Yöntem makalesi

Mantar Patojenlerinde Geliştirilmiş ChIP-seq ve Transkriptomik Analiz Araçları Olarak Tepe Arama Algoritmaları (WonderPeaks ve PeakStream)

DOI:

10.3791/68301

⸱

8 Ağustos 2025

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of California, San Francisco

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, RNA-seq ve ChIP-seq verilerini analiz etmek için yeni bir hesaplama aracı olan WonderPeaks'i tanıtmaktadır. Bu araç, sıralama verilerindeki zirveleri (okuma yığınları) başarıyla tanımlayarak, RNA-seq'te çevrilmemiş bölge sınırlarının karakterizasyonunu sağlar ve ChIP-seq'te kromatin zenginleşmesini tespit ederek mantar patojen araştırmaları için değerli bilgiler sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkriptomik ve transkripsiyon düzenleyici aktivite yoluyla gen ekspresyonundaki değişiklikleri karakterize etmek, mantar patogenezinde yer alan çeşitli yanıtları anlamak için temel bir yaklaşım haline gelmiştir. Bu makale, mantar patojenlerinde, özellikle sınırlı genomik açıklamaya sahip model olmayanlarda transkripsiyonel düzenleme çalışmasındaki temel zorlukları ele almak için tasarlanmış iki hesaplama aracını tanıtmaktadır. İlk olarak, Chromatin ImmunoPrecipitation'daki zenginleştirilmiş zirveleri ve ardından dizilemeyi (ChIP-seq) belirlemek için yeni nesil dizileme (NGS) deneylerinden eşlenmiş genomik verilerin ilk türevinden yararlanan yeni bir tepe çağırma algoritması olan WonderPeaks'i sunuyoruz. İkinci olarak, poli(A) astarlı kitaplık hazırlığı kullanılarak oluşturulan transkriptomik verilerde 3' çevrilmemiş bölgelere (UTR'ler) açıklama eklemek için WonderPeaks'in bir uzantısı olan PeakStream'i tanıtıyoruz. Bu araçlar birlikte, mantarlarda transkripsiyon düzenlemesini inceleyen araştırmacılar için kullanıcı dostu bir çözüm sunan uçtan uca bir veri analizi hattı sağlar. Mantar patojeni Candida albicans'tan elde edilen verilerle etkinliklerini gösteriyoruz, ChIP-seq verilerindeki doğrulanmış zirveleri başarıyla tanımlıyoruz ve aynı koşullar altında toplam RNA dizileme verileriyle karşılaştırarak doğrulanmış UTR'lere açıklama ekliyoruz. Ayrıca, mevcut son teknoloji yöntemlerle karşılaştırıldığında ChIP-seq verileri için WonderPeaks'in sınırlamalarını tartışıyor ve gelecekteki iyileştirmeler için yönergeler öneriyoruz. Sonuç olarak, bu çalışma, patojenik mantarlar ve daha geniş genomik çalışmalardaki potansiyel uygulamalarla doğrudan ilgili olarak, transkripsiyonel düzenlemeyi incelemek için pratik rehberlik ve güçlü kaynaklar sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mantar patojenleri, son yıllarda artan enfeksiyonlarla birlikte ortaya çıkan küresel bir sağlık sorunudur1. Bu patojenlerin çoğu yüksek antifungal direnç sergiler ve önemli ölüm oranları ile ilişkilidir2. Bununla birlikte, model mantar organizmalarıyla karşılaştırıldığında, birçok patojenik mantar zayıf bir şekilde karakterize edilmeye devam etmekte ve bu da patojenite mekanizmaları hakkında daha fazla araştırmaya duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Kromatin İmmünopresipitasyon Dizileme (ChIP-Seq) ve RNA-Dizileme (RNA-Seq) gibi yeni nesil dizileme (NGS) teknikleri, mantar patojenitesinin altında yatan gen ekspresyonunun moleküler mekanizmalarının ortaya çıkarılmasında kritik bir rol oynamaktadır.

NGS verilerinden elde edilen içgörülerin kalitesi, büyük ölçüde ham veri analizi için kullanılan yazılımın doğruluğuna bağlıdır. NGS veri analizinin önündeki en önemli zorluklar arasında, çok çeşitli kütüphane hazırlama ve sıralama teknikleri nedeniyle özellikle karmaşık olan ve evrensel bir çözümü pratik olmayan hale getiren zenginleştirilmiş NGS okumalarının bölgelerini doğru bir şekilde tanımlayan tepe çağrısı yer almaktadır. Daha yeni sürümü olanMACS3 de dahil olmak üzere MACS algoritması 3, ChIP-seq veri kümelerini analiz etmek için yaygın olarak altın standart olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, MACS, evrensel olarak uygulanamayabilecek ve analizden önce belirlenmesi zor olan minimum tepe uzunluğu ve maksimum boşluk gibi kullanıcı tanımlı parametrelere dayanır. Özellikle, en son MACS3 sürümü, kullanıcıların yoğun aramadan önce parametreleri tahmin etmelerine olanak tanıyan bir kesme analizi özelliği içerir. Gelişmiş performans için kullanıcılar, kromatin yapısı veya kopya sayısı varyasyonu nedeniyle yanlılığa neden olduğu bilinen "kara listeye alınmış" genomik bölgelerin bir listesini de sağlayabilir. MACS, ChIP-seq verileri için en yaygın kullanılan ve güvenilir tepe arama aracı olmaya devam ederken, özellikle son derece özel parametre ayarları gerektiren durumlar için birkaç alternatif algoritma mevcuttur.

RNA-Seq, doku kültürü veya fare enfeksiyonu modellerinde olduğu gibi in vivo büyüme sırasında patojenik mantarların gen ekspresyon tepkilerini incelemek için paha biçilmez bir tekniktir 4,5,6,7. Bu koşullarda doğru diferansiyel ifade analizi için yüksek bir sıralama derinliği gereklidir ve bu da maliyet ve kaynak açısından engelleyici olabilir 8,9. cDNA üretimi için mRNA'nın poli(A)-kuyruklarına tavlamak üzere tasarlanmış primerleri kullanan poli-adenilasyon (poli(A))-astarlama Dizileme (3'RNA-Seq) gibi kütüphane hazırlama yöntemleri, gen ekspresyon analizi10 için gereken dizileme derinliğini azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, özellikle poli(A)-hazırlama olaylarından gelen zirvelerin tipik olarak11'de bulunduğu 3' Çevrilmemiş Bölgelerin (UTR'ler) yüksek kaliteli genom açıklamalarına dayanır. Az çalışılmış birçok mantar patojeninin genom açıklamaları, herhangi bir UTR açıklamasından yoksundur, bu da bu organizmalarda 3'RNA-Seq kullanımını zorlaştırır. Ek olarak, tek bir gen için UTR uzunluğu, farklı büyüme koşulları ve hücre tipleri arasında dinamik olabilir12,13. UTR'leri tanımlamak ve açıklama eklemek için bir dizi yeni analiz aracı geliştirilmiş olsa da, bunların çoğu, gen organizasyonu mantarlarınkinden büyük ölçüde farklı olan veya transkriptom analizi yapmak isteyen bir araştırmacı için zaman ve maliyetleri artırabilecek tek hücreli veya ters mRNA dizilimi gibi bağımsız dizileme deneylerinden veri gerektiren memeli veri kümeleri için tasarlanmıştır12, 14,15.

Bu yazıda, NGS veri kümelerindeki tepe noktalarını dinamik olarak çağırmak için kullanılabilen, ilk türevin ilkeleri üzerine tasarlanmış yeni bir tepe arama yazılımı olan WonderPeaks'i sunuyoruz (Şekil 1). WonderPeaks , kapsama sinyalinin ilk türevini hesaplayarak ve potansiyel zirveleri tanımlamak için bu değeri (zirvenin eğimi) kullanarak zirveleri tanımlar. Algoritma, ilk türevin kullanıcı tarafından sağlanan veya veri tarafından çıkarılan bir eğim eşiğinin üzerinde yerel bir maksimum sergilediği (artan bir sinyali gösterir), ardından aynı eşiğin üzerinde bir yerel minimum (azalan bir sinyali gösterir) sergilediği durumları arar ve böylece veri kümesindeki tüm aday zirveleri algılar. ChIP-seq uygulamaları için WonderPeaks, benzersiz şekilde zenginleştirilmiş tepe noktalarını belirlemek için test ve kontrol numuneleri arasındaki tüm aday tepe noktalarını karşılaştırır. WonderPeaks'i mantar patojeni Candida albicans16'daki bir transkripsiyon faktörünün daha önce yayınlanmış bir ChIP-seq veri setine uygulayarak, orijinal çalışmada vurgulanan anahtar genlerin yukarı akışındaki zirveleri başarılı bir şekilde tanımlama yeteneğini gösterdik ve aynı zamanda algoritmanın bu uygulamadaki mevcut sınırlamalarını tartıştık.

Ayrıca, 3'RNA-Seq veri kümelerindeki zirveleri belirlemek için WonderPeaks'ten yararlanan bir yazılım aracı olan PeakStream'i de tanıtıyoruz. 3'RNA-Seq kütüphaneleri, doğru 3' UTR açıklamalarına bağlıdır, çünkü poli(A)-hazırlama yoluyla oluşturulan okumalar genellikle genlerin kodlama dizilerinin (CDS) durdurma kodonunun ötesine uzanır ve bu nedenle, yalnızca kodlama bölgelerine odaklanan standart açıklamalar kullanılırken sayılmaz. PeakStream analiz hattı, gen kodlama dizisi (CDS) bölgelerinin aşağı akışındaki bölgelere odaklanarak 3' RNA-Seq verilerini kullanarak yeni genom açıklamaları oluşturmak için tasarlanmıştır. PeakStream, bu tepe noktalarını genlere atayarak, aşağı akış okuma sayma programlarında kullanılmak üzere yeni bir genom ek açıklaması oluşturur. PeakStream kullanımının, 3'RNA-Seq C. albicans veri setindeki uygun gene aşağı akış poli(A) tarafından oluşturulan tepe noktalarını doğru bir şekilde tanımlayabildiğini ve atayabildiğini gösteriyoruz. PeakStream ayrıca, olası yeni transkriptlerin keşfedilmesini kolaylaştırarak, mevcut herhangi bir mevcut gen ek açıklamasıyla ilişkili olması muhtemel olmayan tepe noktalarına açıklama ekler. PeakStream ve WonderPeaks birlikte, yeni nesil dizileme (NGS) veri kümelerinde tepe tespiti için güçlü bir kullanıcı dostu araçlar paketini temsil eder.

figure-introduction-1
Şekil 1: WonderPeaks ve PeakStream tarafından yapılan zirve çağrısına genel bakış şekli. Sol: İlk türevi kullanarak zirve çağrısı. Sağ Üst: WonderPeaks kullanarak ChIP-Seq veri kümelerinde tepe çağrısı. Sağ Alt: PeakStream kullanarak RNA-Seq veri kümelerinde tepe çağrısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kurulum (tamamlandıysa atlayın)

  1. Önkoşullar
    1. Ön işlemeyi (bölüm 5) ve WonderPeaks'i (bölüm 6 veya bölüm 7) çalıştırma gereksinimlerini yüklemek için Anaconda veya Minconda'yı yükleyin.
      NOT: Anaconda için bir kullanım kılavuzu için referans16'ya bakın.
    2. Python'u yükleyin: Python'u Anaconda veya Miniconda içinde yükleyin.
    3. Bu yöntemdeki tüm işlevleri yürütmek için Jupyter Notebooks'u yükleyin.
      NOT: Jupyter Notebook'lar için yeni başlayanlar için bir kullanıcı kılavuzu referans17'de bulunabilir.
      DİKKAT: Mantar genomları (≤100 Mbp) için en az 20 çekirdek, 8 GB RAM ve 30 GB kullanılabilir disk alanı olan bir bilgi işlem ortamı sağlayın.
  2. Önişleme işlevlerini yükleyin.
    1. Terminalde şunu çalıştırın: conda create -n WP_preprocessing
    2. Terminalde şunu çalıştırın: conda activate WP_preprocessing
    3. Terminalde şunu çalıştırın: conda env update --file environment.yml --name
      NOT: environment.yml , tüm paket bağımlılıklarını içeren ve https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing.git indirilmesi gereken bir dosyadır.
    4. Terminalde şunu çalıştırın: pip install WonderPeaks-preprocessing
    5. Terminalde şunu çalıştırın: conda devre dışı bırakma WP_preprocessing
  3. WonderPeaks İşlevlerini Yükleyin:
    1. Terminalde şunu çalıştırın: conda create -n WonderPeaks
    2. Terminalde şunu çalıştırın: conda WonderPeaks'i etkinleştirin
    3. Terminalde şunu çalıştırın: conda env update --file environment.yml --name
      NOT: environment.yml , tüm paket bağımlılıklarını içeren ve https://github.com/mgarber21/WonderPeaks.git indirilmesi gereken bir dosyadır.
    4. Terminalde şunu çalıştırın: pip install WonderPeaks
    5. Terminalde şunu çalıştırın: conda WonderPeaks'i devre dışı bırak
      NOT: Adım 1.2 ve 1.3 aşağıdakileri gerçekleştirir: Ön işleme (bölüm 5) ve WonderPeaks (bölüm 6 ve 7) için özel bir Conda ortamı oluştururlar ve diğer yazılımlarla çakışmaları önlemek için bağımlılıkları izole ederler. Ortamı etkinleştirirler , WP_preprocessing veya WonderPeaks'e özgü işlevleri yüklemek ve çalıştırmak için ayarlarlar. Verilerin ön işlenmesi için gereken yazılım bağımlılıklarını ve araçları yüklerler . Yanlışlıkla değişiklik yapılmasını önlemek ve sistem kaynaklarını boşaltmak için kullanılmadıklarında ortamı devre dışı bırakırlar .
  4. Jupyter Notebooks'u ve şablonları WonderPeaks GitHub deposundan indirin. WonderPeaks indirmelerini ham verileri içeren işletim sistemine yükleyin (dizin 2. bölümde oluşturulacaktır).
    NOT: Jupyter Notebooks, ön işleme, WonderPeaks ve PeakStream iş akışlarını çalıştırmak için gerekli önceden yazılmış betikler ve şablonlar içerir. Bunları ham verilerle aynı sisteme yüklemek, yolların ve dizinlerin doğru şekilde hizalanmasını sağlar.

2. Bir veri dizini oluşturun

NOT: WonderPeaks ve PeakStream iş akışları, tüm verilerin (ham ve işlenmiş) aynı dizinde depolanmasını gerektirir. Bu adımda, bu yeni dizinin ({data_directory} = /path/to/your/data) nasıl oluşturulacağı ve deneysel ham verilerin (işlenmemiş sıralama okumaları) bu dizin içindeki raw_data adlı bir klasöre nasıl taşınacağı açıklanmaktadır.

  1. Bir veri dizini oluşturun.
    1. Terminalde mkdir {data_directory} komutunu çalıştırın (ör. mkdir /path/to/your/data)
  2. İşlenmemiş sıralama okumaları için bir ham veri alt dizini oluşturun.
    1. Terminalde mkdir {data_directory}/raw_data komutunu çalıştırın (ör. mkdir /path/to/your/data /raw_data)
  3. İşlenmemiş sıralama okumalarını ham veri dizinine taşıyın.
    1. Terminalde mv {current_path_to_raw_data}/*fastq* {data_directory}/raw_data (örn. mv current/data/path/*fastq* /path/to/your/data /raw_data

3. Kullanıcı girişleri dosyasını oluşturun (NGS_user_input.csv)

NOT: Giriş dosyası, ön işleme ve WonderPeaks'i çalıştırmak için kullanıcı tarafından oluşturulan yapılandırmaları belirtir.

  1. WonderPeaks GitHub deposundan şablon NGS_user_inputs.csv indirin.
  2. NGS_user_inputs.csv'daki alanları güncelleştirin. Alanları aşağıdaki gibi güncelleştirin:
    Veri dizini: /path/to/your/data
    Genom dizini: /path/to/your/genome
    Genom fasta: genome.fasta
    Genom ek açıklaması: genome_annotation.gtf (genom ek açıklamasının dosya adını GTF formatında sağlayın)
  3. Güncellenen NGS_user_inputs.csv 2. bölümde oluşturulan veri dizinine kaydedin.
    DİKKAT: Dosya adını değiştirmeyin; WonderPeaks, bu dosyayı yalnızca NGS_user_input.csv olarak adlandırılmışsa tanıyacaktır.

4. Meta veri dosyası oluşturun (NGS_user_metadata.csv)

NOT: Meta veri dosyası, denemeyle ilgili tüm bilgileri depolamak için kullanılır. Denemenin koşullarını açıklamak için ek sütunlar eklenebilir, ancak bunlar sonraki adımları etkilemeyecektir.

  1. WonderPeaks GitHub deposundan şablon NGS_user_metadata.csv indirin.
  2. NGS_user_metadata.csv'daki alanları güncelleştirme Alanlar aşağıdaki gibidir:
    1. file: Dosya adında boşluk olmadığından, dosya tanıtıcısını (ör. fastq, fastq.gz) içerdiğinden ve mutlak yolu içermediğinden emin olun.
    2. bedgraph: Bu alanı TRUE veya FALSE olarak ayarlayarak dosyanın PeakStream'e dahil edilip edilmeyeceğini belirtin.
      1. Dosyanın PeakStream analizinden makul bir şekilde hariç tutulabildiği durumlarda bedgraph alanını FALSE olarak ayarlayın. Örneğin, bir RNAseq deneyinde, mutantlar veya numuneler arasında UTR farklılıklarının beklenmediği diğer durumlar için bedgraph=FALSE bedgraph parametresini ayarlayın. Ancak, bir RNAseq denemesindeki tüm denetim dosyaları ve bir ChIPseq denemesindeki tüm dosyalar için temel grafik alanını TRUE olarak ayarladığınızdan emin olun.
    3. tasarım faktörü
      1. designfactor1: Deneysel tasarımla ilgili bir tasarım faktörü belirtin (örneğin, tedavi veya sample_type).
      2. designfactor2: Deneysel tasarımla ilgili ikinci bir tasarım faktörü belirtin (örneğin, gerinim veya epitop). Bir RNAseq deneyi için, tipik tasarım faktörleri olarak tedavi ve suşu dahil edin. Tedavi sütunu uygulanan tedavileri listeler (ör. kontrol, ilaç1) ve suş sütunu suş bilgilerini listeler (ör. vahşi tip, mutant). Bir ChIPseq denemesi için, tipik tasarım faktörleri olarak sample_type ve epitopu ekleyin. sample_type sütunu, proteinin etiketli mi yoksa etiketsiz mi olduğunu listeler ve epitop sütunu, kullanılan epitopun adını listeler.
        NOT: tasarım faktörleri , deneysel tasarıma özgü özelliklerdir.
        WonderPeaks, temel olarak etiketlenmemiş kontrollerle veya giriş kontrolleriyle uyumludur.
      3. Tasarım faktörü sütunlarının benzersiz çoğaltma numarası içermediğinden emin olun (örneğin, sample_type: [etiketli, etiketli, untagged_control, untagged_control] sample_type: [tagged_1, tagged_2, untagged_control _1, untagged_control _2] değil. Benzersiz çoğaltma numaralarının sağlanması, çalıştırma sırasında hataya neden olur.
      4. Tasarım faktörü adlarında boşluk yerine alt çizgi (_) kullandığınızdan emin olun.
      5. ChIPseq uygulaması için, meta veri dosyasındaki sample_type (veya özel ad) sütununun sözcük etiketi ve denetimi içeren terimler içerdiğinden emin olun.
        NOT: Örneğin, geçerli girişler etiketli ve untagged_control içerebilir. Bu terimler olmadan bir sample_type sütunu sağlamak, çalıştırma sırasında hataya neden olur.
        DİKKAT: ChIP uygulaması için kullanıcının iki tasarım faktörü belirtmesi gerekir.
      6. Tasarım faktörlerini ilgili NGS_user_inputs.csv satırına ekleyin. Tasarım faktörleri için kullanılan sütun adlarının noktalı virgülle ayrılmış dize olarak listelendiğinden emin olun (örneğin, tedavi; suş veya sample_type; epitop).
        DİKKAT: NGS_user_inputs.csv'daki tasarım faktörleri , NGS_user_metadata.csv sütunlarıyla tam olarak eşleşmelidir. Eşleşmeyen herhangi bir çalıştırma, çalıştırma sırasında bir hataya neden olur (Şekil 2, Ek Tablo S1 ve Ek Tablo S2).

figure-protocol-1
Şekil 2: Örnek NGS_user_input.csv ve NGS_user_metadata.csv. Designfactor ve designfactor sütunları arasındaki eşleşmeyi pembe veya mavi metin ve oklarla vurgulayan NGS_user_input.csv (üst panel) ve NGS_user_metadata.csv (alt panel) örnekleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. NGS verilerinin ön işlenmesi

NOT: Özel ön işleme kullanıyorsanız bölüm 5 veya bölüm 6'ya atlayın.

  1. NGS ön işleme Jupyter Notebook'u (NGS_Preprocessing.ipynb) açın.
  2. Not defteri arabiriminin sağ üst köşesinde WP_preprocessing ortamı (adım 1.2'de oluşturulan) etkinleştirin.
  3. Shift tuşunu basılı tutarak ve ardından Enter (Shift+Enter) tuşlarına basarak ilk hücreyi yürütün.
  4. Jupyter Notebook'un ikinci hücresinde, Directory = "path/to/your/data" ayarını yaparak dizin yolunu güncelleştirin, burada path/to/your/data/ bölüm 2'de oluşturulan dizindir.
  5. Hizalama dosyaları oluşturun. Ön işleme işlevleri, FastP18 kullanarak Kırpma gerçekleştirecektir; FastQC19 ve MultiQC20 kullanarak Kalite Kontrol; STAR21 kullanarak hizalama. Çıktı hizalama dosyaları, veri dizini içinde startout adlı bir alt dizine kaydedilir (örneğin, path/to/your/data/starout); Filtreleme (veyaptional) Samtools view22'yi kullanarak, hizalama dosyasını yalnızca NGS_user_inputs.csv'da belirtilen bir eşiğin üzerindeki okumaları tutacak şekilde filtreleyin.
    NOT: Bu işlevler, bir seferde veri kümesinin yalnızca tek okumalarını (örneğin, R1) işleyecektir. Kullanıcılar, NGS_user_inputs.csv içinde FastP ve STAR için çalıştırma seçeneklerini belirleyebilir (örneğin, FastP: adapter_sequence (isteğe bağlı); STAR: genomeDir, genomeFastaFiles, sjdbGTFfil).
  6. Shift + Enter tuşlarını kullanarak ikinci hücredeki ön işleme işlevlerini yürütün.
    NOT: İkinci hücredeki görevlerin tamamlanması birkaç saat sürebilir. Çalıştırma kesintiye uğrarsa, çalıştırmayı yeniden başlatmak için 5.3-5.6 arasındaki adımları yineleyin. Önceki adımlardan elde edilen ilerlemenin üzerine yazılmaz ve işlem kaldığı yerden devam eder.
  7. BamCoverage23'ü kullanarak hizalama kapsamının izleme dosyalarını oluşturun (bkz. adım 5.7.1 ve 5.7.2).
    NOT: ChIPseq için WonderPeaks, hem ileri hem de geri okumalar için kapsama alanı içeren tek bedgraph dosyaları gerektirir. Poly(A) astarlamalı RNAseq için PeakStream, biri ileri okumalar (_fwd.bedgraph) ve diğeri ters okumalar (_rev.bedgraph) için olmak üzere iki bedgraph dosyası gerektirir. İleri ve geri okumalar, BamCoverage23 içindeki filterRNAstrand parametresi kullanılarak oluşturulur.
    1. Aşağıdaki parametreleri kullanarak ChIPseq: outfilfeformat="bedgraph", strand=None, binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      NOT: Çıktı: Hem ileri hem de geri okumalar için kapsam içeren tek bedgraph dosyaları üretir. Çıktı /path/to/your/data/bedgraphout içinde saklanır (Şekil 3).
      1. Shift + Enter tuşlarını kullanarak üçüncü hücrede BamCoverage işlevini yürütün.
    2. Aşağıdaki parametreleri kullanarak RNAseq: outfilfeformat="bedgraph", strand="forward" veya "reverse", binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      DİKKAT: Her iki yönde de okumalar için dosyalar oluşturmak için iplik ileri veya geri olarak ayarlanmış olarak işlevi iki kez yürüttüğünüzden emin olun.
      NOT: Çıktı: İki bedgraph dosyası oluşturur: biri ileri okumalar için (_fwd.bedgraph) ve diğeri ters okumalar için (_rev.bedgraph). Çıktı, /path/to/your/data/ bedgraphout içinde saklanır (Şekil 3).
      1. Shift + Enter tuşlarını kullanarak üçüncü hücrede BamCoverage işlevini yürütün.

figure-protocol-2
Şekil 3: WonderPeaks için dosya organizasyonu. bedgrapghout/normalizeUsingCPM dizinindeki bedgraph dosyalarının bulunduğu veri klasörünün ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. ChIPseq için WonderPeaks

  1. Ön kontrol
    1. filehandle .bedgraph içeren tüm bedgraph dosyalarının, bedgraphout adlı veri dizini içinde bir alt dizinde olduğunu onaylayın (Şekil 3).
    2. user_inputs dosyasındaki (NGS_user_inputs.csv) (Şekil 2) designfactors'un meta veri dosyasındaki (NGS_user_metadata.csv) sütunlarla eşleştiğini ve designfactor sütunlarının satırlarının benzersiz olmadığını onaylayın (adım 4.2.4'teki uyarıya bakın).
  2. NGS ön işleme Jupyter Notebook'u (WP4ChIP.ipynb) açın.
  3. Dizüstü bilgisayar arayüzünün sağ üst köşesinde WonderPeaks'i (adım 1.3'te oluşturulan ortam) etkinleştirin.
  4. Tepe çağrısını çalıştırmak için kesme noktasına kadar Shift + Enter tuşlarını kullanarak hücreleri yürütün. Tamamlandığında, işlenen verilerin bir kaydı kaydedilecek ve WonderPeaks adlı veri dizini içindeki bir alt dizinde saklanacaktır
    1. WOnder_init.csv arayın: tüm ham kapsamın ve ilk türevin hesaplanmasından elde edilen sonuçların bir birleşimi.
    2. Not WOnder_unfiltered_peaks.csv: ilk türeve dayalı olarak çağrılan tüm filtrelenmemiş tepe noktalarının birleşimi.
    3. Observe bedgraph_summary.csv: her dosyayı ve kromozomu gruplandırdıktan sonra skor istatistiklerinin bir özeti.
  5. Çalıştırma parametrelerini tanımlayın:
    1. Markdown kesme noktasının altındaki 1. hücreyi çalıştırın.
      NOT: Belirtilen tasarım faktörlerine göre ayrılmış ham verileri gösteren bir çizim ve tasarım faktörlerini gösteren bir tablo açılır; sonraki adımlarda değerleri belirlemek için tabloyu ve çizimi kullanın (Şekil 4).
    2. Sonraki hücrede score_cut, fold_change ve designfactor değerlerini belirtin (Şekil 4).
      1. score_cut , çıktıda bir tepe noktasının dikkate alınıp alınmayacağını belirlemek için kullanılan eşik değeridir. score_cut belirlemek için grafiği gözlemleyin ve etiketlenmiş verilerin medyanına yakın bir değer seçin (bkz. karma satır, Şekil 4). Bu değeri aşağıdaki gibi girin: score_cut= değer.
      2. fold_change , bir zirvenin gerçek olarak kabul edilip edilmediğini belirlemek için kullanılan tagged:untagged oran puanlarının eşik değeridir. fold_change belirlemek için grafiği gözlemleyin ve etiketlenmemiş ve etiketlenmiş verilerin medyanlarının oranının üzerinde bir değer seçin. Bu değeri şu şekilde girin: fold_change= değer.
      3. designfactor_value , deneysel tasarımın bir parçası olarak belirtilmiştir. Olası tasarım faktörleri yazdırılan tabloda kırmızı renkle listelenmiştir. Tasarım faktörünü belirlemek için kırmızı ile listelenen değerlerden birini seçin. Tırnak işaretleri arasına bu değeri şu şekilde girin: designfactor_value ="{ value}".
  6. Tepe filtrelemeyi ve eşlemeyi çalıştırmak için Shift + Enter tuşlarını kullanarak sonraki hücreleri yürütün. Veriler ve özet grafikler, WonderPeaks adlı veri dizini içindeki bir alt dizinde saklanacaktır.
    1. {designfactor_value}_taggedVuntagged.csv gözlemleyin: Etiketli ve etiketsiz örneklerin her biri için sütunla birlikte çakışan tüm tepe noktalarının bir pivot tablosu.
    2. Not {designfactor_value}_all_tagged_peaks.csv: Kullanıcı parametrelerine dayalı olarak tüm gerçek zirvelerin bir özet tablosu (adım 6.5).
    3. {designfactor_value}_peaks2gtf.csv'yi gözlemleyin: Kullanıcı parametrelerine (adım 6.5) dayalı olarak gerçek tepe noktalarının, kullanıcı tarafından belirlenen ek açıklamalar dosyasındaki genlerle eşlenmesi.
  7. İsteğe bağlı: 6.5-6.6 arasındaki adımları yeniden yürüterek adım 6.5'teki parametreleri değiştirin. Aynı designfactor_value kullanılıyorsa, adım 6.6'da açıklandığı gibi oluşturulan dosyaların üzerine yazılır.

figure-protocol-3
Şekil 4: ChIP-seq için WonderPeaks'te designfactor_value ve kullanıcı tarafından belirlenen eşikleri vurgulayan ekran görüntüsü. WonderPeaks jupyter not defterinin ekran görüntüsü, görüntülenen tablodaki olası designfactor_value seçeneklerini ve designfactor_value sonraki hücrede nasıl uygulanacağını vurguluyor. Üstteki siyah ok, olası designfactor_value girişlerini gösteren bir tabloya işaret eder; Op değeri daire içine alınır ve seçenekler hücresinde (alttaki siyah ok) designfactor_value için seçilen kullanıcı girişi olarak gösterilir. Grafikte, düz ve kesikli çizgiler, opak hücre deneylerinde sırasıyla etiketli ve etiketsiz örnekler için yaklaşık medyan tepe puanlarını gösterir. Bu medyanlar, score_cut (etiketli medyan) ve fold_change (etiketli medyanların etiketlenmemiş medyanlara oranı) parametrelerini tanımlamak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. 3'RNAseq için PeakStream

  1. Ön kontrol:
    1. Tüm bedgraph dosyalarının, bedgraphout adlı veri dizini içindeki bir alt dizinde olduğunu onaylayın (Şekil 2).
    2. NGS ön işleme Jupyter Notebook'u (PeakStream.ipynb) açın
    3. Dizüstü bilgisayar arayüzünün sağ üst köşesinde WonderPeaks'i (adım 1.3'te oluşturulan ortam) etkinleştirin.
  2. Tepe çağrısını ve tepe eşlemeyi çalıştırmak için kesme noktasına kadar Shift + Enter tuşlarını kullanarak hücreleri yürütün. Tamamlandığında, tahmini 3' UTR ve FeatureCounts24 okuma sayısı dosyasına sahip yeni bir açıklama dosyası kaydedilecek ve veri dizininizdeki PeakStream adlı bir alt dizinde saklanacaktır (Şekil 5).
    NOT: Varsayılan olarak, çıktı dosyası yalnızca protein kodlayan biyotipler için ek açıklamalar içerecektir, ancak bu, biyotip seçeneği kullanılarak değiştirilebilir.

figure-protocol-4
Şekil 5: PeakStream için dosya organizasyonu. bedgrapghout dizinindeki bedgraph dosyalarının bulunduğu veri klasörünün ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Harikalar Tepeleri
Bir ChIP-seq deneyi gerçekleştirdikten sonra, araştırmacılar, epitop etiketli bir DNA bağlayıcı protein tarafından zenginleştirilmiş genomik bölgeleri tanımlamak için genellikle MACS3 gibi tepe çağrıcıları kullanırlar. WonderPeaks'i, yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak zirveleri belirlemek için tasarlanmış, kullanıcı dostu bir tepe arayan olarak geliştirdik.

WonderPeaks, önce kapsamın ilk türevini hesaplayarak zirveleri tanımlar ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni nesil dizileme (NGS) teknikleri, mantar patojenlerinde gen regülasyonu ve ekspresyonu hakkında benzersiz bir bakış açısı sağlar. Bu nedenle, hesaplama araçları hem kapsamlı olmalı - bir deneyde üretilen tüm verileri yakalamalı - hem de genel kullanıcılar, özellikle de tezgah bilimcileri tarafından erişilebilir olmalıdır. Bu raporda, ChIP-seq ve RNA-seq iş akışlarında mantar patojeni araştırmacıları için bu ihtiyaçları karşılayan WonderPeaks ve PeakStream adlı iki aracı tanıttık.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) RO1AI175080 ve R01GM037049 hibeleri (Alexander D. Johnson'a) ve NIH T32 Eğitim Hibe Ödülü T32 AI 60537-20 (HG'ye) tarafından desteklenmiştir. Alexander Johnson, Matthew Lohse, Jenny Zhang ve Brian Wang'a yararlı tartışmalar ve tavsiyeler için teşekkür ederiz. Ayrıca geri bildirimleri için Carol Gross'un Lab üyelerine teşekkür ederiz. Teknik destek için Ananda Mendoza'ya teşekkür ederiz. Sıralama, UCSF PBBR, RRP IMIA ve NIH 1S10OD028511-01 hibeleri tarafından desteklenen UCSF CAT'de gerçekleştirildi. Kodda sorun giderme konusunda yardım almak ve makaleyi düzenlemek için öneriler sağlamak için OpenAI'nin ChatGPT'sinin kullanımını kabul ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CORALL Total RNA-seq V1 kitiLexogen095Islak laboratuvar malzemesi 
Filamentli-Mantarlar riboPOOLsiTOOLsdp-P096-6Islak laboratuvar malzemesi 
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Islak laboratuvar malzemesi 
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape MerdivenAgilent5067-5581Islak laboratuvar malzemesi 
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape Örnek TamponuAgilent5067-5580< / strong>Wet lab malzemesi 
https://github.com/mgarber21/WonderPeaks/blob/main/environment.yml WonderPeaks için bağımlılıkların listesi
https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing/blob/main/environment.yml
Monarch Spin RNA Cleanup KiNEBT2040LIslak laboratuvar malzemesi 
pygenometracks (3.9)
QuantSeq 3′ mRNA-Seq FWD Kütüphane Hazırlık Kiti V1Lexogen015Islak laboratuvar materyali 
Qubit RNA Yüksek Hassasiyetli (HS) Test KitiCanlandırıcıQ32852Islak laboratuvar malzemesi 
RNA Temiz & Konsantratör-5Zymo ResearchR1016Islak laboratuvar malzemesi 
TURBO DNA İçermeyen KitThermoFisherAM1907Islak laboratuvar malzemesi 
Harikalar Tepeleri(0.1.14)
WonderPeaks_preprocessing(0.2.3)
WonderPeaks_preprocessing için bağımlılıkların listesi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. fungal priority pathogens list to guide research, development and public health action. , WHO. https://www.who.int/publications/i/item/9789240060241 (2022).
  2. Fisher, M. C., Denning, D. W. The WHO fungal priority pathogens list as a game-changer. Nat Rev Microbiol. 21 (4), 211-212 (2023).
  3. Gaspar, J. M. Improved peak-calling with MACS2. bioRxiv. 496521, (2018).
  4. Muñoz, J. F., et al. Coordinated host-pathogen transcriptional dynamics revealed using sorted subpopulations and single macrophages infected with Candida albicans. Nat Commun. 10 (1), 1607(2019).
  5. Miramón, P., Pountain, A. W., Lorenz, M. C. Candida auris-macrophage cellular interactions and transcriptional response. Infect Immun. 91 (11), e0027423(2023).
  6. Lindemann-Perez, E., Rodríguez, D. L., Pérez, J. C. An approach to analyze spatiotemporal patterns of gene expression at single-cell resolution in Candida albicans-infected mouse tongues. mSphere. 9 (9), e0028224(2024).
  7. Mo, X., et al. In vivo RNA sequencing reveals a crucial role of Fus3-Kss1 MAPK pathway in Candida glabrata pathogenicity. mSphere. 9 (11), e0071524(2024).
  8. Haas, B. J., Chin, M., Nusbaum, C., Birren, B. W., Livny, J. How deep is deep enough for RNA-Seq profiling of bacterial transcriptomes. BMC Genomics. 13, 734(2012).
  9. Zaheer, R., et al. Impact of sequencing depth on the characterization of the microbiome and resistome. Sci Rep. 8 (1), 5890(2018).
  10. Xiong, Y., et al. A comparison of mRNA sequencing with random primed and 3′-directed libraries. Sci Rep. 7 (1), 14626(2017).
  11. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20, 9(2019).
  12. Fansler, M. M., Mitschka, S., Mayr, C. Quantifying 3′UTR length from scRNA-seq data reveals changes independent of gene expression. Nat Commun. 15 (1), 4050(2024).
  13. Tuch, B. B., et al. The transcriptomes of two heritable cell types illuminate the circuit governing their differentiation. PLoS Genet. 6, e1001070(2010).
  14. Shenker, S., Miura, P., Sanfilippo, P., Lai, E. C. IsoSCM: improved and alternative 3′ UTR annotation using multiple change-point inference. RNA. 21 (1), 14-27 (2015).
  15. Haese-Hill, W., Crouch, K., Otto, T. D. peaks2utr: a robust Python tool for the annotation of 3′ UTRs. Bioinformatics. 39 (3), btad112(2023).
  16. Anaconda - Getting started. , https://docs.anaconda.com/anaconda/getting-started/ (2025).
  17. Pryke, B. Jupyter Notebook tutorial. , https://www.dataquest.io/blog/jupyter-notebook-tutorial/ (2025).
  18. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  19. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  20. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  21. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  22. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), giab008(2021).
  23. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  24. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  25. Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3 (Bethesda). 6 (3), 721-729 (2016).
  26. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  27. Diaz, A., Park, K., Lim, D. A., Song, J. S. Normalization, bias correction, and peak calling for ChIP-seq. Stat Appl Genet Mol Biol. 11 (3), Article 9(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ChIP Seq AnaliziWonderPeaks AlgoritmasPeakStream AracTranskripsiyon Reg lasyonu3 UTR AnotasyonuYeni Nesil DizilemeCandida Albicans
Video yakında

İlgili makaleler