Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir retinitis pigmentosa murin modelinde fotoreseptör dejenerasyonu ve korunmasının analizi

621 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68324

⸱

22 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Science and Biotechnology Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 2Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Neuroscience Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 3Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HEMORIO)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, retinitis pigmentosa'nın bir murin modelinde fotoreseptör dejenerasyonu ve korunmasını analiz etmek için intravitreal ilaç uygulaması, kriyostat kesiti ve immünofloresan dahil olmak üzere optimize edilmiş teknikleri ana hatlarıyla belirtir. Yöntem retina bütünlüğünü sağlar ve terapötik müdahalelerin etkinliği hakkında nicel veriler sağlar.

Özet

Retinopatiler dünya çapında yüz milyonlarca insanı etkiler ve görme bozukluğu ve körlüğün önemli nedenleridir. Bu hastalıklar arasında retinitis pigmentosa (RP), dünya çapında yaklaşık 1,5 ila 2 milyon insanı etkileyen, ilerleyici retina dejenerasyonu ile karakterize kalıtsal bir oküler hastalıktır. Kalıtsal retinal distrofilerin hayvan modellerinde yapılan kavram kanıtlama çalışmaları, hastalığın patofizyolojik mekanizmaları, tedavi etkinliği ve güvenliği ile ilgili çalışmalar için önemli bir kanıt temeli oluşturmaktadır. Farelerde intravitreal enjeksiyon ve kriyostat kesiti, maddelerin vitreus mizahına hassas bir şekilde verilmesini ve retina değişikliklerinin ayrıntılı analizi için yüksek kaliteli histolojik örneklerin hazırlanmasını sağladığından, RP modellerinde ilaç etkilerini araştırmak için yaygın olarak kullanılan tekniklerdir. Ayrıca, retinal fotoreseptörlerde eksprese edilen kalsiyuma bağımlı bir protein olan recoverin'e karşı antikorlar kullanılarak immünofloresan yoluyla hücre sayımı, RP modellerinde retinal dejenerasyon ile ilişkili hücresel değişiklikleri incelemek için son zamanlarda kullanılmıştır, çünkü bu yaklaşım, fotoreseptör kaybının değerlendirilmesini kolaylaştırır ve terapötik müdahaleleri takiben potansiyel hücresel koruma. İntravitreal enjeksiyon, solüsyonu vitreus odasına uygulamak için ince bir iğne kullanılarak oküler bütünlük ve güvenilir sonuçlar sağlamak için optimize edilmiştir. İlaç etkilerini değerlendirmek için önceden tanımlanmış bir süreden sonra, bir kriyostat kullanılarak 10 μm kalınlığında kesitlere ayrılan numunelerle histolojik işlem gerçekleştirilir ve ardından geri kazanım antikorları ile immünofloresan etiketleme yapılır. Son olarak, fotoreseptörlerin korunmasıyla kanıtlandığı gibi, ilaçlarla tedavinin koruyucu bir etki gösterip göstermediğini değerlendirmek için hücre sayımı yapılır. Bu teknikler retinopati araştırmalarında tutarlı veriler elde etmek için yaygın olarak uygulanmış olsa da, hassas doku işleme ve işleme kalitesinin elde edilmesinde zorluklar devam etmektedir. Bu protokol, intravitreal enjeksiyondan histolojik kesitlerin hazırlanmasına kadar her adımı optimize etmek için standartlaştırılmış bir yaklaşım sağlayarak tekrarlanabilir ve yüksek kaliteli sonuçlar sağlar.

Giriş

Görme, duyusal sistemin en karmaşık duyularından biridir ve çevresel görsel uyaranları yakalamak ve bunları beyinde görüntüler oluşturmak üzere işlenen elektrokimyasal sinyallere çevirmek için gereklidir. Yaşlanma, genetik kusurlar ve hastalıklar gibi çeşitli biyolojik faktörler görmeyi tehlikeye atarak yaşam kalitesini ve günlük aktiviteleri önemli ölçüde etkileyebilir.

İnsan gözü üç ana odacıktan oluşur. Kornea ve sklera tarafından oluşturulan dış tabaka, göz küresine yapısal destek sağlar. Ara katman, iris, siliyer cisim ve koroidi içerir ve ikincisi fotoreseptörlere kan sağlamaktan sorumludur. Son olarak, iç katman, ışık uyaranlarını işlemekten ve ışığı görüntü oluşumu için beyne gönderilen elektrik sinyallerine dönüştürmekten sorumlu bir yapı olan retinayı içerir 1,2.

Nöral retina, fotoreseptörler, bipolar hücreler, yatay hücreler, amakrin hücreleri ve ganglion hücreleri gibi özel hücreler dahil olmak üzere birkaç hücresel katmandan oluşur. Ek olarak, retina mikroglia, astrositler ve Müller hücreleri gibi glial hücrelerin yanı sıra pigmentli epitel hücreleri içerir. Retinanın nöral olmayan kısmında bulunan ikincisi, yapısal bütünlüğün, korumanın ve fotoreseptörleredesteğin korunmasında kritik bir rol oynar 3,4. Nöral kısım, ışığın yakalanması ve işlenmesinde doğrudan yer alan duyusal ve nöronal hücreleri barındırır 5,6,7.

Görme için gerekli olan retina, genellikle körlüğe yol açabilecek patolojilerden etkilenir. Bu durumlar arasında retinitis pigmentosa (RP), etiyolojisi ile ilişkili 80'den fazla gen ile başlıca kalıtsal retinopatilerden biri olarak öne çıkmaktadır 8,9. RP, ağırlıklı olarak otozomal dominant veya resesif kalıtılan heterojen bir hastalıktır, ancak X'e bağlı veya spontan mutasyonlara bağlı olarak da ortaya çıkabilir10.

Nüfusa ve coğrafi bölgeye bağlı olarak 3.000'de 1 ile 7.000 kişide 1 arasında tahmin edilenküresel prevalansla 11,12 RP, genellikle ergenlik veya erken yetişkinlik döneminde, gece görüşünün azalması ve periferik görme alanı kaybı gibi ilk semptomlarla ortaya çıkar. Hastalık ilerledikçe, merkezi görme tehlikeye girer ve potansiyel olarak tam körlüğe yol açar 9,13.

RP için henüz bir tedavi olmamasına rağmen, geliştirilmekte olan çeşitli tedaviler hastalığın ilerlemesini yavaşlatma veya tersine çevirme potansiyeli göstermiştir. Bu yaklaşımlar arasında genetik, hücresel ve farmakolojik tedavilerin yanı sıra elektronik cihazlar da bulunmaktadır. RP'nin anlaşılmasını ilerletmek ve yeni müdahaleleri değerlendirmek için, retina dejenerasyonunun murin modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Genellikle rd (retinal dejenerasyon) olarak adlandırılan bu modeller, RP'nin moleküler temelini ve tedavilerini incelemek için değerli araçlardır. Retinitis pigmentosa çalışmasında kullanılan çeşitli modeller arasında, Pde6βrd10/rd10 (rd10) fare suşu, fosfodiesteraz14'ün çubuğa özgü β alt birimini kodlayan gende yanlış anlamlı bir mutasyon sunar ve insanlarda meydana gelene benzer şekilde yavaş bir fotoreseptör dejenerasyonu sergiler15.

İntravitreal ilaç uygulaması çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır 16,17,18. Bu protokol, özellikle fotoreseptör hücre sağkalımı ile ilgili olarak, retina üzerindeki ilaç etkilerini inceleyen araştırmacılar için uygundur. Bu şekilde, bu protokolün birincil amacı, retinitis pigmentosa (RP) murin modelinde intravitreal enjeksiyon yoluyla ilaç dağıtımını optimize etmek ve bir fotoreseptör hücre markörü olan recoverin için immünofloresan kullanarak fotoreseptör sağkalımını değerlendirmektir. İntravitreal enjeksiyon, lokalize ilaç uygulamasına, sistemik yan etkilerin en aza indirilmesine, retina biyoyararlanımının artırılmasına ve diğer organlardaki yan etkilerin azaltılmasına olanak sağlar. Öte yandan, recoverin için immünofloresan, fotoreseptör sağkalımının spesifik bir analizine izin vererek, bu terapötik stratejinin etkinliğini değerlendirmek için etkili bir araç sağlar. Bununla birlikte, uygulanabilirlikleri, bu yöntemi diğer deneysel ortamlara uyarlarken göz önünde bulundurulması gereken hayvan modeli seçimi, enjeksiyon hassasiyeti ve tedavi süresi gibi faktörlere bağlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Proje ve bünyesinde yürütülen tüm protokoller, Ulusal Hayvan Deneyleri Kontrol Konseyi'nin hayvan bakımı yönergelerini takip etmektedir ve Hayvan Kullanımı Etik Kurulu (CEUA - UFF) tarafından 1464280219 numarası ile onaylanmıştır.

1. Hayvanlar

  1. Fotoreseptör dejenerasyonuna uğrayan rd10 fare suşunu ve C57 Black/6 suşunu (rd10'un arka planı) kullanın. Bu suşları 12 saat / 12 saat aydınlık-karanlık döngüsü altında, suya ve yiyeceğe ad libitum erişimi ile koruyun.

2. Anestezi

  1. Damıtılmış suda seyreltilmiş 80 mg / kg ketamin ve 8 mg / kg ksilazin dozunda hazırlanan bir anestezik ile intraperitoneal enjeksiyon yapın. Ketamin, analjezik etkiler sağlayan bir N-metil-D-aspartat reseptörü (NMDA) reseptör inhibitörü olarak işlev görürken, ksilazin anestezik bir yatıştırıcı olarak işlev görür.
  2. İntraperitoneal enjeksiyon için enjekte edilecek hacmi 10 μL x Ağırlık (g) olarak hesaplayın.
  3. Karına net erişim sağlamak için fareyi kısıtlayın. Karın boşluğunun sağ alt çeyreğini% 70 alkolle temizleyin, burada iğne eğimi yukarı bakacak şekilde yerleştirilmelidir.
  4. Ağrı refleksinin olmadığını doğrulamak için, hayvanın kuyruğunu veya pençesini nazikçe sıkıştırın. Herhangi bir reaksiyon yoksa, bu hayvanın uygun şekilde uyuşturulduğunu gösterir.

3. İntravitreal enjeksiyon

  1. Hayvanlar anestezi altındayken, gözleri açığa çıkarın ve 10x büyütmeli bir binoküler stereoskopik mikroskop kullanarak, enjeksiyonun gerçekleştirileceği kornea ve sklera arasında gri bir bant olan limbus alanını belirleyin.
  2. Enjeksiyonu gerçekleştirmek için başka bir kişiden yardım alınması gerekir. Binoküler stereoskopik mikroskop altında, bir kişinin hayvanı tutması ve iğneyi sokması gerekirken, asistan maddeyi göze sokmak için şırınga pistonuna basar.
  3. İlk olarak, limbus bölgesinde bir delik açmak için sabit iğneli (31 G x 6 mm) ultra ince bir şırınga kullanın, iğneyi çok derine sokmamaya dikkat edin; Eğimin sadece yarısını yerleştirmek yeterlidir.
  4. Ardından, 1 μL ilgilenilen sıvı/ilaç içeren elde taşınan önceden sterilize edilmiş Mikro Şırıngayı (eğim olmadan ölçü 26 S) insülin şırıngası tarafından yapılan deliğe yerleştirin.
  5. Asistanın şırınga pistonuna yavaşça basmasını sağlayın ve tüm hacmin yaklaşık 30 saniye boyunca uygulandığından emin olun.
  6. Aynı hayvanın diğer gözü için işlemi tekrarlayın ve zamanı kaydedin.
  7. Birden fazla deney grubu varsa, her grubun doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için hayvanın kulağını işaretleyin.
  8. Kurumayı önlemek için hayvanın her gözüne 1 damla 0.01 M PBS solüsyonu kullanın.
  9. Bu işlemlerden sonra, hayvanları uyanana kadar sıcaklığı 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığına koyun. 1-2 saat sürebilir. Anestezi altındayken hayvanları sürekli olarak izleyin ve uyandıktan sonra analiz zamanına kadar kafeslerine geri koyun.
  10. Operatörlerin farelerde intravitreal enjeksiyon tekniklerini iyileştirmelerine yardımcı olmak için tripan mavisi gibi görünür bir boya kullanarak bir ilk eğitim seansı gerçekleştirin.
    NOT: Boya, iğne yolunun görselleştirilmesini kolaylaştırır, enjeksiyonun derinliğinde ve açısında hassas ayarlamalara izin verir, oküler yapıya zarar verme riskini azaltır ve prosedürün güvenliğini artırır.

4. Ötenazi ve göz hazırlığı

  1. Enjeksiyonu takiben belirli bir tedavi süresinden sonra,% 5'lik bir izofluran doz aşımı soluyarak hayvanları ötenazi yapın. Solunumun kesilmesinden en az 1 dakika sonrasına kadar maruziyete devam edin. Ölümü sağlamak için, hayvanı boynunun arkasından tutun ve servikal çıkık elde edilene kadar kuyruğa sıkı bir çekiş uygulayın.
  2. Gözleri çıkarmadan önce şakak kutbunu işaretleyin. İşaretleyiciyi veya sıcak iğneyi/pimi skleranın temporal bölgesine dikkatlice uygulayın ve işaretlemenin görünür ve kesin olduğundan emin olun. Bu adım, kesit oluşturma işlemi sırasında oryantasyon için bir referans noktası görevi görecektir.
  3. Daha sonra gözleri açığa çıkarın ve steril bir neşter ve iridektomi makasıyla, bağ ve kas dokularını ayırmak için çevredeki dokuyu kesin ve göz küresini açığa çıkarın. Farelerde, göz kaslarını dikkatlice inceleyin, çünkü bu zor olabilir. Prosedürü kolaylaştırmak için, göz derisinin her iki köşesinde steril bir neşter ile yanal bir kesi yapın.
  4. Orta uçlu kavisli bir forseps kullanarak, gözleri optik sinirden tutarak göz yuvasından nazikçe çıkarın ve dokuyu hemen oda sıcaklığında (RT) %4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi içinde 5 dakika sabitleyin.
  5. PFA çözeltisinde fiksasyondan sonra, orta uçlu kavisli forseps kullanarak gözleri bir cam plakaya aktarın. Bu plaka bir diseksiyon platformu olarak işlev görür ve 0.1 M pH 7.4 konsantrasyonunda bir fosfat tamponu içerdiğinden emin olur.
  6. Daha sonra, plakayı 10x büyütmeli bir binoküler stereoskopik mikroskop altına yerleştirin ve bir neşter kullanarak limbusun (kornea sınırı) hemen üzerinde küçük bir kesi yapın. Daha sonra, korneayı ayırmak için mikroiridektomi makası ile limbusu takip eden çevresel bir kesim yapın.
  7. Dumont #5 forseps kullanarak korneayı, iris ve lens ile birlikte çıkarın. Son olarak, gözleri tekrar %4 PFA solüsyonunda 55 dakika sabitleyin. Bundan sonra, gözleri fosfat tamponu 0.1 M, pH 7.4 ile üç kez yıkayın.

5. Kriyoprezervasyon ve dondurma

NOT: Retina dokusu kriyostat kesiti, bazı ayarlamalarla daha önce tarif edildiği gibigerçekleştirildi 19.

  1. 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4 içinde seyreltilmiş% 10,% 20 ve% 30'luk bir sükroz gradyanı ile gözleri kriyoprezervasyon yapın. Gözleri sırayla sakaroz çözeltilerine batırın, en düşük konsantrasyondan (% 10) başlayın ve yavaş yavaş en yükseğe (% 30) yükseltin. Her adım, gözler kabın dibine yerleşene kadar gerekli süre boyunca sürer, bu da bir sonraki konsantrasyonun kullanılabileceğini gösterir. Son konsantrasyonda, gözleri yaklaşık 12 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.
  2. Ertesi gün, fazla %30'luk sükrozu çıkarın ve gözleri deney gruplarına göre düzenlenmiş 2 cm çapında yuvarlak alüminyum bir kaba koyun.
    NOT: Deney grubu sayısına göre uygun büyüklükte alüminyum folyo kap yapınız.
  3. 10x büyütmeli binoküler stereoskopik mikroskop altında, doku yapısına zarar vermemek için gerekli özeni göstererek bir pipet veya filtre kağıdı kullanarak göz küresinin içinden ve çevresinden fazla sakarozları çıkarın.
  4. Gözleri optimum kesme sıcaklığında (OCT) dondurucu ortama gömün, gözlerin içinde veya çevresinde kabarcık oluşumunu önlemeye dikkat edin ve RT'de 1 saat bekletin.
  5. OCT'de 1 saat sonra, gözleri önceden işaretlenmiş referans noktası yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Alüminyum folyo kabını, dondurmak için küçük bir strafor kutunun içindeki uygun bir alüminyum plaka üzerine yerleştirin.
  6. Folyo kabın etrafındaki alüminyum plakanın üzerine dikkatlice sıvı nitrojen dökün. Nitrojenin yüzeye eşit şekilde yayıldığından emin olun. Bu, homojen doku donmasını teşvik eder. Sıvı nitrojenin folyo kabın içindeki gözlerle doğrudan temas etmediğinden emin olun. Ardından, bir kriyostat kullanarak gözleri bölümlere ayırmaya devam edin.

6. Slayt hazırlama

  1. Buzlu kenarlı cam slaytların üzerine poli-L-lizin (200 μg/mL) yayın.
  2. Kaydırakların kuruması ve kullanıma hazır hale gelmesi için 12 saat bekleyin.

7. Kriyostat kesiti

  1. Bir kriyostat üzerinde, donmuş bloğu platforma yerleştirin.
  2. 10 μm kalınlığında bölümler yapmak için el çarkını çevirin.
  3. Kesimde tüm gözlerin eşit şekilde bulunduğundan emin olmak için bloğun konumunu ayarlayın.
  4. Parlak alan mikroskobu kullanarak optik sinir tanımlanana kadar kesmeye devam edin.
  5. Poli-L-lizin ön işlem görmüş slaytlar üzerindeki bölümleri toplayın.
  6. Slaytları analize kadar -20 °C'de saklayın.

8. İmmünofloresan

NOT: İmmünofloresan daha önce tarif edildiği gibi bazı ayarlamalarlagerçekleştirildi 19,20.

  1. Kriyostattaki bölümden elde edilen slaytları, hücre plazma zarına nüfuz etmek için RT'de 15 dakika boyunca 0.01 M PBS'de 100 μL% 0.5 Triton X-100 ile inkübe edin.
  2. Fazla Triton X-100'ü çıkarmak için slaytları RT'de her biri RT'de 0,01 M PBS ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  3. Spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için RT'de 30 dakika boyunca 0.01 M PBS'de 100 μL% 1 sığır serum albümini (BSA) ile inkübe edin.
  4. Bloke ettikten sonra, fotoreseptör hücrelerini etiketlemek için BSA% 1 içinde seyreltilmiş 1:1500 konsantrasyonda 100 μL anti-recoverin ile bölümleri gece boyunca 4 ° C'de (buzdolabı) inkübe edin.
  5. Ertesi gün, bölümleri RT'de 2 saat boyunca BSA% 1 içinde seyreltilmiş 100 μL anti-tavşan poliklonal ikincil antikor 488 veya anti-tavşan poliklonal ikincil antikor 568 1: 500 ile inkübe edin.
  6. Slaytları RT'de her biri 0.01 dakika boyunca 5 M PBS ile iki kez yıkayın.
  7. Bölümleri 100 μL DAPI 1 mg / mL (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) ile RT'de 2-3 dakika inkübe edin.
  8. Slaytı RT'de 5 dakika boyunca 0.01 M PBS ile bir kez yıkayın.
  9. Son olarak, bölümlere 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4'te 40 mL gliserol içinde 2.5 g n-propil gallat içeren bir montaj ortamı ile muamele edin. Numuneleri koruyarak solmaya karşı bir reaktif ve bir montaj ortamı olarak işlev göreceklerdir. Slaytların üzerine bir lamel (24 mm 50 mm) yerleştirin, ardından bölümleri oje ile kapatın. Bundan sonra, numuneleri mikroskop altında görüntülemeye devam edin.

9. Floresan mikroskobu fotomikrografisi

  1. İmmünohistokimya tekniği kullanılarak etiketlenmiş hücrelerin görüntülerini elde etmek için mavi, yeşil ve kırmızı filtrelerle donatılmış bir floresan optik mikroskobu kullanın. Ek olarak, slayt fotomikrografisi için bir kamera takın. Fotomikrografları elde etmek için, mikroskopla eşzamanlı görselleştirme için açık olması gereken LAS V3.7 (Leica) yazılımına (görüntüleme yazılımı) sahip bir bilgisayar kullanın.
  2. Slaytı mikroskop tablasına yerleştirin. Başlangıçta, en düşük büyütme hedefini ve mavi filtreyi kullanın.
  3. Mavi etiketli hücrelerin (hücre çekirdekleri) bulunduğu retina net bir şekilde görüntülenene kadar kaba ve ince odak düğmelerini kullanarak odağı ayarlayın.
  4. Görüntüleme için retinanın istediğiniz alanını seçin. Büyütmeyi kademeli olarak 40x objektife kadar artırın ve odağı gerektiği gibi ayarlayın.
  5. Odağı ayarladıktan sonra, mikroskop görüntüsünü görüntüleme yazılımına aktarmak için baypas pimini çekin. İstediğiniz filtreleri seçin (A4 (mavi), L5 (yeşil) ve TX2 (kırmızı)). Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Görüntünün net ve mikroskop altında gözlemlenene mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olmak için Pozlama, Kazanç ve Gama.
  6. ×400 büyütmede, retinanın çevresinden merkezine doğru bir yönlendirmeyi takip ederek 113 × 113 μm alana sahip dört alanı yakalayın. Bu alanlardan ikisinin periferik bölgeyi, ikisinin de retinanın merkezi bölgesini temsil ettiğinden emin olun.
  7. Periferik alan fotomikrografları elde etmek için, gözün kenarlarından yaklaşık 50 μm'de görüntüler yakalayın. Merkezi alan fotomikrografları için, optik sinirden 50 μm uzakta bulunan bitişik alanları seçin ve görüntüleri elde edin. Ölçümler için hem sağ hem de sol gözleri kullanın, bu da tedavi başına toplam sekiz analiz alanıyla sonuçlanır.
  8. Tüm fotomikrografları tamamladıktan sonra, immün etiketli hücrelerin manuel olarak ölçülmesine devam edin.

10. Hücre nicelemesi

  1. ImageJ v.1.54g programını açın. Program içinde Dosya'ya, ardından Aç'a tıklayın ve bilgisayara kaydedilen görüntüyü seçin.
  2. Görüntü zaten açıkken, Çok noktalı'ya tıklayın. Sayılacak her hücreye sol tıklayarak hücreleri ölçmek için bu aracı kullanın.
  3. Dış nükleer tabakadaki (ONL) kolokalize hücreleri, yani geri kazanım ve DAPI için pozitifi ölçün.
  4. Sayım tamamlandığında, işaretlenen toplam hücre sayısını görmek için farenin sol tuşuyla çift tıklayın.
  5. Geri kazanım pozitif hücrelerin sayısını belirledikten sonra, Excel niceleme tablosuna hücre sayısını girin ve bir sonraki fotomikrografa geçin.
  6. Her bir hayvana karşılık gelen 8 alan için tüm adımları tekrarlayın.
  7. Tüm retina için tek bir deney noktasına karşılık gelen bu sekiz alanın ortalamasını hesaplayın (n= 1). Periferik retina grafisi için, periferik alanların ortalamasını kullanın ve toplam dört alan elde edin: ikisi sol gözden ve ikisi sağ gözden olmak üzere. Bu ortalama, periferik retina için bir deney noktasına karşılık gelir (n= 1). Retina grafiğinin merkezini, periferik grafikle aynı şekilde oluşturun ve yalnızca bölgeyi değiştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fotoreseptörleri, geri kazanım pozitif hücreleri etiketlemek için immünofloresan tekniği, rd10 ve C57Bl6 hayvanlarında fotoreseptörlerin dejenerasyon modelini gözlemlememize izin verdi ve ikincisi sağlıklı kabul edildi (Şekil 1). Görülebileceği gibi, geri kazanım pozitif hücreler için etiketleme, hem rd10 hem de vahşi tip hayvanlarda bu hücrelerin içindeki segmentlerin etiketlenmesi de dahil olmak üzere, fotoreseptörlerin bulunduğu dış nükleer katmana (ONL) ö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Retina, erişilmesi zor olan hassas bir dokudur; Bu nedenle, bu dokuyu hedef alan farmakolojik tedavide kullanılacak tekniğin göz önünde bulundurulması gerekir. İntravitreal enjeksiyon, özellikle yaşa bağlı makula dejenerasyonu21, diyabetik retinopati22 ve retinitis pigmentosa23 gibi oküler hastalıkların tedavisinde, ilaçların doğrudan retinaya verilmesi için iyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan bir tekn...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq), Carlos Chagas Filho Rio de Janeiro Eyaleti Araştırma Desteği Vakfı (FAPERJ) tarafından desteklenen bir araştırma bursu sırasında gerçekleştirildi ve ayrıca kısmen Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finans Kodu 001 tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.3 Triton-X-100Sigma-AldrichT8787Tamponu bloke etmek için çözelti
%1 BSASigma-AldrichA4503Tamponu bloke etmek için çözelti
%1 İnsan BD Fc BloğuBD Biosciences564220Fc Tamponu bloke etmek için blok
gereklidir 150 W LED lambaAmazonB07VH3CVSFDoku foto ışınlaması için LED ışık kaynağı
1x PBS Gibco10010-023Tampon ve yıkama adımlarını engellemek için çözüm
20 Galon Depolama KabıAmazonB001B1C4G0Fotoışınlama işlemi için
Konteyner 40 W RGBW sel LED lambası Dokufotoirradyasyonu için Amazon B08QFPJSMD RGB ışık kaynağı
Ag85BAbcamab43019/NAIBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
IBEX görüntüleme için alfa-düz kas aktini DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAAntikoru. Tablo 1'e bakın.
Avidin / Biotin Bloke Etme KitiAbcamab64212Avidin ve biotin bloke etme çözeltisi
BD Cytofix / CytopermBD Biosciences554714Fiksasyon çözeltisi
BOND Dewax ÇözeltisiLeica BiosystemsNC0221076Deparafinizasyon çözeltisi
BOND Epitop Geri Alma Çözeltisi 1Leica BiosystemsNC0235529Sitrat bazlı pH 6 epitop geri alma çözeltisi ( ER1)
BOND Epitop Alma Solüsyonu 2Leica BiosystemsNC0235530EDTA bazlı pH 9 epitop geri alma solüsyonu (ER2)
BOND Araştırma Tespit SistemiLeica BiosystemsNC0396648Otomatik araştırma boyama reaktifi
BOND RX Araştırma BoyayıcıLeica BiosystemsNAOtomatik araştırma boyama platformu
BOND Yıkama SolüsyonuLeica BiosystemsNC0221077Yıkama tamponu
CD15BD Biosciences347420 / AB_400298IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82 / AB_11150959IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
CD4 Alexa Fluor 488Ar-Ge D SystemsFAB8165G/AB_2728839IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
IBEX görüntüleme için CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE / NAANTIKORU. Tablo 1'e bakın.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
Eşek anti-keçi IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814 / AB_2762838IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
Eşek anti-fare IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787 / IBEXgörüntüleme için AB_2762830 Antikoru. Tablo 1'e bakın.
Eşek anti-fare IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020 / AB_2340844IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
Eşek anti-tavşan IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794 / AB_2762834IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
EasyDip Boyama SistemiYeni Gelen Tedarik5300KITSlayt boyama sistemi
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02Montaj ortamı
HoechstBiotium40046IBEX görüntüleme için nükleer boya. Tablo 1'e bakın.
Imaris Dosya Dönüştürücü x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsÜcretsiz dosya dönüştürücü
ImarisViewer yazılımı x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsÜcretsiz görüntü işleme yazılımı
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000Hidrofobik bariyer kalemi
Lityum Borhidrür (1 gram)STREM Kimyasalları93-0397Boya inaktivasyonu için kimyasal, bu kimyasalın küçük alikotlarını satın alın (1 gram)
Lumican BiotinR& D SystemsBAF2846IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
Mikro Kapaklı GözlüklerVWR48393-241Cam sürgülü kapaklar
Pan-sitokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750 / AB_2868569IBEX görüntüleme için antikor. Tablo 1'e bakın.
PELCO BioWave Pro Mikrodalga SistemiTed Pella Inc36500-230Isıtmasız bilimsel mikrodalga
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062Bilimsel mikrodalga için tam otomatik sıcaklık kontrolü
SimpleITKAçık kaynaklı yazılımKayıt ve kanal işleme yazılımı
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227IBEX görüntüleme için etiketleme reaktifi. Tablo 1'e bakın.
Geniş Alan Mikroskobu,Leica MicrosystemsNALEICA Microsystems, LED8 ışık kaynağı ve LAS X yazılımı ile THUNDER görüntüleyici (3.7.1.21655). Floresan görüntüleme için, geçiş başına yedi boya kanalını görüntülemek için iki ek tek bantlı filtreye (PN: 8118215) sahip harici filtre tekerleğine (PN: 11536075) sahip özel bir dört bantlı filtre kullanıldı. Filtre uyarma, dikroik ve emisyon çizgileri (1) Dört Bantlı küp: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31'de dikroik, uyarma veya emisyon filtresi yok; (2) Dış filtre tekerleği konumu 1: 434/32, konum 2: 520/40, konum 3: 585/20, konum 4: 720/60, konum 5: geçiş; (3) tek bantlı 1 & 585/22 uyarma, 594 dikroik, 625/30 emisyon; (4) tek bantlı 2 & 635/20 uyarma, 647 dikroik, 667/30 emisyon.
Zeiss Optik Lens TemizleyiciAmazonB00GPVQVCOMikroskobu objektif lens temizleyici
Antikorlar
Ag85BAbcamab43019Poliklonal Tavşan IgG, döngü 1
Alfa-düz kas aktin DyLight 755Novus BiyolojiklerNBP2-345221R1A4/asm-1, döngü 1
CD4 Alexa Fluor 488R&;D SistemlerFAB8165GPoliklonal Keçi IgG, döngü 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8/144B, döngü 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, döngü 1
Eşek anti-keçi IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814Poliklonal Eşek, döngü 1
Eşek anti-fare IgG Alexa Fluor Plus AF647Termo Fisher ScientificA32787Poliklonal Eşek, döngü 1
Eşek anti-tavşan IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794Poliklonal Eşek, döngü 1
HoechstBiotium40046Nükleer etiket, döngü 1
CD15BD Biosciences347420MMA, döngü 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26, döngü 2
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, döngü 2
Eşek anti-fare IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020Poliklonal Eşek, döngü 2
Lumican BiotinR& D SistemleriBAF2846Poliklonal Keçi IgG, döngü 2
Pan-sitokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1 / AE-3, döngü 2
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227N / A, döngü 2
HoechstBiotium40046döngü 2
< güçlü > Çözümler< / güçlü>
Engelleme Tamponu (Döngü 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787hacimce %0,3
BSASigma-AldrichA4503Hacimce %1
İnsan BD Fc BlokBD Biosciences564220Hacimce %
1 1x PBS Gibco10010-023Hacimce %97,7
Primer Antikor Boyama Çözeltisi #1 (Döngü 1)
Engelleme Tamponu (Döngü 1)YukarıyaAntikorları ekledikten sonra hacmi doldurun
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
Birincil Antikor Boyama Çözeltisi #2 (Döngü 1)
Blokaj Tamponu (Döngü 1)YukarıyaAntikorları ekledikten sonra hacmi
doldurun CD4  AF488Ar-Ge D SistemleriFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
İkincil Antikor Boyama Çözeltisi #1 (Döngü 1)
Blokaj Tamponu (Döngü 1)YukarıyaAntikorlar ekledikten sonra hacme kadar doldurun
Eşek Anti-Keçi AF Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_27628381:100
Eşek anti-Tavşan AF Plus 555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_27628341:100
Eşek anti-Fare AF Plus 647Thermo Fisher ScientificA32787/AB_27628301:50
Birincil Antikor Boyama Çözeltisi #3 (Döngü 1)
Blocking Buffer (Döngü 1)YukarıyaEkledikten sonra ses seviyesine kadar doldurun antikorlar
CD68 iF594Caprico Biotechnologies1064135 1:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
BSA içermeyen Blokaj Tamponu (Döngü 2) 
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787hacimce %0,3
İnsan BD Fc BlokBD Biosciences564220hacimce %1
1x PBS Gibco10010-023Hacimce %98,7
Primer Antikor Boyama Çözeltisi #4 (Döngü 2)
BSA İçermeyen Engelleme Tamponu (Döngü 2)YukarıyaAntikorlar ekledikten sonra hacme kadar doldurun
CD15BD Biosciences3474201:30
Lumican BiotinR& D SistemleriBAF28461:100
CD45 PENovus BiyolojiklerNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-Sitokeratin AF750Novus BiyolojiklerNBP2-33200AF7501:10
İkincil Antikor Boyama Çözeltisi #2 (Döngü 2)
BSA İçermeyen Engelleme Tamponu (Döngü 2)YukarıyaAntikorlar ekledikten sonra hacme doldurun
Eşek anti-Fare IgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher ScientificS112271:200
, bakın bakın bakın bakın bakın bakın

Kaynaklar

  1. Kels, J., et al. Anatomy and physiology of the retina: a comprehensive review. Retinal J. 21, 75-92 (2015).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  3. Tsang, S. H., Sharma, T. Retinal degeneration and gene therapy: present and future approaches. Prog Retin Eye Res. 67, 93-120 (2018).
  4. Gasparini, S. J., Favretto, F., La Greca, C. Biology of the retina: structure, function, and dysfunction. J Biomed Sci. 19 (3), 289-300 (2019).
  5. Masland, R. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  6. Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
  7. Hoon, M., et al. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  8. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  9. Liu, W., et al. Retinitis pigmentosa: progress in molecular pathology and biotherapeutical strategies. Int J Mol Sci. 23 (9), 4883(2022).
  10. Hamel, C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis. 1, 40(2006).
  11. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Prog Retin Eye Res. 66, 157-186 (2018).
  12. O'Neal, T. B., Tripathy, K., Luther, E. E. Retinitis Pigmentosa. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  13. Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), e112142(2014).
  14. Chang, B., et al. Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene. Vision Res. 47 (5), 624-633 (2007).
  15. Jae, S. A., et al. Electrophysiological and histologic evaluation of the time course of retinal degeneration in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Korean J Physiol Pharmacol. 17 (3), (2013).
  16. Strettoi, E., et al. Inhibition of ceramide biosynthesis preserves photoreceptor structure and function in a mouse model of retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18706-18711 (2010).
  17. Rösch, S., Johnen, S., Mataruga, A., Müller, F., Pfarrer, C., Walter, P. Selective photoreceptor degeneration by intravitreal injection of N-methyl-N-nitrosourea. Investig Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1711-1723 (2014).
  18. Kellish, P. C., et al. Intravitreal injection of a rationally designed AAV capsid library in non-human primate identifies variants with enhanced retinal transduction and neutralizing antibody evasion. Mol Ther. 31 (12), 3441-3456 (2023).
  19. Molday, L. L., Cheng, C. L., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells and Subcellular Organelles by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. New York. (2019).
  20. Cheng, C. L., Djajadi, H., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  21. Girgis, S., Lee, L. R. Treatment of dry age-related macular degeneration: a review. Clin Exp Ophthalmol. 51 (8), 835-852 (2023).
  22. Lee, J. Y., et al. Superoxide dismutase 3 prevents early stage diabetic retinopathy in streptozotocin-induced diabetic rat model. PLoS One. 17 (1), e0262396(2022).
  23. Isiegas, C., et al. Intravitreal injection of proinsulin-loaded microspheres delays photoreceptor cell death and vision loss in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Investig Ophthalmol Vis Sci. 57 (8), 3610-3618 (2016).
  24. Doshi, R. R., Bakri, S. J., Fung, A. E. Intravitreal injection technique. Semin Ophthalmol. 26 (3), 104-113 (2011).
  25. Kim, H. M., Woo, S. J. Ocular drug delivery to the retina: current innovations and future perspectives. Pharmaceutics. 13 (1), 108(2021).
  26. Jones, B. W., Marc, R. E., Pfeiffer, R. L. Retinal Degeneration, Remodeling and Plasticity. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482309/"K482309 (2016).
  27. Roche, S. L., Wyse-Jackson, A. C., Byrne, A. M., Ruiz-Lopez, A. M., Cotter, T. G. Alterations to retinal architecture prior to photoreceptor loss in a mouse model of retinitis pigmentosa. Int J Dev Biol. 60, 127-139 (2016).
  28. Ladha, R., Caspers, L. E., Willermain, F., de Smet, M. D. Subretinal therapy: technological solutions to surgical and immunological challenges. Front Med. 9, 846782(2022).
  29. Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
  30. Bussing, D., et al. Pharmacokinetics of monoclonal antibody and antibody fragments in the mouse eye following intravitreal administration. J Pharm Sci. 112 (8), 2276-2284 (2023).
  31. Roberge, F. G., de Kozak, Y., Utsumi, T., Faure, J. P., Nussenblatt, R. B. Immune response to intraocular injection of retinal S-antigen in adjuvant. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 227 (1), 67-71 (1989).
  32. Ishikawa, T., Hokama, H., Katagiri, Y., Goto, H., Usui, M. Effects of intravitreal injection of tacrolimus (FK506) in experimental uveitis. Curr Eye Res. 30 (2), 93-101 (2005).
  33. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry: the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
  34. Gargini, C., Terzibasi, E., Mazzoni, F., Strettoi, E. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study. J Comp Neurol. 500 (2), 222-238 (2007).
  35. Haverkamp, S., Wässle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J Comp Neurol. 424, 1-23 (2000).
  36. Haverkamp, S., Ghosh, K. K., Hirano, A. A., Wässle, H. Immunocytochemical description of five bipolar cell types of the mouse retina. J Comp Neurol. 455, 463-476 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ntravitreal EnjeksiyonKriyostat Kesit Almamm nofloresan EtiketlemeRecoverin AntikorlarRetinal KorumaH cre Say mRetinal Histoloji
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.