Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68284

⸱

1 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Endodontics, School of Dentistry, University of Alabama at Birmingham, 3Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University, 4Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Bu makalede

Özet

Bu protokol, sağlam trigeminal ganglion (TG) nöronlarının in vivo GCaMP kalsiyum görüntülemesini tanımlar. Bu tanım, TG maruziyet cerrahisini, TG nöronlarının in vivo konfokal mikroskopi görüntülemesini, TG nöronlarının mikroskobik görüntülemesi sırasında somatik uyaranların uygulanmasını ve in vivo GCaMP kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini içerir.

Özet

Kalsiyum görüntüleme, Ca2 + 'yı sitozole akan veya hücreiçi Ca 2 + depolarından Ca2 + salan sinyal mekanizmalarını izlemek için önemli bir araçtır. Pirt promotör bölgesinin akış aşağısına yerleştirilmiş ve neredeyse tüm (% >95) birincil duyusal nöronlarda eksprese edilen Ca2 + sensör GCaMP3'e sahip Pirt-GCaMP3 farelerinin kullanımı, trigeminal ganglion (TG) birincil duyusal nöronların Ca2+ görüntülemesi yoluyla >3.000 nöronun aktivitesinin eşzamanlı olarak izlenmesine izin verir. Bu, araştırmacıların zararlı uyaranlara ve somatosensoriyel ve hormonal tepkilere karşı sinir ağı tepkilerini in vivo olarak incelemelerine olanak tanır, aksi takdirde diğer yöntemler kullanılarak tespit edilmesi çok zor olacaktır.

Spesifik olarak, yüzü ve başın diğer bölgelerini innerve eden TG alanını ayrı ayrı izleme yeteneği, daha sonraki nöron işleme katmanlarından önce yüz bölgesinin uyaranları tarafından aktive edilen birincil duyusal nöronların izlenmesine izin verir. Farklı duyusal modalitelere duyarlılıklarını gösteren Ca2+ geçici akımları üreten nöronların sayısı ve Ca2+ geçici akımların genliği de gözlemlenebilir. Ek olarak, araştırmacılar, aktive edilen lif tipinin bir göstergesi olan nöronların çapını ölçebilirler (zararlı olmayan mekanik liflere karşı zararlı nosiseptif lifler, Aβ, Aδ ve C lifleri). Bu nedenle, TG'nin Pirt-GCaMP3 kalsiyum görüntülemesi, trigeminal kökenli ağrı (orofasiyal ve kraniofasiyal, diş ve/veya diş ağrısı, baş ağrısı, migren, temporomandibular eklem ağrısı, trigeminal nevralji), kaşıntı ve dokunma ve diğer somatosensation'ların yanı sıra hormonal tepkiler.

Giriş

Birincil duyusal nöronlar, cilt de dahil olmak üzere dokuları doğrudan innerve eder ve duyusal sinyalleri merkezi sinir sistemine (omurilik veya beyin sapı) iletir. Trigeminal ganglion (TG) nöronları başı innerve eder ve dişlerden, periorbital bölgeden, orofasiyal ve kraniyofasiyal bölgelerden, temporomandibular eklem 1,2 ve meninkslerden 3,4,5 gelen ağrı dahil olmak üzere duyusal uyaranlara yanıt verir. TG nöronları büyüklük, miyelinasyon seviyesi ve gen ekspresyon profilleri 6,7,8,9 bakımından farklılık gösterir. Daha küçük nöronlar nosiseptiftir, oysa daha büyük nöronlar genellikle ağrısız mekanik uyaranlara yanıt verir10,11. Trigeminal ganglion nöronlarının disfonksiyonu hem nöronların kendilerini hem de merkezi sinir sistemi (CNS) duyusal nöronlarını hassaslaştırabilir11,12.

Patolojik olmayan koşullarda normal bir fizyolojik bağlamda, nöronların in vivo ateşlenmesi ağrı için gereklidir, ancak son yirmi yıla kadar, in vivo sağlam duyusal gangliyonları incelemek için kullanılan araçlar, bir seferde nispeten az sayıda nöronun izlenmesiyle sınırlıydı13. Normalde düşük sitoplazmik kalsiyum konsantrasyonları, aksiyon potansiyelleri sırasında kalsiyum akışı ve kalsiyumun sitoplazmik bir sinyal olarak kullanılması nedeniyle, kalsiyum dinamiği, kalsiyuma duyarlı floresan göstergeler kullanarak in vivo aksiyon potansiyellerini veya hücresel aktiviteyi izlemek için güçlü vekillerdir. Bu yöntemin mantığı, floresan mikroskobunun farelerinperiferik duyusal gangliyonlarında aynı anda yüzlerce ila binlerce nöronda bu göstergeleri aynı anda izleyebilmesidir 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ve Sıçanlar25,26. Bu, in vivo olarak daha sınırlı sayıda nöronu izleyebilen yöntemlere göre güçlü bir avantajdır.

Bu yöntemin amacı, baş ağrısı modellerinde mekanik, sıcaklık, kimyasal ve hormonal uyaranlara yanıt olarak TG'de in vivo sitoplazmik Ca2 + dinamiklerinin doğrudan gözlemlenmesidir 19,23,24. Bu yöntem, orofasiyal bölgedeki ağrı veya diğer somatosensoriyel testlerin tamamlayıcısı olarak kullanılabilir. İn vivo trigeminal Ca2+ görüntüleme, termal ve duyusal kodlamayıkarakterize etmek için kullanılmıştır 19,22, mekanoreseptör sınıflarınıincelemek 27, yeni bir mekanosensitif nöronsınıfı keşfetmek 28, meninksler üzerindeki normal mekanik streslere trigeminal tepkileri izlemek29, hormonların ağrı duyarlılığı üzerindeki etkilerini incelemek24, orofasiyal ağrı modellerini karakterize etmek30ve alkol yoksunluğuna bağlı ağrıya katkıda bulunanları inceleyin23.

Pirt-GCaMP3 fareleri, tüm (% >95) primer duyusal nöronlarda yüksek oranda eksprese edilen Pirt geninin promotör bölgesine yerleştirilmiş Ca2+ sensörü GCaMP3'e sahip oldukları için in vivo nöral aktivitenin izlenmesine izin verir12,18. Bu makale, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak Pirt-GCaMP3 farelerinin sağ tarafındaki TG için in vivo TG cerrahi maruziyeti ve kalsiyum indikatör mikroskobu verilerinin toplanması ve analizi için bir tekniği göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan tüm işlemler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında gerçekleştirilir. Ameliyat sağ kalım değildir. Bu prosedürün 1. ve 2. bölümleri, başlatıldıktan hemen sonra gerçekleştirilmelidir. Bölüm 3 daha sonraki bir tarihte gerçekleştirilebilir.

1. Sağ taraf TG görüntüleme için farenin sabitlenmesi ve ameliyatı

NOT: Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J farelerin18 cinsiyetten bağımsız olarak yetişkin vücut büyüklüğüne (genellikle 8 hafta veya daha büyük) sahip olması gerekir. Bilateral TG görüntüleme mümkündür. Burada listelenen süreler, deneyimli bir teknisyen tarafından yapılan tahminlerdir. Kanama normalden fazlaysa, her verilen süre için birkaç dakika daha uzun sürebilir.

  1. 40 mg / mL ketamin ve 6 mg / mL ksilazin içeren steril bir tuzlu su çözeltisi hazırlayın. Görüntülemeden sonra ameliyat ve ötenazi için yeterli hacim hazırlayın (fare vücut ağırlığının gramı başına en az 9 μL).
    NOT: İn vivo görüntüleme sırasında birçok anestezi türü kullanılmıştır. Dikkat: Ketamin enjekte edildiğinde, yutulduğunda veya gözlerle temas ettiğinde zararlıdır. Dikkatli tutun.
  2. Tüm cerrahi aletleri bir boncuk sterilizatöründe sterilize edin. Aletleri% 70 etanol ile yıkayın.
    NOT: Alternatif olarak, aletleri önceden otoklavlayın.
  3. Ameliyattan 15-25 dakika önce Pirt-GCaMP3 farelerine vücut ağırlığının gramı başına 2.25 μL ketamin / ksilazin (sırasıyla 90 mg / kg ve 13.5 mg / kg ketamin ve ksilazin) i.p. enjekte edin. 120 mg / kg ketamini aşmayın.
  4. 15-25 dakikalık anestezik enjeksiyondan sonra (adım 1.3), farenin cerrahi anestezik düzlemde olduğundan emin olmak için arka pençeyi forseps ile sıkıştırın.
    NOT: Kıstırma, bilinçli bir farede seslendirmeye neden olacak kadar yoğun olmalı, ancak yaralanmaya neden olacak kadar yoğun olmamalıdır. Vücut ısısında bir düşüşü önlemek için fareyi bu adımda gerekenden daha uzun süre bırakmamak önemlidir. Mümkünse kafesi sıcak tutmak yardımcı olur.
  5. Vücut sıcaklığının 37 °C'de tutulduğundan emin olmak için fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve farenin kafasını, başı yaklaşık 15° sola eğik olacak şekilde stereotaktik bir maskeye yerleştirin (Şekil 1A,B).
    NOT: Hem başı stabilize eden hem de izofluran uygulamak için bir yol sağlayan stereotaktik bir maske burada açıklanmaktadır. Bir prosedür izofluran kullanmıyorsa veya stereotaktik bir maske kullanılmıyorsa, hareketi önlemek için başı stabilize etmek için başka bir yöntem kullanılmalıdır.
  6. Kuruluk ve tahrişi önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün, çünkü tahriş trigeminal sinir aktivitesine neden olur.
  7. Farenin kafasının sağ tarafını tıraş edin.
    NOT: Bu adım 90 saniye sürer. Araştırmacı, hayvanı tıraş için ısıtma yastığından kısa bir süre çıkarabilir.
  8. Sağ kulak ile sağ göz arasında 9 mm x 5 mm dikdörtgen bir kesi yapın (Şekil 2A). Kanamayı hemostatik bir sürüntü veya laboratuvar mendili ile durdurun.
    NOT: Bu işlem 2 dakika sürer. Araştırmacı, insizyonu açık tutmak için hemostatik forseps veya ekartör kullanabilir. Bu hayatta kalmayan bir prosedürdür, yani ek temizlik gereksizdir. Bununla birlikte, araştırmacı cerrahi bölgeyi povidon iyot ile sürüntü alabilir. İzin verilen en büyük kesi boyutu verilir. Cerrah yeterince yetenekliyse, doku hasarını en aza indirmek için daha büyük bir kesi yerine daha küçük bir kesi tercih edilir. TG bu dokuyu innerve eder ve hasar görebilir.
  9. Kafatası yüzeyindeki dokuyu (periosteum) gözün tam ventralinden kesin (Şekil 2B).
  10. Bir diş matkabı ve konik fissür TNT bur 31p kullanarak, insizyon bölgesinde ortalanmış dorsal kafatasında yaklaşık 9 mm x 5 mm'lik bir delik açın (Şekil 2C). Frezi kafatası yüzeyine mümkün olduğunca hafif bir şekilde uygulayın.
    NOT: Bu işlem yaklaşık 2 dakika sürer. Cerrah yeterince yetenekliyse, daha büyük bir delik yerine daha küçük bir delik tercih edilir.
  11. TG net bir şekilde görünene kadar başınızı eğin (Şekil 2C). TG'de kanama varsa, kanı aspire edin veya hemostatik bir sürüntü veya laboratuvar mendili ile fitilleyerek kanı alın. Herhangi bir kortikal doku çıkarmadan TG'nin açıkça görülebildiğinden emin olun (Şekil 2C).
    NOT: Nöronlarda sıkıntı belirtisi olmadan TG'yi rutin olarak 3-6 saat veya daha uzun süre görüntüleriz, ancak bir araştırmacı TG'nin kurumasını önlemek için bir lamel veya başka bir örtü yerleştirmeyi seçebilir.
  12. Hayvanı ve ısıtma yastığını mikroskop aşamasına getirin ve farenin burnunu stereotaksik burun konisine yerleştirin. Farenin sürekli izofluran anestezisi alması için oksijen / izofluran hatlarını bağlayın (Şekil 3A).
    NOT: Bu işlem 3 dk sürer. Sürekli izofluran, oksijen tankları, gaz dağıtım tüpleri ve bir anestezi buharlaştırıcısı gerektirir. Periyodik anestezik enjeksiyonları ile prosedür boyunca anesteziyi sürdürmek de mümkündür.
  13. Stereotaksik çerçeveyi, mikroskobun amacı doğrudan kraniyal açıklığın 9 mm üzerinde olacak şekilde konumlandırın (Şekil 3B).
    NOT: Tam mesafe objektife, mikroskoba ve fareye bağlıdır.
  14. Rektal termometreyi yerleştirin. Güç kablosunu rektal termometreye ve ısıtma yastığına bağlayın. Anestezi maskesini% 1 izofluran ile oksijen hattındaki izoflurana bağlayın.

2. TG görüntüleme

NOT: Yeşil (FITC) ayarı 495 nm, emisyon 519 nm, algılama dalga boyu 500-580 nm, GaAsP-Pmt1 görüntüleme cihazı, GaAsP-PMT dedektörü kullanın veya mikroskop için önerilen ayarları kullanın. Yazılım ayarlarının bir özeti için Tablo 1'e bakın.

  1. 5x/0.25 M27 objektif, mikroskop üreticisinin yazılımı ve dikey konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Mikroskopla TG yüzeyini bulun.
    NOT: Objektif seçimi, mikroskop ve araştırmacının tercihine bağlıdır.
  2. TG yüzeyini mümkün olduğunca düz hale getirmek ve odak düzleminde mümkün olan en geniş yüzey alanına sahip olmak için objektif ve burun konisini ayarlayın.
    NOT: Daha düz bir TG, daha keskin bir görüntü sağlar, yazılımın daha keskin filmler oluşturmasına, daha fazla nöron görüntülemesine neden olur ve daha eğimli bir TG'ye kıyasla analizin doğruluğunu basitleştirir ve geliştirir.
  3. Anestezi maskesinden oksijen akışına %1-1.5 izofluran uygulayarak fareyi anestezi altında tutun.
    NOT: Hayvanın anestezi altında kalmasını sağlamak için her 20-30 dakikada bir arka pençeyi sıkıştırarak hayvan prosedür boyunca yakından izlenmelidir. Anesteziyi sürdürmek için gereken izofluran yüzdesi, bireysel fareye bağlı olacaktır. Hayvan bir test tutamağı sırasında hareket ederse, izofluran arttırılmalıdır. Solunum sığlaşırsa, izofluran azaltılmalıdır. DİKKAT: İzofluran solunduğunda zararlıdır ve baş dönmesine veya uyuşukluğa neden olabilir. Solumaktan kaçının ve çalışma alanının yeterli havalandırmaya sahip olduğundan emin olun.
  4. Mikroskobu yükleyin yüksek hızlı tarama protokolü: voksel boyutu 4.160 μm x 4.160 μm x 14 μm, 512 x 512 piksel, 10 optik dilim Z-yığını, 1,02 havadar birim (AU)/33 μm, %15 488 nm lazer gücü/75 mW, piksel süresi 1,52 μs, hat süresi 0,91 ms, kare süresi 465 ms, LSM tarama hızı 8, çift yönlü tarama, GaAsP-PMT dedektör kazancı 550 V, Dijital Kazanç 1.
    NOT: En uygun ayarlar mikroskoplar ve hayvanlar arasında farklılık gösterebilir.
  5. TG'yi 6-8 döngülük kısa aralıklarla tarayın. Bir film oluşturmak ve kareler arasındaki görüntü netliğini ve tutarlılığını kontrol etmek için taramaların ortogonal projeksiyonlarını oluşturun (bir tarama bir film karesi oluşturur). Gerekirse, stereoskopik çerçeve konumunu ve optik kesit kalınlığını ayarlayın ve net, tutarlı bir film oluşturulana kadar bu adımı tekrarlayın.
    NOT: Farenin kafası hareket ederse veya araştırmacı fareyi yeniden konumlandırırsa veya odak düzlemini ayarlarsa bu adım tekrarlanmalıdır.
  6. Mikroskobu yükleyin yüksek çözünürlüklü tarama protokolü: voksel boyutu 0,520 μm x 0,520 μm x 14 μm, 4096 x 4096 piksel, 6 optik dilim Z yığını, 1,02 havadar birim (AU)/33 μm, %20 488 nm lazer gücü/100 mW, piksel süresi 0,52 μs, hat süresi 4,95 ms, kare süresi 20,26 sn, LSM tarama hızı 6, çift yönlü tarama, GaAsP-PMT dedektör kazancı 550 V, dijital kazanç 1.
    NOT: Optimum ayarlar mikroskoba ve hayvana bağlıdır. Hücreler td-Domates ile etiketlenmişse, mikroskobu yeşil kanala ek olarak kırmızı kanal 592 nm uyarma / 614 nm emisyon, algılama dalga boyu 600-700 nm taramak için ayarlayın.
  7. TG'nin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü oluşturun.
    NOT: Bu görüntü, nöronları saymak, loş nöronların çapını ölçmek veya aynı nöronun iki farklı uyarana mı yanıt verdiğini veya iki farklı nöronun yanıt verip vermediğini ayırt etmek için ayrıntılı bir görüntü sağlamak için yararlı olabilir.
  8. Mikroskop yüksek hızlı tarama protokolünü yükleyin (bkz. adım 2.4).
  9. 80 döngü (yaklaşık 10 dakika) için spontan aktiviteyi kaydedin. Ortogonal bir projeksiyon filmi oluşturun ve görüntülerin analiz edilecek kadar net ve tutarlı olup olmadığını kontrol edin.
    NOT: Bu, spontan aktiviteyi analiz etmek için yeterli çerçeve üretir. Sayı, spontan aktivitenin belirli bir deney için ne kadar önemli olduğuna bağlı olarak azaltılabilir veya artırılabilir.
  10. Stimülasyon uygulamak için mikroskobu 15-20 döngü taramaya ayarlayın.
    NOT: Farenin kafasını hareket ettirmemek için uyaranları uygularken dikkatli olun. Uyaran sırasında TG'yi mikronlarda bile hareket ettirmek görüntülemeyi bozabilir. Tarama, döngülerin bir temel, bir uyaran oluşturmasına ve uyaran çıkarıldıktan sonra nöronları gözlemlemesine izin verir.
  11. Bir taban çizgisi oluşturmak için 1-5 döngüleri tamamlanana kadar bekleyin. 6-10 taramaları sırasında stimülasyon uygulayın. Nöronların duyarsızlaşmasını önlemek için her uyarandan sonra en az 5 dakika bekleyin.
    NOT: Her uyaran ayrı bir 15-20 döngü taraması gerektirir. Önce mekanik stimülasyon uygulayın, ardından soğuk, sıcak ve kimyasal stimülasyon uygulayın. Yüksek frekanslı stimülasyondan (yüksek mekanik kuvvet, oda sıcaklığından uzak sıcaklık) önce düşük frekanslı stimülasyon (örneğin, düşük mekanik kuvvet, oda sıcaklığına yakın sıcaklık) uygulayın. Stimülasyon uygularken TG'yi hareket ettirmemeye dikkat edin. Taramalar net bir şekilde duyulabiliyorsa, tarama 5'ten hemen sonra stimülasyon uygulanabilir. Bununla birlikte, tutarlı bir stimülasyon zamanlaması sağlayan herhangi bir yöntem işe yarayacaktır. Teşvik sırası hakkındaki tartışmaya bakın.
  12. TG'nin V2 kısmı tarafından innerve edilen bölgedeki von Frey için, filamenti tutun ve tarama 5'ten hemen sonra tarama 10'dan hemen sonraya kadar gözün altındaki ipsilateral alana ve ağzın üstündeki ipsilateral alana tekrar tekrar uygulayın.
  13. TG'nin V3 kısmı tarafından innerve edilen bölgedeki von Frey için, filamenti tutun ve tarama 5'in bitiminden hemen sonrasından tarama 10'un bitiminden hemen sonrasına kadar kulağın hemen altındaki ipsilateral alana tekrar tekrar uygulayın.
  14. Soğuk ve sıcak uyaranları için, su kabını istenen sıcaklığın biraz altına (soğuk için) veya üstüne (ısı için) soğutun veya ısıtın ve ardından plastik bir transfer pipeti kullanarak taramaya başlayın. Tarama 5'ten hemen sonra transfer pipeti ile uyaranı transfer pipeti ile gözün hemen altında, ağzın üstünde (V2 için) veya kulağın hemen altında (V3 için) ipsilateral alana uygulayın.
    NOT: Sıcaklığın, tarama 5 için istenen sıcaklığın 1 °C içinde olduğundan emin olun. Nöronları duyarsızlaştırmamak için, beher sıcaklığı doğru değilse uyaranı uygulamayın. Bunun yerine, suyu tekrar soğutun veya ısıtın ve tekrar deneyin.
  15. Deneylerin sonunda, tüm duyarlı nöronları aktive etmek ve tanımlamak için döngü 6'dan başlayarak V2 veya V3 alanlarına deri altına 50 mM potasyum klorür enjekte edin.
  16. Tüm uyaranlar uygulandıktan ve kaydedildikten sonra, hayvanı aşırı dozda ketamin / ksilazin (kg ketamin başına 200 mg, kg ksilazin başına 30 mg veya adım 1.1'de hazırlanan çözeltinin g'ı başına 5 μL) ile ötenazi yapın ve ardından dekapitasyon.

3. Analiz protokolü

  1. Sürükle ve bırak seçeneğini kullanarak ortogonal projeksiyon dosyasını açın. Görüntü | Türü | RGB Rengi. İsteğe bağlı: Eklentiler | kavanozlar | Hareket artefaktlarını ve hizalamayı düzeltmek için StackReg.
    NOT: Araştırmacı, tercihine göre görüntü türünü seçebilir. RGB, yayın için renkli görüntülerin oluşturulmasını basitleştirir.
  2. Analiz Et | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi.
  3. Araç çubuğundaki Elips veya Dikdörtgen aracını kullanarak bir ROI çizerek aktif nöronları seçin ve ardından ROI Yöneticisi penceresindeki Ekle düğmesine tıklayarak veya "t" tuşuna basarak ROI dosyasına yerleştirin.
    NOT: ROI dosyalarını sık sık kaydedin. ROI'ler, ROI dosyasını ImageJ'ye sürükleyip bırakarak ve ROI Yöneticisi penceresinin altındaki Tümünü Göster kutusuna tıklanarak geri yüklenebilir. Bir ROI .zip dosyasını kaydetmek, ROI'leri bir katman olarak kaydetmeye kıyasla analizi basitleştirir. Başlangıç döneminde dalgalanan bir nöron, uyarana yanıt vermek yerine kendiliğinden aktif olarak dışlanmalıdır.
  4. İçinde Analiz | Ölçüm Ayarları, Ortalama Gri Değer'i işaretleyin (isteğe bağlıdır, ancak önerilir: Ölçüm Ayarları altındaki diğer tüm kutuların işaretini kaldırın).
  5. Daha Fazla | Yoğunluğu ölçmek için Çoklu Ölçüm.
    NOT: Bazen, bitişik nöronlar ayrı bir ROI çekmek için çok yakındır. Bu nöronlar aktif nöron sayısına dahil edilebilir, ancak geçici yoğunluk ölçümlerine dahil edilemez.
  6. Çoklu ölçüm, "Sonuçlar" etiketli yeni bir pencerede bir CSV dosyası oluşturur. Dosya | Farklı Kaydet'i tıklayın. .csv dosyasını elektronik tablo yazılımıyla açın ve dosyayı bir elektronik tablo olarak kaydedin.
    NOT: Analiz şablonu için Ek Dosya 1'e bakın.
  7. Ca2+ geçici yoğunluğunu ΔF/F0 = (Ft- F0)/F0 olarak hesaplayın, burada Ft , ilgilenilen zaman noktasındaki ROI'deki piksel yoğunluğudur ve F0 , spontan aktivite için Ca2+ geçici durumundan önceki 2-4 karenin veya uyaranın neden olduğu Ca2+ geçici durumlar için ilk 1-5 karenin ortalama yoğunluğu tarafından belirlenen temel yoğunluktur. Stimülasyondan önce Ca2+ pikleri oluşturan tüm nöronları hariç tutun ve stimülasyondan sonra aktiviteyi analiz etmeyin.
  8. Ca2+ geçici yoğunluk analizi için, en fazla sayıda yanıt veren nöronu oluşturan ganglionların analize hakim olmasını önlemek için her gangliondan yaklaşık olarak aynı sayıda nöronu rastgele örnekleyin. ΔF/F0 < 0.15 ile tepe noktalarını hariç tutun.
    NOT: 15,16,19,22,32,33,34,35 nöronlarını analiz etmek ve dahil etmek ve hariç tutmak için yayınlanmış alternatif yöntemler vardır.
  9. Araç çubuğundaki Çizgi aracını kullanarak ImageJ'de en uzun ve en kısa çaplar boyunca çizilen bir çizginin ortalama uzunluğunu hesaplayarak nöron çapını ölçün.
    NOT: Bir araştırmacı, çapı tahmin etmek için ROI'lerin alanını ve eliptik parametrelerini de ölçebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Pirt-GCaMP trigeminal ganglionunun konfokal taraması ile çok sayıda nöronun ve spesifik trigeminal dalların görüntülenmesi
Pirt-GCaMP3 farelerinde cerrahi TG maruziyetinden sonra, konfokal mikroskopi aynı anda >3.000'den fazla nöronun görüntülenmesine izin verir (Şekil 4). Bu, binlerce TG nöronunu normal fizyolojik bağlamlarında aynı anda gözlemlemenin güçlü avantajını sağlar. Stimülasyon yokluğunda spontan Ca2+ geçişleri izlenebilir (Şe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Temporomandibular eklem ve apikal periodontitis ağrı bozuklukları genel popülasyonun sırasıyla yaklaşık %5'ini36 ve %30-70'ini37,38 etkiler. Birincil duyusal nöronlar cilt, ağız mukozası, dişler ve periorbital bölgelerdeki zararlı uyaranları algılar ve plastisiteleri kalıcı ağrıya katkıda bulunur. Hücre kültürü ve eksplantlar, nöronları incelemek için kullanılabilir, ancak normal fizyolojik bağlamlarından ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibeleri R01NS0128574 ve R01DE031477 (YSK'ye) ve Texas Üniversitesi sisteminden (YSK) Yükselen Yıldız Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anased Enjeksiyon (Ksilazin)Covetrus, Akorn33197
Flurar 5x/0.25 M27 obejctiveCal Zeiss420130-9900-000
Pamuk Uçlu AplikatörlerMcKesson'ın24-106-1S
Eğri Kanama DurdurucuGüzel Bilim Araçları13007-12
DC Sıcaklık Kontrol CihazıFHC40-90-8D
DC Sıcaklık Kontrol Cihazı Isıtma YastığıFHC40-90-2-05
Dumont Seramik Kaplı ForsepsGüzel Bilim Araçları11252-50
FHC DC Sıcaklık Kontrol CihazıFHC40-90-8D
Fluriso (İzofluran)MWI Hayvan Sağlığı, Piramal Group501017
Friedman-Pearson RongeursGüzel Bilim Araçları16221-14
Jel KöpükPfizer09-0353-01
ResimJUlusal Sağlık Enstitüleriij153
Ketaset (Ketamin)ZoetisKET-00002R2
Model 923-B Fare Gaz Anestezi Başlık Tutucu (Yetişkin fare)Kopf Aletleri923-B
Işıldayan Yeşil Sahne BandıJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
M35 Kompakt Elektrikli Laboratuvar El Aleti SistemiBuffalo Diş İmalat A.Ş.M35 Serisi
Matrx VIP 3000 İzofluran BuharlaştırıcıOrta işaret91305430
Mikro diseksiyon makasıRobozRS-5882 Serisi
Mikro diseksiyon yaylı makasGüzel Bilim Araçları15023-10
Mikro diseksiyon yaylı makasRobozRS-5677 Serisi
Mini Rektal Termistör ProbuFHC40-90-5D-02
Çalıştırma makasıRobozRS-6812 Serisi
Pirt-GCaMP3 C57/BL/6J farelerJohns Hopkins ÜniversitesiYOKHer iki cinsiyet de eşit derecede iyi görüntülenebilir. Genç farelerde zayıf veya aralıklı Pirt promotör ekspresyonu nedeniyle fareler en az 8 haftalık olmalıdır.
Potasyum klorürFisher BilimselBP366-500 Serisi
Stereotaksik çerçeveKopf Modeli 923-B923-B
Fareler için sterotaktik maske (aktif) < 30g tüplerle birlikteRWD Yaşam Bilimleri68663
Konik Çatlak TNT Bur (31P)Buffalo Diş İmalat A.Ş.31P-ALTIN
td-Domates C57BL/6J farelerJackson Laboratuvarı7909
Üst Plaka, 6 inç x 10 inçNewport290-TP
Transfer pipeti, 3 mLCole ParmerKullanıcı Deneyimi-06226-23
TrpV1-Cre C57BL/6J farelerJackson Laboratuvarı17769
Zeiss LSM 800 konfokal mikroskopCal ZeissLSM800 Serisi
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition YazılımıCal ZeissZen (Mavi Sürüm) 2.6

Kaynaklar

  1. Kuramoto, E., et al. Three-dimensional topography of rat trigeminal ganglion neurons using a combination of retrograde labeling and tissue-clearing techniques. J Comp Neurol. 532 (2), e25584(2024).
  2. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. Int J Mol Sci. 22 (11), 5810(2021).
  3. Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., Strassman, A. M. Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache. Pain. 130 (1-2), 166-176 (2007).
  4. Moskowitz, M. A., Macfarlane, R. Neurovascular and molecular mechanisms in migraine headaches. Cerebrovasc Brain Metab Rev. 5 (3), 159-177 (1993).
  5. Strassman, A. M., Raymond, S. A., Burstein, R. Sensitization of meningeal sensory neurons and the origin of headaches. Nature. 384 (6609), 560-564 (1996).
  6. Avraham, O., et al. Profiling sensory neuron microenvironment after peripheral and central axon injury reveals key pathways for neural repair. Elife. 10, e68457(2021).
  7. Bhuiyan, S. A., et al. Harmonized cross-species cell atlases of trigeminal and dorsal root ganglia. Sci Adv. 10 (25), eadj9173(2024).
  8. Chu, Y., et al. Single-cell transcriptomic profile of satellite glial cells in trigeminal ganglion. Front Mol Neurosci. 16, 1117065(2023).
  9. Mapps, A. A., et al. Diversity of satellite glia in sympathetic and sensory ganglia. Cell Rep. 38 (5), 110328(2022).
  10. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Curr Biol. 9 (12), R429-R431 (1999).
  11. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  12. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of trpv1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  13. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  14. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Sci Rep. 9 (1), 7651(2019).
  15. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., Mcmahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  16. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Sci Adv. 2 (11), e1600990(2016).
  17. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. J Neurosci. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  18. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  19. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: Modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. J Physiol. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  20. Macdonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  23. Son, H., et al. Mast-cell-specific receptor mediates alcohol-withdrawal-associated headache in male mice. Neuron. 112 (1), 113-123.e4 (2024).
  24. Son, H., Zhang, Y., Shannonhouse, J., Gomez, R., Kim, Y. S. PACAP38/mast-cell-specific receptor axis mediates repetitive stress-induced headache in mice. J Headache Pain. 25 (1), 87(2024).
  25. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  26. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  27. Moayedi, Y., et al. The cellular basis of mechanosensation in mammalian tongue. Cell Rep. 42 (2), 112087(2023).
  28. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954.e4 (2017).
  29. Blaeser, A. S., et al. Trigeminal afferents sense locomotion-related meningeal deformations. Cell Rep. 41 (7), 111648(2022).
  30. Son, H., et al. Elucidation of neuronal activity in mouse models of temporomandibular joint injury and inflammation by in vivo GCaMP Ca2+ imaging of intact trigeminal ganglion neurons. Pain. 165 (12), 2794-2803 (2024).
  31. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  32. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  33. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nat Commun. 7, 11450(2016).
  34. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nat Commun. 6, 8171(2015).
  35. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nat Neurosci. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  36. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine 2020. Temporomandibular disorders: Priorities for research and care. Yost, O., Liverman, C. T., English, R., Mackey, S., Bond, E. C. , The National Academic Press. Washington, DC. (2020).
  37. Eriksen, H. M. Endodontology--epidemiologic considerations. Endod Dent Traumatol. 7 (5), 189-195 (1991).
  38. Sidaravicius, B., Aleksejuniene, J., Eriksen, H. M. Endodontic treatment and prevalence of apical periodontitis in an adult population of vilnius, lithuania. Endod Dent Traumatol. 15 (5), 210-215 (1999).
  39. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Nav1.8-positive and Nav1.8-negative sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  40. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. (192), e64826(2023).
  41. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca2+ activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J Neurosci. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  42. Zheng, Q., et al. Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain. Neuron. 110 (2), 209-220.e6 (2022).
  43. Mahadevan, A. S., et al. Cytonet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Comput Biol. 18 (6), e1009846(2022).
  44. Chen, C., et al. Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice. Nat Commun. 10 (1), 3087(2019).
  45. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca2+ responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. J Pharmacol Sci. 137 (1), 101-104 (2018).
  46. Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
  47. Li, J., et al. Engineering of nemo as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
  48. Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nat Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
  49. Tan, C. H., Mcnaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  50. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nat Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  51. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  52. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  53. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with genetically-encoded voltage indicator, ASAP4.4-kv. bioRxiv. , (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Trigeminal GangliyonIn Vivo GörüntülemeGCaMP3 FareleriKonfokal GörüntülemeDuyusal ModalitelerVon Frey StimülasyonuKalsiyum Geçici Değişimleri
In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.