Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Su Örneklerinde İyonik Cıvayı Ölçmek için Tam Hücre Biyosensörlerinin Kullanılması

641 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68257

⸱

3 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Moléculas Individuales, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 2Kenniscentrum AI, Erasmushogeschool Brussel, 3Open BioLab Brussels, Erasmushogeschool Brussel

Bu makalede

Özet

Bu makale, iyonik cıvayı tespit etmek için iki tam hücre biyosensörünün (Mer-Blue ve Mer-RFP) kullanılması için protokoller sunmaktadır. Çalışma, çalışma ve çıktı analizleri için ayrıntılı prosedürler sağlayarak, belirli kirleticileri izlemek için bu teknolojilerin daha geniş çapta benimsenmesini ve daha da geliştirilmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Özet

Tam hücre biyosensörleri (WCB'ler), düzenleyici unsurları keşfetmek ve karakterize etmek ve biyomühendisliği ilerletmek için araçsal platformlardır. Ayrıca çevre ve gıda izleme için büyük umut vaat ediyorlar. Hassasiyetlerini ve taşınabilirliklerini artırmak için önemli çabalar harcanmış olsa da, bunların kullanımı ve veri analizinin standardizasyonu nispeten az gelişmiş durumda. Bu makale, Dünya Sağlık Örgütü'nün içme suyu limitlerinin altındaki seviyelerde iyonik cıvayı tespit edebildiği kanıtlanmış, yakın zamanda geliştirilen iki WCB olan Mer-Blue ve Mer-RFP'nin kullanımına yönelik kapsamlı bir kılavuz sunmaktadır. Burada ayrıntıları verilen protokoller, mikrobiyal kültür hazırlama, sensör kalibrasyonu, veri toplama ve analizi kapsar. Florometrik Mer-RFP biyosensörü için, güvenilir ve doğru doz-yanıt ölçümleri için zaman aralığını belirlemek üzere yeni bir biyosentez tahsis teoremi kullanılır. Kolorimetrik Mer-Blue biyosensör için düşük maliyetli bir kamera kurulumu, pahalı spektrofotometreler ve florimetrelerin bulunmadığı ortamlarda titiz ölçümlere olanak tanıyarak merkezi olmayan kirlilik izlemeyi kolaylaştırır. Tatlı su numunelerini test etmek için kullanılan prosedürler açıklanmakta ve bu biyosensörlerin numune türlerine göre sınırlamaları tartışılmaktadır. Bu işleme ve analiz tekniklerini paylaşarak, daha geniş araştırma gruplarını etkili çevresel izleme çözümleri geliştirmek için bu biyolojik cihazları benimsemeye ve iyileştirmeye teşvik ediyoruz. Sonuç olarak, bu araştırma, çevre bilimi topluluğu içinde biyosensör teknolojilerinin yaygın olarak benimsenmesini kolaylaştırmayı ve çeşitli ekosistemlerde eser element kirliliğinin daha etkili ve verimli bir şekilde izlenmesine katkıda bulunmayı amaçlamaktadır.

Giriş

Çevre kirliliği ve su ve gıda arzının güvenliği konusundaki endişeler arttıkça, biyosensörler geleneksel analitik kimya yöntemlerine çekici ve uygun fiyatlı bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Ağır metaller, insan faaliyetleri nedeniyle giderek daha yaygın hale gelen oldukça toksik kirleticilerdir 1,2,3,4. Bununla birlikte, geleneksel algılama yöntemleri5 genellikle maliyetlidir ve erişilemez.

Cıvaya duyarlı WCB'ler, MerR transkripsiyon faktörü 6,7,8'in olağanüstü özgüllüğünden ve hassasiyetinden yararlanır. MerR, doğal işlevinde, detoksifiye edici aktivitesi cıva direnci9 sağlayan efektör proteinlerin ekspresyonunu düzenler. MerR'nin gen ekspresyonunu cıvaya bağımlı bir şekilde düzenleme yeteneği, cıva algılama sistemlerindeki raportör proteinlerin düzenlenmesi için yeniden tasarlanmıştır 10,11,12,13,14,15,16. Umut verici araştırmalara rağmen, bu WCB'ler gerçek dünya izlemesi için henüz benimsenmemiştir. Biyolojik kırılganlık, özel kullanım gereksinimleri ve standartlaştırılmış protokollerin ve sertifikalı referans materyallerinin olmaması gibi faktörler pratik uygulamayı engellemiştir 17,18,19,20.

İyonik cıva tespiti için bir WCB sistemi, iki farklı raportör proteine bağlı MerR kullanılarak geliştirilmiştir. Mer-Blue, kromojenik bir proteini ifade eder ve kolorimetrik bir biyosensör görevi görerek görsel veya kamera tabanlı algılama sağlar. Floresan bir biyosensör olan Mer-RFP, sinyal birikiminin sürekli izlenmesini sağlar. Büyüme aşaması sırasında numuneye maruz kalma zamanlamasını dikkatli bir şekilde kontrol ederek, her iki sistemde de sağlam tekrarlanabilirlik elde edilmiştir15.

Bu makale, hem Mer-Blue hem de Mer-RFP'yi çalıştırmak için ayrıntılı protokollerin yanı sıra sinyal çıkışlarının kapsamlı bir analizini sunar. Mer-RFP için analiz, yakın zamanda tanıtılan bir protein biyosentez tahsisiteoremine dayanmaktadır 21. Mer-Blue için kolorimetrik analiz, ImageJ gibi görüntü işleme yazılımları kullanılarak sayısallaştırılabilir. Tutarlı görüntü elde etme ayarları sağlamak için, PelletCam adlı düşük maliyetli, kendin yap kamera kurulumu sunulmaktadır. Her iki durumda da, işlemi kolaylaştırmak için otomatik yazılım sağlanır. Erişilebilir ve standartlaştırılmış deneysel metodolojileri ve veri analizi tekniklerini paylaşarak, güvenilir ve uygun maliyetli biyosensör tabanlı izleme çözümlerinin geliştirilmesi için WCB'lerin daha geniş çapta benimsenmesi teşvik edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. İyonik cıva çözeltilerinin hazırlanması

  1. Solunmasını ve cildin maruz kalmasını önlemek için uygun koruyucu eldivenler ve bir maske kullanarak küçük bir HgBr2 tozu kütlesini (tipik olarak 0,1 ila 0,2 g arasında) tartın.
  2. Aşağıdaki formülü kullanarak ölçülen katı toz kütlesini ddH2O içinde çözerek 4 mM'lik bir çözelti elde etmek için gereken su miktarını hesaplayın:
    figure-protocol-1
    NOT: Beklenen hacim 100 mL'ye yakındır; Basitleştirilmiş bir formül kullanılabilir:
    figure-protocol-2
    1. Alternatif olarak, HgCl2 kullanırken aşağıdaki formülü uygulayın:
      figure-protocol-3
  3. Buharlaşmayı önlemek için stok çözeltisini hava geçirmez şekilde kapatılmış bir kapta, soğutulmuş bir ortamda (4 °C) saklayın.
  4. Her titrasyon testinden önce, Tablo 1'de gösterildiği gibi 1 mL 2 mMHg 2+ ile başlayarak ve 40 nM'ye kadar seyrelterek seri seyreltmeler hazırlayın.
    NOT: İyonik cıva konsantrasyonu, muhtemelen elementel cıvanın (Hg°) kendiliğinden azalması ve buharlaşması nedeniyle depolama sırasında değişebilir. Soğutma ve yüksek kaliteli, hermetik kapların kullanılması bu etkileri azaltabilse de, özellikle 250 nM Hg2 + veya daha düşük konsantrasyonlar için 6 haftadan fazla saklanan çözeltileri kullanmaktan kaçının.

2. M9 ortamının hazırlanması

  1. Aşağıdaki stok çözeltilerini hazırlamak için reaktif tozlarını ultra saf su kullanarak ayrı şişelerde çözün: M9 5×, 1 M MgS04, 1 M CaCl2, (a/h) glikoz ve (a/h) Kaamino asitler.
  2. 500 mL veya 1 L'lik bir cam şişede, 50 mL M9 5×, 2.5 mL% 20 (a / h) Casamino asitleri karıştırın ve toplam 246.475 mL hacme ulaşmak için ultra saf su ekleyin.
  3. Karışımı ve yukarıda listelenen stok çözeltilerini 121 °C'de 20 dakika otoklavlayın.
  4. CaCl2'nin çökelmesini önlemek için tüm çözeltilerin tamamen soğumasına izin verin.
  5. Soğutulmuş karışıma ekleyin: 25 μL 1 M CaCl2, 500 μL 1 MMgS4 ve 3 mL% 20 (a / h) glikoz.
    NOT: Bu, aşağıdaki nihai konsantrasyonlara sahip zengin bir şekilde takviye edilmiş bir M9 ortamı ile sonuçlanır:% 0.24 (a / h) glikoz,% 0.2 (a / h) Kaamino asitler, 2 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 3 g / L KH2PO4, 0.5 g / L NaCl, 6.78 g / L Na2HPO4, 1 g / L NH4Cl.

3. Mer-Blue / Mer-RFP biyosensörünün etkinleştirilmesi

  1. pUC-Mer-RFP veya pUC-Mer-Blue plazmidi ile dönüştürülmüş Escherichia coli DH5α hücrelerini kullanın (bkz.
  2. 100 μg/mL ampisilin içeren bir LB-agar Petri kabı hazırlayın.
  3. Dondurularak saklanmış bir gliserol stoğundan tohum hücreleri, çizgi yöntemi kullanılarak LB-agar plakasına yerleştirilir.
  4. Plakayı gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  5. Ertesi gün, M9 besiyeri kullanarak 10 mL'lik bir kültürü aşılamak için LB-agar plakasından tek bir koloni seçin (Şekil 1A).
  6. Kültürü gece boyunca (~ 16 saat) 220 rpm'de sürekli çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edin (Şekil 1B).

4. Mer-RFP kullanarak titrasyon deneyi

  1. Gece boyunca bakteri kültürünün optik yoğunluğunu 600 nm'de (OD600) ölçün.
  2. Aşağıdaki formülü kullanarak toplam 10 mL taze M9 ortamı hacminde 0.05'lik bir OD600'e ulaşmak için gereken gece kültürünün hacmini hesaplayın:
    figure-protocol-4
    burada C1 , gece kültürünün OD600'üdür ve V1 ondan alınacak hacimdir.
  3. Ön aşılamanınV 1 mL'sini 3500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Eski M9 ortamını atın ve bakteri peletini 10 mL taze M9 ortamında yeniden süspanse edin (Şekil 1C).
  4. 96 oyuklu bir mikroplakanın her bir oyuğuna 195 μL yeniden süspanse kültür ekleyin. Doğru ölçümler için her mikro kültürün üç nüsha halinde hazırlandığından emin olun.
  5. 1 nM ila 1 μM arasında değişen nihai konsantrasyonları elde etmek için her bir oyuğa adım 1'de açıklandığı gibi 5 μL 40 nM ila 40 μM iyonik cıva çözeltisi ekleyin (Şekil 1D).
  6. Mikroplakayı sıcaklık kontrollü çok modlu bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin, aşağıdaki parametrelere ayarlayın (Şekil 1E) - Sıcaklık: 37 °C, Çalkalama: 60 rpm'de sürekli sallama, Zaman aralığı: 16 saat boyunca her 15 dakikada bir okuyun, Optik yoğunluk ölçümü: 600 nm'de okuyun, Floresan ölçümü: 570 nm'de uyarma ve 615 nm'de emisyon.
  7. 16 saatlik inkübasyon süresini tamamladıktan sonra, verileri mikroplaka okuyucusundan toplayın (Şekil 1F).

5. Mer-RFP sonuçları için veri analizi

  1. Tüm bireysel kültürler için zaman içinde ham OD600 değerlerini görselleştirmek için tercih edilen elektronik tablo yazılımını veya veri yönetimi araçlarını kullanın (Şekil 1G). Gecikme fazının sonunun ve durağan fazın başlangıcının, her bir cıva konsantrasyonu koşulundaki tüm kopyalarda yaklaşık olarak aynı anda gerçekleştiğini doğrulayın. Ortalama zamanlamadan 1 saatten fazla sapan kültürleri hariç tutun.
  2. Her cıva konsantrasyonu koşulundaki tüm kopyalardaki her zaman noktası için ortalama OD600'ü hesaplayın. Her üçlü kültür koşulu için, farklı zaman noktalarında tek, ortalama bir OD600 büyüme eğrisi ve üç floresan yoğunluk çıkışı mevcut olacaktır.
  3. Ortalama OD600 ile karşılaştırın. Cıvasız kültür zamanı. Büyüme oranının pozitif olduğu zaman aralığını görsel olarak tanımlayın ve seçin (bkz. Şekil 2). Kalan veri noktalarını tüm kültürlerden dışlayın.
  4. Her kültür için, aşağıdaki formülü kullanarak, önceki zaman noktasından OD600'deki değişikliği bularak ve bu değişikliği o zaman noktasındaki OD600 değerine bölerek her bir zaman noktasındaki spesifik büyüme oranını hesaplayın:
    figure-protocol-5
  5. Benzer şekilde, aşağıdaki formülü kullanarak, önceki zaman noktasından floresan yoğunluğundaki değişikliği bularak ve bu değişikliği o zaman noktasındaki OD600 değerine bölerek her kültür için spesifik floresan üretim oranını hesaplayın:
    figure-protocol-6
  6. Her kültür için, floresan üretim hızına karşı spesifik büyüme oranını çizin (bkz. Şekil 3). Geç zaman noktaları içinde doğrusal bir aralık belirleyin. En az 12 noktaya (yaklaşık 3 saat) dayalı olarak en yüksek R2'ye sahip doğrusal bir regresyon elde edilene kadar erken zaman noktalarını hariç tutun.
    NOT: Bu doğrusal regresyonun eğimi, ekspresyon fraksiyonunu, yani raportör protein21'e tahsis edilen toplam protein sentezinin oranını temsil eder.
  7. Tüm kültürler için, yaklaşık olarak aynı zaman aralığından doğrusal eğilimleri çıkarın ve her koşul için eğim değerini kaydedin.
    NOT: Aynı zaman aralığını kullanarak tüm kültürlerde mümkün olan en yüksekR2 değerini elde etmek için birden fazla deneme gerekebilir. Otomatik analiz için aşağıdaki Jupyter Notebook (Google Colab çerçevesi) https://github.com/frank-britto/Mer_RFP adresinde mevcuttur. Bu not defteri, doğrusal eğilimlerin çıkarılmasını ve daha fazla doz-yanıt profili oluşturmayı optimize etmek için bir şablon görevi görür.
  8. Her cıva konsantrasyonu için kopyalar arasındaki ortalama eğimi alın.
  9. Cıva konsantrasyonuna karşı ortalama eğim değerlerini çizin (bkz. Şekil 4A). Verilere bir Hill işlevi sığdırın:
    figure-protocol-7
    Nerede: fRFP , Kırmızı Floresan Protein için ifade fraksiyonudur, H, devre için mümkün olan maksimum ifadeyi temsil eder, [Hg2 +] iyonik cıva konsantrasyonudur, kHg , iyonik cıva afinitesi ile ilgilidir, n, Hg2 + 'ya verilen yanıtın işbirliğini, ifade eden Hill katsayısıdır.

6. Mer-Blue biyosensör kullanarak titrasyon deneyi

  1. 3. adımda tarif edildiği gibi elde edilen gece boyunca, yoğun bir kültürü 3.500 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  2. Kullanılmış M9 ortamını atın ve bakteri peletini taze M9 ortamında600 /1.0'lık bir OD'ye yeniden süspanse edin. Bu yoğunlukta en az 5 mL kültür elde edildiğinden emin olun (Şekil 1C).
    NOT: Bir spektrofotometre mevcut değilse, bakteri peletini yoğun kültürün orijinal hacminin iki katına eşit bir taze M9 ortamı hacminde yeniden süspanse ederek başlangıç koşullarına yaklaşın.
  3. Sterilize edilmiş cam kültür tüplerine 9.5 mL M9 ortamı ve 10 μL 100 mg / mL ampisilin stok çözeltisi ekleyin (Şekil 1H).
  4. Takviye edilmiş M9 ortamını, adım 6.2'de hazırlanan 500 μL biyosensör kültürü ile aşılayın (OD600 = 1.0).
  5. 0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 125 nM ve 250 nM'lik nihai konsantrasyonlara ulaşmak için hazırlanan iyonik cıva çözeltilerinden 10 μL ekleyin (bkz. adım 1).
  6. Kültürleri 37 ° C'de 16 saat boyunca 220 rpm'de kuvvetli çalkalama ile inkübe edin (Şekil 1I).

7. Mer-Blue sonuçları için veri toplama ve analizi

  1. Her kültürün yaklaşık 1.3 mL'sini 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın (Şekil 1J).
  2. Sıkı peletler elde etmek için mikrotüpleri 3 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  3. (İsteğe bağlı) Daha büyük peletler elde etmek için, santrifüjlemeyi ve süpernatan çıkarmayı altı defaya kadar tekrarlayın.
  4. Pelele odaklanarak her bir mikrotüpün altını fotoğraflayın (Şekil 1K). Tüm görüntülerde tutarlı ve tekrarlanabilir yönlendirme, aydınlatma ve renk ayarları sağlamak için bir mikrotüp tutucu ve bir tripod veya bir PelletCam (bkz. adım 8) kullanın (bkz. Şekil 5).
  5. Kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) kanallardaki her bir pelet görüntüsünün renk yoğunluğu değerlerini belirleyin.
    1. ImageJ kullanıyorsanız: Görüntüyü yükleyin ve üç dilimli bir yığın (kırmızı, yeşil ve mavi kanallar) oluşturmak için Görüntü > > RGB Yığını Yazın'a gidin. Pelet alanının etrafına bir ilgi alanı (ROI) çizmek için seçim aracını kullanın. Her kanalda seçilen alan için ortalama yoğunluk değerlerini elde etmek için Analiz Et > Ölç'e gidin.
    2. PelletCam kullanılıyorsa: Pellet görüntüsünün temsili dokuz piksellik bir alanı için ortalama renk yoğunluğu değerlerini içeren .csv dosyasını açın.
  6. Aşağıdaki denklemi kullanarak, daha önce22 açıklandığı gibi, beyaz bir referans pelet görüntüsüne (dönüştürülmemiş E. coli) göre RGB alanındaki Öklid mesafesini hesaplayarak her numune için biyosensörün yanıtını hesaplayın:
    figure-protocol-8
    Burada, Rnumunesi, Gnumunesi ve Bnumunesi, biyosensör numunesinden pelet görüntüsünün seçilen alanındaki her bir RGB kanalından ortalama renk yoğunluklarını temsil ederken, Rref, Gref ve Bref, dönüştürülmemiş E. coli'nin referans peleti için karşılık gelen değerleri belirtir.
  7. Hesaplanan Öklid mesafelerini karşılık gelen iyonik cıva konsantrasyonlarına karşı çizin (bkz. Şekil 6). Aşağıdaki denklemi kullanarak verilere bir Hill fonksiyonu sığdırın (bkz. Şekil 4B):
    figure-protocol-9
    Burada, E Öklid mesafesidir, H devre için mümkün olan maksimum renklenmeyi temsil eder, [Hg2 +] iyonik cıva konsantrasyonudur, kHg iyonik cıva afinitesi ile ilgilidir ve n, Hg2 + 'ya verilen yanıtın işbirliğini, ifade eden Hill katsayısıdır.

8. Bir PelletCam Oluşturmak

  1. Bakteri peletlerinde renk ölçümü için kapalı bir mikrodenetleyici sistemi oluşturmak için dosyaları web sitesinden indirin (https://github.com/EhbAIGit/PelletCam-OPENBIOLAB-AI).
    NOT: Lazer kesim, 3D baskı, ESP32 ve Arduino hakkında temel bilgiler yardımcı olur. ESP32-CAM için bir giriş kılavuzu (https://lastminuteengineers.com/getting-started-with-esp32-cam/?utm_content=cmp-true) adresinde mevcuttur. Daha kolay programlama için ESP32-CAM'i MB Adaptörü ile birlikte satın almanız önerilir. ESP32'ye aşina olmayan kullanıcılar için, önce https://lastminuteengineers.com/esp32-arduino-ide-tutorial/ öğreticiyi takip etmeleri önerilir.
  2. Lazer kesici ile 3 mm'lik bir multipleks kesmek ve kazımak için LasercutterBox.ai dosyasını kullanın.
  3. Parçaları bir 3D yazıcı ile ESP32SET.stl dosyasından oluşturun. Bu .stl dosyası, hemen hemen tüm 3D yazıcı yazılımları tarafından doğrudan içe aktarılabilir; örneğin, Bambu stüdyosu (https://bambulab.com/en/download/studio).
  4. .cpp ve .h ve .ino dosyalarını tek bir klasöre yerleştirerek ESP32'yi (ESP32-CAM-MB 2640 WiFi Bluetooth kamera modülü) kurun. Ardından, .ino dosyasını Arduino IDE yazılımı ile açın ve >Yükle'ye tıklayın. Yüklendikten sonra ESP32 otomatik olarak başlayacaktır.
  5. Bu noktada kullanıcı, ESP32'nin .ino dosyasında belirtildiği gibi >PELLET adlı WiFi erişim noktasına ve şifre >PELLETCAM) bağlanabilmelidir. PelletCam'in IP adresi, Arduino IDE'nin seri monitöründe görüntülenecektir. Bir web tarayıcısı açın ve şu adrese gidin: http://192.168.4.1.
    NOT: Bu, görüntüyü görüntülemeyi veya yeni bir görüntü çekmeyi (>FOTOĞRAF ÇEK), görüntüyü döndürmeyi (>ROTATE) veya LED şeridin parlaklığını ayarlamayı (>LED'ler) sağlar.
  6. ESP32 Arduino'yu InstallationManual.pptx dosyadaki şemaya göre LED şeridine (NeoPixel Stick - Entegre Sürücülü 8 x 5050 RGB LED) ve 5V USB kablosuna bağlayın.
  7. ESP32 ve LED şeridi 3D baskılı desteklere yapıştırmak için bir tutkal tabancası kullanın.
  8. PelletCam'in 3D baskılı ön kısmına renkli tabanlı bir mikrotüp (veya bakteri peleti) yerleştirin. ESP32-LED desteğini yaklaşık 5 cm daha uzağa yerleştirin ve web sayfası üzerinden bir fotoğraf çekin. Keskin ve düzgün aydınlatılmış bir görüntü elde edilirse, ESP32-LED desteğini ahşap kutunun altına yapıştırın. Değilse, ön ile ESP32-LED desteği arasındaki mesafeyi ayarlayın ve tatmin edici bir mesafe elde edilene kadar prosedürü tekrarlayın.
  9. Maskeleme bandı kullanarak ve tüm parçaları ahşap tutkalı ile yapıştırarak kutuyu monte edin.
  10. PelletCam'i USB kablosuyla en az 1 A sağlayabilen bir USB güç kaynağına bağlayın.
    NOT: Python 3.9 veya sonraki bir sürümünün kurulu olduğundan emin olun.
  11. Bir komut istemi veya terminal penceresi açın. pellet.py dosyasını içeren dizine gidin. >python pellet.py komutunu kullanarak betiği çalıştırın.
  12. pellet.py betiği çalışamıyorsa, bunun nedeni eksik Python kitaplıkları olabilir. >pip install pillow tkinter pathlib statistics komutunu kullanarak gerekli kitaplıkları yükleyin. Kendi sisteminizi kurmaya yönelik ekstra rehberlik için PelletCam Example.docx belgesine bakın.

9. Çevresel su numunelerinin ölçülmesi

  1. Nehirler veya göletler gibi çevresel kaynaklardan örnekler toplayın ve buharlaşmayı en aza indirmek için bunları hava geçirmez kaplarda düşük sıcaklıklarda saklayın. Ayrıntılar için Tartışma bölümüne bakın.
  2. Numuneleri 3.500 × g'da 10 dakika boyunca kumu ve organik kalıntıları çökeltmek için santrifüjleyin ve sulu fraksiyonu izole edin.
  3. Arıtılmış numuneyi 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin.
    NOT: Cıva uçucu olduğundan ve işlem sırasında buharlaşabileceğinden ısı sterilizasyonundan kaçının.
  4. (İsteğe bağlı) Standart analitik kimya tekniklerini kullanarak bağımsız ölçüm için %5 HCl ekleyerek ayrı bir asitleştirilmiş alikot hazırlayın. Biyosensör tahlilleri için yalnızca asitleştirilmemiş numuneyi kullanın.
  5. Steril filtrelenmiş çevresel numunenin 5 mL'sini 4,5 mL 2× M9 ortamı ile karıştırın, bu da numunenin 1:2 oranında seyreltilmesine neden olur.
  6. Seyreltilmiş numune-ortam karışımını 0.5 mL'lik bir gece kültürü ile aşılayın (adım 5.4'te açıklandığı gibi hazırlanır). Bu aşılama, kültürün 20 kat seyreltilmesine karşılık gelir ve testi başlatmak için 0.05'lik bir OD600 verir.
    1. Mer-RFPTransfer kullanılıyorsa, numune-ortam karışımından 200 μL'lik bir mikroplaka kuyucuğuna aktarın ve adım 3.6'da açıklandığı gibi bir mikroplaka okuyucu kullanarak ölçümleri başlatın.
    2. Mer-Blue kullanılıyorsa: 10 mL numune-ortam karışımını 37 °C'de 16 saat boyunca 220 rpm'de kuvvetli çalkalama ile adım 5.6'da açıklandığı gibi inkübe edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Her iki biyosensör de cıva içermeyen koşullar altında ilgili raportör proteinlerinin saptanabilir bir temel ekspresyonunu göstermez. Mer-Blue kültürleri tipik olarak, 25 nM ve üzeri HgBr2 konsantrasyonlarında aşılamadan 6-8 saat sonra çıplak gözle gözle görülür renklenme göstermeye başlar. Düzgün bir şekilde yürütüldüğünde, Mer-RFP veya Mer-Blue kullanılarak yapılan titrasyon deneyleri, 1'e yakın bir Hill katsayısına sahip bir Hill fonksiyonuna uyan yanıtlar verir ve bu da işbirlikçi olmayan bağlanma davranışı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada kullanılan biyosensör devreleri aynıdır, sadece raportör proteinde farklılık gösterir. Her ikisi de tamamen yüksek kopyalı plazmitler üzerinde kodlanmıştır ve çeşitli suşların Escherichia coli hücrelerinde konuşlandırılmalarını sağlar. E. coli B suş hücrelerinde işlevsel iken, K-12 suşlarında, özellikle DH5α ve kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerinde15 Mer-Blue'dan daha güçlü bir renkli sinyal gözlendi.

Güvenilir bir çıktı elde etme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Bu araştırma, Programa Nacional de Investigación Científica y Estudios Avanzados PROCIENCIA'nın EF-041-2024-01 "Proyectos de Investigación aplicada" programı, PE501086520-2024-PROCIENCIA hibe sözleşmesi aracılığıyla desteği sayesinde sunulmuştur. Cıva biyosensörlerinin geliştirilmesi, Güney Girişimi hibe kodu PE2020SIN292B122 aracılığıyla VLIR-UOS tarafından finanse edildi. MD, Global Minds projesi BE2017GMHVLHC106 kapsamındaki XREI hibesi için VLIRUOS, DGD ve Flaman Uygulamalı Bilimler ve Sanatlar Üniversiteleri Konseyi'ne teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3 mm kalınlığında multipleks ahşapBirçok distribütör
5 V USB kablosuBirçok distribütör
96 kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı Polistiren TC ile işlenmiş MikroplakalarCorning3599
Agar tozuHiMediaGRM026
AmpisilinAltın Biyoteknoloji, Inc.A-301-100
CaCl2Millipore208290
Kasamino AsitlerCalbiochem2040OP
D- (+) - GlikozMerkezi İlaç Evi (P) Ltd.506250
ESP32-CAM-MB 2640 Bluetooth WiFi Kamera Modülü USB'den Seri Bağlantı Noktasına Geliştirme Kartı Otomatik İndirme (Tip C)Birçok distribütör
Cam kültür tüpleriCorning9825
HgBr2, Cıva(II) bromürMerck200085
HgCl2, Cıva(II) klorürMerck21465
Luria suyu (Miller)Sigma-AldrichL3522
M9 minimum tuzlarSigma-AldrichM6030
MgSO4HiMediaGRM684
NeoPixel Stick - Entegre Sürücülü 8 x 5050 RGB LEDAdafruit1426
Plazmid: pUC-Mer-Mavi Grubumuz-Tamdizi https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
Plazmid'de mevcuttur: pUC-Mer-RFP Grubumuz-Tam dizi,
Şırınga filtreleri, hidrofilik, gözenek boyutu 0.22 mikronMilliporeSLGV004SLÇevresel numuneleri sterilize etmek için mevcuttur.
https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1

Kaynaklar

  1. Cooke, C. A., Balcom, P. H., Biester, H., Wolfe, A. P. Over three millennia of mercury pollution in the Peruvian Andes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (22), 8830-8834 (2009).
  2. Gautam, R. K., Sharma, S. K., Mahiya, S., Chattopadhyaya, M. C. Contamination of heavy metals in aquatic media: transport, toxicity and technologies for remediation. Heavy Metals in Water: Presence, Removal and Safety. Sharma, S. K. , Royal Society of Chemistry. Cambridge. 1-24 (2014).
  3. Chen, C. Y., et al. A critical time for mercury science to inform global policy. Environ Sci Technol. 52 (17), 9556-9561 (2018).
  4. Ali, H., Khan, E., Ilahi, I. Environmental chemistry and ecotoxicology of hazardous heavy metals: environmental persistence, toxicity, and bioaccumulation. J Chem. 2019, 6730305(2019).
  5. Gao, Y., et al. Determination and speciation of mercury in environmental and biological samples by analytical atomic spectrometry. Microchem J. 103, 1-14 (2012).
  6. Ralston, D. M., O'Halloran, T. V. Ultrasensitivity and heavy-metal selectivity of the allosterically modulated MerR transcription complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3846-3850 (1990).
  7. Brown, N. L., Stoyanov, J. V., Kidd, S. P., Hobman, J. L. The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiol Rev. 27 (2-3), 145-163 (2003).
  8. Wang, D., et al. Structural analysis of the Hg(II)-regulatory protein Tn501 MerR from Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 6, 33391(2016).
  9. Nucifora, G., Chu, L., Silver, S., Misra, T. K. Mercury operon regulation by the merR gene of the organomercurial resistance system of plasmid pDU1358. J Bacteriol. 171 (8), 4241-4247 (1989).
  10. Cai, S., et al. Engineering highly sensitive whole-cell mercury biosensors based on positive feedback loops from quorum-sensing systems. Analyst. 143 (3), 630-634 (2018).
  11. Guo, M., et al. Using the promoters of MerR family proteins as "rheostats" to engineer whole-cell heavy metal biosensors with adjustable sensitivity. J Biol Eng. 13, 70(2019).
  12. Wang, D., et al. Engineered cells for selective detection and remediation of Hg2+ based on transcription factor MerR regulated cell surface displayed systems. Biochem Eng J. 150, 107289(2019).
  13. Wang, D., et al. Visual detection of Hg2+ by manipulation of pyocyanin biosynthesis through the Hg2+-dependent transcriptional activator MerR in microbial cells. J Biosci Bioeng. 129 (2), 223-228 (2020).
  14. Guo, Y., Hui, C., Liu, L., Chen, M., Huang, H. Development of a bioavailable Hg(II) sensing system based on MerR-regulated visual pigment biosynthesis. Sci Rep. 11, 13516(2021).
  15. Zevallos-Aliaga, D., et al. Highly sensitive whole-cell mercury biosensors for environmental monitoring. Biosensors. 14 (1), 246(2024).
  16. Zhang, N. -X., et al. Versatile artificial mer operons in Escherichia coli towards whole-cell biosensing and adsorption of mercury. PLoS One. 16 (5), e0252190(2021).
  17. Chen, Y., et al. Advances in bacterial whole-cell biosensors for the detection of bioavailable mercury: a review. Sci Total Environ. 868, 161709(2023).
  18. Chen, S., Chen, X., Su, H., Guo, M., Liu, H. Advances in synthetic-biology-based whole-cell biosensors: principles, genetic modules, and applications in food safety. Int J Mol Sci. 24 (7), 7989(2023).
  19. Yu, W., et al. Genetically encoded biosensors for microbial synthetic biology: From conceptual frameworks to practical applications. Biotechnol Adv. 62, 108077(2023).
  20. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (6), 2000187(2020).
  21. Vaccari, N. A., Zevallos-Aliaga, D., Peeters, T., Guerra, D. G. Biosensors characterisation: Formal methods from the perspective of proteome fractions. Synth Biol. 10 (1), ysaf002(2025).
  22. Liljeruhm, J., et al. Engineering a palette of eukaryotic chromoproteins for bacterial synthetic biology. J Biol Eng. 12, 8(2018).
  23. Alon, U. An Introduction to Systems Biology. , Chapman and Hall/CRC. Boca Raton. (2019).
  24. Lineweaver, H., Burk, D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am Chem Soc. 56 (3), 658-666 (1934).
  25. Wyatt, L., et al. Spatial, temporal, and dietary variables associated with elevated mercury exposure in Peruvian riverine communities upstream and downstream of artisanal and small-scale gold mining. Int J Environ Res Public Health. 14 (12), 1582(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

yonik C va TespitiSu rne i Analizievresel zlemeSens r KalibrasyonuMikrobiyal K lt r Haz rlamaDoz Yan t l mKolorimetrik Biyosens rFlorometrik Biyosens rKirlilik zleme
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.