Yöntem makalesi

Memeli Hücrelerinde Godanti Bhasma Tarafından Tetiklenen Fagositozun Sıralı Hücresel Olaylarının Araştırılması

DOI:

10.3791/68321

⸱

11 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, memeli hücrelerinde Godanti Bhasma (GB) parçacıklarının fagositik işlenmesini, hücresel alımlarını, vakuol dinamiklerini, asitleşmelerini ve bozunmalarını karakterize ederek aydınlatmaktadır. Bu bulgular sadece temel fagositoz mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı ilerletmekle kalmaz, aynı zamanda GB'yi yeni terapötik stratejiler geliştirmek için umut verici bir model sistem olarak kurar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagositoz, hücrelerin yabancı parçacıkları, patojenleri veya kalıntıları yuttuğu ve parçaladığı, bağışıklık savunmasında ve doku homeostazının sürdürülmesinde önemli bir rol oynayan hayati bir hücresel mekanizmadır. Bu süreçteki aksaklıklar çeşitli hastalıklarla ilişkilidir. Fagositoz yolunda yer alan karmaşık olayları keşfetmek için gelişmiş akıllı parçacıklar ve etkili izleme teknikleri gereklidir. Biyoaktif kalsiyum sülfat parçacıklarından oluşan geleneksel bir Hint tıbbı olan Godanti Bhasma (GB), memeli hücrelerinde fagositoz ile hızla içselleştirilir ve önemli sitoplazmik vakuolasyona neden olur. GB ile indüklenen fagositozun anahtar aşamaları burada akış sitometrisi (FC), canlı hücre görüntüleme ve spesifik boyama teknikleri kullanılarak değerlendirildi. Akış sitometrik analizi, partikül içselleştirmesi ile ilişkili fagositik kap benzeri yapıların oluşumunu göstermiştir. Canlı hücre görüntüleme, parçacık alımı, vakuol oluşumu, yutulan malzemelerin bozunması ve vakuolar devir dahil olmak üzere fagositik süreçlerin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini sağladı. Vakuolar asitlenmeyi değerlendirmek için nötr kırmızı ve akridin turuncu ile boyama yapıldı. İlginç bir şekilde, GB ile tedavi edilen hücrelerde lizozomal inhibitör BFA1 ile tedavi, nötr kırmızı alımının olmamasıyla kanıtlandığı gibi, vakuolasyonun meydana gelmesi için asidik bir ortamın gerekliliğini vurgulayan vakuolasyona yol açmamıştır. Bu bulgular, konak-patojen etkileşimlerini, hücre içi trafiği anlamak ve fagositozla ilgili bozukluklar için yenilikçi terapötik stratejiler geliştirmek için kritik olan bu süreçte yer alan sıralı hücresel olayları aydınlatmak için bir model olarak GB kaynaklı fagositozun potansiyelinin altını çizmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagositoz, makrofajlar ve dendritik hücreler gibi dokuda yerleşik profesyonel fagositlerin yanı sıra yabancı partikülleri yutan ve bozan epitel hücreleri ve fibroblastlar gibi profesyonel olmayan fagositler tarafından gerçekleştirilen önemli bir hücresel süreçtir. Bu hücreler, yabancı partikülleri, patojenleri veya hücresel kalıntıları içselleştirir ve ortadan kaldırır, bu da bağışıklık savunmasına ve doku homeostazına önemli ölçüde katkıda bulunur1. Bu süreç, patojenle ilişkili moleküler modellere (PAMP'ler) bağlanan Toll benzeri reseptörler (TLR'ler) gibi örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) aracılığıyla patojenlerin, kalıntıların veya partiküllerin tanınmasıyla başlar2. Bu tanıma, plazma zarı çıkıntılarının hedef parçacık3 etrafında uzandığı bir fagositik kap oluşumunu tetikler. Aktin filamentleri bu adımda çok önemli bir rol oynar ve parçacık yutulması için gerekli olan zarın yeniden şekillenmesini sağlar4. Parçacık bir fagozom içine alındığında, zara bağlı bir vezikül oluşur. Fagozom, erken, daha sonra geç endozomlarla füzyon ve ardından hidrolitik enzimler5 içeren lizozomların dahil edilmesi ile karakterize edilen olgunlaşmaya uğrar. Katepsinler, lizozim ve nükleazlar gibi bu enzimler, vakuolar ATPaz (V-ATPaz) ile elde edilen fagozom içindeki asitleştirme ile aktive edilir ve pH'ı 4.5-5.5'e düşürür. Bozunma işlemi, hücreden kalan kalıntıların ekzositozu ile sona erer. Bu dinamik ve karmaşık süreçteki işlev bozuklukları önemli bağışıklık sorunlarına neden olabilir 6,7,8.

Fagositozun karmaşık hücresel sürecini doğru bir şekilde değerlendirmek için, fagositozun ana hücresel olaylarını izlemek için gelişmiş ve kolay yöntemlere ihtiyaç vardır. Geleneksel olarak, fagositoz nicelemesi için izleme yöntemi, mikroskobik görselleştirme için önceden belirlenmiş zaman aralıklarında fagositlerin sabitlenmesi, görüntüleme veya akış sitometrisi yoluyla boya etiketli hedeflerin içselleştirilmesinin ölçülmesi veya belirli bir fagositoz süresinden sonra kalan hedef hücrelerin sayısının sayılması gibi teknikleri içerir, Bununla birlikte, bu yöntemler fagositoz işlemi sırasında meydana gelen dakikadan dakikaya dalgalanmaları yakalamaz9. Ayrıca, boya alımı gibi dolaylı göstergelere dayanan yöntemler, potansiyel pasif boya transferi nedeniyle gerçek fagositik olayları doğru bir şekilde yansıtmayabilir10.

Canlı hücre görüntüleme, akış sitometrisi ve boyama tekniklerindeki son gelişmeler, fagositozu yüksek uzay-zamansal hassasiyetle izleme yeteneğimizde devrim yaratmıştır. Örneğin, canlı hücre görüntüleme, sıralı olay takibi ile dinamik süreçlerin sürekli gözlemlenmesini sağlar11. Akış sitometrisi, klinik araştırmalarda memeli hücrelerini analiz etmek ve biyobelirteçleri tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır12. Bununla birlikte, geleneksel FC yöntemleri, tek tek hücrelerin morfolojik ve mekansal özelliklerini değerlendirmek için donatılmamıştır12. Görüntüleme Akış Sitometrisi (IFC), tek hücrelerden ayrıntılı bilgi toplanmasını sağlayan sağlam bir alternatif olarak hizmet eder. IFC, akış sitometrisinin analitik yeteneklerini yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birleştirerek morfolojik ve uzamsal ayrıntılarla tek hücreli analize olanak tanır. Floresan lateks boncuklar, zimozan-APC ve sentetik nanopartiküller dahil olmak üzere çeşitli partiküller, fagositozu incelemek için yaygın olarak kullanılır ve reseptör katılımı, fagozom oluşumu ve bağışıklık tepkileri hakkında bilgi sağlar12.

Tipik olarak son nokta analizine dayanan geleneksel biyokimyasal tekniklerin aksine, canlı hücre görüntüleme, hücresel süreçlerin sürekli ve dinamik olarak izlenmesini sağlar. Bu yöntem, yüksek uzay-zamansal çözünürlük ve fagositozda sıralı olayları gözlemleme yeteneği sunar. Sonuç olarak, karmaşık fagositoz sürecini incelemek için güçlü bir araçtır ve hücresel davranışlar ve mekanizmalar hakkında daha doğru ve ayrıntılı bilgiler sağlar13.

Görüntüleme sistemlerindeki gelişmelere ek olarak, fagositik olayları, özellikle de fagozom içinde meydana gelen bozunma aşamalarını belirgin bir şekilde vurgulayabilen akıllı fagositik parçacıklara ihtiyaç vardır. Fagositoz çalışmaları genellikle reseptör katılımı, fagozom oluşumu ve bağışıklık tepkileri gibi mekanizmaları keşfetmek için lateks boncuklar, zimozan, bakteriler, apoptotik hücreler ve sentetik nanopartiküller gibi partikülleri kullanır. Bu parçacıklar değerli bilgiler sağlarken, tam bozunma sürecini izlemede veya fagozom olgunlaşmasını doğrudan değerlendirmede sınırlamaları vardır. Örneğin, lateks boncuklar biyolojik olarak parçalanamaz ve bozunma gösteremezken, zymosan ve bakteriler genellikle karmaşık etiketleme gerektirir ve tutarlı bozunma profilleri vermeyebilir 14,15.

Önceki çalışmamız, esas olarak kalsiyum sülfattan oluşan geleneksel bir Ayurveda formülasyonu olan GB'nin, fagozom olgunlaşması ve bozunmasını incelemek için ideal bir parçacık olarak faydasını göstermiştir16. GB, fagozomun asidik ortamında zamanla çözünür ve parçacık bozulmasının net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Ayrıca, GB'nin sağlam vakuol oluşumunu indükleme yeteneği, erken oluşumdan asitleşmeye ve nihai çözünürlüğe kadar fagozom olgunlaşmasının farklı aşamalarının araştırılmasını kolaylaştırır. Diğer parçacıklardan farklı olarak GB, fagozomların tüm yaşam döngüsünü incelemek için kendi kendini idame ettiren bir sistem sağlayarak harici etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırır ve onu fagositoz ve ilişkili bozuklukların dinamiklerini anlamak için ideal bir model haline getirir16.

Bu çalışma, hem profesyonel (RAW 264.7) hem de profesyonel olmayan (HeLa ve 3T3-L1) fagositik hücre hatlarında Godanti Bhasma (GB) kullanılarak partikül kaynaklı fagositoz ve vakuol oluşumunu değerlendirmek için tasarlanmış standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu yöntemin genel amacı, farklı hücre tiplerinde hücresel alım mekanizmalarını, vakuolar biyogenezi ve hücre içi parçacık işlemeyi incelemek için sağlam bir platform sağlamaktır. GB, DMEM'de 10 mg / mL'lik bir konsantrasyonda süspanse edildi ve homojenliği sağlamak için, üst fraksiyon deneysel kullanım için toplanırken daha büyük partiküllerin çökelmesine izin verildi. Akış sitometrisi tahlilleri için, hücreler 12 oyuklu plakalarda oyuk başına 2 x 105 hücre yoğunluğunda ekildi ve her oyuğa 300 μL GB çalışma süspansiyonu eklendi. Görüntülemeye dayalı analizler için, 5,000-10,000 hücre, 96 oyuklu plakalarda veya oda slaytlarında kuyu başına tohumlandı. Bu yöntem, GB'yi çeşitli hücresel tiplerde vakuol oluşumunu ve parçacık içselleştirmesini araştırmak için güvenilir bir model olarak kurar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü ve tohumlama

  1. % 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS ve antibiyotikler (100 μg / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin) ile desteklenmiş tam DMEM ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce tüm reaktifleri ve ekipmanı sterilize edin.
  2. 3T3-L1, HeLa ve RAW 264.7 hücrelerini 25 cm'lik2 şişelerde ve 35 mm'lik kültür kaplarında DMEM kullanarak kültürleyin. Kültürleri 37 ° C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun ve ortamı her 48 saatte bir değiştirin.
  3. Alt kültürleme için, hücreleri 2x PBS ile yıkayın, daha sonra 500 μL Tripsin-EDTA kullanarak yapışkan hücreleri ayırın ve 5 dakika inkübe edin. Tripsin-EDTA çözeltisini nötralize etmek için 1 mL DMEM ekleyin, tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için pipetleyin ve taze DMEM ile hacmi 10 mL'ye ayarlayın. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, peleti 1 mL taze ortamda tekrar süspanse edin.
  4. 10 μL hücre süspansiyonunu %0.4 tripan mavisi (1:1) ile karıştırın, bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın, yoğunluğu Hücreler/mL = Ort. sayısı x 104 x 2 olarak hesaplayın.
  5. 96 oyuklu plakalar için: Her oyuklu içine 100 μL hücre süspansiyonu (10.000 hücre içeren) dağıtın. Boşluk kaymaları için, 50 μL hücre süspansiyonunu (5000 hücre içeren) iki boşluğa tohumlayın ve orta boşluğu boş bırakın. Tohumlanmış boşlukların her birine 50 μL DMEM ekleyin.
  6. Hücre yapışmasını ve stabilizasyonunu sağlamak için plakaları ve slaytları 37 ° C'de% 5 CO2 içinde 24 saat inkübe edin. Deneylere devam etmeden önce morfolojiyi, birleşmeyi ve kontaminasyonu değerlendirmek için hücreleri 20x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop altında inceleyin.

2. Hücre kültürü için GB stok çözeltisi/kokteylinin hazırlanması

  1. GB temin edin ve tam olarak 100 mg toz tartın. Tozu% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 10 mL DMEM içinde askıya alın.
  2. Süspansiyonu girdaplayın ve daha büyük parçacıkların yerleşmesine izin vermek için 1 dakika bekletin. Ardından, süspansiyonun üst 5 mL'sini steril bir santrifüj tüpüne aktarın.
  3. Bu 5 mL hazırlanmış GB süspansiyonunu, sonraki hücre kültürü deneyleri için stok çözelti olarak belirleyin. Hücrelere eklemeden önce parçacıkların eşit şekilde dağılmasını sağlamak için süspansiyonu iyice sarın.

3. Akış sitometrisi analizi

  1. RAW 264.7, HeLa veya 3T3-L1 hücrelerini tripsinizasyon ile hasat edin, tam DMEM ile nötralize edin, 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, 1 mL taze ortamda yeniden süspanse edin, 10 μL'yi %0.4 tripan mavisi (1: 1) ile karıştırın, bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın, yoğunluğu hesaplayın ve 2 x 105 hücre / mL'ye ayarlayın.
  2. 12 oyuklu bir plakada oyuk başına 2 x 105 hücre tohumlayın ve 24 saat boyunca kültürleyin. 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
  3. Hücreleri çeşitli sürelerde GB süspansiyonu (kuyu başına 300 μL) ile tedavi edin: 30 dakika, 1 saat ve 12 saat. İşlemden sonra, fazla partikülleri uzaklaştırmak için hücreleri 5x PBS ile yıkayın.
  4. Hücreleri adım 1.3'teki gibi tripsinize edin ve PBS ile iyice yıkayın. Hazırlanan süspansiyonu akış sitometresinin numune portuna yükleyin. Yazılımı başlatın ve uygun edinme ayarlarını seçin. Görüntüleme için Parlak Alan Modu'nu seçin.
  5. Yazılımda Çalıştır'a tıklayarak veri alımını başlatın. Sistem, akış hücresinden geçen tek tek hücrelerin görüntülerini yakalarken en az 10.000 olay için veri elde edin.
  6. Tek bir bozulmamış hücreleri geçit etmek için alan ve en boy oranı dağılım grafiklerini kullanın. Bu, çiftlerin ve kümelerin dışlanmasına yardımcı olur. Görüntü kitaplığında ilgili görüntüleri görüntüleyin. Tedavinin neden olduğu morfolojik değişiklikleri incelemek için yazılım görüntü kitaplığından tek tek hücre görüntülerini toplayın.
  7. Partikül analizi için, 12 oyuklu plakalarda oyuk başına 2 x 105 hücre tohumlayın ve 24 saat boyunca kültürleyin. Hücreleri farklı sürelerde GB süspansiyonu (kuyu başına 300 μL) ile tedavi edin: 1 saat, 7 saat, 14 saat ve 24 saat.
  8. Tedaviden sonra, kültür plakasını 1 dakika boyunca hafifçe çalkalayın ve kültür ortamını 1.5 mL'lik tüplere toplayın. Hücre dışı parçacıkları gidermek için hücreleri PBS ile 5x yıkayın.
  9. Hücreleri tamamen parçalamak için 500 μL RIPA tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl;% 0.1 Triton X-100;% 1 sodyum deoksikolat) ekleyin.
  10. Kültür ortamını ve parçacıklar içeren parçalanmış hücre örneklerini akış sitometresinden ayrı ayrı geçirin. Numuneleri sistemin numune portuna yükleyin. Yazılımı başlatın ve uygun edinme ayarlarını seçin. Parçacık analizi için Parlak Alan Modu'nu seçin.
  11. Yazılımda Çalıştır'a tıklayarak veri alımını başlatın. Sistem, akış hücresinden geçen tek tek parçacıkların görüntülerini yakalarken en az 20.000 olay için veri elde edin.
  12. Tüm parçacıkları geçit etmek için alan ve en boy oranı dağılım grafiklerini kullanın. Parçacık sayımını analiz etmek için dağılım grafiği araçlarını kullanın.

4. Hızlandırılmış mikroskopi

  1. 3T3-L1 hücrelerini (3.0 x 10,4) 35 mm'lik bir tabakta, 37 ° C'de 2 mL DMEM ile% 5 CO2'de % 70 birleşmeye ulaşana kadar kültürleyin.
  2. 300 μL GB süspansiyonunu önceden ısıtılmış taze 2 mL kültür ortamına iyice karıştırın ve ardından kültür kabını hücreler ve GB ile birlikte görüntüleme mikroskobu aşamasına yerleştirin.
  3. 10x Reklam Verme Amacını seçin. Parlak düğmesini kullanarak parlak alan aydınlatmasını açın. Tıkla Film Hızlandırılmış moda girmek için düğmesine basın. Aralık süresini 5 dakikaya ayarlayın. Rec düğmesine tıklayarak kayda başlayın.
  4. 16 saat ila 24 saat boyunca her 5 dakikalık aralıklarla görüntü yakalayın ve bir CO2 inkübatöründe standart koşullar altında sürekli görüntüleme sağlayın.
  5. Yakalanan görüntüleri hızlandırılmış bir videoda derlemek için ImageJ yazılımını kullanın. Bu teknik, içselleştirmeden parçacıkların tamamen bozulmasına kadar fagositozun çeşitli aşamalarının farklılaşmasına izin verir.

5. Nötr kırmızı boyama

  1. 96 oyuklu plakalarda ve boşluk slaytlarında 24 saatlik hücre büyümesinden sonra, GB partikül süspansiyon stoğunu iyice karıştırın ve her bir oyuklu veya boşluğa 30 μL süspansiyon ekleyin.
  2. Vakuol oluşumunu indüklemek için 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Negatif kontroller olarak tedavi edilmemiş kuyuları veya boşlukları kullanın.
  3. Nötr Kırmızı (NR) boyama için, serumsuz DMEM'de 0,5 mg / mL NR çözeltisi hazırlayın ve 0,2 μm'lik bir filtreden süzün.
  4. 96 oyuklu plakalarda ve kavite slaytında vakuollerin görüntülenmesi için: ortamı çıkarın, 60 μL NR boyası ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Fazla boyayı çıkarmak için 3x'i PBS ile yıkayın ve ardından mikroskobik görüntülemeye devam edin.
  5. Vakuollerin boyutunu, morfolojisini ve sayısını değerlendirmek için 20x objektifi kullanarak vakuolleri mikroskop altında inceleyin.

6. Vakuol oluşumu ve asitleşme inhibisyonu için Bafilomisin A1 ile tedavi

  1. 100 μg BFA'yı 50 μL DMSO'da çözerek ve ardından 950 μL DMEM'de seyrelterek 100 μg / mL (160.5 nM) konsantrasyonda bir Bafilomisin A1 (BFA1) stok çözeltisi hazırlayın. 0.1 nM'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için bu stokun 1 μL'sini 1.6 mL DMEM içinde seyreltin.
  2. İyice karıştırın ve 96 oyuklu plakalardaki hücreleri içeren kuyucuklara 100 μL çalışan BFA çözeltisi ekleyin. Ayrıca, vakuol ve fagozom oluşumunun inhibisyonunu değerlendirmek için 30 μL GB partikül süspansiyonu ekleyin.
  3. Fagozom asitlenmesini inhibe etmek için, önceden oluşturulmuş vakuollere (daha önce GB parçacıkları ile muamele edilmiş) kuyucuklara 100 μL çalışan BFA çözeltisi ekleyin. Tüm kuyucukları 37 ° C'de% 5 CO2 ile 24 saat inkübe edin.
  4. Her oyuğa 60 μL Nötr Kırmızı (NR) boya ekleyin, 15 dakika daha inkübe edin ve vakuol oluşumunu ve asitleşmesini analiz edin.

7. Akridin portakal (AO) boyama

  1. Boşluk slaytlarında kültürlenen hücreleri 50 μL GB ile tedavi edin ve standart deney koşulları altında gece boyunca inkübe edin.
  2. Tedaviden sonra, vakuollerin ve asidik veziküler organellerin seçici boyanmasını sağlamak için hücreleri akridin portakal çözeltisi (1 mg / mL) ile 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  3. Bağlanmamış boyayı çıkarmak ve arka plan floresansını en aza indirmek için hücreleri 3 kez steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın.
  4. Hücresel morfolojiyi ve akridin portakal alımını değerlendirmek için 20x objektif ve 450-492 nm'lik mavi uyarma filtresi aralığı ile donatılmış bir floresan mikroskobu ile slaytları hızlı bir şekilde analiz edin, bu da vakuolar dinamikler hakkında bilgi sağlayacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, memeli hücrelerinde GB parçacıklarına karşı temel hücresel tepkileri vurgulamaktadır. 3T3-L1 hücrelerinde GB partiküllerinin içselleştirilmesini araştırmak için bir görüntüleme akış sitometresi kullandık (Şekil 1). Hücreler, 30 dakika ila 12 saat arasında değişen süreler boyunca partiküllere maruz bırakıldı. 30 dakika sonra, hücre yüzeyindeki parçacıkları gözlemledik (Şekil 1B) ve hücre zarı, bağlanma yerlerinde içe doğru katlanmaya başladı, bu da içsel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagositoz, partiküllerin, patojenlerin ve apoptotik hücrelerin yutulmasını ve ardından ortadan kaldırılmasını sağlayan çok önemli bir bağışıklık savunma mekanizması olarak hizmet eder. Fagozom oluşumu ve olgunlaşma süreçlerini anlamak için, gelişmiş görüntüleme teknikleriyle birleştirilmiş akıllı biyouyumlu parçacıklar, yutulan malzemelerin vakuolar ilerlemesi, asitlenmesi ve bozunması gibi dinamik olayları incelemek için gereklidir18,19

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Hindistan Hükümeti Bilim ve Teknoloji Departmanı Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (SERB) Çekirdek Araştırma Hibesi (CRG/2022/009045) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
25 cm2 Kültür MataralarıNEST, Hindistan707001
96 ve 6 oyuklu plakalarTarsons Hindistan Pvt. Ltd., Kalküta, Hindistan; Thermo Scientific, Hindistan980040; 140675
Akridin turuncuSRL, Hindistan82407
Antibiyotikler ve Tripsin-EDTA çözeltisiYüksek Medya, Hindistan628242; 655111
Hücre Hatları - HeLa, 3T3-L1 ve RAW-264.7Ulusal Hücre Bilimi Merkezi (NCCS), Pune, Maharastra
kültür kapları (35mm) SPL Yaşam Bilimleri, Hindistan101350
Dulbecco' s modifiye Eagle ortamı (DMEM)MP Biomedicles, Hindistan1033126
Fetal sığır serumu (FBS)Yüksek Medya, Hindistan651257
Akış sitometresiMillipore, Amerika Birleşik DevletleriAmnisAmnis Görüntüleme Akış Sitometreleri,
Floresan MikroskopDiGi Lab, HindistanModeli: DiGi 110 Infinity
Godanti BhasmaPatanjali Ayurved240002
Nötr Kırmızı boyaCDH, Hindistan593630
Hızlandırılmış mikroskopNanoEnTek Inc.  Seul, Kore.JuliJuLi akıllı floresan hücre analizörü,
Hızlandırılmış mikroskopLEEDZ MIKRO IMA. Birleşik KrallıkS.No. LIM225552358A58EA PRIME Ters mikroskop

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. B. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8 (2), 131-141 (2008).
  2. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12 (7), 492-502 (2012).
  3. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  4. Flannagan, R. S., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol Mech Dis. 7, 61-98 (2012).
  5. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: Going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (10), 781-795 (2008).
  6. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  7. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  8. Méresse, S., Gorvel, J. P., Chavrier, P. The rab7 GTPase resides on a vesicular compartment connected to lysosomes. J Cell Sci. 112 (21), 3195-3204 (1999).
  9. Caponegro, M. D., Thompson, K. K., Tayyab, M., Tsirka, S. E. A Rigorous Quantitative Approach to Analyzing Phagocytosis Assays. Bio Protoc. 10 (15), e3698(2020).
  10. de Neergaard, T., Sundwall, M., Wrighton, S., Nordenfelt, P. High-Sensitivity Assessment of Phagocytosis by Persistent Association-Based Normalization. J Immunol. 206 (1), 214-224 (2021).
  11. Chu, C. C., et al. High-resolution quantification of discrete phagocytic events by live cell time-lapse high-content microscopy imaging. J Cell Sci. 133 (5), jcs237883(2020).
  12. Park, Y., et al. Imaging Flow Cytometry Protocols for Examining Phagocytosis of Microplastics and Bioparticles by Immune Cells of Aquatic Animals. Front Immunol. 11, 203(2020).
  13. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochem Pharmacol. 116, 107-119 (2016).
  14. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  15. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annu Rev Immunol. 31, 443-473 (2013).
  16. Das, S. K., et al. Godanti bhasma (anhydrous CaSO4) induces massive cytoplasmic vacuolation in mammalian cells: A model for phagocytosis assay. Methods. 230, 158-168 (2024).
  17. Huss, M., et al. Proton translocation by V-ATPase: molecular mechanism and target for inhibition by Bafilomycin A1. J Bioenerg Biomembr. 34, 243-250 (2002).
  18. Méndez-Alejandre, A., Raymond, B. B. A., Trost, M., Marín-Rubio, J. L. Bi-functional particles for real-time phagosome acidification and proteolysis multiplex assay in macrophages. Front Immunol. 14, 1204223(2023).
  19. Lancaster, C. E., et al. Phagosome resolution regenerates lysosomes and maintains the degradative capacity in phagocytes. J Cell Biol. 220 (9), e202005072(2021).
  20. Krendel, M., Gauthier, N. C. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 77, 102112(2022).
  21. Barger, S. R., et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 10 (1), 1249(2019).
  22. Ghosh, M., et al. Quantitative determination of phagocytosis using pH-sensitive fluorescent bioparticles. J Vis Exp. (125), e56093(2017).
  23. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. J Vis Exp. (120), e54646(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fagositoz YoluPartik l selle mesiVakuol Olu umuAk SitometrisiCanl H cre G r nt lemeN tral K rm z BoyamaAkridin Oranj BoyamaFagozom Olgunla mas

İlgili makaleler