,40 önemli ölçüde ısınmasına ve devitrifikasyonuna neden olabilir.
  3. Parametrelerden memnun kaldığınızda, eksenel yönde adım atan bir ön frezeleme floresan z-yığını edinin. Ardından, hedefi bir ROI olarak işaretleyin.
  4. ROI'de bir lamel çizmek için FIB-SEM yazılımına geçin.
  5. Malzemenin büyük kısmını ROI'nin yaklaşık 3 μm üstünde ve altında çıkarmak için kaba frezeleme gerçekleştirin. Bu arada, floresan sinyalindeki herhangi bir azalmayı izlemek için frezeleme sırasında floresan mikroskobunu açık tutun.
  6. Temizleme kesit modunu kullanarak ROI'yi ~2 μm'ye inceltin.
  7. Lamelleri inceltirken floresan sinyalini izlemek için terminalden Python tabanlı interferometrik araç setini açın (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)36.
  8. Sonraki frezeleme ve parlatma için, seçilen hedeflerin boyutlarına göre frezelemeyi yönlendirmek için aşağıda adım 5.9 veya 5.10'da açıklanan iki yaklaşımdan birini izleyin.
    1. Hedefin eksenel boyutu 300 nm >
      NOT: Burada doğrudan frezeleme için yarı tahribatlı bir yaklaşım kullanacağız.
      1. Python-GUI'de, floresan mikrografında ilgilenilen hedefi seçin. Yazılım, her yeni karede parlaklığı otomatik olarak zamanın bir fonksiyonu olarak çizmeye başlayacaktır.
      2. Python araç seti aracılığıyla floresan yoğunluğunu izleyin. Varsa, kalan destek filmi malzemesini çıkarmak için numuneyi alttan temizleme kesiti modunda frezeleyin.
        NOT: Destek filmi çıkarıldığında, floresanda bir artış gözlenmelidir.
      3. Floresan yoğunluğundaki hızlı düşüşleri (floresan malzeme kaybını gösterir) frezeleme yönlerinin ne zaman değiştirileceğine dair bir ipucu olarak kullanın. Örneğin, aşağıdan yukarıya doğru frezeleme yapılıyorsa ve floresansta keskin bir azalma gözlemleniyorsa, frezelemeyi durdurun ve yukarıdan aşağıya doğru frezelemeye geçin.
        NOT: Bir yapı çok hızlı bir şekilde kaldırılırsa, hedefin kaldırılmasını yavaşlatmak için FIB-SEM yazılımındaki frezeleme akımını azaltın.
    2. Hedefin eksenel boyutu ≤ 300 nm
      NOT: Burada, frezelemeyi36 yönlendirmek için interferometrik etkiyi kullanacağız.
      1. Python-GUI'de, floresan mikrografında ilgilenilen hedefi seçin. Yazılım, her yeni karede parlaklığı otomatik olarak zamanın bir fonksiyonu olarak çizmeye başlayacaktır.
      2. Bir test hedefi boyunca yukarıdan aşağıya frezeleme yaparak başlayın. Floresan yoğunluğu boyunca hedef boyunca frezelemeden hemen önce saçak kontrastını izleyin. Floresan hedefi sürekli olarak bir 2B Gauss'a uyar ve uyum, daha sonra çizilen entegre bir yoğunluk elde etmek için kullanılır.
      3. Hedef frezelendikten sonra, yoğunluk izindeki salınımları Python-GUI'yi kullanarak aşağıdaki model işlevine sığdırın:
        figure-protocol-1
        Burada A salınımın genliği, λ uyarmanın dalga boyu, k ışık kaynağının tutarlılık uzunluğunu temsil eden bir sönümleme terimi, bir faz faktörü Φ ve d yakalanan nesneye olan mesafedir. Test hedefinden, tüm terimler makul sınırlar içinde tahmin edilebilir, öyle ki mesafe, d, kullanıcıya floresan nesnenin frezelemeye göre nerede olduğunu söylemek için kullanılan tek serbest değişkendir. Daha fazla ayrıntı için Sica ve ark.36.
        NOT: Sonraki hedefler için araç seti, yoğunluk izini aynı model işleviyle canlı olarak sığdıracak ve frezelemenin yukarıdan aşağıya nerede durdurulacağını tahmin edecektir. Tüm bağlantı parçaları frezeleme ile aynı anda yapılır. Amaç, hedef üst yüzeyin altında istenen lamel kalınlığının yarısına eşit bir derinlikte olduğunda frezelemeyi durdurmaktır.
      4. Yukarıdan aşağıya frezeleme tamamlandıktan sonra, istenen kalınlık elde edilene kadar temizleme kesit modunda aşağıdan yukarıya doğru frezeleme yaparak lameli sonlandırın.
  9. Frezeleme sonrası floresan görüntüsü alın.

6. Bağıntılı ışık mikroskobu ve eğim serisi toplama

  1. Numuneyi CryoTEM'e aktardıktan sonra, tüm ızgaraların yeterli şekilde kapsanmasını sağlamak için 182x'te ızgaranın bir atlas özetini toplayın.
  2. 6.500x ila 11.000x arasında değişen uygun bir ara büyütmede, 0° eğimde son lamelin bir dizi montaj görüntüsünü toplayın.
  3. Frezeleme sonrası çok kanallı floresan görüntülerini ve adım 6.2'deki projeksiyon görüntüsünü ROI kaydı (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git) için özel bir projektif dönüştürme yazılımına okuyun.
  4. Projektif görüntü dönüşümünü tam olarak hesaplamak için toplam 8-10 çift referans noktası seçin.
    NOT: Bu noktalar, hem parlak alan optik mikroskobunda hem de elektron mikroskobunda bulunan bariz özellikler (örneğin, lamel kenarları, görünür buz kirliliği veya açık ızgara delikleri) olabilir.

7. Yüksek büyütmeli eğim serisi koleksiyonu

  1. Bu üst üste bindirilmiş floresan ve transmisyon elektron mikroskobu görüntüsünü, kullanıcıların yüksek büyütmeli eğim serisi toplama için kamera çerçevesi boyutu sınırı dahilinde bir görüntüleme alanı seçmeleri için referans olarak kullanın.
  2. Biyolojik soruya göre eğim serisinin büyütme ve parametrelerini seçin.
    NOT: Gösteri için, 3,5 ş41,42,43 piksel boyutunda 2°'lik artışlarla 54°'den veri topladık.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklılaşmış makrofaj hücrelerini, dondurmadan önce tübülin işaretleyicisi SiR-tübülin ile etiketledik. Protokolü takiben, MTOC'yi floresan mikroskobu altında tek bir ~ 1 μm çapında floresan punktum olarak tanımladık (Şekil 1A). Ek olarak, mikrotübül ağı ile tutarlı olarak MTOC'den hücre çevresine doğru yayılan fibril benzeri floresan yapılar gözlemledik (Şekil 1A). Farklı numune kalınlıklarında kademeli frezeleme anlık görüntüleri Şekil 1B'de gösterilmektedir. Özellikle, lamel yaklaşık 800 nm kalınlığa ulaştığında, tek MTOC punktum, her biri yaklaşık 700 nm çapında iki bitişik beneğe dönüştü. Daha sonraki analizler, her beneğin ayrı bir merkezcile karşılık geldiğini doğruladı.

Eşzamanlı görüntüleme ve frezeleme, floresan yoğunluğundaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlememizi sağladı. Özellikle, toplu floresan olmayan malzemenin ve emici destek filminin çıkarılmasından sonra floresanda bir artış gözlemledik (Şekil 1B-D). Lamel 2 μm'den 800 nm'ye inceltildiğinde, floresan yoğunluğu keskin bir şekilde azaldı ve bu da etiketli yapıların aşamalı olarak çıkarılmasını yansıtıyordu. Bu düşüş, lamel 200 nm'nin altına inceldikçe devam etti (Şekil 1B-D). İlişkili floresan görüntüsü ve elektron mikroskobu atlası, iş akışımızın frezeleme için hassas hedefleme sağladığını göstermektedir (Şekil 2A). Yeniden yapılandırılmış tomogramlar ve bölümlere ayrılmış modeller, önceki raporlar 42,43,44,45 ile tutarlı olarak merkezcillerin mikrotübül üçlülerinden oluştuğunu ortaya koymaktadır (Şekil 2A,B). Son lamelde sadece bir floresan beneğinin korunduğu durumlarda, karşılık gelen tomogramda tek bir merkezcil gözlemliyoruz (Şekil 2B).

figure-results-1
Şekil 1: Mikrotübül düzenleme merkezinin hassas lokalizasyonu için üç çakışan CryoFM-FIB-SEM'in iş akışı. (A) (sol) Canlı hücre mikroskobu ve (sağda) MTOC'nin CryoFM'i. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Hedeflenen frezeleme için CryoFM ve CryoFIB'nin adım adım anlık görüntüleri. Yakın çekim FM görünümü, sarı kesikli kutular olarak gösterilir. Sentriyoller sarı oklarla işaretlenmiştir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) CryoFIB frezeleme sırasında MTOC'nin floresan yoğunluğu. (D) CryoFIB frezeleme sırasında farklı aşamalarda alınan MTOC boyunca floresan hattı profili. Kısaltmalar: CryoFM-FIB-SEM = Odaklanmış iyon ışını frezeleme ve taramalı elektron mikroskobu ile kriyojenik floresan mikroskobu; MTOC = mikrotübül düzenleme merkezi; ROI = ilgi alanı. Bu rakam Wang39'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Üçlü çakışan CryoFM-FIB-SEM iş akışı tarafından ortaya çıkarılan MTOC'nin moleküler ayrıntıları. (A) MTOC'nin ilişkili FM, EM ve segmentasyon modeli. (a) Frezeleme sonrası FM görüntüsü. Bu, Şekil 1B'nin 180 nm olarak işaretlenmiş ancak CryoET rekonstrüksiyonu ve segmentasyonuna uyacak şekilde döndürülmüş son panelindeki görüntünün aynısıdır. Ölçek çubuğu = 5 μm; (b) Kesikli alanın (a)'dan sarı renkte büyütülmüş görünümü. (c) (2)'de gösterilen camgöbeği rengindeki kesikli alanın FM ve TEM projeksiyonu ile ilişkilidir. Ölçek çubuğu = 1 μm. (d) İlgilenilen bölgede (sarı, merkezcil; yeşil, mikrotübül) tomografik rekonstrüksiyonun bölümlere ayrılmış modeli. Ölçek çubuğu = 100 nm. (B) Farklı merkezcil yönelimler sunan iki farklı lamelin temsili FM görüntüleri ve tomografik dilimleri. FM: Ölçek çubuğu = 5 μm. Tomografik dilim: Ölçek çubuğu = 200 nm. Kısaltmalar: CryoFM-FIB-SEM = Taramalı elektron mikroskobu ile kriyojenik odaklanmış iyon ışını frezeleme; MTOC = mikrotübül düzenleme merkezi; FM = floresan mikroskobu; ET = elektron iletimi; TEM = transmisyon elektron mikroskobu. Bu rakam Wang39'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sonuçlarımız, eş zamanlı floresan görüntüleme ve frezelemeye olanak tanıyan üç çakışan görüntüleme platformunun faydasını vurgulamaktadır. Bu geri bildirimden yararlanarak, frezeleme sırasında kırılma indisi uyumsuzluğu ve hareketi ile ilgili temel doğruluk sınırlamalarıyla karşı karşıya kalan hantal ve kayıt tabanlı yaklaşımlara olan ihtiyacı ortadan kaldıran iki floresan kılavuzlu frezeleme stratejisi - yarı tahribatlı ve interferometrik - gösteriyoruz 12,33,46. Ayrıca, kesin kılavuz SEM yerine floresan mikroskobuna dayandığından, yoğunluk devitrifikasyona yol açan eşiğin altında tutulduğu sürece optik radyasyonsaptanabilir hasara yol açmaz 37,47. Burada gösterilen yetenekler, erişilebilir biyolojik numuneleri, iş akışını kolaylaştırırken nadir ve küçük (eksenel kapsamda <300 nm) ilgi çekici hedefleri içerecek şekilde genişletir.

Bu protokoldeki temel adım, ilgilenilen hedefin floresan parlaklığındaki değişikliklere bağlı olarak frezelemenin ne zaman durdurulacağını belirlemektir. Şu anda bu, frezelemeyi istenen zamanlarda durdurmak için hızlı manuel müdahaleyi içermektedir. Bu yöntemin, araştırılan mevcut hedefler için yeterli olduğu kanıtlanmıştır, ancak gelecekteki değişiklikler, frezelemeyi doğrudan durdurmak için Python araç setini FIB sistemine daha da entegre edebilir. Daha hızlı frezeleme hızları gerekiyorsa bu değişiklik gerekli olabilir, çünkü bu, manuel müdahale için daha az zaman kazandıracaktır. Alternatif olarak, daha yavaş frezeleme hızları tolere edilebiliyorsa, bu, gerektiğinde manuel müdahale için daha fazla zaman sağlayacaktır.

İlgilenilen lamel içeren biyolojik yapıların oluşturulmasının ardından, özelleştirilmiş görüntü dönüştürme yazılımımız, CryoET veri toplamaya rehberlik etmek için lamellerin atlas genel bakışlarını kullanarak CryoTEM düzeyinde korelasyon sağlar. Genel olarak, burada sunulan protokol, kalın ökaryotik hücresel örneklerde kriyojenik elektron tomografisi ile floresan etiketli, küçük ve nadir biyolojik hedeflerin görüntülenmesi için gereklidir. iFLM'li Aquilos 2 gibi mevcut tesadüfi olmayan Cryo-FIB sistemleriyle karşılaştırıldığında, iş akışımız bu özellikleri hedeflemede daha yüksek bir başarı oranına ulaşıyor.

Bu yüksek hedefleme hassasiyeti, verimlilik pahasına gelir. Frezeleme otomatik yerine manuel olduğundan, lamel üretiminin verimi sınırlıdır. 8 saatlik bir frezeleme seansında, tipik olarak 6-8 lamel üretiriz ve yaklaşık beşi ilgilenilen bir hedef içerir. Ancak, verimi artırmak için bu iş akışının gelecekte otomatikleştirilebileceğine inanıyoruz. Otomasyon, FIB görüntüsündeki aktif frezeleme alanlarını sürekli olarak izlemek ve hedefin korunmasını sağlamak için floresan yoğunluğunu gerçek zamanlı olarak izlemek için özel komut dosyaları gerektirecektir. Hem CryoFIB-SEM hem de floresan mikroskobu için tüm özel komut dosyaları ve kontrol yazılımı arasında etkili iletişim kurmak da dahil olmak üzere temel zorluklar devam etmektedir.

Geleceğe baktığımızda, floresan biyosensörler, süper çözünürlüklü görüntüleme ve konfokal mikroskopi dahil olmak üzere daha önce tartışılan diğer gelişmiş floresan mikroskobu tekniklerini dahil etmek için yapılacak çok iş var. Bununla birlikte, üçlü çakışan geometrilerin gelecekteki cihazlarda standart hale geleceğini ve frezeleme sırasında eş zamanlı floresan görüntülemenin rutin hale geleceğini öngörüyoruz. Eğer öyleyse, bu protokol, boyutlarına ve bolluklarına rağmen hücre biyolojisinin merkezinde yer alan küçük ve nadir biyolojik yapıların moleküler ölçekli ayrıntılarını yakalamayı amaçlayan araştırmacılar için değerli bir rehber görevi görebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görüntüleme iş akışı geliştirme konusundaki yardımları için Delmic üyelerine teşekkür ederiz. PDD, DE-AC02-76SF00515 sözleşmesi kapsamında Enerji Bakanlığı Laboratuvarına Yönelik Araştırma ve Geliştirme programının bir parçası olarak SLAC Ulusal Hızlandırıcı Laboratuvarı'ndaki Panofsky Bursu tarafından kısmen ve Enerji Bakanlığı, Bilim Ofisi, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi tarafından Sözleşme No. DE-AC02-76SF00515 FWP 100883. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden GJJ'ye hibe AI127401 ile desteklenmiştir. JW, Silikon Vadisi Toplum Vakfı'nın tavsiye ettiği bir fon olan Chan Zuckerberg Initiative DAF'tan 2021-234593 hibe ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Aquilos 2 Cryo-FIBThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m
& gad_source=1& gad_campaignid=12
764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS
s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid=
Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w
xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9
KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy
2EALw_wcB
Autogrid uyumlu kriyo ızgara kutusuElektron Mikroskopi Bilimlerihttps://www.emsdiasum.com/autogrid
-compatible-cryo-grid-box?srsltid=
AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk
cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
Autogrid halkaları ve C-klipsleriNanosofthttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
CLEM Yazılım PaketiStanford/SLAC'ta Dahlberg Araştırma Grubuhttps://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
Yusufçuk 2022.1Nesne Araştırma Sistemlerihttps://dragonfly.comet.tech/
ENZELDelmic B. V.ENZEL sistemi özelleştirilmiş bir enstrüman olup şu anda ticari olarak mevcut değildir
IMOD 4.12Colorado Üniversitesihttps://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 sıvı azot dewarıNanosofthttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023MathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Pin kapağı manipülatör aracıNanosofthttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Python toolkitStanford/SLAC'ta Dahlberg Araştırma Grubuhttps://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, 200 ağ, Au EM ızgaraElektron Mikroskopi Bilimlerihttps://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
Seri EMColorado Üniversitesi Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Spearlab standart gemisi (transfer dewar)Nanosofthttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
CizbitElektron Mikroskopi Bilimlerihttps://www.emsdiasum.com/style-3sa

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Komeili, A., Li, Z., Newman, D. K., Jensen, G. J. Magnetosomes are cell membrane invaginations organized by the actin-like protein MamK. Science. 311 (5758), 242-245 (2006).
  2. Bykov, Y. S., et al. The structure of the COPI coat determined within the cell. eLife. 6, e32493(2017).
  3. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  4. Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
  5. Hampton, C. M., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nat Protoc. 12 (1), 150-167 (2017).
  6. Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. Cellular electron cryotomography: Toward structural biology in situ. Annu Rev Biochem. 86 (1), 873-896 (2017).
  7. Grimm, R., et al. Electron tomography of ice-embedded prokaryotic cells. Biophys J. 74 (2), 1031-1042 (1998).
  8. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  9. Tamborrini, D., et al. Structure of the native myosin filament in the relaxed cardiac sarcomere. Nature. 623 (7988), 863-871 (2023).
  10. Kaplan, M., et al. Bdellovibrio predation cycle characterized at nanometre-scale resolution with cryo-electron tomography. Nat Microbiol. 8 (7), 1267-1279 (2023).
  11. Schur, F. K. M., et al. An atomic model of HIV-1 capsid-SP1 reveals structures regulating assembly and maturation. Science. 353 (6298), 506-508 (2016).
  12. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy. Biophys J. 110 (4), 860-869 (2016).
  13. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. cryoEM: Methods and Protocols. , Springer. 49-82 (2020).
  14. Rigort, A., Plitzko, J. M. Cryo-focused-ion-beam applications in structural biology. Arch Biochem Biophys. 581, 122-130 (2015).
  15. Noble, A. J., de Marco, A. Cryo-focused ion beam for in situ structural biology: State of the art, challenges, and perspectives. Curr Opin Struct Biol. 87, 102864(2024).
  16. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  17. Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2006).
  18. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge freezing for electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. 481, 63-82 (2010).
  19. Chang, Y. -W., et al. Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography. Nat Methods. 11 (7), 737-739 (2014).
  20. Wu, G. -H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237.e3 (2020).
  21. Lin, C., Zhang, L., Zhang, Z., Jiang, Y., Li, X. Locating cellular contents during cryo-FIB milling using cellular secondary-electron imaging. J Struct Biol. 215 (3), 108005(2023).
  22. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nat Protoc. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  23. Carter, S. D., Mamede, J. I., Hope, T. J., Jensen, G. J. Correlated cryogenic fluorescence microscopy and electron cryo-tomography shows that exogenous TRIM5α can form hexagonal lattices or autophagy aggregates in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (47), 29702-29711 (2020).
  24. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705.e12 (2018).
  25. Perez, D., et al. Identification and demonstration of roGFP2 as an environmental sensor for cryogenic correlative light and electron microscopy. J Struct Biol. 214 (3), 107881(2022).
  26. Sartor, A. M., Dahlberg, P. D., Perez, D., Moerner, W. E. Characterization of mApple as a red fluorescent protein for cryogenic single-molecule imaging with turn-off and turn-on active control mechanisms. J Phys Chem B. 127 (12), 2690-2700 (2023).
  27. Sexton, D. L., Burgold, S., Schertel, A., Tocheva, E. I. Super-resolution confocal cryo-CLEM with cryo-FIB milling for in situ imaging of Deinococcus radiodurans. Curr Res Struct Biol. 4, 1-9 (2022).
  28. Dahlberg, P. D., Moerner, W. E. Cryogenic super-resolution fluorescence and electron microscopy correlated at the nanoscale. Annu Rev Phys Chem. 72 (1), 253-278 (2021).
  29. Perez, D., et al. Exploring transient states of PAmKate to enable improved cryogenic single-molecule imaging. J Am Chem Soc. 146 (42), 28707-28716 (2024).
  30. Li, S., et al. ELI trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  31. Loginov, S. V., Boltje, D. B., Hensgens, M. N. F., Hoogenboom, J. P., vander Wee, E. B. Depth-dependent scaling of axial distances in light microscopy. Optica. 11 (4), 553-568 (2024).
  32. Petrov, P. N., Moerner, W. E. Addressing systematic errors in axial distance measurements in single-emitter localization microscopy. Opt Express. 28 (13), 18616-18632 (2020).
  33. Yang, J., et al. Precise 3D localization by integrated fluorescence microscopy (iFLM) for cryo-FIB-milling and in situ cryo-ET. Microsc Microanal. 29 (Suppl. 1), 1055-1057 (2023).
  34. Perton, E., Boltje, D., Jakobi, A., Hoogenboom, J. Workflow for fluorescence-targeted lamella milling from vitrified cells with a coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Bio Protoc. 15 (14), e5390(2025).
  35. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. eLife. 11, e82891(2022).
  36. Sica, A. V., et al. Optical interference for the guidance of cryogenic focused ion beam milling beyond the axial diffraction limit. bioRxiv. , (2024).
  37. Dahlberg, P. D., Perez, D., Hecksel, C. W., Chiu, W., Moerner, W. E. Metallic support films reduce optical heating in cryogenic correlative light and electron tomography. J Struct Biol. 214 (4), 107901(2022).
  38. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
  39. Wang, J. Direct visualization of cellular protein complexes in situ by fluorescence-guided cryo-FIB-SEM and cryo-ET. , California Institute of Technology. (2025).
  40. Last, M. G., Tuijtel, M. W., Voortman, L. M., Sharp, T. H. Selecting optimal support grids for super-resolution cryogenic correlated light and electron microscopy. Sci Rep. 13 (1), 8270(2023).
  41. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  42. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
  43. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  44. Meng, E. C., et al. UCSF ChimeraX: Tools for structure building and analysis. Protein Sci. 32 (11), e4792(2023).
  45. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  46. Klumpe, S., et al. A modular platform for automated cryo-FIB workflows. eLife. 10, e70506(2021).
  47. Li, Y., Kang, D. -D., Dai, J. -Y., Wang, L. -W. The cage effect of electron beam irradiation damage in cryo-electron microscopy. npj Comput Mater. 10 (1), 115(2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cryogenic Focused Ion BeamCryoFIB SEMFluorescence MicroscopyElectron MicroscopyTargeted Cell MillingCryogenic Electron TomographyCorrelative Light Electron MicroscopyMicrotubule Organizing CenterLamella PreparationReal Time Fluorescence Feedback

İlgili makaleler