Yöntem makalesi

Mukoza Membranı Pemfigoid Tanısı için Konjonktival Biyopsi ve Direkt İmmünofloresan Tekniği

DOI:

10.3791/68303

⸱

17 Haziran 2025

 ,  , 
1Prof. Krothapalli Ravindranath Ophthalmic Research Biorepository, LV Prasad Eye Institute, 2Brien Holden Centre for Eye Research (BHERC), LV Prasad Eye Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mukoza zarı pemfigoidini tanımlamak için konjonktival biyopsinin alınması ve işlenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oküler mukoza zarı pemfigoidi (MMP), tedavi edilmezse körlüğe neden olabilen kronik sikatrizan konjonktivit olarak ortaya çıkar. Zamanında tanı ve immünosupresif tedavi hastalığın ilerlemesini önler. Konjonktival biyopsinin bazal membranda immün kompleks birikimi için direkt immünofloresan boyaması (DIF) MMP için tanı koydurucudur. Biyopsi pozitiflik oranı biyopsi özelliklerine, lateraliteye, yaşlılığa ve hastalık aktivitesine bağlıdır. Mevcut yöntemler belgesi, konjonktival biyopsinin toplanması ve numune transferi ve blok hazırlama için en uygun kesme sıcaklığına sahip orta dolgulu kartuşların kullanılması tekniğini açıklamaktadır. Biyopsi, her iki gözde de konjonktivanın yara izi olmayan, tutulmamış veya nispeten daha az tutulum bölgesinden yapılır. Normal biyopsi boyutu 4-5 mm uzunluğunda, 2-3 mm genişliğindedir ve bazal membranın kaçırılmaması için altta yatan küçük subkonjonktival dokuya sahip olmalıdır. Bazal membranın varlığını doğrulamak için periyodik asit Schiff boyaması yapmanızı öneririz. Belirli bir protokol kullanılarak, biyopsilerden alınan kriyoseksiyonlar, floresan konjuge antikorlar IgG, IgM, IgA ve kompleman faktörleri C3c ve C4c ile boyanır. Pozitif bir biyopsi, bazal membrandaki yeşil pozitif floresansı gösterir ve antikorlardan biri pozitif olsa bile, MMP pozitiftir. Negatif bir biyopsi pemfigoidi dışlamaz; bununla birlikte, pozitif bir tanesi MMP'yi doğrular ve onu ilaca bağlı sikatrizan konjonktivit veya psödopemfigoidden ayırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mukoza zarı pemfigoid (MMP), otoimmün etiyolojiye sahip kronik sikatrizan konjonktival bir hastalıktır ve vücuttaki mukozal membranları etkiler 1,2. Kronik sikatrizan konjonktivitin farklı etiyolojileri vardır ve MMP'nin SJS, sarkoidoz, oküler skuamöz neoplazi ve psödopemfigoidden ayırt edilmesi, sistemik immünosupresyon gerektirdiğinden gereklidir 3,4. Ayrıca, MMP, hastaların sıklıkla geç başvurduğu ve başlangıçta yanlış teşhis edildiği potansiyel olarak kör edici bir hastalıktır 1,2,5. Oküler MMP hastalarının %27.4'ünde sistemik tutulum olmaksızın sadece oküler tutulum görülebilmektedir6. MMP tanısı, bazal membranda otoantikorların varlığını göstermek için konjonktival biyopsi gerektirir 2,5. Doğrudan immünofloresan (DIF), MMP gibi konjonktivayı etkileyen otoimmün hastalıkları tanımlamak için çok önemli bir tanı aracıdır. DIF, MMP'nin bir özelliği olan bazal membran bölgesinde (BMZ) immünoglobulinlerin ve kompleman bileşenlerinin yerinde birikmesini tespit etmeye yardımcı olur. DIF pozitiflik oranları %30 ile %80 arasında değişmektedir1,5. Bununla birlikte, bazı hastalarda, özellikle sadece oküler MMP'li olanlarda negatif biyopsi olabilir, ancak hastalık ilerlemesinin klinik dokümantasyonu, biyopsi pozitif oküler MMP vakalarına benzer şekilde tedavi edilir 7,8. Bu nedenle, Dart ve ark. sadece oküler MMP8 için ayrı tanı kriterlerine duyulan ihtiyacı vurgulamıştır.

Çalışmalarda düşük pozitiflik oranı için önerilen nedenler, geniş oküler yüzey skarlaşması, yetersiz doku işleme veya boyama teknikleri ile ilerlemiş hastalık ve biyopsi negatif bir hastalık varyantıdır 8,9,10,11. Oküler MMP'den şüphelenilen 27 hastadan alınan biyopsilerin retrospektif analizinde pozitiflik oranı sadece %30 ve %63.7'sinde sadece oküler tutulum vardı12. DIF belirli bir protokol gerektirir; Her tanı laboratuvarı buna uyum sağlamaz. Biyopsi yeri, tek gözden mi yoksa her iki gözden mi biyopsi yapılacağı ve örnek transfer solüsyonları ile ilgili farklılıklar vardır 13,14,15. Merkezimizde yapılan konjonktival biyopsilerin retrospektif analizinde DIF pozitiflik oranı %54,1 olup, bilateral biyopsi yapıldığında daha fazla pozitiflik saptanmıştır (%59'a karşı %45)8. Biyopsi kritik öneme sahip olmasına rağmen, klinik bulgular ve ilerleyici oküler yüzey sikatrizasyonu MMP tanısını perçinlemeye yardımcı olur. Hastaların sırasıyla% 40 ve% 18'inde bildirilen ağız veya cilt gibi bir göz dışı bölge tutulduğunda teşhis etmek daha kolaydır5.

Mevcut literatürde farklılıklar vardır ve burada sunulan protokol, benzersiz bir transfer ortamına olan ihtiyacı azaltmak için yapılan değişikliklerle bir referans kılavuzu görevi görebilir14. Biyopsiler, optimal bir kesme sıcaklığı (OCT) ortamında transfer edilir ve patoloji laboratuvarında aynı transfer kartuşunda dondurulur, böylece ek bir transfer ortamına olan ihtiyaç ortadan kalkar. Mevcut makale, konjonktival dokunun DIF boyama, doku toplama ve numune transfer protokolü için metodolojiyi özetlemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, LV Prasad Göz Enstitüsü insan araştırmaları etik komitesinin insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder.

1. Konjonktival biyopsi tekniği

  1. Pemfigoid şüphesi olan hastanın her iki gözünden topikal veya lokal anestezi ve ameliyat mikroskobu altında biyopsi planlayın.
  2. Hastadan bilgilendirilmiş onam alın ve kanama, yara izi ve ameliyattan sonra topikal steroidlere başlama ihtiyacının olası yan etkilerini listeleyin.
  3. Her iki göze 1-2 damla% 0.5 proparakain damlatın ve işleme başlamadan önce 5 dakika bekleyin.
  4. Konjonktivaya ince forsepslerle dokunduğunda hastanın ağrı hissetmediğinden emin olun. Topikal proparakain uygulandıktan sonra hasta hala ağrı hissediyorsa, 1 mL tüberkülin şırıngası ile 0.2 mL subkonjonktival% 2 lidokain enjekte edin.
  5. Hangisi önce seçilirse, sağ veya sol göze bir spekulum yerleştirin.
  6. Oküler yüzeyi yara izi ve keratinleşme alanları açısından inceleyin. Tutulmamış, yara izi veya keratinize olmayan biyopsi alanını seçin.
    NOT: Bu çalışmada biyopsi yeri olarak limbustan uzakta superior bulbar konjonktiva tercih edilmiş, bunu inferior bulbar konjonktiva izlemiştir.
  7. Sklerayı konjonktivadan kaldırmak için Lim'in forsepslerini kullanın ve 4-5 mm uzunluğunda ve 2-3 mm genişliğinde Westcott'un makasıyla doğrusal olarak eksize edin.
  8. Tüm biyopsiyi hemen optimal bir kesme ortamına (OCT) aktarın.
    NOT: Biyopsiler normal salin veya Michel taşıma ortamında transfer edilebilir.
  9. Bir kartuş ve ortasında bir kuyucuk bulunan plastik bir doku kalıbı alın, tuzlu suyla temizleyin ve havayla kurutun.
  10. Kartuşu sağ ve sol göz için ayrı ayrı OCT ortamıyla doldurun. Eksize edilen konjonktival dokuyu OCT ortamına batırın ve patolojiye gönderin.
  11. Benzer adımları karşı taraf için de tekrarlayın.

2. Dokunun aktarılması

  1. Konjonktivanın biyopsi örneklerini, Michel'in taşıma ortamında veya normal salininde alındığında doku mimarisini ve antijenisitesini korumak için bir OCT ortamına gömün.
  2. Gömülü numuneleri sıvı nitrojen veya kuru buz kullanarak dondurun ve gece boyunca -80 °C'de saklayın.

3. Hazırlık ve doku kesiti

  1. Donmuş dokuyu -20 °C ila -25 °C'de bir kriyostat kullanarak 4-6 μm'lik dilimlere (7 adet) bölün.
  2. Yapışmayı sağlamak için bölümleri pozitif yüklü polilisin kaplı mikroskop slaytlarına monte edin ve alüminyum folyoda lekelenene kadar -80 °C'de saklayın.

4. İmmünofloresan boyama

  1. Antijenleri korumak ve doku hasarını önlemek için slaytları oda sıcaklığında (RT) 10 dakika çözün ve 10 dakika boyunca soğuk asetonda (% 100) sabitleyin.
  2. Fazla OCT ortamını ve asetonu çıkarmak için her seferinde 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın.
  3. Anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM ve anti-C3 seyreltilmiş konjuge antikorları uygulayın (Fibrinojen-1:10 [pozitif kontrol], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10) slaytlar üzerine.
    NOT: Antikorlar 1x PBS'de seyreltilir.
  4. Negatif kontroller için, konjuge antikorların uygulanmasını atlayın ve aşağıda belirtilen kalan adımları izleyin.
  5. Antikorları seyreltmek için üreticinin yönergelerini izleyin ve bilinen pozitif ve negatif kontrollerle standartlaştırın.
  6. Slaytları nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 45-60 dakika inkübe edin.
  7. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için slaytları PBS ile (her biri 5 dakika boyunca 3 ×) yıkayın.
  8. Nükleer görselleştirme için DAPI (4 ', 6 -diamidino-2-fenilidol) içeren montaj ortamı ile karşı lekeleyin.
  9. Slaytların üzerine bir lamel yerleştirin ve 20 dakika kürlenmelerine izin verin.
  10. Kullanılan floroforlar için uygun filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak slaytları inceleyin (488 nm için uyarma yeşil filtresi).
  11. Bulguları dijital mikrograflarla belgeleyin.

5. Hızlı periyodik asit - Schiff boyama

  1. Periyodik asit Schiff'in (PAS) hazırlanması
    1. 1 g bazik fuschini 100 mL sıcak damıtılmış suda çözün.
    2. Boyanın rengini gidermek için 10 mL hidroklorik asit ve 2 g potasyum disülfit ekleyin.
    3. Soğuduktan sonra, 0.5 g aktif kömür ekleyin, karıştırın ve berrak periyodik asit Schiff reaktifi elde etmek için çözeltiyi süzün. Koyu renkli bir şişede saklayın.
      NOT: Schiff reaktifini test etmek için, bir saat camına 10 mL %37 formalin dökün ve test edilmek üzere birkaç damla Schiff ekleyin. İyi bir Schiff reaktifi hızla kırmızı-mor bir renge dönüşecektir. Bozulan bir Schiff reaktifi, gecikmiş bir reaksiyona neden olur ve ürün koyu mavi-mor olur.
  2. PAS boyama tekniği
    1. Slaytları suyla nemlendirin.
    2. % 0.5 periyodik asit çözeltisinde 5 dakika oksitleyin.
    3. Damıtılmış suda durulayın.
    4. Schiff'in reaktifine 15 dakika yerleştirin (bu adımda bölümler açık pembe görünür)
    5. Ilık musluk suyunda 5 dakika yıkayın (bölümler koyu pembeye döner).
    6. Mayer'in hematoksilininde 1 dakika boyunca lekeleyin.
    7. Musluk suyunda 5 dakika yıkayın.
    8. Slaytları aşağıdaki solüsyonlarda kurutun: Bir kez 1 dakika% 80 etil alkolde, iki kez% 90 etil alkolde 1 dakika, iki kez% 100 etil alkolde 1 dakika.
    9. Slaytları her biri 1 dakika boyunca ksilen içinde üç kez kurutun.
    10. Sentetik bir montaj ortamı (örn. DPX montajı) kullanarak kızakların üzerine bir lamel yerleştirin
    11. PAS sonuçlarını parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DIF'in yorumlanması, doku kesitlerinde bazal membranın varlığının doğrulanmasını gerektirir (Şekil 1). PAS ile boyanmış slaytlarda, bazal membran konjonktival epitelin bazal bölgesinde yer alan parlak pembe bir membran olarak görünecektir (Şekil 1C). Bazal membranın sürekliliği ve mimarisi hakkında da yorum yapılmalıdır. DIF pozitifliği, IgM (Şekil 2A), IgA (Şekil 2B), IgG (Şekil 1B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif edilen konjonktival biyopsi tekniği, transfer ortamı olarak OCT ortamını kullanır, bu da ek bir transfer ortamına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve kriyoseksiyon için OCT ortamına aktarmak için biyopsi işleminden kaçınır. Besiyeri ve biyopsi ile doldurulmuş plastik bir kartuş kalıbı, doku blokları yapmak için doğrudan dondurulur ve daha sonra bölümlere ayrılır. OCT'nin avantajları, kristal oluşumundan minimum hasarla hızlı bir şekilde donması ve doku örneklerini kapsüllemesi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmayı desteklediği için Hindistan'daki Haydarabad Göz Araştırma Vakfı'na teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 N hidroklorik asit Finar  kimyasal Limited 7647-01-0
Aseton NiteliklerQ33517
AlbüminDAKOF0117
Temel fuksinNiteliklerQ39402
C3cTanısal Biyosistemler F003 Serisi
C4cTanısal Biyosistemler F005 Serisi
FişekPolibilimler25376-500
Kömür Aktif Hale Getirildi SigmaC-5260 Serisi
Kriyostat Leica CM1860UV 
Kriyotom bıçakları Leica 818
DAPIAbcam Ab104139
Fibrinojen Tanısal Biyosistemler F006 Serisi
Floresan MikroskobuOlympusCX43 Serisi
Forseps Joja cerrahiJS1528A
Nem Odası Tanısal Biyosistemler SM365 Serisi
IgATanısal Biyosistemler F007 Serisi
IgGTanısal Biyosistemler F008 Serisi
IgmTanısal Biyosistemler F009 Serisi
IHC Yapışkanlı cam kaydırıcılar Tomo 33140455
Lim'in forsepsleriSpeedway S-7223
Michel'in tansport ortamıFisher Scinitics NC0253304
Mikroskobik kapak camıMavi yıldızhttps://www.bluestarslides.com
OCT Orta Cryomatrix 6769006
PBS DAKOdm831
Periyodik asit Sigma375810-25G
Potasyum disülfitSigmaP2522-500G
Proparakain %0,5Sunway Özel G/1118A Serisi
Westcott'un makasıPillig Cerrahi Aletler 423480

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jain, N., Jakati, S., Shanbhag, S. S., Basu, S. Direct immunofluorescence findings and factors affecting conjunctival biopsy positivity in ocular mucous membrane pemphigoid. Cornea. 43 (2), 159-165 (2024).
  2. Vazirani, J., et al. Chronic cicatrizing conjunctivitis: a review of the differential diagnosis and an algorithmic approach to management. Indian J Ophthalmol. 68 (11), 2349-2355 (2020).
  3. Singh, S., et al. Drug-induced cicatrizing conjunctivitis: a case series with review of etiopathogenesis, diagnosis and management. Ocul Surf. 24, 83-92 (2022).
  4. Bocanegra-Oyola, N., et al. Clinical characteristics of ocular mucous membrane pemphigoid: a systematic review and meta-analysis. Ocul Immunol Inflamm. 32 (10), 2388-2404 (2024).
  5. Coco, G., et al. Conjunctival biopsy site in mucous membrane pemphigoid. Am J Ophthalmol. 216, 1-6 (2020).
  6. Ong, H. S., et al. Mucous membrane pemphigoid with ocular involvement: the clinical phenotype and its relationship to direct immunofluorescence findings. Ophthalmology. 125 (4), 496-504 (2018).
  7. Anesi, S. D., et al. Reliability of conjunctival biopsy for diagnosis of ocular mucous membrane pemphigoid: redetermination of the standard for diagnosis and outcomes of previously biopsy-negative patients. Ocul Immunol Inflamm. 29 (6), 1106-1113 (2021).
  8. Dart, J., et al. Autoantibody detection for diagnosis in direct immunofluorescence-negative mucous membrane pemphigoid: ocular and other sites compared. Ophthalmology. 128 (3), 372-382 (2021).
  9. Leonard, J. N., et al. Immunofluorescent studies in ocular cicatricial pemphigoid. Br J Dermatol. 118 (2), 209-217 (1988).
  10. Mehra, T., et al. Diagnostic relevance of direct immunofluorescence in ocular mucous membrane pemphigoid. JDDG. 13 (12), 1268-1274 (2015).
  11. Shimanovich, I., Nitz, J. M., Zillikens, D. Multiple and repeated sampling increases the sensitivity of direct immunofluorescence testing for the diagnosis of mucous membrane pemphigoid. J Am Acad Dermatol. 77 (4), 700-705 (2017).
  12. Goldich, Y., et al. Characteristics of patients with ocular cicatricial pemphigoid referred to major tertiary hospital. Can J Ophthalmol. 50 (2), 137-142 (2015).
  13. Mudhar, H. S. Biopsies of cicatricial conjunctivitis cases reveal highly variable sampling practice among ophthalmologists: time for national and international standardisation. Br J Ophthalmol. 100 (6), 736-744 (2016).
  14. Vodegel, R. M., et al. Enhanced diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline. BMC Dermatol. 4, 1-7 (2004).
  15. Jonkman, M. F., De Groot, A. C., Slegers, T. P., De Jong, M. C., Pas, H. H. Immune diagnosis of pure ocular mucous membrane pemphigoid: indirect immunofluorescence versus immunoblot. Eur J Dermatol. 19 (5), 456-460 (2009).
  16. Shimanovich, I., Nitz, J. M., Witte, M., Zillikens, D., Rose, C. Immunohistochemical diagnosis of mucous membrane pemphigoid. J Oral Pathol Med. 47 (6), 613-619 (2018).
  17. Philip, A. M., Stephenson, A., Al-Dabbagh, A., Ramezani, K., Fernandez-Santos, C. C., Foster, C. S. Ocular cicatricial pemphigoid with IgM-positive biopsy. Cornea. 42 (12), 1503-1505 (2023).
  18. Williams, G. P., et al. Conjunctival neutrophils predict progressive scarring in ocular mucous membrane pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
  19. Levian, B., Hussaini, S. S., Woodley, D. T., Kasperkiewicz, M. Pseudopemphigoid: a systematic review. JAAD Int. 17, 170-171 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sikatrizan KonjonktivitBazal MembranPAS BoyamaFloresan MikroskopiKriyostat Kesit Almamm noglobulin BirikimiNumune Haz rlama

İlgili makaleler