Filamentli Mantarlar ile Polimer Hidrolitik Hücre Dışı Enzim Üretimi için Katı Hal Fermantasyon Sistemlerinin Tasarımı

Summary

Bu protokol, enzim üretimini artırmak için döner bir katı hal fermantasyon sisteminde buğday kepeğini kullanır. Kitin gibi indükleyicilerle desteklenen substrat, kontrollü koşullar altında mantar büyümesini destekler. Sonuçlar, daldırılmış fermantasyona kıyasla 4-6 kat daha yüksek enzim verimini göstererek, yöntemin çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için uyarlanabilirliğini ve etkinliğini göstermektedir.

Abstract

Katı hal fermantasyonu (SSF), sulu bir ortamda çözünmeyen katı bir substrat kullanan bir biyodönüşüm işlemidir. Mikroorganizmalar substratın yüzeyinde büyür ve gelişimleri için gerekli besinleri çıkarmak için katı matrisine nüfuz eder. SSF,% 70'in üzerinde tutulan bir substrat nem içeriği ile minimum serbest su ile karakterize edilir ve gaz, sıvı ve katı olmak üzere birbirine bağlı üç faz içerir. Bu protokol, tarımsal endüstriyel bir yan ürün olan buğday kepeğinin döner bir sistemde enzim üretimi için temel substrat olarak kullanımını açıklar. Substrat, hidrolitik proteinlerin sentezini teşvik etmek için kitin, kitosan, nişasta veya selüloz gibi bir indükleyici ile desteklenir. Sistem son derece uyarlanabilir ve miselyum, sporlar veya peletler dahil olmak üzere farklı mantar formlarının kullanımına izin verir. Açıklanan metodolojide, indükleyici ve substrat 1:100 (a/a) oranında karıştırılır, otoklavlama yoluyla sterilize edilir ve steril su ile istenen nem seviyesine ayarlanır. Mantar aşısı daha sonra eklenir ve döner sistem, yeterli karıştırma ve oksijenasyonu sağlamak için 10 rpm'de çalışır. Sistem, mezofilik veya termofilik/termotolerant mantarlar için en uygun büyüme koşulları altında 6-8 gün inkübe edilir ve çok yönlülüğü arttırılır. İnkübasyondan sonra enzim, enzim tipine bağlı olarak uygun bir soğuk tampon (örneğin asetat, sitrat veya fosfat) kullanılarak kolayca ekstrakte edilir. Ekstrakt, hücresiz bir süpernatan elde etmek için santrifüjleme ve filtreleme yoluyla arıtılır. Enzim daha sonra gerektiği gibi daha fazla konsantre edilebilir veya saflaştırılabilir. Sonuçlar, batık fermantasyona (SmF) kıyasla enzim aktivitesinde 4-6 kat artış gösterdi ve bu da sistemin etkinliğini vurguladı. Farklı substratlara, indükleyicilere ve mantar türlerine uyarlanabilirliği, onu çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için değerli bir araç haline getirir.

Introduction

Katı hal fermantasyonu (SSF), yüksek değerli enzimler, biyoaktif bileşikler ve ikincil metabolitler üretmek için umut verici ve sürdürülebilir bir biyodönüşüm teknolojisi olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, mikroorganizmaların minimum serbest su ile katı substratlar üzerinde büyümesini içerir, doğal ortamlarını simüle eder ve verimli metabolik aktivite sağlar¹. Bu protokolün birincil amacı, gelişmiş substrat kullanımı, oksijen difüzyonu ve proses ölçeklenebilirliği sağlayan döner bir SSF sistemi aracılığıyla enzim üretimini optimize etmektir. Bol miktarda bulunan bir tarımsal-endüstriyel yan ürün olan buğday kepeğinin temel substrat olarak kullanılması, tarımsal kalıntıların değerlendirilmesine katkıda bulunur ve döngüsel biyoekonomi uygulamalarını teşvik eder².

SSFdaha düşük enerji ve su tüketimi, daha yüksek ürün konsantrasyonu ve buğday kepeği, pirinç kabuğu ve şeker kamışı küspesi gibi çok çeşitli ucuz tarımsal kalıntılarla uyumluluk dahil olmak üzere batık fermantasyona (SmF) göre önemli avantajlara sahiptir³. Büyük hacimlerde su ve pahalı besin ortamı gerektiren SmF'den farklı olarak, SSF sistemleri, yalnızca mikrobiyal büyüme yüzeyleri olarak hizmet etmekle kalmayıp aynı zamanda mikrobiyal aktivite için gerekli besinleri de sağlayan katı matrislerden yararlanır. Ek olarak, SSF'deki sınırlı serbest su, kontaminasyon risklerini en aza indirerek onu endüstriyel ortamlarda enzim üretimi için daha sağlam bir seçenek haline getirir⁴. Operasyonel avantajlarına ek olarak,SSFbatık fermantasyona (SmF) kıyasla önemli çevresel ve ekonomik faydalar sunar. Çalışmalar, SSFsürekli çalkalama ve havalandırma gerektiren büyük su hacimlerinin olmaması nedeniyle su tüketimini %50-70 oranında azalttığını ve enerji maliyetlerini %30'dan fazla azalttığını bildirmiştir. Ayrıca, tarımsal-endüstriyel kalıntıların substrat olarak kullanılması, hammadde maliyetlerini en aza indirir ve tarımsal yan ürünleri yeniden kullanarak döngüsel ekonomi uygulamalarını teşvik eder ^2,4.

SSFverimliliği ve ölçeklenebilirliği açısından kapsamlı bir şekilde doğrulanmıştır. Örneğin, çalışmalar, SmF'ye kıyasla SSF kullanarak enzim aktivitesinde 4-6 kat artış bildirmiştir^ve bu tekniğin ekonomik ve çevresel avantajlarını vurgulamaktadır ^2,5. Ek olarak, enzim ekstraksiyonu tipik olarak daha az su ve daha az saflaştırma adımı gerektirdiğinden, aşağı akış prosesi basitleştirilmiştir. Bu, SSFoperasyonel maliyetleri ve çevresel etkiyi azaltmayı amaçlayan endüstriler için özellikle çekici⁶.

Bu protokolde açıklanan döner SSF sistemi, geleneksel statik SSF yöntemlerine göre çeşitli iyileştirmeler sunar. Statik sistemler genellikle düzensiz substrat kolonizasyonu ve oksijen sınırlaması gibi zorluklarla karşı karşıya kalırken, döner konfigürasyon kapsamlı karıştırma ve havalandırma sağlayarak tek tip mikrobiyal büyümeyi teşvik eder ^7,8,9. Örneğin, bu sistem, Aspergillus ve Trichoderma² gibi mantar türlerini kullanarak kitinazlar, amilazlar ve proteazlar gibi hidrolitik enzimler üretmek için başarıyla kullanılmıştır.

Bunun önemli bir özelliği SSF sistem uyarlanabilirliğidir. Buğday kepeğinin temel substrat olarak kullanılması, tarımsal-endüstriyel kalıntıların uygun maliyetli biyodönüşüm için potansiyelini göstermektedir³. Ayrıca, substratın kitin, kitosan ve nişasta gibi indükleyicilerle takviyesi, spesifik metabolik yolları^uyararak enzim sentezini daha da geliştirir ^2,10. Sistem ayrıca sporlar, miselyum ve peletler dahil olmak üzere farklı mantar formlarıyla uyumludur ve kullanıcıların süreci kendi özel gereksinimlerine göre uyarlamasına olanak tanır².

SSFgıda biyoteknolojisi, biyoyakıt üretimi ve çevresel iyileştirme gibi çeşitli alanlarda uygulama için geniş bir potansiyel sunar¹¹. Uygun maliyetli substratların, olağanüstü enzim verimlerinin ve yüksek proses esnekliğinin entegrasyonu, SSF'yi endüstriyel ölçekli biyoteknolojik yenilikler için temel bir yaklaşım olarak belirler.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yüzey hazırlığı

NOT: Alt tabaka özelliklerindeki önemli değişiklikleri en aza indirmek için ticari bir marka buğday kepeği kullanın. Her bir buğday kepeği partisi, birden fazla faktöre bağlı olarak değişir, bu da onu standartlaştırılması zor olan heterojen bir malzeme haline getirir ve bileşen içeriğinde dalgalanmalara yol açar. Standartlaştırılmış bir malzeme gerekiyorsa, alternatif bir matris seçin veya ihtiyaca göre ayarlamak için her bir buğday kepeği partisinin yakın bir kimyasal analizini yapın.

1. Organik madde kalıntılarını, kalıntıları ve tozu temizlemek için buğday kepeğini steril damıtılmış suyla üç kez yıkayın. Bu aynı zamanda fermantasyona müdahale edebilecek basit şekerleri de ortadan kaldırır.
2. Yıkanmış kepeği alüminyum bir tepsiye yayın ve 60 °C fırında 24 saat kurutun.
3. Kuruduktan sonra buğday kepeğini 50 mL'lik steril bir konik tüpe yerleştirin.

2. Aşının hazırlanması

NOT: Bu protokol, aşı hazırlama için üç yöntemi tanımlar: spor süspansiyonu, miselyum diskleri ile doğrudan aşılama ve hücresel süspansiyon. Doğru verim hesaplamaları için ilk aşı konsantrasyonunu belirleyin ve protein seviyelerini ölçün.

1. Spor süspansiyonunun hazırlanması
   1. Miselyum ile doyurulmuş 5 mm çapında bir agar diskini taze bir patates dekstroz agar plakasına aktarın. Plakayı 28 ° C'de 5-7 gün veya miselyum ortamı doyurana kadar inkübe edin. Bazı mantarlar daha uzun bir kuluçka süresi gerektirebilir.
   2. Plakaya 5 mL steril damıtılmış su ekleyin ve steril bir halka kullanarak sporları mekanik olarak ayırın.
   3. Spor süspansiyonunun 1:100 oranında seyreltilmesini hazırlayın. Bir Neubauer odasının ortasına 10 μL yerleştirin ve mikroskop altında sporları sayın. Odanın faktörüne ve seyreltmesine bağlı olarak spor konsantrasyonunu (sporlar / mL) hesaplayın.
2. Sıvı ortamda miselyum yetiştiriciliği
   1. Miselyum ile doyurulmuş 5 mm'lik bir agar diskini taze bir patates-dekstroz-agar plakasına aktarın ve doygunluğa kadar 28 ° C'de inkübe edin.
   2. Steril 125 mL'lik bir şişede ve otoklavda 25 mL patates-dekstroz suyu hazırlayın.
   3. Doymuş plakadan 5 mm'lik bir miselyum diskini steril et suyuna aktarın.
   4. Şişeyi, mantar suşuna bağlı olarak 24-48 saat boyunca 125 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Yavaş büyüyen mantarlar için kuluçka süresini uzatın.
   5. İnokulum için 2 mL ve kuru ağırlık tayini için 2 mL toplayın.
3. Miselyum disklerinin doğrudan aşılanması
   1. Miselyum ile doyurulmuş 5 mm'lik bir agar diskini taze bir patates-dekstroz-agar plakasına yerleştirin. Doygunluğa kadar 28 °C'de inkübe edin.
   2. Kuru ağırlığı belirlemek için bir miselyum diskini inokulum olarak ve diğerini kullanın.

3. SSF sisteminin hazırlanması

NOT: İndükleyiciler doğal veya ticari olabilir. Fermantasyon verimliliğini değiştirebilecek safsızlıkları en aza indirmek için saflaştırılmış ticari indükleyiciler tercih edilir. En az %90 bağıl nemi korumak için su ilavelerini ayarlayın.

1. Aşağıdaki bileşenleri 50 mL'lik steril bir konik tüpte birleştirin: 5 g kuru buğday kepeği; 0.2 g indükleyici (ör., ticari kitin); 5,5 mL su (indükleyicinin su emme kapasitesine göre ayarlayın); 16 g/L monobazik potasyum fosfat, 4 g/L sodyum sülfat, 2 g/L potasyum klorür, 1 g/L kalsiyum klorür, 400 mg/L çinko klorür, 60 mg/L borik asit, 40 mg/L sodyum molibdat, 150 mg/L magnezyum klorür, 100 mg/L demir klorür ve 400 mg/L bakır sülfat içeren 5 mL steril tuz çözeltisi.
2. Elektrot tabanlı bir higrometre kullanarak bağıl nemi ölçün ve minimum %90 nem sağlayın. Nem dağılımının temsili bir ölçümünü elde etmek için elektrot probunu doğrudan reaktöre değişen derinliklerde yerleştirin.
   1. %90'ın altındaysa nemi ayarlamak için aşağıdaki adımları izleyin:
      1. 10 g substrat başına 1 mL'lik artışlarla yavaş yavaş steril damıtılmış su ekleyin. Her eklemeden sonra, nemin eşit dağılımını sağlamak için iyice karıştırın.
      2. Alt tabakanın 10-15 dakika dengelenmesine izin verin. Nem seviyesini yeniden ölçün.
      3. %90'lık hedef neme ulaşılana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın. İşlem boyunca alt tabakayı aşırı ıslatmaktan kaçının.
   2. %90'ın üzerindeyse nemi ayarlamak için aşağıdaki adımları izleyin:
      1. Alt tabakayı steril bir ortamda ince bir şekilde yayın. (1) Alt tabakayı laminer hava akışına maruz bırakarak veya (2) 10-15 dakika boyunca 30 °C'de bir kurutma odasına yerleştirerek fazla nemi alın.
      2. Alternatif olarak, nemin eşit şekilde yeniden dağılmasını sağlamak için alt tabakayı nazikçe karıştırın. Tedaviden sonra nem seviyesini tekrar değerlendirin.
      3. Nem %90'a ulaşana kadar kurutma veya karıştırma adımını gerektiği kadar tekrarlayın. Fermantasyona yalnızca hedef neme ulaşıldığında devam edin.
3. Tüpü 15 psi'de 15 dakika otoklavlayın.
4. Soğuduktan sonra, substratı aşağıdakilerden biriyle aşılayın: 1 mL spor süspansiyonu (1 x 10^6-1 x 10⁷ spor / mL), 2 mL hücresel süspansiyon veya bir 5 mm miselyum diski.

4. Katı hal fermantasyon (SSF) prosedürü

NOT: Farklı zamanlarda kinetik etütler veya parametre değerlendirmeleri için, temsiliyeti sağlamak için her zaman noktası için ayrı tüpler hazırlayın.

1. Tüpleri 1 dakikalık döngülerde 5 dakika boyunca maksimum hızda girdaplayarak alt tabaka topaklanmasını önleyin.
2. Tüpleri yatay eksenli bir döner karıştırıcıya yerleştirin. Alt tabakanın tüplerin içinde serbestçe hareket ettiğinden emin olun. Mikseri 10 rpm'de çalışacak şekilde ayarlayın.
3. Karıştırıcıyı, mikroorganizmanın optimum büyüme sıcaklığında bir inkübatörde inkübe edin. Isıya duyarlı indükleyiciler kullanırken optimum enzimatik aktivite için bildirilen sıcaklığı koruyun.

5. Enzimlerin ekstraksiyonu

NOT: Ekstraksiyon temelleri, hücre dışı enzimin çözünürlüğüne ve pH-maksimum aktivitesine dayanmaktadır. SSF su ortamından kaçınırken, hücre dışı enzim katı matrisi çevreleyen suda yer alır, bu da konsantrasyonun SmF'den daha yüksek olduğu anlamına gelir. Bu bağlamda, en iyi ekstraksiyon tamponunun seçimi, istenen aktivitenin bilgisine bağlıdır. Ekstraksiyonların optimizasyonu, nihai enzim konsantrasyonuna ve kullanılan ekstraksiyon tamponunun tipine bağlıdır.

1. İstenen fermantasyon süresinden sonra, substratı 20 mL önceden soğutulmuş tamponda yeniden süspanse edin. Örnekler şunları içerir: kitinaz ekstraksiyonu için 0.1 M asetat tamponu, pH 5.6; Amilaz ekstraksiyonu için 0.02 M fosfat tamponu, pH 6.9.
2. Tüpleri döngüler halinde girdaplayın: maksimum hızda 1 dakika, ardından buz üzerinde 1 dakika. 10 kez tekrarlayın.
3. Süspansiyonu kağıt filtreler kullanarak filtreleyin ve bastırarak süpernatanı mekanik olarak çıkarın.
4. Süpernatanı, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyerek berraklaştırın.
5. Ham ekstraktı doğrudan kullanın veya enzimi kolon kromatografisi veya santrifüj filtreler aracılığıyla daha fazla saflaştırın. Michaelis sabitini (Km) ve maksimum enzimatik dönüşüm oranını (Vmax) belirlemek için kinetik çalışmalar da ^önerilir.12.

6. Optimizasyon süreci

NOT: İndükleyicilerin kalitesini ve konsantrasyonunu ve ayrıca aşının türünü ve konsantrasyonunu değerlendirerek ve ayarlayarak bu protokolü optimize edin.

1. İdeal fermantasyon süresini belirleyin ve verimliliği artırmak için ekstraksiyon adımlarını iyileştirin.
2. Sıcaklık, pH ve havalandırma dahil olmak üzere çevresel koşulları kontrol edin ve ince ayar yapın.
3. Enzim verimini ve stabilitesini artırmak için çeşitli tamponları ve ekstraksiyon koşullarını test edin.
4. En etkili değişkenleri belirlemek ve optimum enzim üretimini elde etmek için yanıt yüzeyi metodolojisi gibi istatistiksel analizler gerçekleştirin.

Results

Şekil 1A , 50 mL'lik altı konik tüp kapasitesine sahip olan bu sistemde kullanılan döner karıştırıcının şematik gösterimini sunmaktadır. Şekil 2B , katı hal fermantasyon işlemine girmeden önce şartlandırma sırasında buğday kepeğinde meydana gelen değişiklikleri göstermektedir. Görüldüğü gibi önemli bir yapısal değişiklik gözlenmedi.

Şekil 2, bu sistemdeki Trichoderma harzianum mantarı tarafından ...

Discussion

Bu çalışma, filamentli mantarlar için özel olarak tasarlanmış katı hal fermantasyon (SSF) sistemleri aracılığıyla enzim üretimini optimize etmek için ilgili bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Aşağıda, metodolojinin kritik yönleri, önemi, sınırlamaları ve potansiyel uygulamaları ile birlikte tartışılmaktadır.

Protokolün başarısı büyük ölçüde substratın ve aşının hazırlanması gibi önemli adımlara bağlıdır. Buğday kepeğinin uygun şekilde yıkanması ve kurut...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyer şişesi	Sigma-Aldrich	CLS431684	Sıvı ortamda miselyum kültürü için.
50 mL konik tüp	Sigma-Aldrich	CLS430921	Substratları ve aşıyı saklamak ve hazırlamak için.
Asetat tamponu, pH 5,6	Sigma-Aldrich	320866	Kitinaz ekstraksiyonu için.
Centricon filtreleri	Kırlangıç	UFC905024	Enzimlerin daha fazla saflaştırılması için.
Hücre odasını sayma	Sigma-Aldrich	Z359629	Mikroskop altında sporları saymak için kullanılır.
Filtre kağıdı	Ne adam	1001-110	Enzim ekstraktını filtrelemek için.
Higrometre	Todomikro	-	Alt tabakanın bağıl nemini ölçmek için.
İndükleyici (örneğin, ticari kitin)	Sigma-Aldrich	C9752 Serisi	Fermantasyon sırasında enzim üretimini arttırmak için kullanılır.
Fosfat tamponu, pH 6,9	Sigma-Aldrich	P5379	Amilaz ekstraksiyonu için.
Patates-dekstroz agar	Sigma-Aldrich	P2182	Mantar miselyumu yetiştirmek için kültür ortamı.
Patates-dekstroz suyu	Sigma-Aldrich	P6685 (İngilizce)	Mantar miselyumu yetiştirmek için sıvı kültür ortamı.
Döner karıştırıcı	Termo-Fisher Bilimsel	88-861-051	Fermantasyon sırasında substratın hareket etmesini sağlamak için.
Tuz çözeltisi bileşenleri (örneğin, KH2PO4, Na2SO4, KCl, vb.)	Sigma-Aldrich	Çoklu	Steril tuz çözeltisi hazırlamak için protokoldeki ayrıntılı tarife bakın.
Buğday kepeği	Ticari pazar	-	Katı hal fermantasyonu için substrat.