Yöntem makalesi

In vivo (İn canlı) Anestezi Uygulanmamış Drosophila Yetişkin Sineklerde Nöral Aktivitenin Görüntülenmesi

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68332

⸱

20 Haziran 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

Bu makalede

Özet

Öğrenme ve hafıza gibi bilişsel süreçler sırasında hücresel aktiviteyi incelemenin önündeki önemli bir engel, in vivo görüntüleme hazırlığı için anesteziklerin kullanılmasıdır. Anestezi, Drosophila da dahil olmak üzere birçok modelde kısa süreli hafızayı ve bilişi bozar.Bu çalışma, yetişkin Drosophila'yı anestezi olmadan in vivo görüntüleme için hazırlamak için benzersiz bir yöntem sunmaktadır.

Özet

İn vivo görüntüleme, Drosophila'da nörobiyolojiyi incelemek için çok önemlidir, çünkü bozulmamış, davranan sinek içindeki nöronal aktivitenin, gelişimin ve plastisitenin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verir. Bu teknik, sabit veya ex vivo hazırlıklarda doğru bir şekilde yakalanamayan sinaptik fonksiyon ve devre bağlantısı gibi dinamik süreçler hakkında paha biçilmez bilgiler sağlar. İn vivo görüntüleme için sinek hazırlama tekniklerinin çoğu, fonksiyonel görüntülemeden kısa bir süre önce sineklerin uyuşturulmasını içerir. Bununla birlikte, kapsamlı kanıtlar anestezinin çeşitli bilişsel ve fizyolojik süreçleri etkilediğini göstermektedir. Bu nedenle, yetişkin Drosophila melanogaster'in hayvan hazırlığı sırasında anestezik kullanılmadan in vivo görüntülenmesi zorlu ancak oldukça arzu edilen bir yaklaşımdır. Burada sunulan protokol, hortumu bir vakum sistemine bağlı küçük bir metal tüpe emerek uyanık sineklerin başının hareketsiz hale getirilmesini içerir. Kafa sabitlenirken anesteziye gerek kalmadan sinek fonksiyonel görüntüleme için hazırlanır. Bu protokol hızlı ve tekrarlanabilir olup, sineğe zarar vermemesini sağlar. Bu yöntemin temel avantajı, anestezik kullanımından kaçınmasında yatmaktadır, böylece anestezinin nöral aktivite üzerindeki potansiyel karmaşık etkilerini hesaba katmaktadır. Bu yöntem, ucuz, özelleştirilebilir araçlar kullanarak hem uygun fiyatlı hem de son derece uyarlanabilir. Dinamik bilişsel süreçlerle ilişkili nöral aktivitedeki hızlı değişiklikleri yakalayarak canlı sineklerin başarılı bir şekilde görüntülenmesine olanak tanır.

Giriş

Genetik olarak kodlanmış aktivite raportörlerindeki son gelişmeler, nöronal aktiviteye gerçek zamanlı, son derece spesifik içgörüler sağlayarak nörobilimde devrim yarattı. Kalsiyum veya voltaj sensörleri 1,2,3,4,5,6,7,8,9 gibi bu raporlayıcılar, araştırmacıların nöronlar içindeki elektriksel ve kimyasal sinyalleri benzeri görülmemiş zamansal hassasiyet ve uzamsal çözünürlükle izlemelerine olanak tanır. Bu araçlar, belirli, tek nöronların farklı beyin bölgelerindeki sinir ağlarına izlenmesini sağlayarak, nöronal ateşleme modellerinin öğrenme, hafıza veya karar verme gibi bilişsel süreçlerle nasıl ilişkili olduğuna dair anlayışımızı derinleştirmiştir 10,11,12,13,14.

Genetik olarak kodlanmış bu göstergelerden yararlanmak için araştırmacılar, model organizmalarını in vivo görüntülemeye hazırlamak için gelişmiş yöntemler geliştirdiler. Genellikle "hafıza izi" olarak adlandırılan in vivo fonksiyonel görüntüleme ile nöronal plastisitenin ilk raporu, iştah açıcı koku alma koşullandırmasını takiben bal arılarının anten lobunda keşfedildi15. Bu keşif, genetik olarak çok yönlü model organizma olan Drosophila melanogaster'deki araştırmalara ilham verdi ve yenilikçi in vivo görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesine yol açtı 10,16,17,18.

Drosophila, bir kokunun (koşullu uyaran-CS) ya caydırıcı ya da ödüllendirici bir uyaranla (koşulsuz uyaran-US) ilişkilendirildiği klasik koşullanma yoluyla koku alma anıları oluşturma konusundaki sağlam yeteneği nedeniyle öğrenmeyi ve hafızayı anlamak için mükemmel bir model olarak hizmet eder19,20,21,22. Drosophila'da kokular, yarım küre başına yaklaşık 2.000 Kenyon hücre nöronundan (KC) oluşan çağrışımsal bellek için kritik bir beyin bölgesi olan mantar gövdesinde (MB)23 seyrek olarak temsil edilir24. Koku alma bilgisi, kaliksten MB loblarına, lobları oluşturmak için bir araya gelen KC aksonları aracılığıyla iletilir. Koku alma koşullanması sırasında, elektrik şoku veya şeker ödülü gibi US, farklı dopaminerjik nöronlar (DAN'lar) aracılığıyla MB loblarına iletilir: caydırıcı uyaranlar için PPL1 nöronları ve ödüllendirici uyaranlar için PAM nöronları 25,26,27,28,29,30. Bellek ediniminin, CS ve US yollarının aynı anda aktivasyonunu içerdiği ve bunun da belleği31,32 kodlayan döngüsel AMP'de (cAMP) sinerjik bir artışa neden olduğu düşünülmektedir. Bu işlem, sinaptik ağırlıklarını 11,12,13,33,34,35,36,37 değiştirerek KC→MBON sinapslarında plastisiteyi indükler. DAN aracılı plastisite, nihayetinde mantar gövdesi çıktı nöronlarını (MBON'lar) öğrenilen kokuya karşı bir yaklaşım veya kaçınma davranışı ortaya çıkarmayayönlendirir 34. Mevcut model, KC'lerden MBON'lara bilgi akışının, kokunun temsilini KC'lerdeki koku kimliğinden, önceki deneyime dayalı bir kokunun değerliği gibi MBON'lardaki daha soyut bilgilere dönüştürdüğünü göstermektedir34,38. KC'lerin aksine, MBON'lar geniş çapta ayarlanmış koku tepkilerine sahiptir; herhangi bir koku, çoğu MBON'a39 yanıt verir. MBON'ların koku ayarı, sinaptik plastisite ile değiştirilir ve bireysel sinekler arasında önemli ölçüde değişir, bu da MBON'ların deneyime dayalı olarak kokulara tepkilerini değiştirdiğini düşündürür. 34 MBON vardır ve MBON ağının çoğunluğu görünüşte kaçınma davranışı34 yaklaşımını yönlendiren karşılıklı olarak karşıt iki sınıfa bölünmüştür. Bu nedenle, farklı MBON'larda kayıt yaparak hafıza alımını incelemek için in vivo görüntülemenin kullanılması yaygın olarak kullanılmaktadır.

İn vivo fonksiyonel görüntüleme için erken yöntemler arasında, kütikülün bir bölümünü kafa kapsülünün üstünden çıkarmak için ameliyatlar yapılması ve daha sonra küçük bir plastik sargıparçası ile kaplanması yer alır 18. Bu, Drosophila'da in vivo görüntülemenin başlangıcı olsa da, o zamandan beri sinek hazırlama tekniklerinde ve öğrenme ve hafıza gibi süreçleri araştırmak için mikroskop altında uyaranların verilmesinde önemli ilerlemeler olmuştur. Bununla birlikte, bugün bile, in vivo görüntüleme için sinek hazırlama tekniklerinin çoğu, sineklerin uyuşturulmasını içerir. Bu uygulama, anestezinin hafızayı ve diğer bilişsel ve fizyolojik süreçleri nasıl etkilediğini gösteren kapsamlı kanıtlar ve tüm bir araştırma alanı olduğu için zorluklar sunar. Örneğin, laboratuvar ortamında çok yaygın olarak kullanılan farklı anesteziklerin (karbondioksit, izofluran, sevofluran ve soğuk şok) etkilerini anlamak için bir çalışma yapılmıştır. Anesteziye maruz kalma süresi ne kadar uzun olursa, iyileşme süresinde bir artış, lokomotor aktivitede değişiklikler, daha düşük doğurganlık olduğunu ve su ve lipit depolarınıetkileyebileceğini bulmuşlardır 40. Ek olarak, eğitimden hemen sonra soğuk şok anestezisi verilmesinin kısa süreli hafızayı tamamen bozabileceği bildirilmiştir21. Bu ilk çalışmadan itibaren, Drosophila'da 6-8 saat içinde bozulan konsolide olmayan hafıza (anesteziye duyarlı hafıza) ve öğrenmeden sonra yavaş yavaş oluşan ve yaklaşık 24 saat sürebilen bir konsolide hafıza (anesteziye dirençli hafıza) olduğu bilinmektedir41. Buna dayanarak, anestezi bilişsel işlemeyi ve nöronların aktivitesini etkileyebilir ve bu da sonunda uygun hafıza ifadesine izin verir.

Anestezinin hafıza üzerindeki etkileri Drosophila ile sınırlı değildir.Çok sayıda insan ve diğer memeli çalışmaları benzer bulgular göstermiştir. Örneğin, bir üniversite hastanesinde yapılan kesitsel bir çalışma, genel anesteziden 24 saat sonra hastalarda kısa süreli hafızanın önemli ölçüde azaldığını buldu42. Farelerde yapılan bir başka çalışma, genel anestezinin, memelilerde öğrenme ve hafıza ile ilgili önemli bir beyin alanı olan hipokampusun CA1 bölgesindeki sivri dinamikleri, dekorla ilgili hücresel toplulukları ve değişen omurga dinamiklerini sağlam bir şekilde azalttığını buldu43. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bu çalışmanın amacı, in vivo görüntüleme için sinek hazırlığı sırasında anestezi kullanımını ortadan kaldıran ve sineğin vücudunu tamamen serbest bırakan yeni bir protokol sağlamaktır. Bu yaklaşım, daha doğru nöronal aktivite kayıtlarına izin verir, daha uzun kayıtlar için sinek sağlığını iyileştirir ve diğer yaklaşımlara kıyasla anestezinin olası karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırır. Bu protokol, Drosophila'daki nöronlardan gelen aktiviteyi kaydetmek için tasarlanmıştır, özellikle nöronların öğrenme deneyimi sırasında ve sonrasında nasıl plastisite sergilediğine bakar. Bununla birlikte, diseksiyon protokolü çok yönlüdür ve canlı görüntüleme araştırmalarındaki çeşitli uygulamalara uyarlanabilir.

Protokol

Bu çalışma için kullanılan ekipman ve reaktiflerin detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Transgenik meyve sinekleri, Drosophila melanogaster

  1. Dişi bakireleri ve erkek sinekleri çaprazlayın (12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde %60 bağıl nemde 25 ° C'de yükseltilir), sırasıyla istenen Gal4 ve UAS yapılarını taşır ve ilgilenilen belirli nöronların istenen genetik olarak kodlanmış aktivite raportörünü ifade ettiği sinekler üretir.
  2. Yukarıdaki melezin döllerini, eklosiyondan 2-5 gün sonra 2-5 gün aralığına gelene kadar yaşlandırın. Görüntüleme odaları her iki cinsiyete de uyacak şekilde özel olarak üretildiği için hem erkekler hem de dişiler kullanılabilir.

2. Aspiratör yapımı (5 dakikalık iş akışı)

  1. Bir tıraş bıçağı kullanarak 6 mm silikon boruyu yaklaşık 8 inç uzunluğunda kesin. Bir p200 pipet ucu alın ve ağızlık için bir tıraş bıçağı kullanarak yaklaşık yarısını kesin (Şekil 1A). Kesilen ucu boruya yerleştirin. Bir p1000 pipet ucunu, bir sineğin içinden geçebileceği kadar kesin.
  2. Küçük bir parça pamuk alın ve silikon boruyu kapatın. Bu, sineğin deneycinin ağzına girmesini önlemek içindir. Kesilen p1000 ucunu pamuk kaplı borunun üzerine yerleştirin.
  3. p1000 pipet ucunu yeni bir p200 pipet ucuyla kapatın. p200 pipet ucunu kesmek için uygun uzunluğu belirlemek için önce p200 pipet ucunu çıkarın ve p1000 pipet ucuna bir sinek aspire edin. P200 ucunu yeniden takın. P200 ucuna gidebildiği kadar hareket ettirmek için sineği hafifçe üfleyin ve hafifçe vurun.
    1. Artık daha fazla ilerleyemediğinde, bir tıraş bıçağı kullanarak sineğin başının bittiği ve göğüs kafesinin başladığı noktayı işaretlemek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Sineği p1000 pipet ucuna geri aspire edin ve p200 pipet ucunu işaretli konumda kesin.

3. Metal boru hortum aspiratörünün inşası (5 - 10 dakikalık iş akışı)

  1. 22X ölçülü hipodermik metal boruyu Dremel aletleri ve elmas testere bıçağı kullanarak istenen boyutta (~10 cm) kesin. Düzgün ve temiz bir açıklık oluşturmak için metal boruların uçlarını bir Dremel 420 kesme diski ile parlatın. Bu açıklık sineğin hortumunu barındıracaktır.
  2. İstenen kavisli şekli elde etmek için boruyu 15 mL'lik bir santrifüj tüpünün etrafına sarın (Şekil 1A). Eğri, sineğin vücudunun hazne ile aynı hizada olmasını sağlayacak kanca benzeri bir şekil oluşturmalıdır.
  3. Dremel aletlerini kullanarak 12TW gauge hipodermik metal borudan bir parça (~7 cm uzunluğunda) kesin (bu boru 2 μL'lik bir pipet ucuna sığmalıdır). 2 μL'lik bir pipet ucu alın ve ucunu 22X gauge metal boruya uyacak şekilde bir tıraş bıçağı kullanarak kesin. Daha büyük metal boruyu 2 μL'lik pipet ucunun diğer ucuna takın.
  4. Az miktarda reçine ve sertleştirici epoksi yapıştırıcıyı karıştırın. Karışımı, küçük metal borunun pipet ucuyla buluştuğu ve daha büyük metal borunun pipet ucuna bağlandığı yere uygulayın. Düzeneği bir mikromanipülatör üzerindeki bir tutucuya bağlamadan önce yapıştırıcının gece boyunca tamamen kürlenmesine izin verin. Açıyı gerektiği gibi ayarlayın.

4. Mikroskop altında öğrenme ve hafıza deneyleri için bir şok ve koku verme pipeti oluşturma (10 dakikalık iş akışı)

  1. Bir Dremel elmas alet kullanarak 1/100 cam pipette 3 mL işaretinde 1 mL kesin. 24,5 mm x 8 mm boyutlarında ve 1/8 inç kalınlığında küçük bir dikdörtgen akrilik levha parçası kesin.
    NOT: Alternatif olarak, bu parça şok ızgarasını daha iyi yerleştirmek için 3D olarak basılabilir (stl ve obj dosyaları Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'de bulunabilir).
  2. Bakır şok ızgarasını, önceki adımdaki dikdörtgen akrilik parçaya sığacak şekilde kesin. Bakır ızgaranın zıt uçlarına iki elektrik kablosu lehimleyin. Bakır ızgarayı dikdörtgen akrilik parçaya yerleştirin ve sineğin karnı ve bacakları şok ızgarasına oturacak şekilde kıvırın (Şekil 1I).
  3. Bakır ızgarayı bir parça elektrik bandı kullanarak dikdörtgen plastiğe bantlayın. Sıcak tutkal tabancası kullanarak, cam pipeti düz ve düzgün bir şekilde ortalandığından emin olarak şok ızgarasına güvenli bir şekilde takın. Dijital bir multimetre kullanarak, bakır ızgaranın sineğin bacaklarına etkili bir şok vermek için çalıştığını doğrulayın.

5. Tutkal eritme için platin direncin montajı (Miristik asit) (20 dakikalık iş akışı)

  1. Tel sıyırıcılar kullanarak 200 mm tel istediğiniz uzunlukta kesin ve her iki telin bir ucunu soyun. Platin telin yaklaşık 60 mm'sini kesin (bu uzunluk, yapıştırıcıyı eritmek için kullanılacak bir ilmek oluşturmak için yeterli olmalıdır).
  2. Bir lehim tabancası kullanarak platin telin bir ucunu elektrik teline lehimleyin. Elektrik telinden ısıyla daralan bir makaron geçirin ve lehimli parçaları kaplamak için boruyu telin üzerine büzüştürmek için bir Bunsen brülörü kullanın.
  3. 2,55 mm iç çap kauçuk borudan 20 mm'lik iki parça kesin ve bunları platin telden geçirin (bu işlemi kolaylaştırmak için platin teli düz tutun). Platin telin diğer ucunu diğer elektrik kablosuna lehimlemek için lehim tabancasını kullanın. Bu yeni lehimli parçayı kaplamak için yeni bir ısıyla daralan makaron kullanın.
  4. BD tb 1 mL şırınganın pistonunu çıkarın ve önceki adımlardan gelen telleri namludan geçirin. Platin, şırınga namlusunun ucundan dışarı çıkmalıdır. Açıkta kalan teller olmamalı ve küçük kauçuk boru platin teli en sonuna kadar örtmelidir.
  5. Bir tel sıyırıcı kullanarak, elektrik kablolarının diğer iki ucundan da az miktarda sıyırın. Bir lehim tabancası kullanarak, her kabloyu güvenli bir şekilde bağlanana kadar bir muz fişine lehimleyin.
  6. Telleri ve namluyu birbirine yapıştırmak için şırınga namlusunun üstünü ve tabanını yapıştırmak için epoksi yapıştırıcı kullanın; Bu, şırınganın içindeki tellerin gerilmesini önleyecek ve direncin daha uzun ömürlü olmasını sağlayacaktır. Tutkalın gece boyunca kürlenmesine izin verin.
  7. Bitmiş direnci DC güç kaynağına bağlayın.

6. Kayıt odasının inşası - (2 günlük iş akışı)

  1. Ek Dosya 3'ü takiben, siyah bir şim tabakası (kalınlık 0,0125 inç) lazerle kesin. Odanın ortasındaki açıklığın boyutu, sineklerin boyutuna uyacak şekilde değiştirilebilir (dosyadaki boyut genellikle dişilere ve erkeklere uyar).
  2. Odanın tabanı olarak işlev görecek bir cam mikroskop lamı alın. Reçine ve epoksiyi birlikte karıştırın. Siyah akrilik hazneyi alın ve epoksi yapıştırıcı kullanarak neodimyum 3 mm x 2 mm mıknatısları dört köşeye de yapıştırın. Her seferinde bir mıknatısın yapıştırılması ve yapıştırıcı bir ataş ile kürlenirken tutulması önerilir.
  3. Daha önce hazneye yapıştırılmış olan mıknatısların her birine iki yeni mıknatıs yerleştirin. Epoksi kullanarak, en son takılan mıknatısı bir cam slayta yapıştırın ve küratörlük yaparken yerinde tutmak için ataş kullanın.
    NOT: Yapıştırıcı küratörlüğünü yaptıktan sonra, hazne tamamlanır ve deneyler için haznenin yüksekliğini ayarlamak için daha fazla mıknatıs eklenebilir. Ek Dosya 4, Ek Dosya 5 ve Ek Dosya 6 , monte edilmiş kayıt odasını gösterir.

7. Anestezisiz in vivo diseksiyon protokolü - (5 - 7 dakikalık iş akışı)

  1. p200 pipet ucunu aspiratörden çıkarın. Aspiratörü şişeye yerleştirin ve p1000 pipet ucuna tek bir sinek aspire edin. p200 pipet ucunu tekrar aspiratöre takın. Aspiratörü hafifçe üfleyin ve hafifçe vurun, böylece sinek p200 pipet ucunun üst kısmında, baş üstü hareketsiz hale gelir.
  2. Diseksiyon odasını manipülatör tutucusuna yerleştirin. Vakumu sinek tutma borusuna bağlayın ve akış seviyesini gerektiği gibi ayarlayın (~ 500 mL / dak). Vakumu kolay ve hızlı bir şekilde bağlamak-bağlantısını kesmek için hızlı bir konektör kullanın (Şekil 1A).
  3. Mikroskoptan bakarken görüş alanında ortalamak için vakumlu metal boruyu hareket ettirin. Haznenin, sineği yapıştırmaya hazır olduğunda doğrudan metal borunun üzerine çıkacak şekilde doğru şekilde yerleştirildiğini onaylayın. Nazikçe, sineğin hortumunu vakum tutucuya aspire edin (Şekil 1A).
  4. Sinek doğru konuma geldiğinde, manipülatörü sineğin başı hazne açıklığı ile aynı hizada olacak şekilde hareket ettirin.
  5. DC güç kaynağını açın. Akım 0.40-0.50 Amper arasında ayarlanmalıdır. Daha yüksek akımlar, miristik asidin viskozitesinin çok düştüğü noktaya kadar erimesine neden olabilir ve bu da yapıştırıcının sineğin kafasına yayılma riskini artırır.
  6. Platin direncini kullanarak, erimiş miristik asit kullanarak gözlerin ve göğüs kafesinin kenarlarını hazneye yapıştırın (Şekil 1B). Başın kütikülüne yapıştırıcı bulaşmasını önlemek için, özellikle gözlerin kenarlarını yapıştırırken mümkün olduğunca az yapıştırıcı kullanın.
  7. Gözler ve göğüs kafesi yapıştırıldıktan sonra, vakum tüpünü ayırın ve kayıt odasını vakum tüpünden çıkarmak için manipülatörü kullanın. Hazneyi ters çevirin ve hortumu aşağıdan yapıştırmak için platin rezistansı kullanın (Şekil 1C). Gözleri alttan yapıştırmak isteğe bağlıdır ve diseksiyon sırasında sineğin yerinde kalmasına yardımcı olabilir, ancak gerekli değildir.
  8. Her şey yapıştırıldıktan sonra, DC güç kaynağını kapatın, odayı dik çevirin ve cam yan tabana takın. Makas kullanarak küçük bir bant parçası kesin ve sineğin başının tam önüne ve arkasına uygulayın (Şekil 1D).
  9. Hazneyi, kafa 90'da deneyciye bakacak şekilde çevirin. Bir diseksiyon iğnesi kullanarak, gözlerin kenarları boyunca dikey bir kesim yapın (Şekil 1E). Hazneyi yatay olarak yerleştirilecek şekilde çevirin. Diseksiyon iğnesini kullanarak kütikül boyunca kesin (Şekil 1E).
    NOT: Yeni oluşturulan kütikül "penceresinin" diseksiyon iğnesi kullanılarak kaldırılabildiğinden emin olun. Herhangi bir direnç göstermeden kalkarsa, diseksiyon iğnesini tekrar kapağına koyun. Işık kırılmasını önlemek için 13. ve 14. adımlarda tuzlu su kullanılmaz, bu da kesimler sırasında net bir görüşü engelleyebilir.
  10. Sineğin kafasına 100 μL salin ekleyin (Şekil 1F). Keskin forseps kullanarak pencereyi dikkatlice çıkarın (Şekil 1G). Keskin forsepsleri kullanarak, kalan yağ veya trakeayı dikkatlice çıkarın. Beyin şimdi görüntüleme için hazır olmalıdır (Şekil 1H-1J).

8. Caydırıcı koku alma koşullandırması yoluyla öğrenmeye bağlı plastisitenin görselleştirilmesi (20 dakikalık iş akışı)

  1. Bir lazer ve suya daldırma objektifi ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, hazırlanan sineği mikroskobun sahnesine yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, sineğin sağlıklı ve hareket ettiğinden emin olarak sineğe odaklanmak için makro lensli bir kamera kullanın.
  2. Bir mikromanipülatör kullanarak şok ızgarasının/koku pipetinin konumunu, sineğin şok ızgarasına oturması için ayarlayın.
    NOT: Şok ızgarası sadece bacaklara ve hafifçe karına dokunduğu için sinek hala serbestçe hareket edebilmelidir (sinek, geri çekilirse bacaklarını ve karnını ızgaradan çıkarabilmelidir). Koku verme pipeti sineğin antenine doğru yönlendirilmelidir.
  3. Kaba Z ayar düğmesini kullanarak beynin Z eksenini tarayın ve ilgilenilen beyin bölgesini bulun. Çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. Tarama frekansı istenen hıza ayarlanmalıdır - en az 2 Hz ile. Son olarak, kaydın süresini ayarlayın.
  4. Özel yapım veya ticari bir koku dağıtım sistemi kullanarak ilgilenilen nöronu kaydetmeye başlayın ve aynı anda bir "ön eğitim" koku iletimi başlatın (Şekil 2C). Kaydı 2 dk olarak ayarlayın. Eğitim öncesi koku sunumu, 5 sn ilk koku darbesine (CS-) verilen yanıtların kaydedilmesiyle başlar ve ardından 30 s'lik bir uyaranlar arası aralıkla 5 sn ikinci koku darbesine (CS+) verilir.
  5. Eğitim öncesi yanıtları topladıktan sonra, koku dağıtım sisteminde bir eğitim protokolü başlatmadan önce 5 dakika bekleyin. Bu örnekte, eğitim sırasında yalnızca CS+ sunulmuştur. CS+ kokusu, koku dağıtım sistemi tetiklendikten 30 saniye sonra başlatılan 1 dakika boyunca sunulur. Şok stimülatörü, koku sunulurken aynı anda 12, 90 V şok verecek şekilde programlanmıştır.
  6. Egzersizden sonra, egzersiz sonrası yanıtları almadan önce 5 dakika veya 15 dakika bekleyin. Egzersiz sonrası yanıtları, 6. adımda eğitim öncesi yanıtların kaydedildiği şekilde kaydedin. Sonraki görüntü analizi için tüm dosyaları uygun formatta kaydedin.

9. Görüntü analizi

  1. Kayıtları analiz etmek için, nöron alanının etrafına bir ilgi alanı (ROI) çizin. Bu, arka plan floresansının etkisini sınırlamak için mümkün olduğunca kesin olmalıdır.
  2. Kaydın her karesi için ROI içindeki ortalama floresan yoğunluğu verilerini çıkarmak için ölçüm aracını kullanın. Bu verileri CSV dosyası olarak dışa aktarın.
  3. Her koku izi için ΔF/Fo değerlerini hesaplamak için verileri MATLAB'da veya herhangi bir veri analiz programında açın. Ortalama ΔF/Fo genel bireysel uçuş kayıtlarını elde etmek için verileri birleştirin ve eğitim öncesi ve sonrası ortalama koku tepkisi izlerinin bir grafiğini oluşturun (Şekil 2E,F).

Sonuçlar

Burada, yetişkin Drosophila'nın anestezi olmadan in vivo görüntülemesi, iyi karakterize edilmiş bir Mantar Vücut Çıkışı nöronunda (MBON γ2α'1)12 plastisiteye neden olan caydırıcı koku alma koşullanmasını araştırmak için kullanılır. Kalsiyum indikatörü GCaMP6f2, kırmızı floresan proteini TdTom ile birlikte, dendritleri MB γ ve α' loblarının bölmesini innerve eden ve genetik olarak bölünmüş Gal4 hattı MB077C34 kullanılarak MBON γ2α'1'i hedefleyen bir MB çıkış nöronunda eksprese edilir (Şekil 2A,B).

Caydırıcı koku alma koşullandırması sonrası plastisiteyi gözlemlemek için, sinek, karnı ve bacakları şok ızgarasının ortasına hizalanmış ve koku verme pipeti sineğin antenine doğru bakacak şekilde konfokal mikroskobun altına yerleştirilir. İlk olarak, kalsiyum kokusu tepkileri 5 s'lik bir 4-metil sikloheksanol (MCH) darbesine ve ardından 30 s'lik bir uyaranlar arası aralıkla ayrılmış 5 s'lik bir 3-oktanol (OCT) darbesine kaydedildi. Beş dakika sonra, sinekler, 12, 90 V şoklarla birlikte 1 dakikalık bir OCT (CS+) darbesinin eşzamanlı sunumu ile eğitildi. Bu çağrışımsal koşullandırma programı, sağlam davranışsal caydırıcı bellek üretir. Son olarak, kondisyondan 5 dakika ve 15 dakika sonra, MCH ve OCT'ye kalsiyum yanıtları antrenman öncesi olarak kaydedildi. MBON γ2α'1, koşullandırmadan önce hem MCH hem de OCT'ye kalsiyum geçişleri ile sağlam bir şekilde yanıt verir (Şekil 2D-F). Bununla birlikte, önceki bulgularlaeşleşen 12, 5 dakika sonra CS+'ya (OCT) koşullandırma sonrası kalsiyum yanıtları tamamen baskılanmıştır (Şekil 2D-F). Ek olarak, CS-'ye (MCH) verilen yanıtlar önemli ölçüde güçlendirildi. Eğitimden on beş dakika sonra, CS+'ya kalsiyum yanıtı önemli ölçüde baskılandığı ve CS- güçlendiği için benzer sonuçlar gösterdi. Bu sonuçlar, her iki kokuda gözlenen hafıza izinin en az 15 dakika sürdüğünü göstermektedir (Şekil 2D-F). Bu tepkiler, 5 s'lik nabız sırasındaki ortalama koku tepkisi kullanılarak ölçüldü ve sinek içinde karşılaştırıldı. Koku tepkilerindeki bu değişiklikler, GCaMP6 floresan öncesi ve sonrası caydırıcı eğitimdeki değişikliğin sahte renkli bir temsili ile de görselleştirilebilir (Şekil 2E). Buna karşılık, hazırlık sırasında sineğin uyuşturulması, hem CS + hem de CS-'ye indirgenmiş plastisite gösterir. Anestezi uygulanmış hayvanlarda sadece CS+'ya kısmi depresyon gözlenir, çünkü eğitim sonrası tepkiler hala mevcuttur. Ek olarak, CS- yanıtları eğitimden sonra önemli ölçüde farklı değildir (Şekil 2G, H). Bunu daha iyi gözlemlemek için, indüklenen plastisiteyi CS+/CS- oranı olarak hesapladık ve anestezi uygulanmamış sineklerin anestezi uygulanmış hayvanlara kıyasla önemli ölçüde artmış plastisite gösterdiğini gösterdik (Şekil 2I). Bu temsili sonuçlar, bu protokolün mikroskop altında öğrenme ve hafızayı incelemek için uygun olduğunu ve nöronlardan görüntüleme sırasında sineğin sağlığını uzun süre sağladığını göstermektedir. Bu protokol yeterince çok yönlüdür ve diğer in vivo görüntüleme türlerine ve diğer ilgilenilen nöronlara uygulanabilir.

figure-results-1
Şekil 1: Anestezi kullanılmadan Drosophila'nın in vivo görüntüleme hazırlığı. (A) Üst panel: Aspiratör hazırlığında yer alan adımları gösteren diyagram. Alt panel: Sinek konumlandırma sırasında bir mikromanipülatörde tutulan odayı gösteren diyagram. Sineğin hortumu, bir aspiratör kullanılarak 500 mL/dk'da bir vakuma bağlı metal borunun açıklığına yerleştirilir. Hazne daha sonra sineğin üzerine yerleştirilir. (B) Gözlerin ve göğsün kenarları, özel yapım bir platin direnç kullanılarak miristik asit ile yapıştırılır. (C) Sineğin hortumu metal borudan çıkarılır ve hortumun yerine yapıştırılmasına izin vermek için hazne ters çevrilir, böylece kayıtlar sırasında hareket en aza indirilir. (D) Hazne bir cam sürgü tabanına tutturulmuştur. Salinin sızmasını önlemek için odanın üst kısmına, antenleri kaplayan ve arka tarafa bant uygulanır. (E) Kütikül boyunca bileşik gözlerin yakınında iki dikey kesi yapılır, ardından göğüsün yakınındaki kütikül boyunca üçüncü bir kesi yapılır ve beyne bir "pencere" oluşturulur. (F) 100-200 μL arasında salin, kesilen yerde sineğin başına eklenir. (G) Kütikül penceresi, beyni açığa çıkarmak için keskin, ince forseps kullanılarak kaldırılır, çekilir ve çıkarılır. (H) Beyin hücrelerinin mikroskop altında net bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için yağ ve trakeal doku çıkarılır. (I) Hazırlanan sinek mikroskobun altına yerleştirilir ve gövdesi şok ızgarasının üzerine hizalanacak şekilde konumlandırılır. (J) MBON γ2α′1'in ifade modelini gösteren sahte renkli görüntü. İlgilenilen bölge, dendritik çardağı çevreleyen kesikli bir çizgi ile özetlenmiştir. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Caydırıcı koku alma koşullanmasını takiben MBON γ2α'1'de öğrenmeye bağlı plastisite. (A) MB077C-splitGal4 sürücüsünün GCaMP'yi ifade eden ifade modeli. Beyinler diseke edildi ve anti-GFP ile boyandı ve anti-nc82 ile karşı boyandı. Ölçek çubuğu: 50 μm. (B) MBON γ2α′1'in hücre gövdesini, uzatma sürecini ve dendritik çardağı vurgulayan sahte renkli görüntüsü. Dendritik bölge, kalsiyum yanıtlarının toplandığı alanı temsil eder. Ölçek çubuğu: 50 μm. (C) Caydırıcı eğitim protokolünün şeması. Sinekler, aralarında 30 s temiz hava ile 5 sn MCH ve OCT darbelerine maruz bırakıldı. 5 dakikalık bir aradan sonra, sinekler OCT'yi on iki adet 90 V elektrik şoku ile ilişkilendirmek için eğitildi. MCH ve OCT'ye kalsiyum yanıtlarının kayıtları antrenmandan 5 dakika ve 15 dakika sonra yapıldı. (D) MCH (üst panel) ve OCT'ye (alt panel) yönelik koku tepkisi izleri, eğitim öncesi ve eğitim sonrası 5 dakika ve 15 dakika sonra gösterilir. Kalın siyah çubuklar koku sunumunun zamanlamasını gösterir. (E) Hem MCH hem de OCT'ye yanıt olarak MBON γ2α'1 antrenman öncesi ve antrenman sonrası 5 dk ve 15 dk sonrası dendritik çardak görüntüleri. CS- (MCH) için floresan güçlenmesi gözlenirken, CS+ (OCT) için floresan kaldırılmıştır. Ölçek çubuğu: 20 μm. (F) MCH'ye ortalama koku tepkisi, antrenmandan 5 dakika ve 15 dakika sonra önemli ölçüde güçlenirken, OCT'ye (CS+) verilen yanıtlar önemli ölçüde bastırılır. Parametrik olmayan Wilcoxon eşleştirilmiş testi, N = 12. (G) Anestezi uygulanmış sinekler için antrenman öncesi ve 5 dakika sonrası MCH (üst panel) ve OCT'ye (alt panel) koku tepkisi izleri gösterilir. Kalın siyah çubuklar koku iletimini gösterir. (H) Anestezi uygulanmış hayvanlarda, MCH'ye ortalama koku tepkileri, eğitim sonrası önemli bir güçlenme göstermez ve OCT'ye verilen yanıtlar, anestezi uygulanmamış hayvanlara kıyasla sadece kısmi baskılanma gösterir. (I) CS+/CS- oranı olarak hesaplanan eğitime bağlı plastisite, anestezi uygulanmadan hazırlananlara kıyasla anestezi uygulanmış sineklerde önemli ölçüde daha düşüktür. Parametrik olmayan Wilcoxon eşleştirilmiş testi, N = 8-12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Grid_holder (STL). Elektrik şebekesini tutmak için kullanılan özel olarak tasarlanmış bileşenin STL dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Grid_holder (OBJ). Elektrik şebekesini tutmak için kullanılan özel olarak tasarlanmış bileşenin OBJ dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Chamber_LaserCut. Hem erkek hem de dişi sinekler için kayıt odalarının üst bileşenini lazerle kesmek için kullanılan Adobe Illustrator dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Recording_chamber (STL). Özel olarak tasarlanmış kayıt odasının STL dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: Recording_chamber (OBJ). Özel olarak tasarlanmış kayıt odasının OBJ dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 6: Recording_chamber_animation. Monte edilmiş kayıt odasının animasyonunu gösteren MP4 videosu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Öğrenme ve hafızanın arkasındaki sinirsel devreyi anlamak, sinirbilim alanında merkezi bir amaçtır. Drosophila'da bulunan genetik araç seti, davranışsal testlerin basitliği ve çok yönlülüğü ile birleştiğinde, onu bu süreçleri incelemek için ideal bir model organizma haline getirir. Çeşitli laboratuvarlardan yayınlanan çalışmalar, anestezi kullanılmadan fonksiyonel görüntüleme için sineklerin hazırlanması için farklı protokoller tanımlamıştır44,45. Bununla birlikte, bu protokoller büyük ölçüde değişir ve genellikle bunların nasıl oluşturulacağı veya kullanılacağı konusunda sınırlı rehberliğe sahip son derece uzmanlaşmış, özel yapım araçlara dayanır. Bu protokolde, genel anestezinin kafa karıştırıcı etkilerinden kaçınan sineklerde in vivo fonksiyonel görüntüleme için bir yöntem sunulmaktadır. Ayrıca, bu yaklaşım, aynı sinek içindeki gerçek zamanlı nöronal aktivitenin yakalanmasına izin vererek, çeşitli uyaranlara maruz kalmadan önce ve sonra nöral tepkilerin doğrudan karşılaştırılmasını sağlar.

Bu protokolü tamamlarken, kritik adımlar, sineğin hortumunun vakum tüpüne düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden emin olmayı içerir. Bu adım, sonraki yapıştırmanın doğru noktalarda gerçekleşmesini sağlar ve ilgilenilen nöronları görselleştirmek için kafanın doğru açıda olduğundan emin olur. Sinek sağlığını korumak için minimum tutkal uygulaması şarttır; Sineği yerinde sabitlemek için gereken en küçük miktarı kullanmak idealdir. Bu protokol ayrıca, tüm vücudun serbest kalması için gözlerin yalnızca yanlarının yapıştırılması gibi belirli ihtiyaçları karşılamak için bazı modifikasyonlara da izin verir. Benzer şekilde, zil perfüzyonunu veya ilaç dağıtımını kolaylaştırmak için kayıt odasının üstüne bir perfüzyon odası takılabilir. Son olarak, daha önce bildirildiği gibi sineğin altına dönen bir yüzer koşu bandı yerleştirilebilir ve bu da hareket yönlülüğünün46,47 analizine olanak tanır.

Bu protokolün, sinekleri canlı görüntülemeye hazırlamak için mikrocerrahi sırasında sineklerin maruz kaldığı stres de dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Küçük sinekleri tutmak, yapıştırıcıyı idareli bir şekilde uygulamak ve herhangi bir beyin dokusuna veya vücuda zarar vermeden kafa kapsülünü dikkatlice açmak, ancak titiz uygulama ve tekrarlama yoluyla elde edilebilecek önemli bir uzmanlık gerektirir. Bu yöntem, hücresel düzeyde bilişsel süreçleri incelemek için özellikle faydalı olsa da, in vivo görüntülemenin elektrofizyolojik kayıtlarla karşılaştırıldığında hala bazı sınırlamaları vardır. Ek olarak, protokolümüz görüntülemeden önce anestezi kullanımından kaçınırken, sinek hala hücresel tepkileri her zaman değiştirebilen fiziksel bir odayla sınırlıdır. Bununla birlikte, metodolojimiz, optimum in vivo görüntüleme için sineğin sağlığını korumanın en yakın yolunu sağlar. Anestezi kullanan ve sineği kısıtlayan mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, yöntemimiz, minimum hareketle hücrelerden görüntü alırken sineği mümkün olduğunca serbest hareket ettirmeyi amaçlamaktadır.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, 1R01GM147917-01A1 için Ulusal Genel Tıp Bilimi Enstitüsü ve 30442 için Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.102 mm Platin telSurepure Chemetals2690
0.25 OD, 0.125 ID, platinle kürlenmiş silikon boruVWR89068-474
0.3 mm ID Silikon boru Fisher Scientific11-189-14
Muz fişleriHassas
Marka44250
Kalsiyum KlorürSigma-Aldrich746495
Bakır şok ızgarasıiçin özel yapılmış
DC güç kaynağıFisher ScientificS35740
Dremel aleti 3000-1Dremel3000-N/18
Drosophila melanogaster / ;; uas-tdtomBDSC36328
Drosophila melanogaster / ; uas-gcamp6f;BDSC42747Bu uas hattı ;; uas-td-tom her iki eki de içeren bir stok oluşturmak için
Drosophila melanogaster/ ;; MB077C-gal4BDSC68287
Epoksi yapıştırıcı Gorilla4200102
Gaz akış ölçer 1.5 LPMAmazonB01N0UWZ2T
Cam 1 mL serolojik pipet Fisher Scientific50-232-9516
Cam KaydıraklarFisher Scientific 12-550-A3
GlikozSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH4034
Hipodermik 12TW ölçer boruMikro grup316H12TW
Hipodermik 22X ölçer boruMikro grup304H22X
Magnezyum Klorür HeksahidratSigma-AldrichM9272
Miristik AsitAcros Organics156961000
Neodimyum Mıknatıslar 3X2 mmAmazonB0CXSQ387M
P1000 uçlarıGenesee Scientific 23-165RL
P200 ipuçlarıGenesee Scientific 23-150RL
Pnömatik itme konektörü 6mm ODAmazonB07ZHG8Y1Y
Potasyum KlorürSigma-AldrichP3911
PTFE boru 6mm ODAmazon
Tıraş Bıçağı ve nbsp;AmazonB08LYD6645
Sodyum BikarbonatSigma-AldrichS5761
Sodyum KlorürFisher ScientificS271-500
Sodyum Fosfat DibazikSigma-AldrichS0876
SükrozSigma-AldrichS9378
TrehalozSigma-AldrichT0167
DC güç kaynağı Platin direnç için özel yapılmış

Kaynaklar

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  2. Chen, T. W., Wardill, T. J., Sun, Y., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  3. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Akerboom, J., Chen, T. W., Wardill, T. J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  5. Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  6. Sun, F., Zeng, J., Jing, M., et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  7. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  8. Wang, L., Wu, C., Peng, W., et al. A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging. Nat Commun. 13 (1), 5363(2022).
  9. Jing, M., Zhang, P., Wang, G., et al. A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies. Nat Biotechnol. 36 (8), 723-737 (2018).
  10. Yu, D., Akalal, D. B. G. B., Davis, R. L. Drosophila alpha/beta mushroom body neurons form a branch-specific, long-term cellular memory trace after spaced olfactory conditioning. Neuron. 52 (5), 845-855 (2006).
  11. Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic plasticity underlies aversive olfactory learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
  12. Berry, J. A., Phan, A., Davis, R. L. Dopamine neurons mediate learning and forgetting through bidirectional modulation of a memory trace. Cell Rep. 25 (3), 651-662 (2018).
  13. Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L., Berry, J. A. Rac1 impairs forgetting-induced cellular plasticity in mushroom body output neurons. Front Cell Neurosci. 14, 258(2020).
  14. Martinez-Cervantes, J., Shah, P., Phan, A., Cervantes-Sandoval, I. High order unimodal olfactory sensory preconditioning in Drosophila. Elife. 11, 79107(2022).
  15. Faber, T., Joerges, J., Menzel, R. Associative learning modifies neural representations of odors in the insect brain. Nat Neurosci. 2 (1), 74-78 (1999).
  16. Yu, D., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Davis, R. L. Detection of calcium transients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo reporters. J Neurosci. 23 (1), 64-72 (2003).
  17. Yu, D., Keene, A. C., Srivatsan, A., Waddell, S., Davis, R. L. Drosophila DPM neurons form a delayed and branch-specific memory trace after olfactory classical conditioning. Cell. 123 (5), 945-957 (2005).
  18. Yu, D., Ponomarev, A., Davis, R. L. Altered representation of the spatial code for odors after olfactory classical conditioning: Memory trace formation by synaptic recruitment. Neuron. 42 (3), 437-449 (2004).
  19. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophilamelanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  20. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (3), 708-712 (1974).
  21. Quinn, W. G., Dudai, Y. Memory phases in Drosophila. Nature. 262 (5569), 576-577 (1976).
  22. Tempel, B. L., Bonini, N., Dawson, D. R., Quinn, W. G. Reward learning in normal and mutant Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (5), 1482-1486 (1983).
  23. Turner, G. C., Bazhenov, M., Laurent, G. Olfactory representations by Drosophila mushroom body neurons. J Neurophysiol. 99 (2), 734-746 (2008).
  24. de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1979).
  25. Schwaerzel, M., Monastirioti, M., Scholz, H., Friggi-Grelin, F., Birman, S., Heisenberg, M. Dopamine and octopamine differentiate between aversive and appetitive olfactory memories in Drosophila. J Neurosci. 23 (33), 10495-10502 (2003).
  26. Kim, Y. C., Lee, H. G., Han, K. A. D1 dopamine receptor dDA1 is required in the mushroom body neurons for aversive and appetitive learning in Drosophila. J Neurosci. 27 (29), 7640-7647 (2007).
  27. Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Curr Biol. 15 (21), 1953-1960 (2005).
  28. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: Anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3 (5), 1-17 (2009).
  29. Liu, C., Plaçais, P. Y., Yamagata, N., et al. A subset of dopamine neurons signals reward for odour memory in Drosophila. Nature. 488 (7412), 512-516 (2012).
  30. Burke, C. J., Huetteroth, W., Owald, D., et al. Layered reward signaling through octopamine and dopamine in Drosophila. Nature. 492 (7429), 433-437 (2012).
  31. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  32. Gervasi, N., Tchenio, P., Preat, T. PKA dynamics in a Drosophila learning center: Coincidence detection by rutabaga adenylyl cyclase and spatial regulation by dunce phosphodiesterase. Neuron. 65 (4), 516-529 (2010).
  33. Séjourné, J., Plaçais, P. Y., Aso, Y., et al. Mushroom body efferent neurons responsible for aversive olfactory memory retrieval in Drosophila. Nat Neurosci. 14 (7), 903-910 (2011).
  34. Aso, Y., Sitaraman, D., Ichinose, T., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, 04580(2014).
  35. Pai, T. P., Chen, C. C., Lin, H. H., et al. Drosophila ORB protein in two mushroom body output neurons is necessary for long-term memory formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7898-7903 (2013).
  36. Owald, D., Felsenberg, J., Talbot, C. B., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
  37. Perisse, E., Owald, D., Barnstedt, O., Talbot, C. B., Huetteroth, W., Waddell, S. Aversive learning and appetitive motivation toggle feed-forward inhibition in the Drosophila mushroom body. Neuron. 90 (5), 1086-1099 (2016).
  38. Aso, Y., Rubin, G. M. Dopaminergic neurons write and update memories with cell-type-specific rules. Elife. 5, 16135(2016).
  39. Hige, T., Aso, Y., Rubin, G. M., Turner, G. C. Plasticity-driven individualization of olfactory coding in mushroom body output neurons. Nature. 526 (7572), 258-262 (2015).
  40. MacMillan, H. A., Nørgård, M., MacLean, H. J., Overgaard, J., Williams, C. J. A critical test of Drosophila anaesthetics: Isoflurane and sevoflurane are benign alternatives to cold and CO2. J Insect Physiol. 101, 97-106 (2017).
  41. Margulies, C., Tully, T., Dubnau, J. Deconstructing memory in Drosophila. Curr Biol. 15 (17), R700-R713 (2005).
  42. Amiri, A., Karvandian, K., Ramezani, N., Amiri, A. Short-term memory impairment in patients undergoing general anesthesia and its contributing factors. Saudi J Anaesth. 14 (4), 454-458 (2020).
  43. Wang, R., Zhang, L., Wang, X., et al. Electrophysiological activity pattern of mouse hippocampal CA1 and dentate gyrus under isoflurane anesthesia. Front Cell Neurosci. , 18(2024).
  44. Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. Sleep facilitates memory by blocking dopamine neuron-mediated forgetting. Cell. 161, 1656-1667 (2015).
  45. Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Sci Rep. 10, 1-15 (2020).
  46. Moore, R. J. D., et al. FicTrac: A visual method for tracking spherical motion and generating fictive animal paths. J Neurosci Methods. 225, 106-119 (2014).
  47. Seelig, J. D., Chiappe, M. E., Lott, G. K., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Fonksiyonel GörüntülemeBellek UnutmasıKonfokal MikroskopiKalsiyum GörüntülemeMantar CisimUyanık Sinek HazırlığıSinaptik Plastisite
In vivo (İn canlı) Anestezi Uygulanmamış Drosophila Yetişkin Sineklerde Nöral Aktivitenin Görüntülenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.