Yöntem makalesi

Sağlıklı ve İskemik Ex Vivo Sıçan Kalplerinde Çift Yönlü Elektrik ve Optoelektronik Arayüzler

DOI:

10.3791/68305

⸱

18 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 2The James Franck Institute, The University of Chicago, 3Department of Chemistry, The University of Chicago, 4The Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, biyoelektronik araştırmaları için hassas kardiyak stimülasyon, kayıt ve enfarktüs modellemesi sağlayan optik ve elektriksel çift yönlü biyoarayüz için gelişmiş malzeme üretimi ve ex vivo sıçan kalbi yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrofizyolojik çalışmalar, materyaller ve kardiyak biyoarayüzler arasındaki etkileşimleri araştırmada çok önemlidir. Son gelişmeler, yüksek uzay-zamansal ve yüksek sinyal-gürültü oranı (SNR) kayıtlarının yanı sıra düşük yoğunluklu pacing'i kolaylaştırarak, kardiyak modellerle çift yönlü arayüzler için çeşitli yeni iletken ve yarı iletken malzemeleri piyasaya sürdü. Ex vivo kemirgen kalp modeli, etik ve idari kaygıları en aza indirirken in vitro bulguları translasyonel içgörülerle köprüleyerek yeni malzemelerin ve cihazların işlevlerini doğrulamak için etkili bir platform görevi görür. Bu protokolde, bir Langendorff cihazı kullanarak yetişkin sıçan kalplerinin izolasyonunu ve ex vivo perfüzyonunu detaylandırıyor, nano gözenekli silikon, nano gözenekli karbon ve esnek ağ benzeri mikroelektrot dizileri dahil olmak üzere yüksek performanslı yarı iletkenler ve iletkenlerle hassas çift yönlü stimülasyon ve kayıt oluşturuyoruz. Ek olarak, iskemi-reperfüzyon (I/R) hasarının neden olduğu, çok kanallı kayıt ve haritalamanın yanı sıra enfarktüs boyama ile değerlendirilen, kalp hastalığı ile ilgili çalışmalara ve potansiyel terapötik keşiflere olanak tanıyan bir miyokard enfarktüsü modeli sunuyoruz. Bu metodoloji, malzeme-biyo arayüz araştırmaları ve yeni nesil kardiyak biyoelektroniklerin geliştirilmesi hakkında değerli bilgiler sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak biyoelektronik alanı, kalp ile hassas ve verimli çift yönlü iletişimi sağlayan malzeme ve cihazlar geliştirme ihtiyacından dolayı hızla ilerlemektedir 1,2,3,4. Elektrofizyolojik çalışmalar bu çabada çok önemli bir rol oynamaktadır ve malzemelerin modülasyon ve algılama yoluyla kardiyak biyoarayüzlerle nasıl etkileşime girdiğine dair kritik bilgiler sağlar. Kültürlenmiş HL-1 hücre hatları ve kemirgenlerden elde edilen primer kardiyomiyositler gibi in vitro modeller, ilk değerlendirmeler için kontrollü bir ortam sunarken 5,6,7,8, basitlikleri genellikle canlı bir kalbin karmaşık, dinamik koşullarını taklit etmekte başarısız olur. Bu modeller, koordineli elektrik iletimi ve mekanik kuvvet üretimi için çok önemli olan kalbin 3D mimarisinden yoksundur ve oksijen ve besin iletimi için kritik olan ritmik kasılma-gevşeme döngülerini veya perfüzyon dinamiklerini taklit edemez9. Tersine, in vivo modeller fizyolojik olarak en ilgili içgörüleri sağlar, ancak kapsamlı eğitim ihtiyacı, karmaşık cerrahi kurulumlar ve katı düzenleyici çerçevelere uyum dahil olmak üzere önemli etik, idari ve teknik zorluklarla birlikte gelir10.

Bu boşluğu doldurmak için, Langendorff perfüze yetişkin sıçan kalbi gibi ex vivo kalp modelleri, bilimsel araştırmalara zorlayıcı bir alternatif sunuyor11,12. Bu modeller, in vivo sistemlerin fizyolojik alaka düzeyini in vitro kurulumların kontrol edilebilirliği ve erişilebilirliği ile birleştirir. Langendorff cihazı, kalbi izole ederek ve işlevsel bir durumda tutarak, araştırmacıların hassas bir şekilde kontrol edilen koşullar altında kardiyak elektrofizyoloji üzerine yüksek kaliteli çalışmalar yürütmelerini sağlar. Nöral girdiler ve dolaşımdaki hormonlar gibi sistemik değişkenlerin olmaması, kardiyak fizyolojinin temel yönlerini korurken sonuçların yorumlanmasını basitleştirir. Ek olarak, ex vivo modeller birçok etik kaygıyı hafifletir ve kaynak yüklerini azaltır, bu da onları çeviri araştırmaları için çok yönlü ve pratik bir platform haline getirir13.

Translasyon potansiyeline ek olarak, bu protokol malzeme performans değerlendirmesi için bir ölçüt belirler. Kablosuz fotostimülasyon için optoelektronik platformlar ve kablolu stimülasyon ve kayıt için elektronik sistemler gibi temsili malzeme stratejilerini dahil ederek, karşılaştırmalı çalışmalar için tekrarlanabilir bir çerçeve oluşturur. Bu standardizasyon sadece yeniliği kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda araştırma grupları arasında bulguların tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini de artırır. Geçmişte, PEDOT gibi birçok yüksek performanslı fotoelektrot ve elektrot, biyoelektrik çalışmalar için büyük umut vaat etmiştir: PSS14, MXene15, iridyum oksitler16, platin17, molibden18, silikon 19,20,21, kuantum noktaları 22,23,24 ve organik yarı iletkenler25. Burada, bu protokol, nano gözenekli silikon26, nano gözenekli karbon27 ve esnek ağ benzeri altın çoklu elektrot dizileri (MEA'lar)28,29 dahil olmak üzere, çift yönlü kardiyak arayüzlerdeki yeteneklerini göstermek için protokole entegre edilen temsili ve son teknoloji malzemeleri sunar. Bu malzemeler, düşük yoğunluklu eşik üstü stimülasyon, yüksek uzay-zamansal çözünürlük ve yüksek SNR kayıtları sağlayarak kardiyak biyoelektroniği ilerletme potansiyellerini sergiliyor. Ayrıca, I/R hasarının neden olduğu bir miyokard enfarktüsü modelinin dahil edilmesi, hastalıkla ilgili çalışmalar ve terapötik araştırmalar için sağlam bir çerçeve sağlar.

Bu çalışma, kurşunsuz fotostimülasyon ve elektrik stimülasyonu ve ex vivo sıçan kalpleri ile algılama için gelişmiş malzemelerin üretilmesi ve uygulanması için ayrıntılı yöntemler sunmaktadır (Şekil 1A). Nano gözenekli silikon membranlar, fotolitografi modellemesi, reaktif iyon aşındırma (RIE) ve 5 μm'lik bir cihaz tabakası ile yalıtkan üzerinde silikon (SOI) gofretlerinden tamponlu hidroflorik asit (HF) salınımı yoluyla üretildi, ardından leke aşındırma ve yumuşak Polidimetilsiloksan (PDMS) membranlara transfer edildi26. Elektriksel stimülasyon ve kayıt için, tuz inkübe edilmiş selüloz substratların lazer ablasyonu ile nano gözenekli karbon geliştirildi, ardından su fazı transferi ve ısı laminasyonu yapıldı ve geleneksel altın elektrotlara kıyasla daha iyi şarj depolama ve enjeksiyon yetenekleri sundu27. Ek olarak, uzamsal olarak çözülmüş epikardiyal kayıt ve haritalamayı mümkün kılmak için fotolitografi, e-ışın metalizasyonu, aşındırma, kapsülleme ve serbest bırakma işlemleri kullanılarak poliimid kaplı Si gofretler üzerinde esnek MEA'lar üretildi28,29.

Protokol, fabrikasyonun ötesinde, yetişkin sıçan kalbi izolasyonu, perfüzyon, izleme ve optik ve elektrikli cihazlarla arayüz oluşturma için adım adım bir protokol sağlar. Cihazlar izole edilmiş kalpler üzerinde test edildi ve elektrofizyolojik değerlendirme için pacing ve kayıtta temsili sonuçlar gösterdi. Bu protokol ayrıca, fizyolojik kayıtlar, boyama ve morfolojik değerlendirmelerle doğrulanan I/R yoluyla bir miyokard enfarktüsü modeli oluşturmak için bir yöntem sunar. Bu kapsamlı metodoloji, kardiyak biyoarayüzlerdeki malzeme ve cihazları değerlendirmek için tekrarlanabilir bir çerçeve oluşturur. Şekil 1B-D, bu ex vivo kardiyak modelde değerlendirme için malzeme imalatının iş akışlarını özetlemektedir. Şekil 2A-C, fabrikasyon cihazların resimlerinde beklenen sonuçları göstermektedir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, Chicago Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 72378).

1. Nano gözenekli silikon membran imalatı (Şekil 1B, Şekil 2A, Şekil 3)

  1. AutoCAD yazılımında fotoğraf maskesi desenini tasarlayın (Şekil 3). Cihaz boyutunun biyolojik hedefin uzunluk ölçeğiyle eşleştiğinden emin olun. Sıçan kalbi için 2 - 10 mm'lik bir cihaz boyutu kullanın. Tasarımda, tamponlu HF'de Si cihaz katmanının serbest bırakılmasını kolaylaştırmak için 20 - 100 μm çapında küçük delik dizileri ekleyin. Zarın doğru tarafını tanımlamaya yardımcı olmak için kiral bir L harfi oluşturarak 200 - 1000 μm çapında üç büyük delik açın.
  2. SOI gofretini ultrasonik banyoda her biri 3 dakika boyunca aseton ve izopropil alkol (IPA) ile temizleyin. Sıcak plaka üzerinde 200 dakika boyunca 200 ° C'de dehidrasyon pişirme işlemi gerçekleştirin.
  3. Kalın pozitif dirençli AZ40XT-11D'yi 3000 rpm'de 45 saniye sıkın, 115 °C'de 3 dakika pişirin. Gofret üzerine çok fazla fotorezist dökmemeye dikkat edin. Sıkma işleminden sonra, asetonlu çubuklar kullanarak gofretin arka tarafındaki kalıntıları temizleyin.
    NOT: AZ40XT-11D çok viskoz bir pozitif fotorezisttir.
  4. Fotorezist desenini 375 nm'de ve 800 mJ /cm2'lik bir dozda ortaya çıkarmak için Heidelberg MLA150 doğrudan yazıcıyı kullanın. Maruz kalma sonrası pişirmeyi 110 °C'de 2 dakika boyunca gerçekleştirin.
  5. Deseni AZ 300MIF geliştiricisinde 2 dakika boyunca geliştirin. Gofret'i deiyonize (DI) su ile 60 saniye durulayın ve ardındanN2 hava ile kurulayın.
  6. Ortaya çıkarılan SOI'yi bir SF6/CHF3 (20 sccm:50 sccm) RIE işlemi kullanarak, 600 W'ta endüktif olarak eşleştirilmiş plazma ve 60 W'lık bir radyo frekansı kullanarak 10 mT'lik bir oda basıncına sahip endüktif olarak eşleştirilmiş bir plazma florür aşındırıcıda 12 dakika boyunca aşındırın, bu da yaklaşık 660 nm/dak'lık bir aşındırma hızı ile sonuçlanır.
  7. AZ NMP kullanarak fotorezisti 80 ° C'lik bir ultrasonik banyoda 10 dakika boyunca soyun ve gofreti ultrasonik banyoda asetonda 3 dakika, ardından IPA'da 3 dakika temizleyin ve sıkıştırılmış nitrojen kullanılarak kurutun.
  8. Gömülü oksit tabakalarını ortadan kaldırmak için numuneyi oda sıcaklığında tamponlu HF'ye daldırın. Cihaz 4 - 8 saat içinde serbest kalır. Salınımı kolaylaştırmak için çözelti sıcaklığını (40 °C) hafifçe artırın.
  9. Kalan HF'yi gidermek için serbest kalan membranları 1 cm x 1 cm filtre kağıdı ile dikkatlice iki ayrı DI su banyosuna aktarın.
    NOT: Deney burada duraklatılabilir. Membranı 4 °C'de saklamak için bir IPA banyosuna batırın.
  10. Membranı filtre kağıdı kullanarak deiyonize (DI) su içeren bir Petri kabına aktarın. Membran, hidrofobiklik ve yüzey gerilimi nedeniyle su yüzeyinde yüzecektir.
    NOT: Silikon membranlar, Marangoni etkisi30 nedeniyle IPA'dan suya sert bir şekilde hareket edebilir.
  11. Ayrı bir Petri kabında, 100: 1 hacim oranında konsantre HF ve konsantre nitrik asit (örneğin, 10 mL HF ve 0.1 mL HNO3) içeren leke aşındırma solüsyonunu yapın. Aşındırmadan önce iyice karıştırın.
  12. Membranı filtre kağıdı ile leke aşındırma solüsyonuna aktarın ve 30 saniye boyunca aşındırın. Üç ana deliğin oluşturduğu L harfi yönüne dikkat ederek Si zarının yan tarafına dikkat edin. Si zarı, zarın sadece bir tarafının kazındığı aşındırma üzerinde yüzmelidir.
  13. Kalan HF'yi yıkamak için membranı filtre kağıdı ile iki ayrı DI su kabına aktarın.
    NOT: Deney buradan duraklatılabilir. Membranı 4 °C'de saklamak için IPA'ya aktarın.
  14. İnce PDMS ile destekleyici bir alt tabaka oluşturun. A kısmını (baz polimer) ve B kısmını (sertleştirici ajan) 10:1 ağırlık oranında karıştırın ve 30 dakika boyunca gazdan arındırın.
  15. Spin coat PMMA (495 A6) 45 s boyunca 2.000 rpm'de cam kızak üzerinde kurban katmanı. 180 °C'de 60 saniye pişirin.
  16. 10 - 20 μm kalınlıkla sonuçlanması gereken PMMA kaplı cam üzerinde 45 saniye boyunca 4.500 rpm'de PDMS sıkın. 80 °C fırında veya sıcak plakada 2 saat kürlenir.
    NOT: Mekanik hasarı azaltmak için PDMS, nano gözenekli silikon membranları barındırmak için yumuşak bir alt tabaka olarak kullanıldı ve cımbızla doğrudan kullanımdan kaynaklanan potansiyel hasara karşı koruma sağladı.
  17. Leke ile kazınmış Si membranını IPA'dan PDMS'ye aktarın. Fazla IPA'yı çıkarmak için temiz doku kullanın ve IPA buharlaştıktan sonra Si zarı PDMS'ye sıkıca yapışacaktır. Üç ana deliğin oluşturduğu L harfi yönünü belirleyerek Si zarının yan tarafına dikkat edin. Kazınmış gözenekli Si dışa bakmalı ve kazınmamış Si, PDMS ile arayüz oluşturmalıdır.
  18. Si zarını içeren bir tıraş bıçağı kullanarak PDMS'yi çevresel olarak kesin. Yeterli boşluk bırakın ve Si zarına zarar vermemeye dikkat edin.
  19. Si/PDMS serbest kalana kadar cihazı asetonda bekletin. PDMS şişmesine neden olabileceğinden çok uzun süre ıslatmaktan kaçının. DI su ile durulayın ve N2 ile kurulayın. 10 dakika boyunca 400 W'ta O2 plazma tedavisi uygulayın.

2. Esnek mikroelektrot dizileri imalatı (Şekil 1C, Şekil 2B, Şekil 4)

  1. AutoCAD'de esnek MEA'ların yapısını tasarlayın (Şekil 4). Aynı elektrot projeksiyon alanına ancak farklı alt tabaka yapılarına sahip iki farklı tasarım sunuyoruz (Şekil 2B, Şekil 4).
  2. Silikon gofret substratını aseton ve IPA'da ultrasonik banyoda her biri 3 dakika boyunca temizleyin.
    NOT: Bu protokol, cihazın serbest bırakılmasını kolaylaştırmak için poliimid (PI) ve Si gofret arasındaki yapışmayı artırmak için ek yüzey işlemi gerektirmez. Gerekirse yapışmayı artırmak için oksijen plazma tedavisi kullanılabilir.
  3. Gofret üzerine 4 mL PI öncü poli çözeltisi (piromelitik dianhidrit-co-4,4'-oksidianilin) dökün. Gofret'i 45 saniye boyunca 1.500 rpm'de sıkarak kaplayın. Gofretin arka tarafındaki öncüyü çıkarmak için NMP veya aseton kullanın.
  4. 110 °C'de 3 dakika, ardından 180 °C'de 3 dakika önceden pişirin. PI kaplı gofreti dirençli fırında bir profil modu ile kürleyin. Oda sıcaklığından başlayın, 4 °C/dk rampa hızında 250 °C'ye kadar ısıtın ve 30 dakika tutun. Daha sonra gofreti 2,5 °C/dk rampa hızında 350 °C'ye ısıtın ve 350 °C'de 60 dakika tutun, ardından yavaşça RT'ye soğutun. Sonuç, yaklaşık 5 μm kalınlığında bir PI filmidir.
  5. PI kaplı gofreti AZ nlof 2020 ile 2.000 rpm'de 45 saniye boyunca sıkarak kaplayın. Gofretleri 110 °C'de 2 dakika pişirin. Fotorezist modelini 375 nm'de ve 200 mJ /cm2'lik bir dozda ortaya çıkarmak için Heidelberg MLA150 doğrudan yazıcıyı kullanın.
  6. Maruz kalma sonrası pişirmeyi 110 °C'de 2 dakika boyunca gerçekleştirin. Deseni AZ 300MIF Developer'da 1 dakika boyunca geliştirin. Gofret'i DI su ile 60 saniye durulayın ve ardından N2 hava ile kurulayın.
  7. Bir e-kiriş evaporatörü kullanarak 10 nm Titanyum ve 200 nm Altın biriktirin. AZ NMP kullanarak fotorezisti 80 ° C banyosunda 3 saat boyunca soyun ve gofreti ultrasonik banyoda asetonda 3 dakika, ardından IPA'da 3 dakika temizleyin ve sıkıştırılmış nitrojen kullanılarak kurutun.
  8. Kalın pozitif direnç AZ40XT-11D'yi 45 saniye boyunca 3.000 rpm'de döndürün. Gofretin arka tarafındaki fotorezisti aseton kullanarak temizleyin. Gofretleri 115 °C'de 3 dakika pişirin.
  9. Fotorezist desenini 375 nm'de ve 800 mJ /cm2'lik bir dozda ortaya çıkarmak için Heidelberg MLA150 doğrudan yazıcıyı kullanın. Maruz kalma sonrası pişirmeyi 110 °C'de 2 dakika boyunca gerçekleştirin.
  10. Deseni AZ 300MIF Developer'da 3 dakika boyunca geliştirin. Gofret'i DI su ile 60 saniye durulayın ve ardından N2 hava ile kurulayın.
  11. Ortaya çıkarılan PI'yi, 600 W'ta endüktif olarak eşleştirilmiş plazma ile 20 dakika boyunca bir SF6 / CHF3 (20 sccm: 50 sccm) RIE işlemi kullanarak ve 10 mT'lik bir oda basıncına sahip endüktif olarak eşleştirilmiş bir plazma florür aşındırıcıda 60 W'lık bir radyo frekansı kullanarak aşındırın.
  12. 80 ° C banyosunda 10 dakika boyunca AZ NMP kullanarak fotorezisti soyun ve gofretleri asetonda 3 dakika boyunca hafif sonikasyon ile temizleyin, ardından IPA'da 3 dakika temizleyin ve sıkıştırılmış nitrojen kullanılarak kurutulun.
    NOT: Cihazın ayrılmasını önlemek için düşük güçlü ultrasonikasyon kullanın. PI ayrılma belirtileri gösteriyorsa sonikasyondan kaçının.
  13. HMDS tedavisini uygulamak için gofreti bir heksametildisilazan (HMDS) fırında işleyin. SU-8 2002'yi 2.000 rpm'de 45 sn döndürün. Bu, yaklaşık 2,5 μm'lik bir SU8 kalınlığı ile sonuçlanır.
  14. Gofretleri 95 °C'de 20 dakika pişirin. 375 nm'de ve 950 mJ /cm2'lik bir dozda fotorezist modelini ortaya çıkarmak için Heidelberg MLA150 doğrudan yazıcıyı kullanın.
  15. Deseni SU-8 Developer'da 1 dakika boyunca geliştirin. IPA ve DI su ile durulayın ve N2 gazı ile kurulayın. IPA durulaması sırasında gofret üzerinde beyaz lekeler oluşursa, beyaz lekeler kaybolana kadar gofretleri SU8 geliştiricisinde bekletin.
  16. Gece boyunca 160 °C'de sert bir pişirme yapın. Akut deneyler için daha kısa pişirme süreleri (~ 30 dakika) kullanın. 150 °C'nin altında veya 200 °C'nin üzerinde pişirmeyin. Esnek PI destekli esnek MEA'yı alt tabakadan soyun.

3. Nano gözenekli karbon üretimi (Şekil 1D, Şekil 2C, Şekil 5)

  1. Tasarım yazılımında karbon film desenini tasarlayın (Şekil 5).
    NOT: Bu yöntem, iki tür elektrot için üretim protokolünü içerir: nano gözenekli karbon bazlı stimülasyon elektrodu ve algılama elektrodu.
  2. Filtre kağıdını sulu sodyum borat çözeltilerinde (0.15 M, pH 9.4) 1 saat emprenye edin ve ardından gece boyunca 60 °C'de kurutun (Şekil 1D).
    NOT: Grade 1 Whatman filtre kağıdı, öncelikle temsili elyaf bazlı gözenekli alt tabaka olarak görev yaptı. Sodyum borat, emprenye ve kurutma işleminden sonra selüloz liflerine dahil edilir. Tuz, lazer sentezi altında fotokimyasal karbonizasyonu kolaylaştıran katalizör görevi görür27.
  3. Önceden tasarlanmış desenlere sahip bir CO2 lazer kullanarak lazer sentezi gerçekleştirin (Şekil 5A). Optimize edilmiş parametrelerle raster modunda desenleme yapın: güç = 1,8 W; hız = 1,6 cm/sn; inç başına nokta = 1000.
  4. 50 μm kalınlığında polietilen tereftalat (PET) film hazırlayın ve filmi ultrasonik banyoda 3'er dakika boyunca aseton ve izopropil alkol (IPA) ile temizleyin.
  5. Bir e-kiriş evaporatörü kullanarak 5 nm Titanyum ve 100 nm Altın biriktirin. MEA'yı PET film (12,5 μm) üzerine aktarmak için su fazı transfer prosedürünü uygulayın.
    NOT: Su fazı transferi, iki ardışık işlem kullanılarak gerçekleştirilmiştir: su fazı ayırma ve kılcal transfer.
  6. Su fazı ayrımı sırasında delaminasyon için kağıt alt tabakaları kademeli olarak DI suya batırın.
    NOT: Selüloz şişmesinin neden olduğu gerinim enerjisi, karbon zarın destekleyici alt tabakadan bir saniyeden daha kısa sürede ayrılmasını kolaylaştırdı ve su yüzeyinde yüzmesine neden oldu.
  7. Kılcal transfer sırasında desenleri su ortamında aktarmak için destekleyici alt tabakayı, örneğin PET filmi kullanın. Alt tabakayı suya batırın ve bir temas hattı (transfer cephesi) oluşturmak için istenen karbon zarın bir ucuyla temas ettirin. Ardından, alt tabakayı elinizle tutun ve düşük hızda eğik veya dikey yönde hareket ettirin.
    NOT: Hidrofobik destekleyici substratlar için, temas hattının oluşturulmasına yardımcı olmak için harici kuvvet veya O2 plazma işlemi uygulanabilir.
  8. Transferden sonra, karbon modellerine yaklaşık 20 μL perflorosülfonik asit (PFSA) polimer çözeltisi (düşük alifatik alkoller ve su karışımında ~%5'lik bir konsantrasyonla) uygulayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın (23 °C) ve fiksasyon için basınç (1 atm) koşulları.
  9. Nano gözenekli karbon bazlı stimülasyon elektrodunu, iletken gümüş yapıştırıcı kullanarak bir Cu teline bağlayarak sabitleyin. Yalıtım ve stabiliteyi sağlamak için Cu teli ile elektrot arasındaki açıkta kalan bağlantıyı silikon yapıştırıcı ile kapsülleyin. Oda sıcaklığında 3 saat kürlendikten sonra stimülasyon elektrodu kullanıma hazırdır. Deney burada duraklatılabilir.
  10. AutoCAD'de karbon ve MEA desenini tasarlayın (Şekil 5B). Adım 2'de açıklandığı gibi standart fotolitografi prosedürünü kullanarak 25 μm'lik bir PI film üzerinde 4 x 4 mikroelektrot dizisi oluşturun.
    NOT: PI filmi, PI öncüsü aracılığıyla veya AZ2020 fotorezist kullanılarak Si gofret üzerine ticari PI filminin lamine edilmesiyle oluşturulabilir. Fotolitografi ve metal biriktirme protokolü, adım 2 ile aynıdır.
  11. Adım 3.1-3.3'te olduğu gibi, tuz emprenye etme ve lazerle yazma işleminden sonra bir kağıt alt tabaka üzerinde monolitik bir karbon zarı (2 cm x 2 cm) oluşturun. Karbon modelini, adım 3.6-3.9'da olduğu gibi standart bir su fazı transfer yöntemi kullanarak önceden tasarlanmış PET destek filmine aktarın.
  12. Karbon desenine heksan içinde ağırlıkça polietilen-ko-vinil asetat (EVA) çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında (23 °C) ve basınç (1 atm) koşullarında kurumasını bekleyin. 10 μm kalınlığında bir PET şablonu (alt tarafında EVA kaplamalı) ve MEA desenine hizalanmış 16 delik, kapsülleme katmanı olarak tasarlayın ve lazerle kesin.
  13. MEA'yı, PET kapsülleme katmanını ve karbon membranı PET desteği üzerinde hizalayın. Aktarım ve kapsülleme için 120 ° C'lik bir işleme sıcaklığında ticari bir sıcak laminatör kullanarak düzeneğe basın.
  14. Nano gözenekli karbon özellikli algılama elektrodunu oda sıcaklığına soğutun, kalıntıyı çıkarın ve kullanmadan önce 3 kez etanol ve su ile durulayın.

4. Sıçan kalbi izolasyonu, perfüzyonu ve izlenmesi (Şekil 6)

  1. Kalp ekstraksiyonundan önce fareleri hazırlayın (Şekil 6A). Bu protokol, Charles River'dan elde edilen 3 ila 4 aylık erkek CD / SD sıçanlarını kullandı.
  2. Kimyasalları Tablo 1'e göre çözerek N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) Tyrode Çözeltisini hazırlayın. 2M NaOH ile pH'ı 7.2-7.4'e ayarlayın. Oksijen gazını 0,5-1 saat köpürterek ön oksijenasyon yapın ve deneylerin sonuna kadar oksijenasyona devam edin.
  3. Buzun üzerine üç tüp Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok) yerleştirin. Temiz cerrahi aletler hazırlayın (keskin makas, bükülmüş makas, iki kanama durdurucu, keskin cımbız, iki çift küçük cımbız).
    NOT: Ameliyat hayatta kalmak için tasarlanmamıştır, bu nedenle sterilite gerekli değildir.
  4. Hayvan tesisinden 400 ila 500 g ağırlığındaki yetişkin CD / SD erkek sıçanları alın. Alt karın bölgesine intraperitoneal olarak 0.5 mL heparin (1000 IU / kg) uygulayın. Fareyi korumak için tutmak için kalın eldivenler kullanın.
  5. Fareyi sırtının üst kısmından tutun, böylece karın açıkta kalır. Fareyi sıkıca tutun, ancak hayvana zarar vermemek için aşırı kuvvet kullanmadan. Heparin çözeltisini hızlı ve doğru bir şekilde enjekte edin. 20-30 dakika bekleyin. Bu arada Langendorff cihazını hazırlayın.
    NOT: Uygun cerrahi prosedür hazırlık adımını sağlamak için sıçan önceden uyuşturulabilir.
  6. HEPES Tyrode Solüsyonunu yeniden doldurmadan önce, intravenöz tedavi (IV) torbasını suyla yıkayın ve uygun nihai bileşimi sağlamak için tamamen kurulayın. Torbayı önceden oksijenlenmiş HEPES Tyrode Solüsyonu ile doldurun.
  7. Langendorff cihazındaki termostatı ve su sirkülasyonunu 37 °C'de açın (Şekil 6A). Kanülü, dikişi hazırlayın ve Petri kabını doku kesiti için soğuk paketin üzerine yerleştirin. Kesit almadan önce kanülü buz gibi HBSS ile astarlayın.
  8. Sıçan torakotomisi yapmaya hazırlanın (Şekil 6B). Hayvanı bir çan kavanozu konfigürasyonunda izofluran ile uyuşturun. Bir gazlı bezle doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpe 8 ila 10 mL izofluran koyun. Hayvanı açık tüp (izofluran ile) ile bir kap içine alın.
  9. Ayak parmağını kıstırma refleksini test ederek anestezinin ilerlemesini gözlemleyin. Hayvanlar anestezi altına alınacak ve 2-3 dakika içinde bilinçlerini kaybedeceklerdir. Farenin durumunu dikkatlice izleyin ve bilincini kaybettikten hemen sonra cerrahi kurula aktarın. Uzun süreli anestezi, farenin ölümüne neden olabilir.
  10. Hayvanı ameliyat tahtasına aktarın. Sırtına koyun ve farenin ağzının üzerine bir gazlı bezle doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpe 5 mL izofluran yerleştirin. Pençelerden birini sıkıştırarak genel anesteziyi onaylayın. Yalnızca yanıt alınmadıysa devam edin.
  11. Üst ve alt kolları iğnelerle cerrahi tahtaya sabitleyin. Farenin göğüs kafesini göğsün hemen altında açmak için bir kesi (~ 5 cm) yapın. Kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için diyaframı dikkatlice kesin.
  12. Tam erişim sağlamak için göğüs kafesini tamamen açmak için her iki taraftaki kaburgaları kesin. Bir hemostat kullanarak göğüs kafesini sternuma sabitleyin. Bir hemostat kullanarak vena kava'yı kalbin altından tutun. Göğüs kafesinin dibine mümkün olduğunca yakın bükülmüş künt makasla kanama durdurucunun altından keserek kalbi çıkarın.
  13. Kalbi buz gibi HBSS'ye aktarın. Kasılan kalbe oksijen beslemesinin uzun süreli kesilmesini önlemek için adımın süresini en aza indirin.
  14. Langendorff perfüzyonu ve monitörizasyonu için hazırlanın. Kanül ve Petri kabını tamamen buz gibi HBSS ile doldurun. Sistemde kabarcık bulunmadığından emin olun.
  15. Kalbi, kesitleme için HBSS ile önceden doldurulmuş Petri kabına aktarın. Cımbız ve makas kullanarak akciğerleri ve diğer bağ dokularını çıkarın (Şekil 6C).
    NOT: Kalbe herhangi bir olası hasarı önlemek için kesit alma prosedürü için künt diseksiyon önerilir. Bitişik dokuların bölünmesi için iki makas kullanın ve dokuyu dikkatlice ayırın.
  16. Kalbe bastırarak ve çıkarken kanın yolunu izleyerek aortu bulun. İlk çıkan arterin altından kesin ve ekstraksiyon sırasında aort arkı korunursa aortu kanül edin (Şekil 6D). Aortu çift düğümle kanüle sabitleyin.
    NOT: Valfin kapalı kalmasını sağlamak için kanülü çok derine sokmaktan kaçının. Koroner arterleri tıkayabileceğinden dikişi çok alçakta konumlandırmayın.
  17. Langendorff cihazını önceden oksijenlendirilmiş çalışma solüsyonu ile doldurun. Tampon akışını açın ve kanülü aparata takın (Şekil 6E). Hava kabarcığı girmediğinden emin olun. Kalp bu adımda kasılmaya başlar.
    NOT: Başlangıçta, ventriküllerden bir miktar tampon sıçrayabilir, ancak aşırı sızıntı beklenmez. Tampon sızıntısını önlemek için dikişi gerektiği gibi ayarlayın. Ameliyat ve hazırlık düzgün yapılırsa bu adımda kardiyak fibrilasyon gözlenmez.
  18. Kulakçıkları kesin. Balonu sol ventriküle yerleştirmeden önce söndürün, ardından bağlı şırıngayı kullanarak suyla doldurun.
  19. Sırasıyla perfüzyonu ve sol ventrikül basıncını (LVP) izlemek için BP-100 problarını perfüzyon hattına ve su dolu balonlara bağlayın (Şekil 6F).
    NOT: BP-100 problarının kullanımdan önce kalibrasyona ihtiyacı vardır. Hassas basınç algılamasını sağlamak için balonlardaki kabarcıkların dışarı atılması gerekir.
  20. HEPES Tyrode'un tampon basıncını ve LVP'nin taban çizgisini izleyin. Tampon basıncının optimum 80-100 mmHg aralığında tutulduğundan emin olun. Balona enjekte edilen su hacmini değiştirerek taban çizgisi LVP'yi yaklaşık 20 mmHg'ye ayarlayın (Şekil 6F).
  21. EKG elektrotlarını bağlayın. Kanülü topraklayın ve tercihinize bağlı olarak elektrodu yanlara, üste veya tepeye yerleştirin (Şekil 6F).
  22. Bir IA-400D amplifikatör kullanarak tüm sinyalleri (perfüzyon, sol ventrikül basıncı ve EKG) yükseltin ve Clampex yazılımına sahip bir sayısallaştırıcı kullanarak bir bilgisayarla arayüz oluşturun (Şekil 6F).

5. IR işlemi kullanılarak miyokard enfarktüsü oluşturma (Şekil 6G, Şekil 7)

  1. Isıtılmış hazneyi önceden ısıtılmış 37 °C HEPES Tyrode tamponu ile doldurun. Kalbi ısıtılmış hazne içindeki tampona daldırın ve tampon akışını durdurmak için vanayı ayarlayın, bu da küresel iskemiye neden olur. İskemi süresini, deneyin belirli hedeflerine göre ayarlayın.
  2. 30 dakikalık iskemiden sonra kalbe tampon akışını eski haline getirmek için musluğu çevirin ve reperfüzyonu başlatın. Enfarktüs boyutunu değerlendirmek için boyama deneyini sonlandırmadan önce kalbin 45 dakika reperfüzyonuna izin verin (Şekil 6G).
    NOT: İskemi veya reperfüzyon süresi deneysel hedeflere göre belirlenir.
  3. Kalp atış hızındaki azalmayı ve düzensiz EKG paternlerini gözlemleyerek başarılı iskemi indüksiyonunu doğrulayın (Şekil 7A). Aritmi veya ventriküler fibrilasyon gözlenecektir.
  4. Kalbi tutuklamak için musluğun yan portundan 10 mL 4 °C HBSS'yi yavaşça uygulayın. Kalbi perfüzyon kolonundan çıkarın, kalan atriyal dokuyu kesin ve kalbi bir doku dilimleme matrisine yerleştirin.
  5. Matrisi şeffaf bir filmle örtün ve kalbi -80 ° C'de yaklaşık 8 dakika veya hatmi benzeri bir kıvama gelene kadar dondurun. Doku dilimleme matrisini dondurucudan çıkarın ve kalbi 2 mm kalınlığında bölümlere ayırmak için tıraş bıçağı yerleştirin.
  6. Doku dilimlerini dilimleme matrisinden tek tek çıkarın ve biyokimyasal deneyler için ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.
  7. Enfarktüs boyama yapın (Şekil 7B). Kalp dilimlerini 10 mL %1 w/v trifeniltetrazolyum klorür (TTC) içinde 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  8. Doku dilimini% 10 tamponlu formaline aktarın ve gece boyunca oda sıcaklığında sabitlenmesine izin verin. En iyi sonuçlar için, kalbi formalinden çıkarın ve dokuyu 24 saat içinde görüntüleyin. Lekenin bozulmasını önlemek için bu adım sırasında ışığa maruz kalmayı en aza indirin.
  9. Lekeli dilimin fotoğrafını çekin ve enfarktüs boyutunu tahmin etmek için ImageJ gibi bir yazılım kullanın.

6. Cihazlar ve kalp dokusu arasında çift yönlü optoelektrik arayüzlerin kurulması (Şekil 8, Şekil 9)

  1. Silikon optoelektronik membranı stimülasyon için istenen yere yerleştirin. Silikon membran, kılcal kuvvet ile epikardiya kendi kendine yapışır (Şekil 8A). Bağlantı zorsa, tutturmaya yardımcı olması için ıslak mendil yapıştırıcıları kullanın.
    NOT: Perfüzyon hızının düşürülmesi, kalp yüzeyindeki su miktarını azaltabilir ve bu da bağlanmayı kolaylaştırır. Kalp yüzeyine bağlandıktan sonra, silikon zar tipik olarak çalışma sırasında önceden belirlenen konuma bağlanır.
  2. Veri kaydı için elektrotları RHD sistemlerine veya diğer elektrofizyolojik platformlara bağlayın. MEA'lar, bir ucunda 0,5 mm aralıklı 16 kanallı G/Ç pedlerine sahiptir ve bunlar sıfır yerleştirme kuvveti (ZIF) konektörü aracılığıyla bir adaptör kartına bağlanır. Adaptör kartı daha sonra bir Omnetics konektörü aracılığıyla ana sahneye bağlanır.
  3. Esnek MEA'ları izole sıçan kalbinin ventriküler yüzeylerine yerleştirin (Şekil 8A). Pencere şeklinde bir silikon membran kullanıyorsanız, MEA'ları pencerenin içine yerleştirin (Şekil 8B).
  4. Transistör-Transistör Mantığı (TTL) sinyallerini kullanarak 635 nm lazer kaynağını istenen frekans (örn. 4 Hz) ve görev döngüsü (örn. %0,4, 1 ms darbe süresi) ile programlayın. Lazer noktasını, nokta boyutu yaklaşık 1 mm olan silikon membrana odaklayın. Koruyucu lazer koruyucu gözlük takın. Odaklama için düşük yoğunlukla başlayın.
  5. Kayıt ve stimülasyon protokolünü başlatın. Kesintisiz bir geçersiz kılma hızı gözlemlenene kadar lazer yoğunluğunu kademeli olarak artırın (Şekil 8C).
    NOT: Bu protokolün standartlarında, lazerin 10 s kesintisiz ilerleme hızı sağladığı eşik yoğunluğunu tanımlar.
  6. Cihaz performansını karşılaştırmak için yoğunluğa karşı süre profili elde etmek için lazer profilini farklı darbe süreleriyle programlayın (Şekil 8D). Kurulum, EKG, TTL ve LVP'nin çok kanallı kaydına izin verir (Şekil 8E).
  7. Silikon zarın veya ışık noktası konumunun konumunu değiştirin ve farklı ilerleme hızı konumlarının hız dalga formlarını ve kalp iletimini nasıl etkilediğini incelemek için adım 6.3-6.6'yı tekrarlayın (Şekil 9A).
  8. İzokron veya aktivasyon gecikme haritasını oluşturmak için her kayıt alanından tempolu QRS tepe noktalarını belirleyin. Aktivasyon gecikme haritasını çizmek için en erken QRS tepe noktasını belirleyin ve bu konumu sıfır gecikme olarak ayarlayın (Şekil 9B-C).
    NOT: Sinüs ritmindeki aktivasyon gecikme haritası (pacing olmadan) referans olarak hizmet edebilirken, paterni kalp koşullarına ve MEA yerleşimine bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir18,30. Sonuçlar, harici pacing gibi net bir stimülasyon kaynağı mevcut olduğunda daha anlamlıdır.

7. Cihazlar ve kalp dokusu arasında çift yönlü elektriksel arayüzlerin kurulması ( Şekil 10)

  1. Stimülasyon elektrotlarını (0,5 cm x 0,5 cm) iki elektrotlu bir konfigürasyonda bağlayın, çalışma elektrodu sol ventrikül duvarına, karşı elektrot ise sağ ventrikül duvarına yerleştirin.
  2. Başarılı ilerleme hızına kadar kare akım dalga biçimlerini (örn. 1 mA, 1 ms darbe süresi) bir potansiyostattan geçirin (Şekil 10A-B). Malzeme stimülasyon etkinliğini değerlendirmek için stimülasyon akımına karşı darbe süresi ve stimülasyon voltajına karşı darbe süresi grafiklerini elde etmek için testler yapın (Şekil 10C-D).
  3. 4 x 4 mikroelektrot dizisi (elektrotlar arasında 2 mm aralık) kullanarak elektrik kaydı yapın ve bir RHD USB arabirim kartı ve RHD 16 kanallı giriş kayıt başlığı kullanılarak kaydedintage. Sinyalleri 0,1-100 Hz bant genişliğinde 10 kS/s'de kaydedin.
  4. Her kayıt elektrodunun gürültüsünü ölçün (Şekil 10E). Aşağıdaki denklemi kullanarak SNR'yi hesaplayın (Şekil 10F):
    figure-protocol-1veyafigure-protocol-2
    Sinyal, sinyal genliğidir ve stdgürültüsü , gürültü seviyelerinin standart sapmasıdır. Kayıtta, ham sonuçları yansıtmak için 60 Hz çentik filtresi kapalıdır.
  5. Python kullanarak ek analizler yapın ve elektrik yayılımının eş zamanlı haritalarını çizin.
  6. Her kasılma için tepe sapmasının (tempolu QRS kompleksi) zaman damgasını belirleyin ve birden fazla sinyalin ortalamasını hesaplayın. Okunabilirliği artırmak için harita oluşturma için Gauss enterpolasyonunu kullanın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok çeşitli optoelektronik ve elektronik malzemelerin stimülasyon elektrofizyolojisi, uygun ve kontrollü bir kurulum sağlayan ex vivo kalp sistemi kullanılarak verimli bir şekilde doğrulanabilir (Şekil 1A). Gözenekli silikon ve gözenekli karbon gibi yüksek şarjlı enjeksiyon malzemeleri, düşük optik yoğunluk ve düşük voltaj stimülasyonu ile biyoelektrik modülasyonu kolaylaştırarak güvenlik ve şarj dengeli kapasitif çalışma sağlar.

Nano gözenekli silikon, gözeneklilik özellikli heteroeklem20, gelişmiş şarj-depolama kapasitesi, azaltılmış empedans ve geliştirilmiş optik absorpsiyon nedeniyle pn veya p-i-n bağlantıları gibi geleneksel silikon yapılara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek fotoakım üretimi sergiler (Şekil 11A). Bu ağırlıklı olarak kapasitif foto akımlar, 0.51 mW /mm2 ışık yoğunluğu ve 1 ms'lik bir darbe süresi ile 240 bpm'de ex vivo sıçan kalplerinin optik pacing'ini elde ederek biyogüvenli, yük dengeli stimülasyonu31 (Şekil 12A-B) mümkün kılar (Şekil 8C) veya 10 ms'lik bir darbe süresi ile 0.167 mW /mm 2 kadar düşük (Şekil 11B) - optogenetik yöntemlerle karşılaştırılabilir veya daha düşük ve lazer güvenlik eşiklerinin çok altında değerler31, 32. Bu yoğunlukların altında, ışık darbelerinin kısmen yakalanması veya hiç yakalanmaması meydana gelebilir. Buna karşılık, p-i-n silikon membranlar veya altın süslemeli p-i-n silikon membranlar gibi diğer malzemeler, pacing'i ortaya çıkarmak için önemli ölçüde daha yüksek optik yoğunluklar gerektirir (Şekil 11B). Nano gözenekli silikon ile sürekli pacing, yüksek LVP ile gösterildiği gibi mekanik büzülmeyi artırır (Şekil 8E). Ayrıca, monolitik formunda, cihaz, lokalize ışık darbeleri altında yüksek uzamsal çözünürlüklü fotoakım enjeksiyonu göstererek, çok bölgeli ve potansiyel rastgele erişim stimülasyon çalışmalarına olanak tanır26.

Çift yönlü, pencere şeklindeki silikon membran çalışmalarında (Şekil 3D, Şekil 8B), çok bölgeli stimülasyon, her bir stimülasyon noktasından dalga yayılımının özgünlüğünü doğrulayarak farklı çok elektrotlu kayıt profilleri ve kalp iletim modelleri üretir (Şekil 9). Bu özellik, sistemin karmaşık kardiyak iletim yollarını yüksek hassasiyetle analiz etme yeteneğini ve miyokard enfarktüsü gibi anormal kalp durumlarını teşhis etme yeteneğini vurgular.

Üretilen MEA'lar yaklaşık 10 μm kalınlığındadır ve bükülme sertliğini en aza indirmek ve esnekliği veya gerilebilirliği artırmak için makro gözenekli yapılar veya serpantin ara bağlantıları içerir (Şekil 4)33,34. Diziler, 6 mm x 6 mm'lik bir alanı kaplayan 4 x 4 konfigürasyonunda düzenlenmiş 16 bağımsız kayıt alanından oluşur. Bu diziler, kalp yüzeyindeki birden fazla bölgede doğrudan epikardiyal sinyal kaydını mümkün kılar. Temsili bir 16 kanallı kayıt Şekil 13'te gösterilmektedir. Kayıtlardan oluşturulan izokron haritaları, lokalize stimülasyon olsun ya da olmasın, kalp yüzeyi boyunca elektrik iletimini görselleştirir. Lokalize stimülasyon genellikle ex vivo kalbin içsel sinüs ritmini ve iletim yollarını geçersiz kılan iletim gecikmelerine neden olur (Şekil 9B).

Nanoyapılı karbon malzemeler, yüksek şarj depolama kapasiteleri ve düşük empedansları sayesinde biyoelektronik cihaz performansını artırmak için etkili bir çözüm sunar (Şekil 14). Tuz destekli lazer transfer yöntemimiz, biyoelektronik performansı artırmak için nano gözenekli karbon cihazlarının esnek alt tabakalara veya geleneksel Au elektrotlarına kolay modelleme ve anında aktarılmasını sağlar. Empedans karakterizasyonu ayrıca, karbon kaplamanın Au elektrodunun empedansını EKG sinyalleriyle ilgili 100 Hz frekansta 7244.4 Ω'den 63.1 Ω'ye yaklaşık 2 büyüklük sırası ile önemli ölçüde azalttığını doğruladı (Şekil 14A-B). Au elektrodunun Helmholtz kapasitansı, karbon kaplamadan sonra 0.025 mF/cm2'den 1.98 mF/cm2'ye önemli ölçüde artmıştır (Şekil 14C). Bu mikro kapasitör kaplama stratejisini kullanan kapasitanstaki artış, geleneksel Au elektrodu ile karşılaştırıldığında polarizasyon voltajını etkili bir şekilde düşürebilir (Şekil 14D).

Bu protokol, elektriksel modülasyona veya kardiyak sistemlerin algılanmasına yönelik etkili biyoarayüzler için nano gözenekli karbon bazlı bir platform oluşturur (Şekil 10). Kardiyak stimülasyon için nano gözenekli karbon elektroniğinin performansını değerlendirmek için, Au veya Au-C elektrodu, bifazik kare akım dalga formlarında35 yük enjeksiyonu için sol ventrikül (LV) duvarına yerleştirildi (Şekil 10A). 4 Hz stimülasyon (1 mA) üzerine, hem Au hem de Au-C elektrotları etkili aşırı hız hızı elde etti (Şekil 10B). Bununla birlikte, Au-C grubunda kasılma kuvvetinin göstergesi olan belirgin şekilde daha yüksek bir EKG amplitüdü gözlendi. Her iki elektrot da darbe süresi ile stimülasyon için eşik akımında üstel bir azalma gösterdi. Etkili frekans modülasyonu için en düşük voltajları gösteren stimülasyon eşikleri de çeşitli darbe genişliklerinde ölçülmüştür (Şekil 10C-D). Mukavemet-süre eğrisi şu denklem kullanılarak modellenmiştir:

figure-results-1

burada I(t), darbe süresindeki (t) uyaran akımını ifade eder, Ireobaz, sonsuz uzun darbe süresindeki (reobaz) eşik akımıdır ve τ, zar zaman sabiti36'dır. Hesaplama, chronaxie'de başarılı bir stimülasyon için gerekli olan minimum şarjı kullanırfigure-results-2. Sdk. Değerler Au ve Au-C elektrotlar için sırasıyla 0.79 ve 0.71 μC olarak belirlendi (Şekil 10C). 4 mA/cm2'lik bir stimülasyon akımında, Au ve Au-C elektrotları için sırasıyla 1.32 V ve 0.90 V'ta etkili stimülasyon için eşik gerilimleri gözlenmiştir (Şekil 10D). Eşik voltajındaki 0,3'lük azalma, uzun süreli stimülasyon31 sırasında oksidatif streste potansiyel bir azalma olduğunu gösterir, böylece minimum doku hasarı ile daha güvenli biyoelektronik uygulamaları kolaylaştırır. Ek olarak, gelişmiş epikardiyal EKG sinyal tespiti için karbon aşılı 16 kanallı bir Au elektrot geliştirilmiştir (Şekil 10E-F). Nanoyapılı karbon transferi, geleneksel Au elektrotlarına kıyasla sinyal-gürültü oranını 8,0 kat artırarak, yüksek kaliteli biyoelektronik için nano gözenekli karbon bazlı kaplamaların etkinliğini gösterdi.

I/R enfarktüs modellerinin başarılı indüksiyonu, deney sırasında yerinde veya deney sonrası olarak sırasıyla fizyolojik sinyal izleme veya TTC boyama yoluyla doğrulandı. Dilimleme ve boyamayı takiben, enfarktüslü kalp, miyokardiyal hasarı temsil eden ve enfarktüs boyutuna karşılık gelen beyaz renkli bir bölge sergileyecektir (Şekil 7B). Buna karşılık, sağlıklı bir kalp lekelenmeden sonra beyaz bölgelerden yoksun kalacaktır. Gerçek zamanlı izleme sırasında, başarılı bir iskemi modeli, LVP ve EKG okumalarında belirgin olan önemli ölçüde azaltılmış bir kalp atış hızı gösterecektir. Ek olarak, iskemik kalbin MEA haritalaması, epikard boyunca azalmış bir elektrik iletim hızını ortaya çıkaracak ve bu da gecikme süresininartmasına neden olacaktır 37 (Şekil 7A).

figure-results-3
Şekil 1: Protokol ve üretim iş akışının şematik gösterimi. (A) Ex vivo sıçan kalbi kurulumunun ve cihaz arayüzünün şematik gösterimi. (B) Gözenekli Silikon membran üretim süreci (adım 1). Gözenekli Si zarının üretimi, altıgen özellikleri tanımlamak için fotolitografi yoluyla bir fotorezist katmanın desenlendiği bir SOI gofret ile başlar. RIE, açıkta kalan silikonu seçici olarak uzaklaştırır, ardından Si membranlarını serbest bırakmak için tamponlu HF'de bir kaldırma işlemi gerçekleştirir. Membran, HF bazlı bir çözelti içinde leke aşındırma işlemine tabi tutulur ve nano gözenekli bir Si yapısı oluşturur. Elde edilen gözenekli Si membranı dikkatlice ayrılır ve mekanik destek için bir PDMS alt tabakasına aktarılır. Son olarak, plazma işlemi, gelişmiş foto akımlar için yüzey özelliklerini değiştirir. (C) Esnek makro gözenekli çok elektrotlu dizilerin üretim süreci (adım 2). Esnek MEA'ların üretimi, esnek alt tabaka tabakası olarak hizmet etmek için bir silikon gofret üzerinde PI kaplama ile başlar. Fotodesenleme, elektrot alanlarını tanımlamak için AZ 2020 fotorezist kullanılarak gerçekleştirilir. Metal biriktirme (Au/Ti), iletken izler oluşturmak için e-ışın buharlaştırma yoluyla gerçekleştirilir, ardından makro gözenekli substrat oluşturmak üzere seçilen bölgeleri RIE'den korumak için AZ 40XT-11D kullanılarak başka bir fotodesenleme adımı gerçekleştirilir. Bir SU-8 fotodesenleme ve sert pişirme adımı, son kaldırma işlemi esnek MEA'yı Si gofretinden serbest bırakmadan önce kapsülleme ekler. (D) Tuz emprenye yoluyla elyaf işleme, lazer sentezi yoluyla mikrofabrikasyon ve kağıt alt tabakadan diğer desteklere su destekli desen transferini kapsayan karbon membran desenleme ve transferinin iş akışı (adım 3). Şekil 1D ,27'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 2: Fabrikasyon cihazların optik ve SEM görüntüleri. (A) Nano gözenekli Si'nin kesitsel SEM (üstte) ve optik mikroskobik görüntüsü (altta). (B) İçi boş (üstte) ve serpantin (altta) tasarımlı makro gözenekli çok elektrot dizilerinin optik görüntüleri. (C) Kömürleşmiş substratların kesitsel optik mikroskobik görüntüsü (üstte) ve fotoğrafı (altta). Şekil 2A ,26'dan değiştirildi. Şekil 2C ,27'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 3: Si membran cihazının CAD tasarımları. Şekil, (A) küçük, (B) orta, (C) büyük ve (D) açık pencere şeklindeki silikon membran cihazları için parametreleri detaylandırmaktadır. Birim: mm. Bu rakam26'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 4: Makro gözenekli MEA'ların CAD tasarımı. (A) İçi boş şekilli MEA için tasarım çizimleri ve ek açıklamalar. (B) Serpantin şeklindeki MEA için tasarım çizimleri ve ek açıklamalar. Birim: mm. Şekil 4A ,26'dan değiştirilmiştir. Şekil 4B ,28'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 5: Kalp arayüzü için karbon bazlı elektrot dizilerinin şemaları ve tasarımları. (A) Uyarıcı elektrot arayüzleri için tasarım (adım 3). Tipik bir stimülasyon sırasında, stimülasyon elektrotları iki elektrotlu bir konfigürasyonda bağlandı. Çalışma elektrodu (serpantin nano gözenekli karbon paterni) sol ventrikül duvarına yerleştirilirken, karşı elektrot sağ ventrikül duvarına yerleştirildi ve toprağa bağlandı. Kare akım dalga biçimleri bir potansiyostat aracılığıyla iletildi. (B) Karbon elektrot maskeleme ve transferi için 16 kanallı MEA'lar (adım 3). Katman 1, bir PI substratı üzerindeki 16 kanallı bir MEA'nın Au modelini gösterir. Katman 2, PET kapsülleme filmini gösterir. Bu rakam27'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 6: Ex vivo kurulum ve deneysel sürecin şematik ve fotoğrafik tasviri. (A) Konik şişe kapları, cerrahi aletler, perfüzyon sistemleri ve sıcaklık kontrol sistemleri dahil olmak üzere ex vivo kurulum için kullanılan aparat ve aletler (adım 4). (B) Sıçan kalbi ekstraksiyon işlemi: Hayvanı izofluran ile uyuşturun; Farenin kollarını sabitleyin; farenin göğüs kafesini açın; Sıçan kalbini hasat edin. (C) Deney düzeneğine hazırlamak için çıkarılan kalpten çevredeki yağ dokusunun çıkarılması. (D) Çıkarılan kalbin ex vivo perfüzyon sistemine bağlanması. (E) Fizyolojik koşulları simüle etmek için sisteme bağlı kalbi gösteren perfüzyon kurulumu. (F) Kalp EKG kayıt kurulumu. (G) İskemi-reperfüzyon (I/R) süreçleri kurulum boyunca gösterilmiştir (adım 5). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 7: Sağlıklı izole kalp ve I/R kalp arasındaki karşılaştırma. (A) LVP, EKG ve EKG yayılma gecikmeleri sahte sağlıklı kalplerden ve iskemi / reperfüzyon (I / R) kalplerden kaydedildi. (B) Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyanmış sağlıklı kalp ve I/R kalp bölümlerinin temsili fotoğrafları. Beyaz alan, enfarktüslü alanın boyutunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 8: Gözenekli silikon membran ve esnek MEA'lar kullanılarak ex vivo sıçan kalbinin çift yönlü optoelektronik pacing ve elektriksel kaydı. (A) Silikon zarın bağlanmasını ve serpantin şeklindeki MEA'ların kalp üzerindeki silikon zarın yanına yerleştirilmesini gösteren fotoğraf. (B) Açık pencere şeklinde bir silikon zarın ve Si penceresinin içine yerleştirilmiş içi boş şekilli MEA'ların takılmasını gösteren fotoğraf. (C) 240 bpm'de üç farklı yoğunlukta yakalanmayan, kısmi yakalama ve tam yakalama gösteren ex vivo sıçan kalbi üzerinde optik ilerleme hızı ve 1 ms darbe süresi. (D) Cihazın ilerleme hızı eşiğini değerlendirmek için süreye karşı yoğunluk grafiği. (E) 0,24 mW/mm2 yoğunluk ve 10 ms darbe süresi altındaki optik pacing profilleri. Şekil 8B-D,26'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11
Şekil 9: Çift yönlü arayüzlerde çok bölgeli ilerleme hızı ve haritalama. (A) İlerleme hızı ve kayıt sitelerinin konumları. (B) İzokron haritası, açık pencere yapılı monolitik bir Si cihazında sekiz farklı konumun fotostimülasyonundan sonra elektrik sinyali aktivasyon gecikmesini gösterir. (C) Farklı pacing konumlarında örnek kontrol ve paced 16 kanallı EKG izleri. Çeşitli yerleri uyararak, mekansal aktivasyon, farklı kayıt bölgelerindeki dokularda tespit edilen QRS evriminde zamansal gecikmelere neden oldu. Bunlar, kalp yüzeyindeki iletim yollarının incelenmesini sağlayan bir aktivasyon gecikme haritası olarak gösterilebilir. Bu rakam26'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-12
Şekil 10. Kardiyak stimülasyon ve kayıt için nano gözenekli karbon bazlı biyoelektronik. (A) Kalp stimülasyonu için gözenekli karbon membran aşılı Au (Au-C) elektrodunun optik görüntüsü. Ekteki resim, Au elektrodu üzerindeki serpantin yapılı bir mikro kapasitörün büyütülmüş görünümünü göstermektedir. (B) İzole sıçan kalbinin 4 Hz frekansında bifazik, kare akım dalga formu stimülasyonuna EKG yanıtı. 4.0 mA /cm2'lik aynı akım yoğunluğu altında, kalp Au veya Au-C elektrotlarından gelen stimülasyon altında farklı EKG yanıtları gösterdi. (C) Au ve Au-C stimülasyon elektrotlarının süre-kuvvet eğrileri ve bunların eğri uydurmaları, 4 Hz'lik bir stimülasyon frekansında mevcuttur. (D) Au ve Au-C elektrotları için farklı sürelerde etkili stimülasyon için elektrotlara uygulanan eşik voltajı. (E) Au elektrot ve Au-C elektrot cihazlarıyla kaydedilen EKG sinyallerinin temel eğrileri. (F) Sinyal-gürültü (S/N) oranı, kaydedilen EKG eğrilerinden hesaplanır. Ekteki şekiller, EKG kaydı için kullanılan Au ve Au-C elektrot dizisinin optik görüntülerini göstermektedir (elektrot boyutu: 1 mm; adım 7.5). Bu rakam27'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-13
Şekil 11: Farklı Si cihazları için fotoakım karşılaştırması ve pacing eşiği değerlendirmesi. (A) Dört Si tabanlı cihazdaki fotoakım büyüklüklerinin karşılaştırılması. Mavi izler, N = 8 bağımsız cihazdan gelen ortalama foto akımları temsil eder ve üst üste binen gri izler, bireysel cihaz ölçümlerini gösterir. Ekteki çubuk grafik, tepe fotoakım değerlerini (mavi renkte) ve entegre şarj enjeksiyonlarını (turuncu renkte) gösterir. Çubuk grafikler ortalama ± s.d olarak ifade edilir. Ölçek çubuğu, 10 ms. (B) Ex vivo kalp pili üç farklı cihaz kullanılarak gerçekleştirildi. Pacing, 240 bpm hızı ve 10 ms darbe genişliği ile gerçekleştirildi. Bu rakam26'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-14
Şekil 12: Enjekte edilen ve geri verilen yükün entegre edilmesiyle yük dengesinin karakterizasyonu. (A) Karakteristik fotoakım izinde şarj ve deşarj işleminin gösterimi. (B) Ücret enjeksiyonu ve ücret iadesi ile ilgili toplam ücretlerin hesaplanması. Sonuçlar, farklı stimülasyon süreleri altında genel olarak iyi bir şarj dengesi gösterdi. Bu rakam26'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-15
Şekil 13: 16 kanallı MEA'da her bir elektrot tarafından toplanan temsili elektrik sinyalleri. 16 kanaldaki (Ch) elektrik sinyalleri, ex vivo atan kalbin elektrokardiyogram (EKG) bilgilerini gösterir. Rakam28'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-16
Şekil 14. Nano gözenekli karbon bazlı biyoelektroniğin elektrokimyasal özellikleri. (A) Uyarılabilir dokular ve desenli karbon arayüzleri arasındaki elektrokimyasal arayüz. (B) A'da gösterilen devreye göre takılmış eğrilere sahip Au ve Au-C elektrotlarının empedans ve faz spektrumları. (C) Aynı geometriye sahip Au ve C modellerinin CV ölçümü, standart bir Ag / AgCl elektroduna karşı -0,2 ila 0,4 V voltaj aralığı. (D) Bifazik galvanostatik stimülasyon döngüsü sırasında Au ve Au-C elektrodunun voltaj değişiklikleri. Bu rakam27'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

BileşikÖnerilen çeşitlilikDevamı [mM]MW1 L başına2 L'de
NaCl (Doğal)Sigma (S9625)12658.47.3614.7
KartalSigma (P4504)5.474.60.40.8
GlikozSigma (G7021)101801.83.6
HEPES ÜNİVERSİTESİSigma (H4034)102382.3834.766
MgCl2.7H2OSigma (M9272)12031 mL2 mL
Stok 1 MStok 1 M
CaCl2.2H2OSigma (C3881)21471 mL2 mL
Stok 2 MStok 2 M
NaH2PO4Sigma (S0751)0.391201 mL2 mL
Stok 0.39 MStok 0.39 M

Tablo 1: HEPES Tyrode'un Çözelti Bileşenleri.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, biyoelektronikte hızla büyüyen araştırma çabalarına ve taleplerine eşlik etmek için hızlı ve uygun organ düzeyinde elektrofizyoloji çalışmaları sunmak için ex vivo sıçan kalbi platformunu (Şekil 1A) ve I/R modelini tanıttı38. Çift yönlü elektrofizyolojik sorgulamalar için ölçüt olarak nano gözenekli silikon, esnek çok elektrotlu diziler ve nano gözenekli karbon (Şekil 1B-D) olmak üzere üç cihaz sisteminin imalatını ve doğrulanmasını detaylandırdı. Nano gözenekli silikon, düşük yoğunluklu, kapasitif ve yüksek uzay-zamansal pacing sağlar, esnek çoklu elektrot dizileri, epikardiyal aktivitelerin çok kanallı kaydını ve haritalanmasını sağlar ve nano gözenekli karbon, MEAs27 ile birleştirildiğinde düşük voltajlı stimülasyona ve yüksek SNR kaydına yol açar.

Optik pacing, hedef dokularda ışığa duyarlı iyon kanallarını eksprese etmek için genetik modifikasyon gerektiren bir yöntem olan optogenetik kullanılarak daha önce gösterilmişti33. Etkili olmakla birlikte, optogenetik, viral vektörlere veya transgenik yaklaşımlara duyulan ihtiyaç nedeniyle önemli bir karmaşıklık ortaya çıkarmakta ve özellikle klinik uygulamalar için güvenlik, etik ve düzenleyici kaygıları artırmaktadır. Buna karşılık, yarı iletken bazlı, genetik olmayan biyostimülasyon, daha basit ve translasyonel olarak daha uygulanabilir bir alternatif sunar 39,40,40,42. Silikon ve diğer organik yarı iletkenler gibi malzemeler, biyolojik olarak güvenli ve yük dengeli stimülasyon için kapasitif fotoakımlardan yararlanarak, genetik değişiklik olmadan dokuların doğrudan optoelektronik modülasyonunu sağlar. Bu yaklaşım, doku hasarını en aza indirmek için lazer güvenlik eşiklerinin çok altında çalışarak, pacing yoğunluğu açısından optogenetik ile karşılaştırılabilir ve hatta daha üstün performans sağlar31,32 (Şekil 8). Yarı iletken bazlı biyostimülasyonun genetik olmayan doğası, genetik modifikasyonla ilişkili engelleri ortadan kaldırarak, klinik ortamlarda daha geniş çapta benimsenmesinin ve doku mühendisliği ve biyoelektronik tıpta çeşitli uygulamaların önünü açar. Bununla birlikte, cihazların, biyouyumluluğun dikkatli bir şekilde dikkate alınması gereken doku ile bütünleşecek şekilde dikkatli bir şekilde tasarlanması ve ayrıca verimli stimülasyon ve kayıt için arayüz yerinin olması gerekir (Şekil 8A-B). Ek olarak, doku yüzeyindeki materyalin varlığı, bir cihaz belirli görüntüleme ajanlarının uyarma-emisyon penceresine şeffaf olacak şekilde tasarlanmadıkça, gerçek zamanlı görüntüleme olasılığını engelleyebilir.

Nano gözenekli silikon, daha önce bildirilen malzemelerin aksine yapay bir geri dönüş elektrotu gerektirmediği için yarı iletken fotostimülatörler arasında öne çıkmaktadır26. Bu benzersiz özellik, ışık noktası boyutuna ve konumuna bağlı olarak uzamsal olarak çözülmüş katot ve anot bölgeleri oluşturma yeteneğinden kaynaklanmaktadır. Aydınlatılmış yüzey katodik enjeksiyon bölgesi olarak işlev görürken, çevredeki çevresel bölgeler anodik akım dönüşünü kolaylaştırır. Bu mekanizma, monolitik, pikselsiz membranlar üzerinde çok bölgeli stimülasyonu mümkün kılarak hassas ve lokalize stimülasyona izin verir. Özellikle, küresel aydınlatma yerine lokalize ışık stimülasyonu, verimli bipolar stimülasyon profilleri oluşturmak için kritik öneme sahiptir. Ek olarak, cihaz boyutu performansı önemli ölçüde etkiler; Daha büyük cihazlar, aynı stimülasyon koşulları altında daha yüksek akımlar üreterek işlevsel çok yönlülüklerini daha da artırır.

Optik pacing'in başarısızlığı, sağlıklı biyolojik modellerde bile, öncelikle cihaz bütünlüğü ve biyoarayüz eşleşmesi ile ilgili çeşitli faktörlerden kaynaklanabilir. İlk olarak, kalp stimülasyonundan önce kapsamlı fotoakım karakterizasyonu kritik öneme sahiptir. Beklenenden daha düşük foto akımlar, uzun süreli depolamadan sonra malzeme bozulması43 oksit pasivasyonundan, leke aşındırma işlemi sırasında aşırı aşındırmadan, taşıma veya aktarma sırasında cihaz kırılmalarından veya arayüz oluşturma sırasında yanlış cihaz yönlendirmesinden kaynaklanabilir. Mekanik hasarı azaltmak için PDMS, nano gözenekli silikon membranları barındırmak için yumuşak bir alt tabaka olarak kullanıldı ve cımbızla doğrudan kullanımdan kaynaklanan potansiyel hasara karşı koruma sağladı. İkincisi, bu kurulumda biyosıvılarla perfüze edilen epikard ile kesintisiz bir arayüz oluşturmak çok önemlidir. Kalın bir biyoakışkan tabakası, düzgün bağlanmayı engelleyebilir ve ilerleme hızı etkinliğini tehlikeye atabilir. Biyoarayüz bağlantısını geliştirmek için, bağlantıyı stabilize etmek ve güvenilir stimülasyon sağlamak için biyoyapıştırıcılar42,43 veya dikiş kullanılabilir. Özellikle, çalışmamızda kullanılan nano gözenekli silikon biyolojik olarak parçalanabilir, geçici pacing uygulamalarını destekler, ancak fizyolojik koşullar altında 1-2 gün içinde performansı düşer. Daha uzun vadeli stabilite için, yüzey pasivasyonu44 veya daha dayanıklı yarı iletken malzemelerin kullanılması düşünülmelidir.

Ex vivo pacing sırasında, daha yüksek frekanslarda (örneğin, 4 Hz) kademeli LVP artışı (Şekil 8E) muhtemelen artmış miyokardiyal kasılma, kalsiyum birikimi ve Frank-Starling mekanizmasındankaynaklanır 45. Yüksek pacing hızları, hücre içi kalsiyum döngüsünü ve ventriküler dolum dinamiklerini iyileştirerek ön yükü ve kasılma kuvvetini artırır46. Bu, miyokardiyal oksijen talebini ve aritmi riskini artırabilirken, bu etkiler yeterli ön oksijenasyon, yakın EKG izleme ve kontrollü pacing parametreleri ile hafifletilebilir. Deneylerimizde önemli bir yan etki gözlenmedi.

Çoklu elektrot kaydında, kalpteki elektrot konumlarının ve bunların pacing elektroduna göre konumlarının belirtilmesi, anlamlı analiz için çok önemlidir. Farklı dalga formlarının ve zamansal olarak çözülmüş modellerin yakalanmasını sağlamak için elektrotlar arasındaki karışmayı ortadan kaldırmak çok önemlidir. Esnek elektrot dizileri tipik olarak epikard ile iyi bir arayüz oluşturur; Bununla birlikte, stabiliteyi ve sinyal kalitesini iyileştirmek için ince hidrojel katmanları28,43 gibi iyonik olarak iletken yapışkan kaplamalar kullanılarak yapışma daha da geliştirilebilir.

Şarj depolama ve enjeksiyon için geniş yüzey alanlarına sahip nanoyapılı grafen/karbon malzemeler, elektrot-salin bağlantılarında empedansı azaltarak ve yük enjeksiyon yeteneklerini artırarak biyoelektronik cihaz performansını iyileştirebilir35. Grafen malzemelerini esnek elektrotlar (örneğin, Au) üzerine desenlemek için mevcut yöntemler arasında elektrodepozisyon, spin kaplama ve serigrafi47 bulunur. Bununla birlikte, bu yöntemler tipik olarak karmaşık imalat süreçleri, sınırlı desenleme yetenekleri ve bağlayıcıların ölü hacmi nedeniyle düşük performans ile ilişkilidir. Selüloz substrat üzerinde nanoyapılı karbon desenleri oluşturmak ve daha sonra biyoelektronik üretimi için kolay ve etkili bir yol sunan uyumlu bir biyoarayüz oluşturmak için bunları diğer yumuşak filmlere aktarmak için bir lazer sentez yöntemi kullanıldı. Lokalize elektrik alanını artıracak olan tek hücre seviyesine kadar küçük geometrik boyutlara sahip desenli karbon kaplamaların ve elektrot-doku arayüzündeki direnci azaltmak için karbon zarın oldukça gözenekli yapılarının kombinasyonu, gelecekte sinerjik olarak verimli biyolojik stimülasyon ve kayıt sağlayacaktır48.

Uygun bir hastalık modeli olmasına rağmen, Langendorff ex vivo I/R modeli, kalbi nörohormonal ve immün tepkilerden izole eden sistemik etkileşimlerden yoksundur ve oksijen iletimi ve endotel fonksiyonu gibi fizyolojik durumları değiştirebilen tamponlarla yapay perfüzyona dayanır. Sınırlı yaşayabilirliği, çalışmaları akut olaylarla sınırlar. Bununla birlikte, model, hassas parametre ayarlamaları ve iyi tekrarlanabilirlik ile son derece kontrollü bir ortam sunar. Aynı zamanda gerçek zamanlı kardiyak fonksiyon ölçümünü mümkün kılarak, iskemik kalp hastalığı için yeni terapötik stratejileri keşfetmek için değerli bir araç haline getirir. Örneğin, elektroceutical cihazların kalbi önceden koşullandırması, şiddetli reaktif oksijen türleri (ROS) ortamlarına dayanması için eğitmesi veya daha iyi iyileşme için ROS seviyelerini azaltması öngörülebilir. Bu tür tedavilerin etkinliği, kalp atışı paternleri, EKG dalga formları ve iletim hızı gibi metriklerle değerlendirilebilir. Ayrıca, çok bölgeli bir stimülasyon platformu, miyokard enfarktüsü hakkında mekansal bilgi sağlayabilir ve etkilenen bölgelerin daha ayrıntılı bir değerlendirmesini mümkün kılabilir. Bu yaklaşım aynı zamanda, enfarktüsün ciddiyeti ile ilişkili gelişmiş stimülasyon eşiklerini de gösterebilir ve terapötik değerlendirme ve optimizasyon için kapsamlı bir çerçeve sunar.

Protokol, üç cihazın çift yönlü ex vivo kalp modellerinde kullanımını vurgularken, uygulanabilirlikleri kalp dokularının çok ötesine uzanıyor. Bu cihazlar, hassas elektriksel modülasyonun kritik olduğu sinir dokuları, iskelet kasları ve gastrointestinal sistemler gibi elektriksel olarak uyarılabilir diğer dokular veya organlarla kullanım için kolayca uyarlanabilir ve bu da onları biyoelektronik tıpta hem araştırma hem de çeviri uygulamaları için çok yönlü araçlar haline getirir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.L. ve B.T., nano gözenekli silikon cihaz üretimi ve uygulaması için patent başvurusunda bulundu. P.L., C. Y. ve B. T., nano gözenekli karbon cihaz üretimi ve uygulaması için patent başvurusunda bulundu. P. L. ve B.T., esnek mikroelektron dizisi üretimi ve uygulaması için bir patent başvurusunda bulundu.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından 1R56EB034289-01 ve 1R01EB036091-01 hibesi ve ABD Ordusu Araştırma Ofisi tarafından W911NF-24-1-0053 hibesi yoluyla mali olarak desteklenmiştir. P. L., Grier Biyofiziksel Bilimler İnovasyon Ödülü'nün verdiği destek için minnettardır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
16 Kanal Sahne Alanıİntan TeknolojileriC3334 (İngilizce)
2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorürSigma AldrichT8877-5GTrifeniltetrazolyum klorür
2-Propanol (IPA) Fischer BilimselA451-4 Serisi
635 nm Lazer, 500 mWLazer parıltısıNA
AsetonFischer BilimselA18-4 Fırlatma Makinası
Angstrom Evovac e-ışın evaporatörüAngstromNA
AZ 300MIF GeliştiriciMikrokimyasallar18441123163Geliştirici
AZ nlof 2020 Mikrokimyasallar1A002020
AZ NMP MikrokimyasallarNAFotorezist sökücü
AZ40XT-11D Mikrokimyasallar1000300Fotorezist
Arabelleğe alınmış HFTermo BilimselAA44627K2
CaCl2.2H2OSigma Aldrich(C3881)
CO2 lazer Üniversal Lazer SistemleriVLS 4.60
İletken gümüş boyaPELCO16062Elektrot ve bağlantı Cu teli arasında iletken yapışma
0,1 mm kapsüllü bakır telAmazonhttps://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/
B09TNM51S5/ref=asc_df_B09
TNM51S5?mcid=155de761ea4
c389ea86d45ba61a83e8d& etiket
=hyprod-20& linkCode=df0& hvadid
=693675076770& hvpos=& hvnetw
=g& hvrand=664358781094905
4431& hvpone=& hvptwo=& hvqmt
=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint
=& hvlocphy=9021716& hvtargid=
pla-1878323158943& psc=1
Digidata 1550 sayısallaştırıcıMoleküler CihazlarNA
GlikozSigma AldrichG7021 Serisi
HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı yokTermo Bilimsel14175095
Heidelberg MLA150 doğrudan yazarHeidelbergNA
heparin (1000 IU/kg)Sagent İlaç1009655
HEPESSigma Aldrich(H4034)
Hekzan Sigma Aldrich52750-10MLÇözücü
HFFisher BilimselA513-500 Cep Telefonuİz metal kalitesi
HMDS Buharlı Prime FırınVerim Mühendisliği SistemleriNA
HNO3Fisher BilimselA509P500İz metal kalitesi
Sıcak laminasyon makinesiOfis DeposuL410-AÇok katmanlı kapsülleme
Intan RHD sistemleriİntan TeknolojileriC3100 Serisi
iWorx EKGiWorx IA-400D
iWorx LVD sondasıiWorxBP-100 Serisi
iWorx ön yükselticiiWorxC-ISO-256
KartalSigma Aldrich(P4504)
Lateks Balon (4 numara)Radnoti Belediyesi170404
MgCl2.7H2OSigma Aldrich(M9272)
NaClSigma Aldrich(S9625)
Nafion 117 içeren çözeltiSigma Aldrich31175-20-9Nano gözenekli karbon modeli için sabitleme reaktifi
NaH2PO4Sigma Aldrich(S0751)
NaOHSigma Aldrich221465
PDMSFisher BilimselNC9285739
Plasma-Therm endüktif olarak eşleşmiş plazma florür aşındırıcıPlazma-TermalNA
PMMA (495 A6) MikrokimyasallarM130006
Poli (piromelitik dianhidrit-Co-4,4'-oksidianilin)Sigma Aldrich575801PI öncüsü
Poli (etilen-ko-vinil asetat)Sigma Aldrich437247-250GSızma için polimer
Poli (vinil alkol)Sigma Aldrich341584-25G
Polietilen tereftalat (PET)AmazonKS-6304-21-11Tip D Şeffaf PET Levha .0005" Kalın x 27" Genişlik x 10 Ft Uzunluk 1 adet
PotansiyostatBiyolojikSP-200 SerisiElektriksel stimülasyon
Fırına Karşı Direnç SevkiyatLCC1-15-5
Taramalı elektron mikroskobuCarl ZeissMerlinMorfoloji karakterizasyonu için araç
silikon gofret NOVA Elektronik MalzemelerHS39626
Silikon yapıştırıcıTEFEKWIK-SIL-SKapsülleme
Sodyum BoratSigma AldrichSX0355 Serisi
SOI gofretUltrasil3-10541Tip-Yönelim:P/B(100) DT:7+/-1um DR:<. 005 Ohmcm HT:300+/-10um HR:1-30 Ohmcm Kutu:1um+/-5% UD-13998/UH-13962
SU-8 2002MikrokimyasallarSU-8 2000 Serisi
SU-8 geliştiricisiMikrokimyasallarSU-8 2000 Serisi
Islak mendil yapıştırıcısı3 milyon1469SB
Whatman kalitatif filtre kağıdı, Sınıf 1Sigma AldrichWHA1001150Karbon desenleme için alt tabaka

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sunwoo, S. H., et al. Soft bioelectronics for the management of cardiovascular diseases. Nat Rev Bioeng. 2 (1), 8-24 (2024).
  2. Choi, H., et al. Adhesive bioelectronics for sutureless epicardial interfacing. Nat Elect. 6 (10), 779-789 (2023).
  3. Choi, Y. S., et al. Fully implantable and bioresorbable cardiac pacemakers without leads or batteries. Nat Biotech. 39 (10), 1228-1238 (2021).
  4. Cingolani, E., Goldhaber, J. I., Marbán, E. Next-generation pacemakers: from small devices to biological pacemakers. Nat Rev Cardiol. 15 (3), 139-150 (2018).
  5. Sala, L., Ward-van Oostwaard, D., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L., Bellin, M. Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs). J Vis Exp. (123), e55587(2017).
  6. Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J Vis Exp. (159), e61167(2020).
  7. Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes. J Vis Exp. (164), e61073(2020).
  8. Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. J Vis Exp. (128), e56634(2017).
  9. Trayanova, N. A. Whole-Heart Modeling: Applications to Cardiac Electrophysiology and Electromechanics. Circ Res. 108 (1), 113-128 (2011).
  10. Yin, R. T., et al. Open thoracic surgical implantation of cardiac pacemakers in rats. Nat Protoc. 18 (2), 374-395 (2023).
  11. Wu, K., et al. Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice. J Vis Exp. (171), e62514(2021).
  12. Pendexter, C. A., et al. Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts. J Vis Exp. (208), e66815(2024).
  13. Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-current possibilities and strive for future applications. J Tissue Eng Regenerat Med. 16 (10), 853-874 (2022).
  14. Jiang, Y. W., et al. Topological supramolecular network enabled high-conductivity, stretchable organic bioelectronics. Science. 375 (6587), 1411-1417 (2022).
  15. Driscoll, N., et al. MXene-infused bioelectronic interfaces for multiscale electrophysiology and stimulation. Sci Transl Med. 13 (612), eabf8629(2021).
  16. Gablech, I., Głowacki, E. D. State-of-the-Art Electronic Materials for Thin Films in Bioelectronics. Adv Elect Mater. 9 (8), 2300258(2023).
  17. Cho, Y. H., Park, Y., Kim, S., Park, J. 3D Electrodes for Bioelectronics. Adv Mater. 33 (47), 2005805(2021).
  18. Chen, Z., et al. bioresorbable, transparent microelectrode arrays for multimodal spatiotemporal mapping and modulation of cardiac physiology. Sci Adv. 9 (27), eadi0757(2023).
  19. Jiang, Y. W., et al. Rational design of silicon structures for optically controlled multiscale biointerfaces. Nat Biomed Eng. 2 (7), 508-521 (2018).
  20. Prominski, A., et al. Porosity-based heterojunctions enable leadless optoelectronic modulation of tissues. Nat Mater. 21 (6), 647-655 (2022).
  21. Huang, Y. X., et al. Bioresorbable thin-film silicon diodes for the optoelectronic excitation and inhibition of neural activities. Nat Biomed Eng. 7 (4), 486-498 (2023).
  22. Balamur, R., et al. Capacitive and Efficient Near-Infrared Stimulation of Neurons via an Ultrathin AgBiS2 Nanocrystal Layer. ACS Appl Mater Inter. 16 (23), 29610-29620 (2024).
  23. Karatum, O., Kaleli, H. N., Eren, G. O., Sahin, A., Nizamoglu, S. Electrical Stimulation of Neurons with Quantum Dots via Near-Infrared Light. ACS Nano. 16 (5), 8233-8243 (2022).
  24. Han, M., et al. Photovoltaic neurointerface based on aluminum antimonide nanocrystals. Comm Mater. 2 (1), (2021).
  25. Ejneby, M. S., et al. Chronic electrical stimulation of peripheral nerves via deep-red light transduced by an implanted organic photocapacitor. Nat Biomed Eng. 6 (6), 741-753 (2022).
  26. Li, P., et al. Monolithic silicon for high spatiotemporal translational photostimulation. Nature. 626 (8001), 990-998 (2024).
  27. Yang, C., et al. A bioinspired permeable junction approach for sustainable device microfabrication. Nat Sustain. 7 (9), 1190-1203 (2024).
  28. Shi, J., et al. Monolithic-to-focal evolving biointerfaces in tissue regeneration and bioelectronics. Nat Chem Eng. 1 (1), 73-86 (2024).
  29. Shi, J., et al. Active biointegrated living electronics for managing inflammation. Science. 384 (6699), 1023-1030 (2024).
  30. Zhang, L., et al. Marangoni Effect-Driven Motion of Miniature Robots and Generation of Electricity on Water. Langmuir. 33 (44), 12609-12615 (2017).
  31. Cogan, S. F. Neural Stimulation and Recording Electrodes. Ann Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  32. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nat Biotechnol. 33 (7), 750-754 (2015).
  33. Hsueh, B., et al. Cardiogenic control of affective behavioural state. Nature. 615 (7951), 292-299 (2023).
  34. Tian, B. Z., et al. Macroporous nanowire nanoelectronic scaffolds for synthetic tissues. Nat Mater. 11 (11), 986-994 (2012).
  35. Fang, Y., et al. Micelle-enabled self-assembly of porous and monolithic carbon membranes for bioelectronic interfaces. Nat Nanotechnol. 16 (2), 206-213 (2021).
  36. Kay, G. N., Shepard, R. B. Stimulation and Excitation of Cardiac Tissues. Clin Cardiac Pacing Defibrillat Resynchronizat Ther. , 61-113 (2017).
  37. Zhang, J., et al. Gold-modified nanoporous silicon for photoelectrochemical regulation of intracellular condensates. Nat Nanotechnol. , (2025).
  38. Li, P., Kim, S., Tian, B. Beyond 25 years of biomedical innovation in nano-bioelectronics. Device. 2 (7), 100401(2024).
  39. Yang, C., Cheng, Z., Li, P., Tian, B. Exploring Present and Future Directions in Nano-Enhanced Optoelectronic Neuromodulation. Acc Chem Res. 57 (9), 1398-1410 (2024).
  40. Prominski, A., Li, P., Miao, B. A., Tian, B. Nanoenabled Bioelectrical Modulation. Acc Mater Res. 2 (10), 895-906 (2021).
  41. Li, P., Kim, S., Tian, B. Nanoenabled Trainable Systems: From Biointerfaces to Biomimetics. ACS Nano. 16 (12), 19651-19664 (2022).
  42. Majmudar, A., Kim, S., Li, P., Tian, B. Perspectives on non-genetic optoelectronic modulation biointerfaces for advancing healthcare. Med-X. 2 (1), 18(2024).
  43. Hwang, S. W., et al. A Physically Transient Form of Silicon Electronics. Science. 337 (6102), 1640-1644 (2012).
  44. Yu, Y., et al. Enhanced photoelectrochemical efficiency and stability using a conformal TiO2 film on a black silicon photoanode. Nat Ener. 2 (6), 17045(2017).
  45. Kosta, S., Dauby, P. C. Frank-Starling mechanism, fluid responsiveness, and length-dependent activation: Unravelling the multiscale behaviors with an in silico analysis. PLoS Computat Bio. 17 (10), e1009469(2021).
  46. Silverman, D. N., et al. Heart Rate-Induced Myocardial Ca2+ Retention and Left Ventricular Volume Loss in Patients With Heart Failure With Preserved Ejection Fraction. J Am Heart Assoc. 9 (17), e017215(2020).
  47. Zeng, M., et al. Printing thermoelectric inks toward next-generation energy and thermal devices. Chem Soc Rev. 51 (2), 485-512 (2022).
  48. Rastogi, S. K., et al. Remote nongenetic optical modulation of neuronal activity using fuzzy graphene. Proc Natl Acad Sci. 117 (24), 13339-13349 (2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ex Vivo Kalpift Y nl Aray zlerKardiyak BiyoelektronikLangendorff Perf zyonuskemi Reperf zyonMiyokard Enfarkt s Modeliok Elektrotlu DiziOptoelektronik Stim lasyonNanog zenekli Karbon ElektrotlarSinyal G r lt Oran

İlgili makaleler