In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

Birincil duyusal nöronlar, cilt de dahil olmak üzere dokuları doğrudan innerve eder ve duyusal sinyalleri merkezi sinir sistemine (omurilik veya beyin sapı) iletir. Trigeminal ganglion (TG) nöronları başı innerve eder ve dişlerden, periorbital bölgeden, orofasiyal ve kraniyofasiyal bölgelerden, temporomandibular eklem ^1,2 ve meninkslerden ^3,4,5 gelen ağrı dahil olmak üzere duyusal uyaranlara yanıt verir. TG nöronları büyüklük, miyelinasyon seviyesi ve gen ekspresyon profilleri 6,7,8,9 bakımından farklılık gösterir. Daha küçük nöronlar nosiseptiftir, oysa daha büyük nöronlar genellikle ağrısız mekanik uyaranlara yanıt verir^10,11. Trigeminal ganglion nöronlarının disfonksiyonu hem nöronların kendilerini hem de merkezi sinir sistemi (CNS) duyusal nöronlarını hassaslaştırabilir^11,12.

Patolojik olmayan koşullarda normal bir fizyolojik bağlamda, nöronların in vivo ateşlenmesi ağrı için gereklidir, ancak son yirmi yıla kadar, in vivo sağlam duyusal gangliyonları incelemek için kullanılan araçlar, bir seferde nispeten az sayıda nöronun izlenmesiyle sınırlıydı¹³. Normalde düşük sitoplazmik kalsiyum konsantrasyonları, aksiyon potansiyelleri sırasında kalsiyum akışı ve kalsiyumun sitoplazmik bir sinyal olarak kullanılması nedeniyle, kalsiyum dinamiği, kalsiyuma duyarlı floresan göstergeler kullanarak in vivo aksiyon potansiyellerini veya hücresel aktiviteyi izlemek için güçlü vekillerdir. Bu yöntemin mantığı, floresan mikroskobunun farelerin^periferik duyusal gangliyonlarında aynı anda yüzlerce ila binlerce nöronda bu göstergeleri aynı anda izleyebilmesidir 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ve Sıçanlar^25,26. Bu, in vivo olarak daha sınırlı sayıda nöronu izleyebilen yöntemlere göre güçlü bir avantajdır.

Bu yöntemin amacı, baş ağrısı modellerinde mekanik, sıcaklık, kimyasal ve hormonal uyaranlara yanıt olarak TG'de in vivo sitoplazmik Ca^{2 +} dinamiklerinin doğrudan gözlemlenmesidir 19,23,24. Bu yöntem, orofasiyal bölgedeki ağrı veya diğer somatosensoriyel testlerin tamamlayıcısı olarak kullanılabilir. İn vivo trigeminal Ca²⁺ görüntüleme, termal ve duyusal kodlamayı^{karakterize etmek için kullanılmıştır 19,22}, mekanoreseptör sınıflarını^{incelemek 27}, yeni bir mekanosensitif nöron^{sınıfı keşfetmek 28}, meninksler üzerindeki normal mekanik streslere trigeminal tepkileri izlemek²⁹, hormonların ağrı duyarlılığı üzerindeki etkilerini incelemek²⁴, orofasiyal ağrı modellerini karakterize etmek³⁰ve alkol yoksunluğuna bağlı ağrıya katkıda bulunanları inceleyin²³.

Pirt-GCaMP3 fareleri, tüm (% >95) primer duyusal nöronlarda yüksek oranda eksprese edilen Pirt geninin promotör bölgesine yerleştirilmiş Ca²⁺ sensörü GCaMP3'e sahip oldukları için in vivo nöral aktivitenin izlenmesine izin verir^12,18. Bu makale, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak Pirt-GCaMP3 farelerinin sağ tarafındaki TG için in vivo TG cerrahi maruziyeti ve kalsiyum indikatör mikroskobu verilerinin toplanması ve analizi için bir tekniği göstermektedir.

Burada açıklanan tüm işlemler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında gerçekleştirilir. Ameliyat sağ kalım değildir. Bu prosedürün 1. ve 2. bölümleri, başlatıldıktan hemen sonra gerçekleştirilmelidir. Bölüm 3 daha sonraki bir tarihte gerçekleştirilebilir.

1. Sağ taraf TG görüntüleme için farenin sabitlenmesi ve ameliyatı

NOT: Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J farelerin¹⁸ cinsiyetten bağımsız olarak yetişkin vücut büyüklüğüne (genellikle 8 hafta veya daha büyük) sahip olması gerekir. Bilateral TG görüntüleme mümkündür. Burada listelenen süreler, deneyimli bir teknisyen tarafından yapılan tahminlerdir. Kanama normalden fazlaysa, her verilen süre için birkaç dakika daha uzun sürebilir.

1. 40 mg / mL ketamin ve 6 mg / mL ksilazin içeren steril bir tuzlu su çözeltisi hazırlayın. Görüntülemeden sonra ameliyat ve ötenazi için yeterli hacim hazırlayın (fare vücut ağırlığının gramı başına en az 9 μL).
   NOT: İn vivo görüntüleme sırasında birçok anestezi türü kullanılmıştır. Dikkat: Ketamin enjekte edildiğinde, yutulduğunda veya gözlerle temas ettiğinde zararlıdır. Dikkatli tutun.
2. Tüm cerrahi aletleri bir boncuk sterilizatöründe sterilize edin. Aletleri% 70 etanol ile yıkayın.
   NOT: Alternatif olarak, aletleri önceden otoklavlayın.
3. Ameliyattan 15-25 dakika önce Pirt-GCaMP3 farelerine vücut ağırlığının gramı başına 2.25 μL ketamin / ksilazin (sırasıyla 90 mg / kg ve 13.5 mg / kg ketamin ve ksilazin) i.p. enjekte edin. 120 mg / kg ketamini aşmayın.
4. 15-25 dakikalık anestezik enjeksiyondan sonra (adım 1.3), farenin cerrahi anestezik düzlemde olduğundan emin olmak için arka pençeyi forseps ile sıkıştırın.
   NOT: Kıstırma, bilinçli bir farede seslendirmeye neden olacak kadar yoğun olmalı, ancak yaralanmaya neden olacak kadar yoğun olmamalıdır. Vücut ısısında bir düşüşü önlemek için fareyi bu adımda gerekenden daha uzun süre bırakmamak önemlidir. Mümkünse kafesi sıcak tutmak yardımcı olur.
5. Vücut sıcaklığının 37 °C'de tutulduğundan emin olmak için fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve farenin kafasını, başı yaklaşık 15° sola eğik olacak şekilde stereotaktik bir maskeye yerleştirin (Şekil 1A,B).
   NOT: Hem başı stabilize eden hem de izofluran uygulamak için bir yol sağlayan stereotaktik bir maske burada açıklanmaktadır. Bir prosedür izofluran kullanmıyorsa veya stereotaktik bir maske kullanılmıyorsa, hareketi önlemek için başı stabilize etmek için başka bir yöntem kullanılmalıdır.
6. Kuruluk ve tahrişi önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün, çünkü tahriş trigeminal sinir aktivitesine neden olur.
7. Farenin kafasının sağ tarafını tıraş edin.
   NOT: Bu adım 90 saniye sürer. Araştırmacı, hayvanı tıraş için ısıtma yastığından kısa bir süre çıkarabilir.
8. Sağ kulak ile sağ göz arasında 9 mm x 5 mm dikdörtgen bir kesi yapın (Şekil 2A). Kanamayı hemostatik bir sürüntü veya laboratuvar mendili ile durdurun.
   NOT: Bu işlem 2 dakika sürer. Araştırmacı, insizyonu açık tutmak için hemostatik forseps veya ekartör kullanabilir. Bu hayatta kalmayan bir prosedürdür, yani ek temizlik gereksizdir. Bununla birlikte, araştırmacı cerrahi bölgeyi povidon iyot ile sürüntü alabilir. İzin verilen en büyük kesi boyutu verilir. Cerrah yeterince yetenekliyse, doku hasarını en aza indirmek için daha büyük bir kesi yerine daha küçük bir kesi tercih edilir. TG bu dokuyu innerve eder ve hasar görebilir.
9. Kafatası yüzeyindeki dokuyu (periosteum) gözün tam ventralinden kesin (Şekil 2B).
10. Bir diş matkabı ve konik fissür TNT bur 31p kullanarak, insizyon bölgesinde ortalanmış dorsal kafatasında yaklaşık 9 mm x 5 mm'lik bir delik açın (Şekil 2C). Frezi kafatası yüzeyine mümkün olduğunca hafif bir şekilde uygulayın.
    NOT: Bu işlem yaklaşık 2 dakika sürer. Cerrah yeterince yetenekliyse, daha büyük bir delik yerine daha küçük bir delik tercih edilir.
11. TG net bir şekilde görünene kadar başınızı eğin (Şekil 2C). TG'de kanama varsa, kanı aspire edin veya hemostatik bir sürüntü veya laboratuvar mendili ile fitilleyerek kanı alın. Herhangi bir kortikal doku çıkarmadan TG'nin açıkça görülebildiğinden emin olun (Şekil 2C).
    NOT: Nöronlarda sıkıntı belirtisi olmadan TG'yi rutin olarak 3-6 saat veya daha uzun süre görüntüleriz, ancak bir araştırmacı TG'nin kurumasını önlemek için bir lamel veya başka bir örtü yerleştirmeyi seçebilir.
12. Hayvanı ve ısıtma yastığını mikroskop aşamasına getirin ve farenin burnunu stereotaksik burun konisine yerleştirin. Farenin sürekli izofluran anestezisi alması için oksijen / izofluran hatlarını bağlayın (Şekil 3A).
    NOT: Bu işlem 3 dk sürer. Sürekli izofluran, oksijen tankları, gaz dağıtım tüpleri ve bir anestezi buharlaştırıcısı gerektirir. Periyodik anestezik enjeksiyonları ile prosedür boyunca anesteziyi sürdürmek de mümkündür.
13. Stereotaksik çerçeveyi, mikroskobun amacı doğrudan kraniyal açıklığın 9 mm üzerinde olacak şekilde konumlandırın (Şekil 3B).
    NOT: Tam mesafe objektife, mikroskoba ve fareye bağlıdır.
14. Rektal termometreyi yerleştirin. Güç kablosunu rektal termometreye ve ısıtma yastığına bağlayın. Anestezi maskesini% 1 izofluran ile oksijen hattındaki izoflurana bağlayın.

2. TG görüntüleme

NOT: Yeşil (FITC) ayarı 495 nm, emisyon 519 nm, algılama dalga boyu 500-580 nm, GaAsP-Pmt1 görüntüleme cihazı, GaAsP-PMT dedektörü kullanın veya mikroskop için önerilen ayarları kullanın. Yazılım ayarlarının bir özeti için Tablo 1'e bakın.

1. 5x/0.25 M27 objektif, mikroskop üreticisinin yazılımı ve dikey konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Mikroskopla TG yüzeyini bulun.
   NOT: Objektif seçimi, mikroskop ve araştırmacının tercihine bağlıdır.
2. TG yüzeyini mümkün olduğunca düz hale getirmek ve odak düzleminde mümkün olan en geniş yüzey alanına sahip olmak için objektif ve burun konisini ayarlayın.
   NOT: Daha düz bir TG, daha keskin bir görüntü sağlar, yazılımın daha keskin filmler oluşturmasına, daha fazla nöron görüntülemesine neden olur ve daha eğimli bir TG'ye kıyasla analizin doğruluğunu basitleştirir ve geliştirir.
3. Anestezi maskesinden oksijen akışına %1-1.5 izofluran uygulayarak fareyi anestezi altında tutun.
   NOT: Hayvanın anestezi altında kalmasını sağlamak için her 20-30 dakikada bir arka pençeyi sıkıştırarak hayvan prosedür boyunca yakından izlenmelidir. Anesteziyi sürdürmek için gereken izofluran yüzdesi, bireysel fareye bağlı olacaktır. Hayvan bir test tutamağı sırasında hareket ederse, izofluran arttırılmalıdır. Solunum sığlaşırsa, izofluran azaltılmalıdır. DİKKAT: İzofluran solunduğunda zararlıdır ve baş dönmesine veya uyuşukluğa neden olabilir. Solumaktan kaçının ve çalışma alanının yeterli havalandırmaya sahip olduğundan emin olun.
4. Mikroskobu yükleyin yüksek hızlı tarama protokolü: voksel boyutu 4.160 μm x 4.160 μm x 14 μm, 512 x 512 piksel, 10 optik dilim Z-yığını, 1,02 havadar birim (AU)/33 μm, %15 488 nm lazer gücü/75 mW, piksel süresi 1,52 μs, hat süresi 0,91 ms, kare süresi 465 ms, LSM tarama hızı 8, çift yönlü tarama, GaAsP-PMT dedektör kazancı 550 V, Dijital Kazanç 1.
   NOT: En uygun ayarlar mikroskoplar ve hayvanlar arasında farklılık gösterebilir.
5. TG'yi 6-8 döngülük kısa aralıklarla tarayın. Bir film oluşturmak ve kareler arasındaki görüntü netliğini ve tutarlılığını kontrol etmek için taramaların ortogonal projeksiyonlarını oluşturun (bir tarama bir film karesi oluşturur). Gerekirse, stereoskopik çerçeve konumunu ve optik kesit kalınlığını ayarlayın ve net, tutarlı bir film oluşturulana kadar bu adımı tekrarlayın.
   NOT: Farenin kafası hareket ederse veya araştırmacı fareyi yeniden konumlandırırsa veya odak düzlemini ayarlarsa bu adım tekrarlanmalıdır.
6. Mikroskobu yükleyin yüksek çözünürlüklü tarama protokolü: voksel boyutu 0,520 μm x 0,520 μm x 14 μm, 4096 x 4096 piksel, 6 optik dilim Z yığını, 1,02 havadar birim (AU)/33 μm, %20 488 nm lazer gücü/100 mW, piksel süresi 0,52 μs, hat süresi 4,95 ms, kare süresi 20,26 sn, LSM tarama hızı 6, çift yönlü tarama, GaAsP-PMT dedektör kazancı 550 V, dijital kazanç 1.
   NOT: Optimum ayarlar mikroskoba ve hayvana bağlıdır. Hücreler td-Domates ile etiketlenmişse, mikroskobu yeşil kanala ek olarak kırmızı kanal 592 nm uyarma / 614 nm emisyon, algılama dalga boyu 600-700 nm taramak için ayarlayın.
7. TG'nin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü oluşturun.
   NOT: Bu görüntü, nöronları saymak, loş nöronların çapını ölçmek veya aynı nöronun iki farklı uyarana mı yanıt verdiğini veya iki farklı nöronun yanıt verip vermediğini ayırt etmek için ayrıntılı bir görüntü sağlamak için yararlı olabilir.
8. Mikroskop yüksek hızlı tarama protokolünü yükleyin (bkz. adım 2.4).
9. 80 döngü (yaklaşık 10 dakika) için spontan aktiviteyi kaydedin. Ortogonal bir projeksiyon filmi oluşturun ve görüntülerin analiz edilecek kadar net ve tutarlı olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Bu, spontan aktiviteyi analiz etmek için yeterli çerçeve üretir. Sayı, spontan aktivitenin belirli bir deney için ne kadar önemli olduğuna bağlı olarak azaltılabilir veya artırılabilir.
10. Stimülasyon uygulamak için mikroskobu 15-20 döngü taramaya ayarlayın.
    NOT: Farenin kafasını hareket ettirmemek için uyaranları uygularken dikkatli olun. Uyaran sırasında TG'yi mikronlarda bile hareket ettirmek görüntülemeyi bozabilir. Tarama, döngülerin bir temel, bir uyaran oluşturmasına ve uyaran çıkarıldıktan sonra nöronları gözlemlemesine izin verir.
11. Bir taban çizgisi oluşturmak için 1-5 döngüleri tamamlanana kadar bekleyin. 6-10 taramaları sırasında stimülasyon uygulayın. Nöronların duyarsızlaşmasını önlemek için her uyarandan sonra en az 5 dakika bekleyin.
    NOT: Her uyaran ayrı bir 15-20 döngü taraması gerektirir. Önce mekanik stimülasyon uygulayın, ardından soğuk, sıcak ve kimyasal stimülasyon uygulayın. Yüksek frekanslı stimülasyondan (yüksek mekanik kuvvet, oda sıcaklığından uzak sıcaklık) önce düşük frekanslı stimülasyon (örneğin, düşük mekanik kuvvet, oda sıcaklığına yakın sıcaklık) uygulayın. Stimülasyon uygularken TG'yi hareket ettirmemeye dikkat edin. Taramalar net bir şekilde duyulabiliyorsa, tarama 5'ten hemen sonra stimülasyon uygulanabilir. Bununla birlikte, tutarlı bir stimülasyon zamanlaması sağlayan herhangi bir yöntem işe yarayacaktır. Teşvik sırası hakkındaki tartışmaya bakın.
12. TG'nin V2 kısmı tarafından innerve edilen bölgedeki von Frey için, filamenti tutun ve tarama 5'ten hemen sonra tarama 10'dan hemen sonraya kadar gözün altındaki ipsilateral alana ve ağzın üstündeki ipsilateral alana tekrar tekrar uygulayın.
13. TG'nin V3 kısmı tarafından innerve edilen bölgedeki von Frey için, filamenti tutun ve tarama 5'in bitiminden hemen sonrasından tarama 10'un bitiminden hemen sonrasına kadar kulağın hemen altındaki ipsilateral alana tekrar tekrar uygulayın.
14. Soğuk ve sıcak uyaranları için, su kabını istenen sıcaklığın biraz altına (soğuk için) veya üstüne (ısı için) soğutun veya ısıtın ve ardından plastik bir transfer pipeti kullanarak taramaya başlayın. Tarama 5'ten hemen sonra transfer pipeti ile uyaranı transfer pipeti ile gözün hemen altında, ağzın üstünde (V2 için) veya kulağın hemen altında (V3 için) ipsilateral alana uygulayın.
    NOT: Sıcaklığın, tarama 5 için istenen sıcaklığın 1 °C içinde olduğundan emin olun. Nöronları duyarsızlaştırmamak için, beher sıcaklığı doğru değilse uyaranı uygulamayın. Bunun yerine, suyu tekrar soğutun veya ısıtın ve tekrar deneyin.
15. Deneylerin sonunda, tüm duyarlı nöronları aktive etmek ve tanımlamak için döngü 6'dan başlayarak V2 veya V3 alanlarına deri altına 50 mM potasyum klorür enjekte edin.
16. Tüm uyaranlar uygulandıktan ve kaydedildikten sonra, hayvanı aşırı dozda ketamin / ksilazin (kg ketamin başına 200 mg, kg ksilazin başına 30 mg veya adım 1.1'de hazırlanan çözeltinin g'ı başına 5 μL) ile ötenazi yapın ve ardından dekapitasyon.

3. Analiz protokolü

1. Sürükle ve bırak seçeneğini kullanarak ortogonal projeksiyon dosyasını açın. Görüntü | Türü | RGB Rengi. İsteğe bağlı: Eklentiler | kavanozlar | Hareket artefaktlarını ve hizalamayı düzeltmek için StackReg.
   NOT: Araştırmacı, tercihine göre görüntü türünü seçebilir. RGB, yayın için renkli görüntülerin oluşturulmasını basitleştirir.
2. Analiz Et | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi.
3. Araç çubuğundaki Elips veya Dikdörtgen aracını kullanarak bir ROI çizerek aktif nöronları seçin ve ardından ROI Yöneticisi penceresindeki Ekle düğmesine tıklayarak veya "t" tuşuna basarak ROI dosyasına yerleştirin.
   NOT: ROI dosyalarını sık sık kaydedin. ROI'ler, ROI dosyasını ImageJ'ye sürükleyip bırakarak ve ROI Yöneticisi penceresinin altındaki Tümünü Göster kutusuna tıklanarak geri yüklenebilir. Bir ROI .zip dosyasını kaydetmek, ROI'leri bir katman olarak kaydetmeye kıyasla analizi basitleştirir. Başlangıç döneminde dalgalanan bir nöron, uyarana yanıt vermek yerine kendiliğinden aktif olarak dışlanmalıdır.
4. İçinde Analiz | Ölçüm Ayarları, Ortalama Gri Değer'i işaretleyin (isteğe bağlıdır, ancak önerilir: Ölçüm Ayarları altındaki diğer tüm kutuların işaretini kaldırın).
5. Daha Fazla | Yoğunluğu ölçmek için Çoklu Ölçüm.
   NOT: Bazen, bitişik nöronlar ayrı bir ROI çekmek için çok yakındır. Bu nöronlar aktif nöron sayısına dahil edilebilir, ancak geçici yoğunluk ölçümlerine dahil edilemez.
6. Çoklu ölçüm, "Sonuçlar" etiketli yeni bir pencerede bir CSV dosyası oluşturur. Dosya | Farklı Kaydet'i tıklayın. .csv dosyasını elektronik tablo yazılımıyla açın ve dosyayı bir elektronik tablo olarak kaydedin.
   NOT: Analiz şablonu için Ek Dosya 1'e bakın.
7. Ca²⁺ geçici yoğunluğunu ΔF/F₀ = (F_t- F₀)/F₀ olarak hesaplayın, burada F_t , ilgilenilen zaman noktasındaki ROI'deki piksel yoğunluğudur ve F₀ , spontan aktivite için Ca²⁺ geçici durumundan önceki 2-4 karenin veya uyaranın neden olduğu Ca²⁺ geçici durumlar için ilk 1-5 karenin ortalama yoğunluğu tarafından belirlenen temel yoğunluktur. Stimülasyondan önce Ca²⁺ pikleri oluşturan tüm nöronları hariç tutun ve stimülasyondan sonra aktiviteyi analiz etmeyin.
8. Ca²⁺ geçici yoğunluk analizi için, en fazla sayıda yanıt veren nöronu oluşturan ganglionların analize hakim olmasını önlemek için her gangliondan yaklaşık olarak aynı sayıda nöronu rastgele örnekleyin. ΔF/F₀ < 0.15 ile tepe noktalarını hariç tutun.
   NOT: ^{15,16,19,22,32,33,34,35} nöronlarını analiz etmek ve dahil etmek ve hariç tutmak için yayınlanmış alternatif yöntemler vardır.
9. Araç çubuğundaki Çizgi aracını kullanarak ImageJ'de en uzun ve en kısa çaplar boyunca çizilen bir çizginin ortalama uzunluğunu hesaplayarak nöron çapını ölçün.
   NOT: Bir araştırmacı, çapı tahmin etmek için ROI'lerin alanını ve eliptik parametrelerini de ölçebilir.

Pirt-GCaMP trigeminal ganglionunun konfokal taraması ile çok sayıda nöronun ve spesifik trigeminal dalların görüntülenmesi
Pirt-GCaMP3 farelerinde cerrahi TG maruziyetinden sonra, konfokal mikroskopi aynı anda >3.000'den fazla nöronun görüntülenmesine izin verir (Şekil 4). Bu, binlerce TG nöronunu normal fizyolojik bağlamlarında aynı anda gözlemlemenin güçlü avantajını sağlar. Stimülasyon yokluğunda spontan Ca2+ geçişleri izlenebilir (Şekil 4A,B ve Video 1). Uyaranlar, V2 (Şekil 4D, E ve Video 2) veya V3 (Şekil 4G, H ve Video 3) tarafından innerve edilen alanlara uygulanabilir. Spontan Ca2+ geçişleri (Şekil 4C) ve bu uyaranlara yanıt olarak ortaya çıkan geçici akımlar (Şekil 4F ve Şekil 4I) izlenebilir.

Daha güçlü uyaranlar nedeniyle Ca2+ geçici akımları üreten hücre sayısının artması ve Ca2+ geçici akımların genliğinin artması
Güçlü stimülasyon veya zararlı ısı,Ca2+ tepkilerini artırır. 0.4 g von Frey filamentleri ile karşılaştırıldığında, 2 g filamentlerin uygulanması Ca2 + geçici akımları oluşturan nöron sayısını artırdı (Şekil 5A, eşleştirilmiş Student t-testi t = 3.786, df = 6, p = 0.0091). Ca2+ geçici akımların ortalama ΔF/F0 genliğinde de bir artış olmuştur (Şekil 5B,C, iki yönlü ANOVA zaman × uyaran etkileşimi F5,2796 = 3.605, df = 5, p = 0.0030) ve ilk uyaran çerçevesi sırasında genlikte (Šidák'ın çoklu karşılaştırma testi, t = 3.758, df = 2796, ayarlanmış p = 0.0010).

Şekil 1: Görüntüleme için maskeli stereotaksik anestezi başlığı tutucusu. (A) Anestezi maskesi bir ısıtma yastığı ile metal bir plakaya cıvatalanmış fare kafası tutucusunun fotoğrafı. Diş tutucu ve burun konisi/anestezi maskesi gösterilmiştir. Isıtma yastığı, hasarı önlemek için alüminyum folyo ile kaplanmıştır. (B) Ameliyat ve görüntülemeye hazırlık olarak anestezi başlığı tutucusunda 15° eğilmiş farenin fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Görüntüleme için trigeminal ganglion cerrahi maruziyeti. (A) Deride küçük bir kesi yapılmış bir fare. (B) Trigeminal ganglion maruziyeti için bir delik hazırlamak üzere kafatasından doku temizlenmiş fare. (C) Sağ trigeminal ganglion açığa çıkarıldı ve görüntüleme için hazırlandı. Beyin dokusu çıkarılmadı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Fareyi görüntüleme için mikroskop sahnesine yerleştirme. (A) Mikroskop sahnesindeki stereotaksik cihazdaki fare. Rektal termometre ve izofluran tüpü gösterilmiştir. (B) Görüntüleme için hazırlanan fare. Objektif kafatasında ameliyatla hazırlanan deliğin yaklaşık 9 mm üzerindedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Trigeminal ganglionun V2 (maksiller) ve V3 (mandibular) bölgeleri tarafından innerve edilen bölgelere zararlı ısı uyaranlarının uygulanması. (A) TG'nin 200 kare üzerindeki yoğunluk projeksiyonunun toplamı (ImageJ'de, Resim |Yığınlar|Z Projesi|Projeksiyon Tipi|Dilimleri Topla). (B) TG'nin 200 kare üzerinde maksimum yoğunluk projeksiyonu (ImageJ'de, Görüntü |Yığınlar|Z Projesi |Projeksiyon Tipi|Maksimum Yoğunluk). Sarı ok belirtme çizgileri, yanıt veren nöronları gösterir. (C) Panel B'deki belirtme çizgileri ile gösterilen altı nöronun ΔF/F0 yoğunluk grafikleri. Her nöron farklı bir renkte grafiklendirilir. (D) V2 alanı tarafından innerve edilen cilde 50 ° C su uygulanmadan önce TG'nin maksimum yoğunluk projeksiyonu. (E) V2 alanı tarafından innerve edilen cilde 50 ° C su uygulanması sırasında TG'nin maksimum yoğunluk projeksiyonu. Sarı ok belirtme çizgileri, yanıt veren nöronları gösterir. (F) Panel E'deki belirtme çizgileri ile gösterilen altı nöronun ΔF/F0 yoğunluk grafikleri (V2 alanı tarafından innerve edilen alana uygulanan zararlı ısı). (G) V3 alanı tarafından innerve edilen cilde 50 ° C su uygulanmadan önce TG'nin maksimum yoğunluk projeksiyonu. (H) V3 alanı tarafından innerve edilen cilde 50 ° C su uygulanması sırasında TG'nin maksimum yoğunluk projeksiyonu. Sarı ok belirtme çizgileri, yanıt veren nöronları gösterir. (I) Panel H'de belirtme çizgileri ile etiketlenmiş altı nöronun ΔF/F0 yoğunluk grafikleri (V3 tarafından innerve edilen alana uygulanan zararlı ısı). Ölçek çubukları = 200 μm (A,B,D,E,G,H). Kısaltmalar: TG = trigeminal ganglion; ΔF/F0 = Ca2+ geçici yoğunluk. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: V2 tarafından innerve edilen alanda iki farklı kuvvet tarafından indüklenen Ca2+ aktivitesi. (A) 0.4 g von Frey ve 2 g von Frey uygulamaları sırasında Ca2+ geçici olayları gösteren, V2 tarafından innerve edilen yedi gangliyondaki nöron sayısının grafiği ve yedi gangliyonda 2 g von Frey ile 0.4 g von Frey arasında aktive edilen nöron sayısındaki fark. Ortalama ve SEM gösterilir. (B) V2 tarafından innerve edilen alanda 0.4 g von Frey (üstte) ve 2 g von Frey (altta) uygulamaları tarafından üretilen Ca2+ geçici akımların ΔF/F 0 yoğunluğunun grafiği. Gri çizgiler tek tek hücrelerdir, kırmızı çizgi ortalama yoğunluktur. (C) V2 tarafından innerve edilen alanda 0.4 g von Frey ve 2 g von Frey uygulamaları tarafından üretilen Ca2+ geçici akımların ortalama ΔF/F 0 yoğunluğunun grafiği. Ortalama ve SEM gösterilir. Hücre sayımları için istatistikler eşleştirilmiş Öğrenci t-testidir. Geçici yoğunluklar için istatistikler 2 Yönlü ANOVA ve ardından Šidák çoklu karşılaştırma testidir. **p < 0,01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: TG'de Pirt-GCaMP3'ü görüntülemek için kullanılan konfokal taramalı mikroskop ayarlarının bir özeti. Sütun 3, her ayarın ne yaptığına dair kısa bir açıklama sağlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Sağ taraftaki trigeminal ganglionda spontan Ca2+ aktivitesi.Uyaranların yokluğunda spontan Ca2 + geçici akımları ve sabit yüksek Ca2 + konsantrasyonu gösteren bir trigeminal ganglion. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Trigeminal ganglionun V2 dalı tarafından innerve edilen orofasiyal alana 50 °C su uygulanmasıyla indüklenen Ca 2+ geçici akımlar. V2 orofasiyal bölgeye 50 °C su uygulanmasına yanıt olarak Ca2+ geçici akımlar gösteren bir trigeminal ganglion. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 3: Trigeminal ganglionun V3 dalı tarafından innerve edilen orofasiyal bölgeye 50 °C su uygulanmasıyla indüklenen Ca 2+ geçici akımlar. V3 orofasiyal bölgeye 50 °C su uygulanmasına yanıt olarak Ca2+ geçici durum gösteren bir trigeminal ganglion. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Örnek analiz elektronik tablosu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.