Yöntem makalesi

Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi

DOI:

10.3791/68308

⸱

20 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mini inme modelinde akış sitometrik analizi kullanarak iskemik inme sonrası immün hücre fonksiyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, nöroimmün etkileşimlerin ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar ve diğer nörodejeneratif hastalıkları incelemek için uyarlanabilir ve inme patolojisindeki immün yanıtları anlamamızı geliştirir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnme, dünya çapında önde gelen bir ölüm ve uzun süreli sakatlık nedenidir ve iskemik inme vakaların çoğunu temsil eder. İskemik inmeyi takiben, yerleşik ve sızan bağışıklık hücreleri aktive olur ve daha fazla nöronal hasara katkıda bulunur. Bununla birlikte, iskemik inme patolojisinde bağışıklık sisteminin rolleri, büyük ölçüde nöroinflamasyon sırasında mikro çevredeki değişikliklere tepki olarak bağışıklık tepkilerinin karmaşık ve dinamik düzenlenmesi nedeniyle tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, iskemik inmeden sonra zaman içinde yerleşik ve sızan bağışıklık hücrelerinin aktivasyonunu izlemek ve analiz etmek önemlidir. Bu çalışmada, mini inme modelinde akım sitometrik analiz kullanarak iskemik inme sonrası bu immün hücrelerin fonksiyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Enfarktüslü beyin dokusunu belirli zaman noktalarında mikrodiseke ediyoruz ve daha sonra hem mekanik hem de enzimatik yöntemler kullanarak tek hücreli bir süspansiyona ayırıyoruz. Hücreler 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirilir ve akış sitometrik analizi ile ölçülmeden önce floresan etiketli antikor kokteylleri ile etiketlenir. Bu test, iskemik inme sonrası nöroimmün etkileşimleri araştırmak için özel olarak geliştirilmiş olsa da, multipl skleroz, Parkinson hastalığı ve Alzheimer hastalığı gibi diğer nörodejeneratif hastalıklarda nöroimmün mekanizmaları incelemek için de kolayca uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnme, dünya çapında mortalite ve uzun süreli sakatlığın baskın bir nedenidir ve iskemik inme vakaların büyük çoğunluğunu oluşturmaktadır 1,2,3. Bu yöntemin genel amacı, bir mini inme murin modelinde hem yerleşik hem de sızan bağışıklık hücrelerinin aktivasyonunu değerlendirmek için rafine bir yaklaşım sağlayarak iskemik inme sonrasında ortaya çıkan nöroimmün etkileşimler hakkındaki anlayışımızı geliştirmektir 4,5. Bu immün hücreler ve nöronal mikroçevre arasındaki karmaşık etkileşim, iskemik inmenin patofizyolojisini anlamak için çok önemlidir. Bununla birlikte, bu nöroimmün etkileşimlerin altında yatan kesin mekanizmalar, esas olarak nöroinflamasyon tarafından tetiklenen immün tepkilerin dinamik ve çok yönlü doğası nedeniyle, tam olarak aydınlatılamamıştır6. Bu teknik, nöroinflamasyon bağlamında immün yanıtların karmaşık dinamiklerini ve bunların nöronal hasar ve iyileşme sonuçları üzerindeki müteakip etkilerini aydınlatmayı amaçlamaktadır.

Bu tekniğin geliştirilmesinin ardındaki mantık, bağışıklık hücrelerinin nöronal hasarı şiddetlendirmede ve iskemik bir olayı takiben iyileşmeyi etkilemede oynadığı kritik rolden kaynaklanmaktadır. Bu etkileşimleri incelemenin geleneksel yöntemleri genellikle bağışıklık hücresi aktivasyonunun zamansal ve mekansal nüanslarını yakalamak için gerekli çözünürlükten yoksundur. Mikrodiseke enfarktüslü beyin dokusundan türetilen tek hücreli süspansiyonlar üzerinde akış sitometrik analizi kullanan bu protokol, zaman içinde bağışıklık hücresi profillerinin daha ayrıntılı ve dinamik bir değerlendirmesini sunar 7,8. Bu yaklaşım, iskemik inmenin patofizyolojisini anlamak için çok önemli olan spesifik immün hücre popülasyonlarının ve fonksiyonel durumlarının tanımlanmasını sağlar.

İmmün hücre tiplerinin bireysel katkıları hakkında sınırlı bilgi sağlayabilen histolojik boyama veya toplu RNA dizilimi gibi alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında, bu akış sitometrik yöntem çeşitli avantajlar sunar. Örneğin, önceki çalışmalar, akış sitometrisinin aynı anda birden fazla markörün yüksek verimli analizine izin vererek, bağışıklık hücresi fenotiplerinin ve işlevlerinin daha kapsamlı bir karakterizasyonunu kolaylaştırdığını göstermiştir 9,10,11,12,13. Ek olarak, bu yöntemin multipl skleroz, Parkinson hastalığı ve Alzheimer hastalığı gibi çeşitli nörodejeneratif durumlara uyum sağlama yeteneği, nöroimmün etkileşimleri ele alan daha geniş literatürde çok yönlülüğünü ve alaka düzeyini göstermektedir.

Bu yöntemin uygulanmasını düşünen araştırmacılar için, çalışmalarının özel amaçlarını değerlendirmek esastır. Bu teknik, özellikle iskemik inme veya ilgili nörodejeneratif hastalıklar bağlamında immün yanıtların ayrıntılı zamansal analizini gerektiren araştırmalar için uygundur. Kullanıcıların bu protokolü etkili bir şekilde uygulamak ve elde edilen verileri yorumlamak için temel bir akış sitometrisi anlayışına ve murin modelleriyle ilgili deneyime sahip olmaları önerilir. Bu yöntem, nöroimmün etkileşimleri incelemek için sağlam bir çerçeve sağlayarak, inme patolojisinde immün tutulumun karmaşıklıklarını tanımlamaya yönelik devam eden çabalara önemli ölçüde katkıda bulunur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Başkent Tıp Üniversitesi, Pekin Dostluk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Tüm solüsyonların steril filtrasyona tabi tutulmasını ve kullanılan tüm tüplerin steril olmasını tavsiye ederiz.

1. Reaktiflerin ve tamponun hazırlanması

  1. Sindirim enzimi karışımı: % 0.25'lik bir konsantrasyon elde etmek için kollajenaz IV'ü çözün ve 2 U / mL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için DNaz I'i seyreltin.
  2. Manyetik aktif hücre sıralama (MACS) tamponu: Sığır serum albüminini (BSA) ve Etilendiamintetraasetik asidi (EDTA) 1x PBS'de sırasıyla% 0,5 ve 2 mM konsantrasyonlara ulaşmak için çözün.

2. Fokal iskemik inme modeli

NOT: C57BL / 6 J fareleri (8-10 haftalık), daha önce tarif edildiği gibi bir fokal iskemik inme modeli oluşturmak için kullanıldı14. Fareler alternatif olarak, 10 g vücut ağırlığı başına 0.2 mL'lik bir dozajda% 1.25 avertin çözeltisi kullanılarak anestezi altına alınabilir.

  1. Fareleri% 3 izofluran kullanarak uyuşturun, bir gaz anestezi aparatı ile% 1.5'lik bir dozajı koruyun. Bir ısıtma yastığı kullanarak tüm prosedür boyunca vücut sıcaklığını 37 °C'de tutun.
    NOT: Bu çalışma, işleme başlamadan önce cerrahi düzlemin elde edildiğinin doğrulanmasının önemini vurgulamaktadır. Bu adım, hedeflenen bölgeye optimum erişimi sağlamak ve ameliyat sırasında olası komplikasyonları en aza indirmek için çok önemlidir.
  2. Sağ göz ile sağ kulak arasındaki bölgedeki tüyleri elektrikli bir tıraş bıçağı kullanarak kesin. Diseksiyon mikroskobu altında gözlere bitişik belirlenen alanda dikey bir kesi oluşturun.
  3. Kafatasını ortaya çıkarmak için tüm dokuları nazikçe ayırın ve dikey "Y" şeklinde bir vasküler yapı ile karakterize edilen sağ orta serebral arterin (MCA) distal dalını tanımlayın. Kafatasına nüfuz etmek için elektrikli bir matkap kullanın ve dikkatli bir şekilde çıkarmaya dikkat edin.
  4. Meninksleri mikro forseps ile hassas bir şekilde eksize edin.
  5. Sağ orta serebral arterin (MCA) distal dalını açığa çıkarın ve ardından 10-0 sütür kullanarak sağ MCA'nın distal dalının kalıcı ligasyonunu gerçekleştirin.
  6. Dokuyu orijinal durumuna yeniden konumlandırın ve yüz derisi kesisini doku yapıştırıcısı ile kapatın.
  7. Fareyi sırtüstü yatış yönünde konumlandırın ve boyun bölgesindeki kürkü elektrikli bir tıraş bıçağıyla düzeltin.
  8. Boyun bölgesinde yatay bir kesi oluşturun ve submandibular bezleri nazikçe ayırın.
  9. Karotis kılıfını mikro forseps ile dikkatlice inceleyin, ortak karotis arteri tanımlayın ve vagus sinirinden ayırın.
  10. Ortak karotis arterden 4-0'lık bir dikiş geçirin ve bir düğümle sabitleyin.
  11. Kontralateral ortak karotis arter üzerinde 10. adımı tekrarlayın. Bilateral ortak karotis arterleri (CCA'lar) 7 dakika boyunca geçici olarak kapatın.
  12. Submandibular bez dokusunu orijinal konumuna getirin ve boyun kesisini doku yapıştırıcısı ile kapatın.
    NOT: Sahte operasyon grubuna, distal MCA ve CCA'nın bağlanmamış kalması gibi tekil bir istisna dışında, inme grubununkilerle aynı prosedürler uygulandı.
  13. Solunumu ve vücut ısısı da dahil olmak üzere cerrahi prosedür boyunca ve sonrasında fareyi izleyin. Fareyi tamamen uyanana kadar bir ısıtma pedi üzerinde tutun.

3. Beyin perfüzyonu ve diseksiyonu

  1. 50 mL'lik bir şırınga hazırlayın ve ucuna 26 G'lik bir iğne takın. Şırıngayı tuzlu su çözeltisi ile doldurun.
  2. Farede derin anestezi elde etmek için çift doz% 1.25 avertin uygulayın.
    NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce farenin tamamen uyuşturulduğu tamamen onaylanmalıdır.
  3. Fareyi bir köpük levha üzerine sırtüstü yönde yerleştirin, ön ayaklarını ve arka ayaklarını uzatın ve 26 G iğnelerle yerlerine sabitleyin.
  4. Fare iyice uyuşturulduktan sonra, karın derisini oftalmik forseps ile kavrayın ve karaciğeri ortaya çıkarmak için yanal bir kesi yapın. Kalbi ortaya çıkarmak için kaburgaların her iki tarafını kesmeye devam edin.
  5. 26 G iğneyi sol ventriküle sokun ve kulak kepçesini kesin, ardından kanın dışarı akmasına izin vermek için şırıngaya bastırın.
  6. Kulak kepçesinden akan kan berrak görünene kadar perfüzyon işlemine devam edin.
  7. Düz cerrahi makas kullanarak omuriliğin hemen üzerindeki farenin kafasını kesin.
  8. Kafatasını ortaya çıkarmak için başın derisinde arka-ön bir kesi oluşturun. Yan duvarların ve kafatasının tabanının birleştiği yerde iki yanal kesi yapın.
  9. Sagital sütür boyunca kafatasını kesin ve yörüngeler arasında bir kesi yapın.
  10. Her yarım küreyi kaplayan kafatasını çıkarmak için forseps kullanın, böylece beyni açığa çıkarın ve onu bir fare çeliği beyin matrisine aktarın. Daha sonra, beyni ardışık 2 mm kalınlığında koronal dilimlere ayırın.

4. Kortikal dokunun tek hücreli süspansiyona sindirilmesi ve akış sitometrisi için antikor boyaması

  1. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 μL sindirim enzimi karışımı ekleyin.
  2. Enfarktüs dokusunu hassas bir şekilde ayırın ve mikro forseps kullanarak sindirim enzim karışımına aktarın (Şekil 1).
  3. Dokuyu oftalmik bir makasla mümkün olan en küçük parçalara ayırın ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
  4. Bir P1000 pipeti kullanarak, dokuyu tek tek hücrelere ayırmak için çözeltiyi 10 kez nazikçe aspire edin ve dağıtın, ardından çözeltiyi 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hem 12 oyuklu plakayı hem de hücre süzgecini kalsiyum ve magnezyum içeren buz gibi HBSS ile sürekli durulayın.
  5. 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı dikkatlice atın.
    NOT: Üretilen peletlerin oldukça gevşek olduğu ve kolayca yerinden çıktığı göz önüne alındığında, herhangi bir hücre kaybını önlemek için lütfen bunları rahatsız etmekten kaçının.
  6. Peleti 1 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve 5. adımı tekrarlayın. Daha sonra, peleti 150 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve süspansiyonu yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Daha sonra 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
  7. 96 oyuklu plakayı sıkıca kavrayın ve süpernatanı atmak için hızla ters çevirin.
  8. Hücre canlılığı floresan boyasını 1x PBS'de 1:100 oranında seyreltin, ardından peleti 150 μL'lik bir alikotta yeniden süspanse edin. Işıktan korunarak oda sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe edin.
  9. 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre yüzeyi antikor kokteylini MACS tamponunda seyreltin. Hücreleri yıkamadan, hücre yüzeyi antikor kokteylini ekleyin ve 4 ° C'de 15-20 dakika daha inkübe edin.
  10. 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti 150 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  11. Adım 4.10'u tekrarlayın ve süspansiyonu 1.5 mL santrifüj tüplerine veya 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren test tüplerine aktarın.

5. Akış sitometrisi analizi ve sıralama

  1. Antikorlara konjuge floroforların seçimini optimize etmek ve spektral örtüşmeyi en aza indirmek için manuel teknikler veya çevrimiçi bir tasarım aracı kullanarak cihaz konfigürasyonuna göre çok renkli bir akış sitometrisi paneli tasarlayın.
    NOT: Çok renkli bir akış sitometrisi paneli tasarlarken birkaç önemli husus dikkate alınmalıdır. İlk olarak, başlamadan önce lazerler ve filtreler de dahil olmak üzere kullanılan cihazın konfigürasyonu hakkında bilgi sahibi olmak önemlidir. İkinci olarak, düşük bolluktaki antijenler için antikorlar üzerinde parlak florofor etiketleri kullanırken, yüksek oranda eksprese edilen antijenleri hedefleyen antikorlar üzerinde loş florofor etiketlerini tercih edin. Son olarak, canlı olmayan hücreleri ve kalıntıları verilerden etkili bir şekilde dışlamak için panele bir hücre canlılığı boyası eklemek zorunludur. Özellikle, düşük bollukta veya zayıf karakterize edilmiş antijenlerin uygun şekilde kapılanmasını sağlamak için, floresan eksi bir (FMO) kontrolleri kullanılmalıdır15. FMO kontrolleri, ilgilenilen hücre dışındaki tüm soy belirteçlerini kapsar ve pozitif ve negatif lekeli hücreler arasında kesin tanımlamayı kolaylaştırır16.
  2. İlgilenilen hücrelerin ölçekte uygun şekilde görüntülendiğinden ve gerektiği gibi kapılanabildiğinden emin olmak için ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) dedektörlerinin ayarlarını yapın.
  3. Kalıntıları veya yabancı gürültüyü ortadan kaldırmak için FSC ve SSC'ye titizlikle ince ayar yapın. FSC'nin hem alanını hem de yüksekliğini gösteren bir nokta grafiği içinde çiftleri tek hücrelerden ayırt edin. Hücre canlılığı, floresan boya negatif sinyaline dayalı olarak canlı hücreleri izole edin.
    NOT: Çeşitli enstrümanların ayarları küçük farklılıklar gösterebilir. Örneğin, bazı hücre sıralayıcılar, çiftleri tek hücrelerden ayırt etmek için FSC'nin genişliğini ve yüksekliğini kullanırken, diğerleri aynı amaç için FSC'nin alanını ve yüksekliğini kullanır.
  4. Her kanal için telafiyi ayarlayın.
    NOT: Floresan yayılma telafisi amacıyla hem hücresel numuneler hem de ticari olarak temin edilebilen kompanzasyon boncukları kullanılabilir.
    1. Lekeli hücrelerin her parametre için uygun şekilde ölçeklendiğinden emin olmak için otomatik floresan kontrolünü (boyanmamış hücreler) lekeli hücre pozitif kontrolleriyle karşılaştırın. Ek olarak, çok renkli hücre örneklerini analiz ederek, 2 renkli nokta çizimlerini izleyerek ve hücre popülasyonlarının birbiriyle dikey veya yatay olarak hizalandığından emin olmak için telafi ayarlarını yukarı veya aşağı doğru ayarlayarak telafiyede ince ayar yapın.
    2. Lenfositler (CD11b-CD45yüksek), mikroglia (CD11b + CD45 int), miyeloid hücreler (CD11b + CD45yüksek) ve astrositler (CD11b-CD45- GLAST +) arasında ayrım yapmak için CD45 ve CD11b sinyallerini kullanın17,18.
    3. Sahte beyin dokusunu otomatik floresan kontrolü ve lenfositleri ayırt etmek için bir referans olarak kullanın. Belirli bir hedef inceleniyorsa, inme sonrası beyin dokusu ile bir FMO kontrolü kullanın.
  5. Denetim ve örnek verilerini toplamaya başlayın ve kaydedildiğinden emin olun.
    NOT: Burada açıklanan mini inme modelinin küçük bir enfarktüs ile sonuçlandığı göz önüne alındığında, tipik olarak orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modelinden daha az hücre toplanır. Genel olarak, 5 × 105 hücre toplamak, sırasıyla yaklaşık 5 × 103 mikroglia ve 1 × 105 astrosit verir.
  6. İstenen hücre popülasyonlarını seçin ve 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren test tüplerine veya 15 mL konik santrifüj tüplerine sıralayın.
    NOT: 500 μL PBS ekleyin ve hücrelerin canlılığını sağlamak ve hücre peletinin oluşumuna yardımcı olmak için tüpü titizlikle durulayın.

6. Seçilmiş hücre popülasyonlarında gen ekspresyonunun analizi

NOT: Toplam RNA ekstraksiyonu, alternatif olarak, üreticinin yönergelerine uygun olarak ticari kitler kullanılarak gerçekleştirilebilir.

  1. Hücreleri 5.6. adımdan itibaren 500 × g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın. Hücreleri 1 mL TRIzol reaktifi içinde yeniden süspanse edin.
    NOT: Sıralanan hücrelerin sayısı, kültürlenmiş hücrelere veya dokuya kıyasla önemli ölçüde daha düşüktür. Sonuç olarak, daha yüksek bir santrifüjleme hızı, daha kompakt bir hücre peleti oluşturmaya yardımcı olabilir. Bu adımdan elde edilen hücreler, hücre kültürü veya tek hücreli RNA dizileme boru hatları gibi sonraki uygulamalar için kullanılabilir.
  2. Nükleoprotein komplekslerinin ayrışmasını kolaylaştırmak için numunenin 5 dakika RT'de kalmasına izin verin.
  3. Numuneye 0.2 mL kloroform ekleyin ve tüpü sabitleyin. Tüpleri 15 saniye kuvvetlice çalkalayın, ardından RT'de 2 dakika inkübe edin.
  4. Numuneleri 10.000 g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. RNA sadece üst sulu fazda kalacaktır.
  5. Arayüzü bozmamaya dikkat ederek üst sulu fazı dikkatli bir şekilde temiz bir tüpe aktarın.
    NOT: Sulu fazın hacmi yaklaşık 500 μL olmalıdır.
  6. 0.5 mL izopropanol ekleyerek ve tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırarak RNA'yı sulu fazdan çökeltin. Numuneleri RT'de 10 dakika inkübe edin.
  7. RNA'yı toplamak için numuneleri 10.000 g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı boşaltın ve kalan sıvıyı aspirasyon ile iyice çıkarın.
  9. RNA peletini bir kez %75 etanol ile yıkayın ve en az 1 mL %75 etanol ekleyin. Numuneyi iyice karıştırın, ardından 7500 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  10. Tüm etanol izlerini ortadan kaldırın. RNA peletini 5 dakika havayla kurutun.
  11. RNA'yı 10 μL RNaz içermeyen suda yukarı ve aşağı pipetleyerek çözün.
  12. Üreticinin talimatlarına göre gerçek zamanlı PCR yapmaya devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, iskemik inme sonrası immün hücrelerin işlevselliğini değerlendirmek için mini inme modelinde akış sitometrik analiz kullanan rafine bir protokol sunuyoruz. Mini inme, sağ orta serebral arterin (MCA) distal dalının kalıcı ligasyonu ile indüklendi ve ardından bilateral ortak karotis arterlerin (CCA'lar) 7 dakikalık bir oklüzyonu izledi. Bu metodoloji, küçük, tutarlı lezyon hacimleri ve oldukça düşük mortalite oranı ile karakterize hafif bir inme sağlar. Ayrıca, modelin uzun vadeli nöroimmün etkileşimleri araş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, iskemik inme sonrası immün hücrelerin fonksiyonunu değerlendirmek için mini inme modelinde akış sitometrik analizi kullanarak ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokolün kritik adımları, bilateral ortak karotid arterlerin (CCA'lar) yedi dakikalık bir oklüzyonunun yanı sıra sağ orta serebral arterin (MCA) distal dalının kalıcı ligasyonu yoluyla fokal iskemik inme oluşturulmasını içerir. Bu cerrahi yaklaşım, tutarlı lezyon hacimleri ve düşük mortalite oranları ile karakte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82201622) ve İç Moğolistan Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2020MS03017) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL Mikrosantrifüj TüpüYUVA 615601Laboratuvar malzemesi
1&kez; PBSCorning21-040-CMReaktif
96-kuyucuklu Şeffaf Yuvarlak Tabanlı TC-işlenmiş MikroplakaCorning3799Laboratuvar malzemesi
APC fare önleyici CD19Biyolojik Efsane152410Antikor
APC/Cyanine7 fare önleyici CD45Biyolojik Efsane103116Antikor
Avertin (%1,25)Nanjing Aibei Biyoteknoloji M2920 SerisiReaktif
BD FACSAria IIBD642510Ekipman
Brilliant Violet 421 anti-fare CD4Biyolojik Efsane100437Antikor
Brilliant Violet 605 anti-fare / insan CD11bBiyolojik Efsane101237Antikor
BSASigma-AldrichA1933-1GKimyasal
Kollajenaz IVSigma-AldrichC4-28-100MGEnzim
DNase INew England BiyolaboratuvarlarıM0303L SerisiEnzim
EDTASigma-AldrichEDS-100GKimyasal
Falcon 5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test TüpleriCorning352052Laboratuvar malzemesi
Şahin  15 mL Konik Santrifüj TüpleriCorning352095Laboratuvar malzemesi
FlowJo V10BDYazılım
GLAST (ACSA-1) Antikoru, PEMiltenyi Biotec130-118-344Antikor
İzofluranRWD Yaşam BilimleriR510-22-10Reaktif
PE/Cyanine7 fare önleyici CD3Biyolojik Efsane100220Antikor
PE/Dazzle 594 anti-fare NK-1.1Biyolojik Efsane156518Antikor
TRIzol ReaktifiThermo Fisher Bilimsel A.Ş.15596026Reaktif
UltraPure DNase/RNase İçermeyen Damıtılmış SuThermo Fisher Bilimsel A.Ş.10977015Reaktif
Vetbond Doku Yapıştırıcıları3 milyon1469SBLaboratuvar malzemesi
Zombie Aqua Düzeltilebilir Canlılık KitiBiyolojik Efsane423102Amin reaktif floresan boya

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleindorfer, D. O., et al. 2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  2. Pu, L., et al. Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030. Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).
  3. Cheng, Y., et al. Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021. J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).
  4. Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown. Front Immunol. 12, 784098(2021).
  5. Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke. J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).
  6. Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases. Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).
  7. Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke. Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).
  8. Garcia-Bonilla, L., et al. Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke. Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).
  9. Stevens, S. L., et al. The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22 (1), 72-85 (1998).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  12. De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  13. Mcdonough, A., Weinstein, J. R. Neuroimmune response in ischemic preconditioning. Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).
  14. Wang, S., et al. Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke. Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).
  15. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).
  16. Siddiqui, S., Livak, F. Principles of advanced flow cytometry: A practical guide. Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).
  17. Sousa, C., et al. Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures. EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).
  18. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. 124, e55781(2017).
  19. Zhang, W., et al. Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke. Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).
  20. Mao, J. H., et al. Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions. Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).
  21. Shui, X., et al. Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges. J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).
  22. Feng, Y., et al. Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models. J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).
  23. Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression. Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).
  24. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  25. Leelatian, N., et al. Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).
  26. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).
  27. Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research. Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).
  28. Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration. Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).
  29. Rui, W., et al. Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).
  30. Rauber, S., et al. Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies. J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).
  31. Rayaprolu, S., et al. Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

skemik nmeAk SitometrisiMini nme Modelimm n H cre AktivasyonuBeyin Dokusu DissosiasyonuTek H cre S spansiyonumm n H cre KantifikasyonuN roinflamasyonMurin nme Modeli

İlgili makaleler