Yöntem makalesi

Fibrozisli Metabolik Disfonksiyonla İlişkili Steatotik Karaciğer Hastalığının Fare Modeli

DOI:

10.3791/68294

⸱

18 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolik disfonksiyon, hepatik gen ekspresyonu değişiklikleri ve ileri fibroz evre 3'e ilerleyen fibroz dahil olmak üzere insan MASLD'ye benzeyen karaciğer histopatolojik değişiklikleri ile metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığının (MASLD) fare modeli. Bu model MASLD patofizyolojisi çalışmalarında ve yeni tedavilerin klinik öncesi çalışmalarında kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karaciğer fibrozisi, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığında (MASLD) olumsuz sonuçların en önemli belirleyicisidir. MASLD'nin klinik öncesi çalışmalarında, fareler en sık kullanılan hastalık modelidir. Bununla birlikte, bu modellerde karaciğer fibrozunun indüklenmesi zordur. Bu protokol, hiperfajik Ay farelerinin ABD'deki ortalama diyete benzeyen yağ ve fruktoz oranı yüksek bir diyetle beslendiği bir MASLD fare modelini tanımlar. Farelerde hepatik steatoz, yaralanma, iltihaplanma ve fibroz gelişir. Fibrozis, 16 hafta sonra perisellüler, evre 1 fibrozdan, 12 ay sonra köprüleme, evre 3 fibrozise ilerler. Bu farelerde ayrıca obezite, hipertrigliseridemi, glukoz intoleransı ve hiperinsülinemi gelişir. Bu hastalık modeli, karaciğer histopatolojisini, hepatik gen ekspresyon değişikliklerini ve insan hastalığının metabolik disfonksiyonunu kopyalar. Bu protokol, fibrozu ölçmek için iki yöntem içerir: kollajenin picro-sirius kırmızısı ile histolojik olarak boyanması ve hidroksiprolinin karaciğer içeriğinin miktarının belirlenmesi. Bu yöntemler MASLD patofizyolojisinin incelenmesi ve potansiyel tedavilerin klinik öncesi çalışmaları için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD), prevalansı ABD'de %31 ila %40 ve dünya çapında %42 ile en sık görülen karaciğer hastalığıdır 1,2,3,4. MASLD'li hastalar, daha önce alkolsüz steatohepatit (NASH), siroz ve hepatosellüler karsinom olarak adlandırılan metabolik disfonksiyonla ilişkili steatohepatit (MASH) geliştirebilir 5,6. MASLD, hepatosellüler karsinom riskini artırmaktadır ve MASLD prevalansındaki son artışı takiben, hepatosellüler karsinom gelişen hastalarda en sık görülen karaciğer hastalığı haline gelmiştir 7,8. MASLD'de fibroz, siroza ilerlemenin ve karaciğerle ilişkili morbidite (karaciğer dekompansasyonu, karaciğer yetmezliği veya karaciğer kanseri) ve karaciğerle ilişkili mortalitedahil olmak üzere olumsuz klinik sonuçların birincil belirleyicisidir 6,9,10,11. Buna göre, Gıda ve İlaç İdaresi, fibrozlu MASH / NASH'e odaklanan terapötiklerin geliştirilmesini ve uygun hayvan modellerinin kullanılmasını teşvik etmektedir12.

İlaçların klinik öncesi çalışmalarında ve MASLD'nin mekanik çalışmalarında, fare modelleri en yaygın olarak kullanılmaktadır13. MASLD'nin binlerce fare modeli tanımlanmıştır, bu da optimal bir modelüzerinde fikir birliği olmadığını düşündürmektedir 13,14. Optimal modellerin oluşturulması çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Farelerde yağ oranı yüksek diyetlerle beslenerek obezite ve steatozu indüklemek nispeten kolay olsa da, karaciğer fibrozunu indüklemek daha zordur 13,14,15,16. Obezojenik diyetler tarafından yönlendirilen MASLD modellerinde, fibroz yavaş gelişir17 Bu yavaş ilerleme, insan hastalığını18 daha iyi taklit edebilse de, hayvan çalışmalarının süresini ve maliyetini artırır. Yüksek kolesterol içeriğine sahip diyetler (ör.% 2) fibroz gelişimini teşvik eder; Bununla birlikte, insan hastalığında tarif edilen artışın tersi olan kolesterolün endojen sentezini de azaltırlar15,16. Bazı MASLD modelleri mutant veya genetiği değiştirilmiş fareler kullanır; Bununla birlikte, uyarıları olabilir: OB / OB fareleri obezite, steatoz ve insülin direnci geliştirir, ancak fibrozun bir aracısı olan leptinden yoksundurlar; PTEN boş farelerde steatoz gelişir ancak insülin direnci geliştirmezler15,17. Bu nedenle, MASLD'nin fare modelleri genellikle uzun çalışma süreleri, yüksek kolesterol içerikli diyetler veya önemli fibroz geliştirmek için genetik manipülasyonlar gerektirir14. Bu sorunlardan bazılarını ele almak için, hayvanların perisellüler/perisinüzoidalden (evre 1) köprüleme fibrozuna (evre 3) ilerleyen fibrozlu MASLD geliştirdiği bir fare modeli geliştirdik19.

Bu makalenin amacı, karaciğer fibrozu ile bu MASLD modelini ve fibrozu ölçmek için iki yöntemi tanımlamaktır: pikro-sirius kırmızısı ile kollajen histolojik boyama ve karaciğer hidroksiprolin içeriğinin miktar tayini.

Bu modeli geliştirmenin mantığı, en kullanışlı hayvan modellerinin, hem hastalığın itici güçlerinde hem de histopatoloji ve gen ekspresyonundaki değişikliklerde insan hastalığını en iyi kopyalayanlar olmasıydı. Bu nedenle, orta derecede yüksek miktarda yağ ve fruktoz19,20 dahil olmak üzere ABD'deki ortalama diyete benzeyen bir diyet kullandık. Bu diyeti, obezite21 modeli olarak yaygın olarak kullanılan Agouti sarı (Ay) mutasyonunu taşıyan farelere besledik. Bu fareler, MC4R de dahil olmak üzere melanokortin reseptörlerinin bir antagonisti olan aguti proteinini her yerde eksprese eder, hiperfajiye neden olur ve insan obezitesinde yaygın olan artan gıda alımını çoğaltır 21,22,23. Bu model, steatoz, hepatosellüler hasar, inflamasyon, fibroz ve metabolik disfonksiyon dahil olmak üzere MASH'ı tanımlayan değişiklikleri özetlemektedir.

Bu modelin temel avantajları, onu insan hastalığına benzer kılan özelliklerdir. Model, tipik ABD diyetine benzeyecek şekilde tasarlanmış ve insan MASLD14,20 fenotipini kopyalamada en etkili diyet olduğu gösterilen Batı tipi bir diyet kullanır. Fareler, MASH19,24 ile insanların karaciğerlerinde tarif edilenlere benzer karaciğer histopatolojik değişiklikler geliştirir. Fareler, MASLD5 tanısı için önemli bir kriter olan metabolik disfonksiyon geliştirir. MASH'lı farelerin karaciğerleri, MASH / NASH19'lu insanlarda olanları özetleyen gen ekspresyonunda değişiklikler gösterir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, MASLD'nin 39 fare modeli, insan hastalığına benzerlikleri açısından karşılaştırıldı. Aynı hiperfaji mekanizmasını paylaşan ve14'ü tarif ettiğimiz modelle aynı diyeti alan MC4R nakavt farelerini içeriyordu. Bu model, fenotip, karaciğer histopatolojisi ve transkriptomik14 tarafından değerlendirilen insan MASLD'ye benzerliği nedeniyle beşinci sırada (39 üzerinden) yer aldı.

Bu modelin ek avantajları şunlardır: Ay fareleri Jackson Laboratuvarı'ndan ticari olarak temin edilebilir ve metabolik çalışmalarda yaygın olarak kullanılan C57BL / 6J suşunda mevcuttur21,25; Mutant fareler, tüy kaplama renklerinden kolayca ayırt edilebilir; model, MASLD'nin gelişiminde belirli genlerin rolünü incelemek için kazanç veya fonksiyon kaybı modelleriyle birleştirilebilir; ve son olarak, model besin eksiklikleri (kolin veya metiyonin eksikliği), olağandışı gıda bileşenleri (kolik asit, etiyonin), alışılmadık derecede yüksek spesifik besin içeriği (trans yağlar) veya hepatotoksinler (karbon tetraklorür), MASLD'nin yaygın nedenleri değildir ve insan hastalığını tekrarlayamaz 13,14,17.

Bu yöntem, MASLD'nin gelişmesine ve ilerlemesine katkıda bulunan mekanizmaların araştırılmasının yanı sıra tedavisi veya önlenmesi için müdahalelerin değerlendirilmesi için de uygundur. Bu model özellikle yararlıdır, çünkü hayvanlar sadece hem steatohepatit hem de metabolik disfonksiyon geliştirmekle kalmaz, aynı zamanda evre 3'e ilerleyen fibroz geliştirir. Model, beslenme davranışını etkileyen mekanizmaların (örneğin, GLP1R agonistleri) incelenmesi için uygun olmayabilir, çünkü bu farelerde hiperfaji vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Brooklyn College'ın hayvan bakımı yönergelerini takip eder; IACUC protokol numarası 318.

1. Fibrozisli MASLD'nin fare modeli

  1. Ay yavruları üretmek için fareler yetiştirin. Ay fareleri ile üreme çiftleri kurun (B6. Cg-AY/J). Yavruların doğum tarihini kaydedin.
  2. Yeterli ve eşit beslenmeyi ve büyümeyi teşvik etmek için yavruların benzer sayıda yavruya sahip olduğundan emin olun. C57BL/6J fareleri için ortalama çöp boyutu olduğundan, çöp başına beş ila altı yavruya sahip olmayı hedefleyin. Ekstra yavrular, tercihen ihtiyaç duyulmayan cinsiyetten olanlar, ötenazi yapılabilir veya teşvik edilebilir.
    NOT: Ay erkekleri ve vahşi tip dişilerin (C57BL/6J Jax 0000664) kullanılması, vahşi tip C57BL/6J dişi farelerin elde edilmesi kolay olduğundan ve Ay dişi farelerinden daha iyi yetiştiriciler olabileceğinden, üreme verimliliğini artırabilir.
  3. Deneyler için aşağıda açıklandığı gibi kafesler kurun.
    1. Ay farelerini sarı kürk renklerine göre tanımlayın. Her fareye benzersiz bir kimlik atayın ve fareleri etiketleyin veya işaretleyin.
      NOT: Aguti geninin aguti sarısı (Ay) aleli sarı bir ceket rengi verir. Alel heterozigotlarda yarı baskındır. Homozigotluk embriyonik ölümcüllüğe neden olur. Bu nedenle, sarı ceket rengine sahip fareler Ay geni için heterozigottur.
    2. Fareleri 21 günlükken sütten kesin. Çalışma sırasında aynı kafeste barındırılacak fareleri bir araya getirin. Beklenen vücut ağırlığına ve kurumsal yönergelere göre kafes başına üç veya dört Ay faresi barındırın.
    3. Standart yemek ve su ile besleyin. Standart sıcaklıkta (20-23 °C) ve bağıl nemde (%40 ila %60) 12 saat ışık, 12 saat karanlık döngü ile ev fareleri.
  4. Ay farelerini aşağıda açıklandığı gibi 8 haftalıktan başlayarak yağ ve fruktoz oranı yüksek diyetle (Yüksek Yağ ve Fruktoz Diyeti, HFFD) besleyin.
    1. Ay farelerine yağ ve sükroz oranı yüksek olan Batı diyeti sağlayın (Ayarlanmış kaloriler Batı Diyeti Inotiv TD.88137) ad libitum.
    2. İçme suyunda fruktoz (23 g/L) ve glikoz (19 g/L) içeren bir çözelti hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzülerek sterilize edin ve steril şişelerde saklayın. Açıldıktan sonra çözeltiyi buzdolabında saklayın.
    3. Farelere steril içme şişelerinde içmek için fruktoz ve glikoz içeren solüsyon sağlayın. Solüsyonu ve şişeleri en az haftada bir değiştirin, mikroorganizmaların büyümesini kontrol edin.
    4. Besin değeri olmayan kafes yatakları kullanın (örn. talaş).
  5. Yem kontrol fareleri, aşağıda açıklandığı gibi yağ ve fruktoz oranı düşük bir diyet.
    NOT: Kullanılacak kontrol farelerinin türü çalışma tasarımına bağlıdır: İlaçların etkisini değerlendirmek için Ay-HFFD fareleri kullanılıyorsa, kontrol fareleri bir plasebo ile tedavi edilen Ay-HFFD fareleri olabilir. Model, bir genetik modifikasyonun fibroz gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için kullanılıyorsa, genetik modifikasyonu olmayan Ay-HFFD fareleri kontrol olarak kullanılabilir. MASH içermeyen kontroller isteniyorsa, burada açıklanan adımları izleyin.
    1. Ay farelerinin littermatları olan vahşi tip fareler kullanın. Siyah ceket renklerinden tanınabilirler.
    2. Fareleri aynı yaştan başlayarak bir kontrol diyeti (Düşük Yağ Kontrol Diyeti Inotiv TD.08485; Düşük Yağ ve Fruktoz Diyeti, LFFD olarak anılır) ile besleyin. Farelere düzenli içme suyu sağlayın.
  6. Fareleri haftalık olarak tartarak, uyanık hayvanları laboratuvar terazisinde darası alınmış bir kaba koyarak ve ağırlıklarını kaydederek obezite gelişimini izleyin.
  7. Farelerin her zaman yeterli yiyecek ve içme çözeltisine sahip olduğundan emin olun. İstenirse kalori alımını tahmin etmek için yiyecek ve içme çözeltisi tüketimini izleyin ve kaydedin.
  8. Dokuları aşağıda açıklandığı gibi toplayın.
    1. HFFD diyetinde 16 hafta sonra doku toplama işlemi gerçekleştirin. Fareyi karbondioksit soluma (veya kurumun IACUC tarafından onaylanan diğer yöntemler) ile ötenazi yapın.
      NOT: 16 hafta sonra, HFFD diyetiyle beslenen Ay fareleri genellikle evre 1 fibrozise sahiptir; Sürenin uzaması, 9 ila 12 ay sonra evre 3'e ilerleyen daha fazla fibrozise yol açacaktır.
    2. Fareyi tartın ve ağırlığıkaydedin 19.
    3. Gerekirse kan toplayın. Bunu yapmak için, karnı açtıktan sonra ve karaciğeri diseksiyondan önce (veya IACUC tarafından onaylanan başka bir yöntem kullanarak) 1 mL'lik bir şırınga ve 27G iğne ile inferior vena kava'dan kan alın.
    4. Orta hat kesisi ile karnı açarak, forseps ile karaciğeri hilusundan tutarak ve karaciğeri diyaframa ve retroperitoneuma bağlayan bağları makasla keserek karaciğeri diseksiyon edin. Karaciğeri tartın ve ağırlığı kaydedin.
    5. Karaciğeri buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisinde (PBS) durulayın. Karaciğerin fotoğrafını çekin ve görüntüye boyut referansı olarak bir cetvel veya başka bir nesne ekleyin. Karaciğeri buz üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına yerleştirin.
    6. Medyan lob, sol lob ve sağ lob dahil olmak üzere çeşitli lobların örneklerini (örnek başına yaklaşık 100 ila 150 mg) inceleyin. Sabitlemeyi kolaylaştırmak için numunelerin kalınlığının 4 mm'den fazla olmadığından emin olun. Bunları 24 saat boyunca fiksatif solüsyona (formalin% 10 veya% formaldehit% 4) koyun ve histopatolojik analiz için işleyin (aşağıya bakınız).
    7. Birkaç lobun ek örneklerini inceleyin. Tüplere (1,5 veya 2 mL) koyun, sıvı nitrojene batırarak dondurun ve -80 °C'de saklayın. Bu numuneler hidroksiprolin içeriğini ölçmek için kullanılacaktır.
    8. İstenirse diğer organlardan örnekler toplayın (yağ dokusu, kas vb.)

2. Kollajen histokimyasal boyama ve morfometrik kantifikasyon

NOT: Tehlikeli ve/veya uçucu kimyasalların kullanılmasını gerektiren adımlar çeker ocakta yapılmalıdır. Tüm slaytlar, boyama kapları ve slayt tutucular kullanılarak paralel olarak işlenmelidir.

  1. Karaciğer bölümlerini aşağıda anlatıldığı gibi hazırlayın.
    1. Karaciğer dokusunu oda sıcaklığında 24 saat formalin (veya formaldehit) içinde tutarak sabitleyin. Doku hacminden 20 kat daha büyük bir fiksatif hacim kullanın. Daha sonra, dokuları% 70 etanole aktarın. Protokol bu noktada duraklatılabilir.
      NOT: Dokular histoloji kasetlerine yerleştirilebilir ve daha sonra fiksatif içeren bir kaba veya alternatif olarak ayrı kaplara veya tüplere yerleştirilebilir.
    2. Dokuları parafine gömün. Bu genellikle bir histopatoloji çekirdek tesisi veya servisi tarafından yapılır.
    3. Kızaklara monte edilmiş 0,5 μm kalınlığında bölümler elde edin (yüksüz kızaklar yeterlidir). Bölümleri oda sıcaklığında havaya maruz bırakarak kurumaya bırakın. Bir histopatoloji çekirdek tesisi veya hizmeti genellikle bunu yapar. Protokol bu noktada duraklatılabilir.
  2. Aşağıda açıklandığı gibi bölümleri deparafinize edin ve rehidre edin.
    1. Bölümleri, her birinde 5-15 dakika boyunca iki deparafin / temizleme çözeltisi (ksilen veya sitrisolv) değişikliğine batırarak deparafinize edin.
    2. Slaytları art arda %100 etanol, %95 etanol, %70 etanol ve suya her birinde 5 dakika batırarak rehidre edin.
  3. Bölümleri aşağıda anlatıldığı gibi picro-sirius kırmızısı ile boyayın.
    1. Bölümleri Sirius kırmızısı (doğrudan kırmızı 80) çözeltisine batırın, 1 g / L, pikrik asit içinde 1 saat boyunca% 1.3. Doğrudan kırmızı, kollajen dışındaki yapıları (örneğin çekirdekler) lekeleyebileceğinden daha uzun süre lekelemeyin. Karşı boyama isteniyorsa, boyama çözeltisine hızlı yeşil (1 g/L) ekleyin26. Alternatif olarak, çekirdekleri Weigert'in hematoksilen27'si ile boyayın.
    2. Picro-sirius kırmızı solüsyonunu saklamak için kapalı, koyu cam veya plastik bir kaba geri koyun. Çözelti birden çok kez yeniden kullanılabilir (en az 20 yıl27).
  4. Numuneleri kurutmak için 5 dakika etanole (% 100) batırın. İkinci bir etanol değişikliği ile tekrarlayın.
  5. Montaj için ayrı ayrı çıkarılana kadar temizleme çözeltisine (ksilen veya citrisolv) daldırın.
  6. Temizleme solüsyonundan her seferinde bir slayt çıkarın ve kağıt havluların üzerine sürerek fazla sıvıyı çıkarın. Montaj ortamı ekleyin (yaklaşık 50 ila 100 μL). Bölümü bir lamel ile örtün ve hava kabarcıklarını gidermek için lameli hafifçe aşağı bastırın. Havanın kurumasını bekleyin.
    NOT: Protokol bu noktada duraklatılabilir.
  7. Parlak alan aydınlatmalı ve 4x ila 20x objektifli bir ışık mikroskobu kullanarak bölümleri gözlemleyin - kollajen açık sarı-turuncu bir arka plan üzerinde kırmızı görünür. Kamera talimatlarına göre renkli bir kamera ile ilgi alanlarını görüntüleyin.
  8. Aşağıda açıklandığı gibi polarize ışık mikroskobu ile görüntüleme yapın.
    1. Kollajenin görünür olduğundan ve arka plan sinyalinin minimum olduğundan emin olmak için polarizör ve analizör filtrelerini ortogonal olarak devreye sokun ve ayarlayın. Kolajen koyu bir arka plan üzerinde beyaz, sarı veya turuncu olarak görünür. Fibrozisin az olduğu veya hiç olmadığı bölümlerde, kan damarı duvarlarındaki kollajen görünür olacaktır. Karşılaştırılacak tüm numuneler için aydınlatma yoğunluğu da dahil olmak üzere ayarları aynı tutun.
    2. Tek renkli kamera veya renkli kamerada tek renkli mod kullanarak görüntü. 4x büyütme objektifi kullanın. Bölüm başına birden fazla resim çekin. Büyük kan damarları varsa hiluma yakın alanlardan kaçının. Karşılaştırılacak tüm görüntüler için aynı ayarları kullanın.
  9. Aşağıda açıklandığı gibi Photoshop (alternatif a) kullanarak morfometrik niceleme gerçekleştirin.
    1. Görüntülerdeki kolajene karşılık gelen beyaz alanı ölçün. Photoshop'ta > Renk aralığı seç'e tıklayın, ardından Vurgular'ıseçin ve kolajene karşılık gelen beyaz pikselleri seçmek için Bulanıklık ve Aralık parametrelerini ayarlayın. Ardından, Genişletilmiş Görünüm> Pencere > Histogramı'nı seçin ve parametrenin yanında gösterilen seçili piksel sayısını kaydedin. Karşılaştırılacak tüm görüntüler için aynı parametreleri kullanın.
    2. Görüntünün toplam alanını ölçün. Photoshop'ta Tümünü > Seç'i tıklatın, ardından daha önce yapıldığı gibi toplam piksel sayısını kaydedin.
    3. Beyaz piksel sayısını toplam piksel sayısına bölerek kolajene karşılık gelen görüntü alanının yüzdesini hesaplayın. Değerler genellikle alan yüzdeleri olarak ifade edilir.
  10. Aşağıda açıklandığı gibi ImageJ (alternatif b) kullanarak morfometrik niceleme gerçekleştirin.
    1. Görüntülerde kolajene karşılık gelen beyaz alanları seçin. Görüntü > Eşiği Ayarla'ya tıklayarak Eşik aracını açın (veya Shift + T tuşlarına >). Yalnızca kolajen lekeli bölgelerin (beyaz alanlar) kırmızıyla vurgulandığından emin olmak için eşik aralığını ayarlayın (ör. minimum eşik 64; maksimum eşik: 255) ve Uygula'yı tıklayın. Bu, görüntüyü ikili hale getirecek, kollajen bölgesini siyaha ve arka planı beyaza dönüştürecektir.
    2. Analiz Et'e tıklayarak Toplam Görüntü Alanını ölçün > Ölçümleri Ayarlayın. Alanı ve ekran etiketini kontrol edin. Tamam'a tıklayın. Analiz > Ölç'e tıklayın (veya klavyede M tuşuna basın). Sonuçlar penceresinde toplam görüntü alanı görüntülenir.
    3. Kollajen alanını ve yüzdesini ölçmek için önce Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'ya tıklayarak Sınırla Eşiği etkinleştirin. Alanı, Alan Fraksiyonunu (ImageJ kollajen yüzdesini otomatik olarak hesaplayacaktır), Eşik Sınırını ve Etiketi Görüntüle'yi kontrol edin. Tamam'a tıklayın. Ardından, Analiz > Ölç'e tıklayın (veya M tuşuna basın). Sonuçlar penceresi şunları gösterecektir: Kollajen Alanı (mutlak piksel sayısı) ve Alan Fraksiyonu (toplam görüntünün kollajeni).
    4. Farklı Kaydet'i seçerek sonuçları kaydedin veya panoya kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın.

3. Karaciğer hidroksiprolin miktar tayini

NOT: Kuvvetli bazların ve asitlerin kullanılmasını gerektiren adımlar, uygun kişisel koruyucu ekipman ile gerçekleştirilmelidir.

  1. Adım 1.8.7'de hazırlanan karaciğer örneklerini tartın ve ağırlıkları kaydedin. Doku alikotlarını homojenizasyon için uygun bir tüpe yerleştirin. 100 mg doku başına 900 μL su su-doku oranı kullanarak deiyonize su ekleyin.
  2. Görsel gözlemle değerlendirildiği gibi, doku tamamen homojen hale gelene kadar üreticinin talimatlarına göre boncuk çırpma veya başka bir yöntemle homojenize edin. Bu noktada protokol duraklatılabilir ve homojenatlar -20 °C'de saklanabilir.
  3. Protein çökeltme işlemini aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. Aşağıdaki adımlar, farklı bir sıcaklığın belirtildiği durumlar dışında, oda sıcaklığında yapılır.
    1. Yaklaşık 500 μL ila 1000 μL homojenatı 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın. Tüm numuneler için aynı hacmi aktarın.
    2. % 12'lik bir nihai konsantrasyon için trikloroasetik asit ekleyin (örneğin, 880 μL homojenata 120 μL trikloroasetik asit ekleyin)28. Karıştırmak için kısaca girdap.
    3. Numuneleri buz/su banyosunda 30 dakika inkübe edin. 6.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Protein formlarını içeren bir çökelti. Süpernatanı aspirasyon ile çıkarın. Tüpleri buz üzerinde tutun.
    4. Peleti yıkamak için 1 mL buz gibi soğuk etanol (%100) ekleyin. Peleti sonikasyonla (veya başka bir yöntemle) yeniden askıya alın ve malzemenin yeniden askıya alındığını görsel olarak doğrulayın. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 6.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspirasyonla çıkarın. Ekipman talimatlarına göre sonikasyon ayarlarını kullanın (örneğin, 3,2 mm çapında bir mikro uca sahip bir Branson SFX 150 sonifier kullanarak, 10 saniye boyunca% 70'lik bir genlik çoğu örnek için etkilidir). 2 kez yıkamayı tekrarlayın.
    5. Peletin 10 dakika veya gerekirse daha uzun süre kurumasını bekleyin.
  4. Protein hidrolizini aşağıda tarif edildiği gibi gerçekleştirin.
    1. Protein çökeltisini içeren tüplere 800 μL 6 N hidroklorik asit ekleyin. Pelet, adım 3.3.4'teki gibi aynı ayarları kullanarak sonikasyon (veya başka bir yöntemle) yeniden askıya alın.
    2. Protein süspansiyonunu cam tüplere veya vidalı kapaklı şişelere aktarın; sıkıca kapatın. Tüpleri 110 °C fırında 22 ± 2 saat29 inkübe edin.
    3. Tüpleri 10 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin; Partikül bir pelet oluşturacaktır. Bu genellikle hidrolizatın santrifüjlemeden önce cam şişelerden santrifüj tüplerine aktarılmasını gerektirir.
    4. Hidroksiprolin içeren süpernatanı 1.5 mL'lik tüplere aktarın. Protokol bu noktada duraklatılabilir. Hidrolizatlar 4 °C'de depolanabilir.
  5. Hidroksiprolin konsantrasyonu için standart bir eğri hazırlayın. Fibroz evre 1 ila 3 olan karaciğer örnekleri için, bu protokolde belirtilen doku miktarlarını kullanarak, 125 μg / mL'ye kadar standart konsantrasyonlar yeterlidir (ör., 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.81, 3.91, 1.95 ve 0 μg / mL'lik seri dilüsyonlar). Hidroksiprolin'i 6 N hidroklorik asit içinde seyrelterek standartları hazırlayın.
  6. Her numuneden 40 μL ve standart olarak 1,5 mL etiketli santrifüj tüplerine aktarın. Her birine 10 μL 10 N sodyum hidroksit ekleyin ve karıştırmak için kısa bir süre girdaplayın.
  7. Hidroksiprolinin oksidasyonunu aşağıda tarif edildiği gibi gerçekleştirin.
    1. Deiyonize suda asetik asit %1.2 v/v, sitrik asit 46 g/L, sodyum asetat trihidrat 120 g/L ve sodyum hidroksit 34 g/L içeren asetat-sitrat tamponu hazırlayın ve tampon pH'ını 6.5'e ayarlayın.
    2. Su:n-propanol:asetat-sitrat tamponu (1:1:8 v:v:v) içinde 12.7 g/L kloramin T çözeltisi hazırlayın. Önce kloramin T'yi suda karıştırarak çözün, ardından n-propanol ekleyin, karıştırın ve ardından asetat-sitrat tamponu ekleyin ve karıştırın.
    3. Numuneler ve standartlar içeren tüplere 450 μL kloramin çözeltisi ekleyin. Girdap yaparak karıştırın. Oda sıcaklığında 25 dakika30 dakika inkübe edin.
  8. Ehrlich reaktifini perklorik asit içinde 1 M 4- (Dimetilamino) benzaldehit ile hazırlayın: propanol 1: 2 (h / h). Numunelere ve standartlara 500 μL Ehrlich reaktifi ekleyin. Girdap yaparak karıştırın.
  9. 65 ° C'de bir ısıtma bloğunda, su banyosunda veya inkübatörde 20 dakika inkübe edin. Kuluçka sona erdiğinde, numunelerin ve standartların oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
  10. Bir spektrofotometre kullanarak 550 nm dalga boyunda numunelerin ve standartların absorbansını ölçün.
  11. Standart miktarlara karşı absorbansı çizin ve standart bir eğri oluşturmak için doğrusal bir regresyon kullanın. Numunelerdeki hidroksiprolin konsantrasyonunu hesaplamak için standart eğrideki parametreleri kullanın.
  12. Hidrolizatın toplam hacmine dayalı olarak karaciğer numunelerindeki hidroksiprolin miktarını hesaplayın (adım 3.4) ve protein çökeltmesi için kullanılan homojenat hacmine karşılık gelen doku kütlesi ile normalleştirin (adım 3.3.1). Sonuçları mg doku başına ng hidroksiprolin olarak ifade edin. Alternatif olarak, homojenatlardaki protein konsantrasyonu ölçülebilir ve sonuçlar protein kütlesi başına hidroksiprolin kütlesi olarak ifade edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HFFD ile beslenen fareler, LFFD ile beslenen vahşi tip farelere göre daha fazla kilo almakta ve obezite geliştirmektedir (Şekil 1A). HFFD beslenmesinin ilk 4 haftasında daha hızlı kilo alırlar ve haftada yaklaşık 3-4 g alırlar. 8 hafta sonra, kontrol farelerine benzer bir oranda kilo alırlar (yaklaşık 0,6 g / hafta)19. 16 hafta sonra, HFFD ile beslenen Ay fareleri yaklaşık 45 g ila 50 g ağırlığındadır (üç ayrı deneyin ortalaması) ve L...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hastalığı insanlarda tekrarlayan karaciğer fibrozisli bir MASLD fare modelini tanımlar 5,6. Fareler, histolojide karışık mikro ve makro veziküler steatoz ve yüksek hepatik triaçilgliserol içeriği19 ile gösterildiği gibi karaciğer steatozu geliştirir. Fareler ayrıca obezite, hipertrigliseridemi, glukoz intoleransı geliştirir ve karaciğer steatozu ile birlikte insanlarda MASLD tanı kriterlerine ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri K22CA178098, R03DK101863 ve Brooklyn College'dan (JMC'ye) R15DK131627 ve başlangıç fonları tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-(Dimetilamino)benzaldehitSigma-AldrichD2004
Asetik asitÇeşitliNA
Ayarlanmış kalori diyeti Batı diyetiInotivTD.88137Diyet yağ (%42 %kcal) ve sakroz (%34 %w/w/w) içeriyordu. Diğer tedarikçiler de aynı bileşime sahip diyetler sunar
B6. Cg-Ay/JJackson Laboratuvarı000021Strain, Agouti ölümcül sarı mutasyonuna ve C57BL6/J arka planına sahiptir. Şu anda Jackson Laboratuvarı'nda bu suş kriprokonserve edilmiştir.
C57BL/6JJackson Laboratuvarı000664
SantrifüjÇeşitliNA1.5 mL tüpler için rotorlu, soğutulmuş, 16.000 xg'ye ulaşabiliyor.
SantrifüjÇeşitliNA
Kloramin-T hidratSigma-Aldrich857319
Sitrik asitÇeşitliNA
Doğrudan Kırmızı 80Sigma365548-5G
EtanolDecon Laboratuvarları2701
Formalin çözeltisi, nötr tamponluSigmaHT501128
FruktozSigma-AldrichF0127
GlikozSigma-AldrichG8270
Histoloji işlem ekipmanıNANAGömme ve kesitleme, araştırmacı laboratuvarında veya dış tesiste yapılabilir
HomojenizerÇeşitliNABoncuk çalan makineler, birden fazla örneği işlemek için oldukça verimlidir. Diğer homojenleştirme yöntemleri de kullanılabilir
Hidroklorik asitÇeşitliNA
HidroksiprolinSigmaH5534
Düşük Yağ Kontrol DiyetiInotivTD.08485Kontrol diyeti, düşük yağ (%13 kcal) ve sakroz (%12 %w/w)
Polarize ışık mikroskobu için donatılmış mikroskopÇeşitliNA
N-propanolÇeşitliNA
Perklorik asitÇeşitliNA
Permount Montaj OrtamıFisher ScientificSP15-100
Pikrik Asit, Doymuş Sulu Çözeltisi, SpektrumFisher18612375
Sodyum asetat trihidratÇeşitliNA
Sodyum hidroksitÇeşitliNA
SonicatorÇeşitliNASonicator, 2.5. adımda pelletleri yeniden süslemek için faydalıdır, ancak kesinlikle gerekli değildir
Trikloroasetik asitÇeşitliNA
VWR Mikro Kapaklı Gözlükler, DikdörtgenVWR 48393-081
VWR Premium Superfrost Plus Mikroskop Slaytları | VWRVWR 48311-703
Su, deionize edilmişÇeşitliNASu arıtma sisteminden deionize edilmiş su veya bir tedarikçiden satın alınan su.
KsilenFisher ScientificX3FCitrisolv Temizleme Ajanı  (Fisher 22-143-975) çevre dostu bir alternatif olarak satılmaktadır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciardullo, S., Carbone, M., Invernizzi, P., Perseghin, G. Exploring the landscape of steatotic liver disease in the general US population. Liver Int. 43 (11), 2425-2433 (2023).
  2. Lee, B. P., Dodge, J. L., Terrault, N. A. National prevalence estimates for steatotic liver disease and subclassifications using consensus nomenclature. Hepatology. 79 (3), 666-673 (2024).
  3. Kalligeros, M., et al. Prevalence of Steatotic Liver Disease (MASLD, MetALD, and ALD) in the United States: NHANES 2017-2020. Clin Gastroenterol Hepatol. 22 (6), 1330-1332.e4 (2024).
  4. Younossi, Z. M., Kalligeros, M., Henry, L. Epidemiology of Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease. Clin Mol Hepatol. 31 ((Suppl)), S32-S50 (2024).
  5. Rinella, M. E., et al. A multisociety Delphi consensus statement on new fatty liver disease nomenclature. Hepatology. 78 (6), 1966-1986 (2023).
  6. Rinella, M. E., et al. AASLD Practice Guidance on the clinical assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 77 (5), 1797-1835 (2023).
  7. Friedman, S. L. Hepatic Fibrosis and Cancer: The Silent Threats of Metabolic Syndrome. Diabetes Metab J. 48 (2), 161-169 (2024).
  8. Phoolchund, A. G. S., Khakoo, S. I. MASLD and the Development of HCC: Pathogenesis and Therapeutic Challenges. Cancers. 16 (2), 259(2024).
  9. Taylor, R. S., et al. Association Between Fibrosis Stage and Outcomes of Patients With Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Gastroenterology. 158 (6), 1611-1625.e12 (2020).
  10. Younossi, Z. M., et al. Liver histology is associated with long-term clinical outcomes in patients with metabolic dysfunction-associated steatohepatitis. Hepatol Commun. 8 (6), e0423(2024).
  11. Dulai, P. S., et al. Increased risk of mortality by fibrosis stage in nonalcoholic fatty liver disease: Systematic review and meta-analysis. Hepatology. 65 (5), 1557-1565 (2017).
  12. Noncirrhotic Nonalcoholic Steatohepatitis With Liver Fibrosis: Developing Drugs for Treatment; Draft Guidance for Industry. The Federal Register / FIND. , Food and Drug Administration. (2018).
  13. Im, Y. R., et al. A Systematic Review of Animal Models of NAFLD Finds High-Fat, High-Fructose Diets Most Closely Resemble Human NAFLD. Hepatology. 74 (4), 1884-1901 (2021).
  14. Vacca, M., et al. An unbiased ranking of murine dietary models based on their proximity to human metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD). Nat Metab. 6 (6), 1178-1196 (2024).
  15. Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Animal Models of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis: Do They Reflect Human Disease. Adv Nutr. 11 (6), 1696-1711 (2020).
  16. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  17. Farrell, G., et al. Mouse Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Toward Optimization of Their Relevance to Human Nonalcoholic Steatohepatitis. Hepatology. 69 (5), 2241-2257 (2019).
  18. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. J. Hepatol. 68 (2), 230-237 (2018).
  19. St Rose, K., et al. Mouse model of NASH that replicates key features of the human disease and progresses to fibrosis stage 3. Hepatol Commun. 6 (10), 2676-2688 (2022).
  20. Hintze, K. J., Benninghoff, A. D., Cho, C. E., Ward, R. E. Modeling the Western Diet for Preclinical Investigations. Adv Nutr. 9 (3), 263-271 (2018).
  21. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L. J., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Dis Model Mech. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  22. Okumura, K., et al. Exacerbation of dietary steatohepatitis and fibrosis in obese, diabetic KK-A(y) mice. Hepatol Res. 36 (3), 217-228 (2006).
  23. Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, Pathophysiology, and Therapeutics. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 706978(2021).
  24. Brunt, E. M. Pathology of fatty liver disease. Mod Pathol. 20 Suppl 1, 40(2007).
  25. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Dig Dis Sci. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  26. Caviglia, J. M., et al. MicroRNA-21 and Dicer are dispensable for hepatic stellate cell activation and the development of liver fibrosis. Hepatology. 67 (6), 2414-2429 (2018).
  27. Kiernan, J. Histological and histochemical methods. , Scion Publishing Ltd. (2015).
  28. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. S. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Sci. 18 (5), 980-993 (2009).
  29. Davidson, I. Hydrolysis of samples for amino acid analysis. Methods Mol Biol. 211, 111-122 (2003).
  30. Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clin Biochem. 29 (3), 225-229 (1996).
  31. Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  32. Mark, A. L., et al. Contrasting blood pressure effects of obesity in leptin-deficient ob/ob mice and agouti yellow obese mice. J Hypertens. 17 (12 Pt 2), 1949-1953 (1999).
  33. Luo, Y., et al. Metabolic phenotype and adipose and liver features in a high-fat Western diet-induced mouse model of obesity-linked NAFLD. Am J Physiol Endocrinol Metab. 310 (6), 418(2016).
  34. Lonardo, A., Suzuki, A. Sexual Dimorphism of NAFLD in Adults. Focus on Clinical Aspects and Implications for Practice and Translational Research. J Clin Med. 9 (5), 1278(2020).
  35. Lonardo, A., Ballestri, S., Mantovani, A., Targher, G., Bril, F. Endpoints in NASH Clinical Trials: Are We Blind in One Eye. Metabolites. 14 (1), 40(2024).
  36. Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
  37. Hao, L., Khan, M. S. H., Zu, Y., Liu, J., Wang, S. Thermoneutrality Inhibits Thermogenic Markers and Exacerbates Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Mice. Int J Mol Sci. 25 (15), 8482(2024).
  38. Horakova, O., et al. Thermoneutral housing promotes hepatic steatosis in standard diet-fed C57BL/6N mice, with a less pronounced effect on NAFLD progression upon high-fat feeding. Front Endocrinol. 14, 1205703(2023).
  39. Suzuki, A., Diehl, A. M. Nonalcoholic Steatohepatitis. Annu Rev Med. 68, 85-98 (2017).
  40. Arrese, M., et al. Insights into Nonalcoholic Fatty-Liver Disease Heterogeneity. Semin Liver Dis. 41 (4), 421-434 (2021).
  41. Wentworth, B. J., Caldwell, S. H. Pearls and pitfalls in nonalcoholic fatty liver disease: tricky results are common. Metab Target Organ Damage. 1 (1), 2(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Metabolik Disfonksiyonla li kili Karaci er HastalFare Fibrozis ModeliHepatik SteatozKaraci er FibrozisiKollajen BoyamaSirius Red BoyamaHidroksiprolin KantifikasyonuY ksek Ya l DiyetKaraci er HistopatolojisiPolarize I k Mikroskopisi

İlgili makaleler