Yöntem makalesi

Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı: Hepatik İntravital Mikroskopi İçin Yeniden Kullanılabilir 3D Baskılı Bir Araç

DOI:

10.3791/68337

⸱

17 Mart 2026

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, canlı farelerin intravital mikroskopisi (IVM) için hızlı ve akut deneyler için doku stabilitesini artıran son teknoloji ve Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı (RHIT) sunmaktadır. RHIT'in 3D baskılı tasarımı, maliyet etkin üretim, ölçeklenebilirlik ve çok yönlülük sunar; böylece farklı boyuttaki farelerde metabolik süreçlerin uzun süreli gözlemlenmesini mümkün kılar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatik fonksiyon ve disfonksiyon, karaciğerin dinamik süreçlerinin doğrudan görselleştirilmesiyle konfokal tabanlı intravital mikroskopi (IVM) kullanılarak değerlendirilebilir. Özellikle, hem nitel hem de nicel bilgilerin çıkarımında mükemmel mekânsal ve zamansal hassasiyet elde edilebilir. Mikroskop aşamasında, fizyolojik doku koşullarını koruyarak stabilite ve tekrarlanabilirlik sağlamak hâlâ zordur. Artan kilo ve karaciğer lipid içeriği, Tip II diyabet (T2D) ve alkol olmayan yağlı karaciğer hastalığı (MAFLD) hayvan modellerinde bu süreç üzerinde olumsuz bir etkiye sahiptir. Bu kısıtlamaları aşmak için, doku erişimini ve stabilitesini iyileştiren devrimci bir görüntüleme cihazı tasarımı olan RHIT'i yarattık. RHIT, 3D baskı kullanılarak verimli tek adımlı bir yöntemle üretilen, yeniden kullanılabilir, ölçeklenebilir bir hepatik görüntüleme cihazıdır. Boyutları, farklı boyuttaki farelere uyacak şekilde değiştirilebilir. Kısaca, RHIT, intravital karaciğer mikroskopisi sırasında laboratuvar hayvanlarını konumlandırmak ve stabilize etmek için 3D baskılı bir cihazdır ve kısa cerrahi hazırlıktan sonra kullanımı, stresi ve değişkenliği en aza indirmek için kullanılır. Yeniden kullanılabilir, standartlaştırılmış tasarımı kolayca üretilip özelleştirilir; çeşitli boyutlar ve potansiyel deneysel tasarımları destekler. İlk sonuçlar, karaciğer içi vital görüntülemenin stabilitesi ve güvenilirliğinde belirgin bir iyileşme göstermekte; bu da lipid damlacıkları gibi subhücre yapılarının ayrıntılı görselleştirilmesini mümkün kılmaktadır. Bu gelişmiş hassasiyet, daha fazla netlik, tekrarlanabilirlik ve uzunlamasına tasarımlar için daha fazla potansiyelle metabolik ve fizyolojik çalışmaları kolaylaştırır. Protokol, hepatik IVM'de uzun süredir devam eden teknik zorlukları ele alan standartlaştırılmış ve erişilebilir bir yaklaşım sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İntravital mikroskopi, sabit doku veya canlı hücre görüntüleme ile izole edilmiş hücrelerin akış sitometrisi analiziyle geleneksel immünofluoresans histolojisinin aksine, in vivo süreçleri dinamikolarak 1,2,3 görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Karaciğer muayenesi için IVM, safra salgılanmasıve akışı 4,5, glukozmobilizasyonu 6,7, nonparenkimal hücreler 8,9,10 ve karaciğer hastalıkları 11,12 incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, lipid birikimi araştırmaları açısından IVM, canlı dokularda lipid damlacıklarının oluşumu, büyümesi ve bozulma dinamikleri hakkında gerçek zamanlı bilgi sağlar; örneğin, lipid damlalarının yüksek mekansal çözünürlükte görselleştirilmesi ve nicelendirilmesi, ayrıca lipid damlacıklarının birikiminin diğer hücresel ve fizyolojik süreçlerle doğrudan ilişkisi için13. Bu avantajlara rağmen, IVM teknik olarak hâlâ zordur: özel ekipman ve uzmanlık gerektirir, doku hasarına yol açabilir, hücresel davranışı değiştirebilir ve invaziv işlemler gerektirebilir. Davranışsal gözlem, fizyolojik izleme ve genetik analizlere dayanan geleneksel in vivo çalışmaları değerli bilgiler sağlar ancak intravital mikroskopinin sunduğu mekansal ve zamansal çözünürlükten yoksundur.

IVM ile ilgili ilk büyük zorluk, incelenen hayvanın kalp atışı ve solunumunun neden olduğu artefaktların istikrarsızlığını kontrol etmektir; bu durum, görüntü kalitesini zedeleyebiliyor ve gözlemlenen biyolojik süreçlerin gizlenmiş veya çarpıtılmış görüntülerine yolaçabiliyor. Bunu görüntü işlemeyle düzeltmeye yönelik girişimler genellikle önemli mekânsal ve zamansal bilgilerin kaybolmasına veya gelişmiş cerrahi ekipman ve bakım gerektirmesineyol açar 16,17. İkinci olarak, karaciğer hastalığı çalışmaları için kullanılan fare modelleri, örneğin MAFLD ve T2D, genellikle obez olup, artan boyutları ve doku lipid içeriği nedeniyle stabilize edilmesi dahazordur 16,18. Obez NAFLD ve T2D fare modellerinde, artan vücut kütlesi, standart mikroskop aşamalarının yük kapasitesini aşarak ve hayvan stabilizasyonunu zorlaştırarak intravital görüntüleme için mekanik zorluklar oluşturur19. Bu ek ağırlık, hareket artefaktları ve doku sıkıştırma riskini artırır; bu da görüntühassasiyetini 20 azaltır.

Aynı zamanda, yüksek hepatik lipid içeriği doku opaklığını ve ışık saçılmasını artırır, bu da görüntü çözünürlüğünü ve kontrastını düşürür. Bu etkiler genellikle değişen perfüzyon ve iltihap gibi metabolik eşlik hastalıklarla daha da artarak boya dağılımını ve sinyal netliğini daha da azaltır21. Son olarak, görüntüleme boyunca sabit vücut sıcaklığını korumak zor olabilir ve tekrarlanabilirliği bozabilir; böylece doku fizyolojisi ve biyolojik aktiviteler sürdürülür. Ayrıca, IVM sırasında karaciğerin mikroskop aşamasında stabil konumlanması, mekanik stres veya doku hasarını önlemek için çok önemlidir7. Karaciğer dokusunun açığa çıkması, şiddetli kanamayı ve karaciğer parankima hasarını önlemek için teknik hassasiyet gerektiren hassas birişlemdir 7. Hareket artefaktlarını azaltmak için, farenin kaburga kafesi daha önce karton kullanılarak mikroskop aşamasından kaldırılarak yerçekimi karaciğeri vücudun geri kalanındanuzaklaştırıyordu 22. Bu yaklaşımın ölçülebilir veri üretmede başarılı olduğu kanıtlanmış olsa da, karton malzeme şeklini kaybettiği ve temizlemesi zor olduğu için sürdürülemez değildir. Ayrıca, obez fare modellerine uygun olarak karton insertin boyutlarını değiştirmek zordur.

Son yıllarda, taramalı ışık alanı mikroskobu ve hesaplamalı olarak geliştirilmiş optik sistemler gibi birkaç gelişmiş hepatik intravital mikroskopi tekniği ortaya çıkmıştır; bunlar mekansal zamanlamaçözünürlüğünde (23), azaltılmışfototoksisitede (24), görüntüleme derinliğindedaha yüksek (25,26) ve hareket artefaktbaskılamasında (27) iyileşmeler göstermiştir. Bu gelişmeler, sonçalışmalarda gösterildiği gibi 28,29,30 alanda önemli teknolojik ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu makale, fare karaciğerinin IVM'i için yenilikçi bir araç olan Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı'nı (RHIT) sunmaktadır. RHIT, metabolik hastalığı olanlar da dahil olmak üzere çeşitli hayvan modellerinde mekanik stabiliteyi ve doku erişilebilirliğini artıran ölçeklenebilir ve yeniden kullanılabilir bir araç sunarak bu gelişen manzaraya katkıda bulunuyor. Tasarımı, hareket, değişkenlik ve kurulum karmaşıklığı gibi kalıcı zorlukları anatomik uyum, sahne tekrarlanabilirliği ve kullanım kolaylığı ile ele alır. RHIT'in hem geleneksel hem de gelişmiş görüntüleme yöntemleriyle uyumluluğu, bu yeni tekniklerin faydasını artırır ve güvenilir ve fizyolojik olarak stabil intravital karaciğer görüntülemesini teşvik eder.

IVM sırasında dokuyu stabilize etmek için cerrahipencere 9,31,32,33,34,35,36 ve özel montaj akrilik aşama 6,37 gibi çeşitli yöntemler önerilse de, bu yöntemler ölçeklenebilirlik, tekrarlanabilirlik ve cerrahi beceriler açısından birçok sınırlama ve karmaşıklık da getirir. Karşılaştırıldığında, RHIT işlevsel olarak amacı ve tasarımı açısından farklıdır. Doğrudan sıkıştırmaya veya jel tabanlı gömme38'e dayanmaz. Bunun yerine, RHIT, karaciğer izolasyonunu yerçekimi pozisyonuyla destekleyen ölçeklenebilir, yeniden kullanılabilir, anatomik olarak şekillendirilmiş bir araç olarak hizmet eder; fizyolojik yönelimi kısıtlamadan veya çarpıtmadan korur. Önemli olarak, RHIT çok çeşitli fare boyutlarında veri tekrarlanabilirliğini, görüntüleme doğruluğunu ve prosedürel tutarlılığı artırır. Jel, yapıştırıcı veya karmaşık cerrahi arayüzlere olan ihtiyacı ortadan kaldırırken, doku hizalanması ve sıcaklık kontrolünü basitleştirir. Ayrıca, RHIT, hayvan ile mikroskop arasındaki arayüzü birleştiren özel bir araçtır ve hem fizyolojik destek hem de görüntüleme hassasiyeti için tasarlanmıştır.

RHIT, ölçeklenebilir geometrisiyle metabolik olarak zayıf modellerin mekanik ve optik zorluklarını doğrudan ele alır; bu geometri, daha büyük hayvan boyutlarını kabul ederken ağırlığı eşit şekilde dağıtarak platform istikrarsızlığını en aza indirir. Geri çekilmiş karaciğer açıklığı, dokuyu baskı kuvveti olmadan yerçekimi kullanarak stabilize eder, böylece tutarlı erişim sağlanır ve görüntüleme sırasında hareketi azaltır. Yeniden kullanılabilir, kimyasal olarak hareketsiz tasarımı, biyolojik dokularla uyumluluğu sağlarken hijyenik yeniden kullanımı destekler. Tutarlı konumlandırmayı mümkün kılarak, hareket artefaktlarını en aza indirerek ve doku bütünlüğünü koruyarak, RHIT intravital mikroskopi iş akışlarında temel bir ilerleme sağlar. Uyumlanabilirliği ve açık kaynak erişilebilirliği, laboratuvarlar ve hayvan modelleri arasında geniş bir kullanım alanını teşvik ederek hem örneği hem de görüntüleme sistemini destekleyen görüntüleme araçları için yeni bir standart oluşturuyor.

Ayrıca, ticari olarak bulunan ısıtmalı mikroskop aşamaları gelişmiş mikroskop kurulumları ve39 kullanımına ihtiyaç duyabilir. Numuneye ölçeklenebilir değiller ve genellikle daha pahalıdırlar, bu da birçok araştırmacı için erişimlerini daha az hale getirir. Bu nedenle, farklı hayvan modelleri için IVM'yi standartlaştırmak için yeniden kullanılabilir ölçeklenebilir bir ekleme önemlidir. 3D baskı teknolojisi, diğer adıyla ek üretim olarak da adlandırılır, bilimsellaboratuvarlarda giderek daha popüler hale gelerek biyokimya, fizik ve biyoloji laboratuvar protokollerini dönüştürüyor. IVM için, 3D teknolojisi hafif görüntüleme optikpencereleri (41,42), doku erişimini iyileştirmekve doku onarımı ile yenidenyapılandırmayı kolaylaştırmak için kullanılmıştır 44. Bu nedenle, bildiğimiz kadarıyla tanımlanmamış olan doku stabilizasyonu için özel bir araç, hepatik IVM'nin bazı zorluklarını aşmak için 3D baskıyı kullanmak için mükemmel bir fırsat sunuyor.

RHIT, tek aşamalı 3D baskı yöntemiyle oluşturulur ve uzun süre doku stabilizasyonunu önemli ölçüde iyileştirir. RHIT, son derece erişilebilir olup minimal cerrahi uzmanlık gerektiren akut IVM deneyleri için uygundur. Ayrıca, RHIT hayvan boyutuna kolayca ölçeklenebilir ve düşük üretim maliyetine sahiptir. Son olarak, RHIT'in daha önce kullanılan karton inserte kıyasla stabil zaman geçişli floresan görüntüleme sağladığını ve doku kararlılığını artırdığını gösteriyoruz. RHIT, karaciğer lipid homeostazının IVM'ini doğrudan temas veya fizyolojik koşullar üzerinde ölçülebilir bir etki olmadan basitleştirir. Sonuç olarak, RHIT IVM34,36,45'e hızlandırılmış, yeniden kullanılabilir ve uyarlanabilir bir katkı olarak rekabet avantajı sunar.

figure-introduction-1
Şekil 1: RHIT tasarımı. (A) Obez bir fareye göre ölçeklendirilmiş 3.0 mm RHIT'in tasarımı ve boyutları. Yüz görünümü (solda) doku açıklığının boyutlarını, konumunu ve boyutunu, ayrıca görüntüleme sırasında farenin yönümünü gösterir. Yan görünüm (sağda) boyutları içerir ve ısı pedi ile sıcaklık probu insertinin konumunu gösterir. Farklı fare boyutları için ölçeklendirme parametreleri Tablo 1'de verilmiştir. (B) Açık kaynak STL dosyasından oluşturulan RHIT'in 3D yüzey görünümü, rektal prob telinin özel porttan nereye takıldığını gösterir (sağ üstte gösterilen rektal prob ekleme boyutları gösterilmiştir). (C) RHIT'in teknik montajı, ısıtma cihazı ile farklı RHIT boyutları için özel yapısal eklemelerin entegrasyonunu gösterir; tel, sıcaklık probuna erişim için rektal prob insertine takılır. Kısaltma: RHIT = Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

RHIT, başlangıçta ABS (Akrilonitril Butadien Stiren) kullanılarak tek parçalı bir montaj olarak tasarlandı; bu, füzelenmiş biriktirme modellemesinde yaygın kullanılan termoplastik polimerdir ve 3Dbaskı 45. ABS bu uygulama için birkaç avantaj sunar: hafif, ısıya dayanıklıdır (erime noktası ~200 °C) ve iyi darbedirencine sahiptir (46,47,48). RHIT'in tasarımı, ABS'nin ayarlanabilir yoğunluğundan faydalanarak kalp atışı ve solunum gibi fizyolojik hareketleri emmesini sağlar. Artan dolgu yoğunluğu hareket sönümünü artırır, bu da görüntü kararlılığını artırır ve görüntü kalitesini artırır.

RHIT, ABS gibi kimyasal olarak inert bir malzemenin yoğunluğuna yapılan ayarlamalarla hareketi emmek üzere tasarlanmıştır. Bu bağlamda, yoğunluk özellikle 3D baskı sırasında kullanılan iç dolgu yüzdesini ifade eder; bu yüzde, platformun rijitliğini ve titreşimi azaltma yeteneğinietkiler 49,50,51. ABS yoğunluğunun artırılması, kalp atışı ve solunumdan kaynaklanan hareket iletimini azalttığı gözlemlenmiş, bu da görüntüleme için stabil bir platform ve görüntü kalitesinin iyileştirilmesine yol açmıştır. Değişen iç dolgu yoğunluklarına (%20-100) sahip RHIT yapılarını test ettik ve daha yüksek yoğunluklu konfigürasyonların farelerde karaciğer intravital görüntüleme sırasında hareket artefaktlarının gözle görülür şekilde azalmasına yol açtığını niteliksel olarak gözlemledik. Yüksek yoğunluklu konfigürasyon, test edilen tüm RHIT boyutlarında yeterince sağlam ve etkili olduğu için resmi nicelik yapılmadı ve rutin görüntüleme koşullarında tutarlı bir şekilde güvenilir performans sağladı. Çoğu kullanıcı için, bu varsayılan yoğunluk daha fazla ayarlama olmadan uygun olacaktır. Ancak, belirli mekanik özellikler gerektiren deneyler için, dolgu yoğunluğu ve tasarım parametreleri değiştirilebilir ve bu özelleştirmeyi desteklemek için tam 3D baskı talimatları sağlanmıştır.

Alternatif malzemeler baskı için kullanılabilir; ancak ABS, RHIT üretiminde tercih edilen malzemedir çünkü birkaç önemli avantaj sunar. Kimyasal olarak inerttir, doku veya vücut sıvılarıyla etkileşim riskini en aza indirir ve suda çözünmez; bu da verimli temizlik, depolama ve yeniden kullanım sağlar. Bu özellikler, ABS'yi deneysel kullanım için güvenilir ve dayanıklı bir tercih haline getirir. Sigortalı biriktirme modelleme yazıcısına erişim sınırlı olduğunda, diğer 3D baskı teknikleri ve malzemeleri kullanılabilir. Stereolitografi, seçici lazer sinterleme ve çoklu jet füzyon naylon, fotopolimer reçine veya kompozit tozlar gibi malzemelerle uygun seçeneklerdir. Naylon dayanıklılık ve esneklik sağlarken, stereolitografi reçineleri ince yapısal detay gerektiren uygulamalar için yüksek çözünürlük sunar. RHIT tasarımı, farklı malzemelerin toleranslarına ve kısıtlamalarına kolayca uyarlanabilir, böylece çeşitli baskı platformlarıyla uyumlu hale gelir. Kullanıcılar, mekanik stabilite, biyouyumluluk, görüntüleme iş akışlarıyla uyumluluk ve mevcut baskı kaynakları temelinde malzemeleri seçmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan çalışmaları, Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından yetkilendirilen yönergeler ve protokollere uygun olarak Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin hayvan tesislerinde gerçekleştirildi (protokol No. LCMB-037). Tüm personelin aşağıdaki protokollere devam etmeden önce uygun şekilde eğitilmesi gerekmektedir. Hayvan bakımı kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

RHIT protokolü, intravital mikroskopi (IVM) deneylerinde kullanılmak üzere Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Araçlarının (RHIT) hazırlanmasını özetlemektedir. Deneysel işlemler, sterilize edilmiş bir mikroskop odasında veya kaputu içinde yapılır ve bir dizi adımdan oluşur: önce RHIT'in basılması, anestezi ve farenin floresan etiketlenmesi, ardından mikroskobun kurulumu, ardından cerrahi işlem ve son olarak RHIT'li yardımlı IVM uygulaması. Şekil 1 ve Şekil 2, canlı örneklerin konfokal mikroskopla görüntülenmesi için gerekli bileşenleri göstermektedir; bunlar arasında RHIT'in yerleştirilmesi için metalbir insert 5,6,7 (canlı örneklerin görüntülemesi için mikroskop adaptörü) ve ileri veya kontrollü steatozda kullanılan RHIT'ler bulunmaktadır. Sistemi test etmek için, 6-10 haftalık erkek C57BL/6J Mus musculus alındı ve deneyden önce 8-10 hafta boyunca Standart veya Batı diyetiyle beslendi.

1. RHIT'in modifikasyonlarla tasarlanması

  1. RHIT'i yeniden oluşturmak için 3D ürün tasarım yazılımı kullanın ( bkz. Malzemeler Tablosu). Tasarım yazılımını açın ve yeni bir standart parça oluşturun. Dosyayı uygun bir açıklamayla kaydedin.
  2. RHIT'in eskizini ön düzlemde Create 2D Sketch özelliğiyle oluşturun.
    1. Dikdörtgen simgesine tıklayın ve onun sol alt köşesini eskiz düzleminin başlangıcına yerleştirin.
    2. İlk dikdörtgenin içine ikinci bir dikdörtgen çizerek RHIT'in görüntüleme penceresini temsil et.
    3. Boyut özelliğini kullanarak her iki dikdörtgene boyut ekleyin; böylece tüm uzunluk ve genişlikler orijine ve birbirine göre referans gösterilir.
    4. RHIT boyutlarını fare boyutuna göre ayarlayın.
    5. RHIT'e kalınlık ekleyin, sadece dış dikdörtgeni seçip ekstrüziye tıklayarak tıklayın. Bir açılır pencere belirdiğinde, Extrude aracıyla eskizi seçerek ortada bir açıklık bırakın.
    6. Ekstrüze edilmiş RHIT'in alt yüzünü seçin ve Start 2D Sketch özelliğiyle yeni bir 2D eskiz başlatın.
  3. Isı pedinin cebini belirlemek için bir dikdörtgen çizin. Elde edilen boyutları Boyut özelliği ile uygulayın.
    1. 2D taslaktan çıkın ve Cut Extrude aracıyla ısı pedi için derin bir boşluk oluşturmak amacıyla malzeme çıkarımı yapın.
  4. Sıcaklık probu için boşluk yüzeyinin üzerinde yeni bir taslak başlatın. 2D bir eskiz başlat seçeneğine tıklayın ve daire simgesini seçin. Çemberi düzlem yüzeyine yerleştirin ve buna göre boyutlandırın. Eskiz modundan çık.
    1. Ekstrüze tuşuna tıklayın ve dairenin eskizini seçin. Extrusion modunda, cut extrude'a tıklayın ve materyali tamamen silmek için bir açılır pencere çıkmasını bekleyin. Tamam tuşuna tıklayın. Ekstrüzyon modundan çıkın.
    2. Fileto simgesine tıklayarak ve tüm sekiz keskin kenarı seçerek pencerenin kenarlarına fileto ekleyin. Fileto boyutunu ekle ve fileto modundan çık.
      NOT: Ek hareket emilimi istenirse, kullanıcılar 3D baskı hazırlığı sırasında iç dolgu yoğunluğunu artırabilir.
  5. Modeli 3D baskıya hazırlayın; ortam sekmesine gidip 3D Baskı sekmesini seçin.
    1. Modelin baskı yatağında düz durduğundan ve dikey olarak yönlendirilmediğinden emin olmak için Set Orientation fonksiyonunu kullanın.
    2. Ünite ayarlarını yapılandırmak ve gerekirse ölçeği ayarlamak için Print Options'a tıklayın.
    3. Nihai modeli kaydet. STL dışa aktarma fonksiyonunu kullanarak STL formatı ile oluşturuldu.
    4. Ortam sekmesinden çıkıp kaydet, böylece RHIT'i sağlam bir parça olarak kaydet.
  6. Tasarım programını kapatın.
    NOT: Yazıcının . ile uyumlu olduğundan emin olun. STL dosya formatını veya 3D yazıcı yazılımının gerektirdiği şekilde uygun formata dönüştürün.

2. STL dosyalarından RHIT yükleme ve baskı

  1. Şekil 1A veya Ek Dosya 1'den .stl dosyasını 3D bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımına aktarın; İçe Aktar tuşuna tıklayın ve .stl dosyasını seçin. Modeli ince katmanlara ayırmak için Hazırla butonuna tıklayarak 3D baskı yapın.
  2. Uygun 3D ticari yazıcıyı seçin ve Yazdır'a tıklayın. Sonra, baskı ilerleyişini izleyin ve baskı tamamlandıktan sonra 3D baskı nesnesini gerektiğinde kaldırıp temizleyin.
Fare BoyutuFare Vücut Ağırlığı (g)RHIT Kalınlığı (mm)Görüntüleme Penceresi Boyutu L X W (mm)
Küçük (S)17-201.517 x 17
Orta (M)22-252.521 x 21
Büyük (L)35-40326 x 26

Tablo 1: Fare boyutunu RHIT'e ölçeklendirme. Fare ağırlığı RHIT kalınlığına göre ölçeklendirilir; burada 30 g'dan (ok ucu) büyük ağırlık en büyük RHIT'e (3,0 mm) karşılık gelir. En hafif fare, en ince RHIT'e karşılık gelir ve obez fareler en kalın RHIT'le temsil edilir. Bu boyutlar CAD yazılımında ayarlanabilir. RHIT uzunluğu ve görüntüleme açıklığı, kullanılan numunenin organ konumuna göre değişebilir; Üç RHITS için sabit uzunluk ve görüntüleme açıklığı bu çalışma için uygundu. Kısaltmalar: RHIT = Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı; CAD = bilgisayar destekli tasarım.

3. Mikroskop hazırlama ve RHIT kullanımı

figure-protocol-1
Şekil 2: RHIT tekniğiyle karaciğerin IVM'i. (A) Anestezi edilmiş bir fareyle ters konfokal mikroskop düzeninin şeması. (B) Canlı görüntüleme için fareyi mikroskop sahnesine yerleştirmek amacıyla metal bir mikroskop adaptörü (insert) kullanıldı. (C) 3D baskılı RHIT, karaciğer parenximasını kolayca manipüle etmek için gazlı bez şeridi ile birlikte kullanıldı. (D) RHIT pozisyonundan önce ön dışa vurulmuş karaciğerin görüntüsü. Burun konisi, ameliyat öncesi ve sırasında anestezi için kullanıldı. (E) Akut bir işlem sırasında RHIT pozisyonundan önce dışa vurulmuş karaciğerin görüntüsü. Tıraş olmak zorunlu değildi. (F) Görüntüleme için RHIT'te ters çevrilmiş farenin son yüzü aşağı pozisyonunda görüntüsü. (G) RHIT mikroskop aşamasına güvenli şekilde bağlanmış. (H) RHIT ve metal adaptör üzerine yerleştirilmiş bir fare. (I) J-L ile ilgili ölçekli RHIT eklemeleriyle gösterilen ince (mavi ok) ve obez (yeşil ok) fareler, sırasıyla obez ve zayıf karaciğerin kaba anatomik görüntülerini gösterir. Yüksek çözünürlüklü IVM, obez ve zayıf farelerden karaciğerin M,N'sini BODIPY (yeşil, pembe okla gösterilmiş) ile etiketlenmiş ve sırasıyla çekirdekleri etiketlemek için Hoechst 33342 (beyaz, camgöbeği okuyla gösterilmiş) ile işaretlenmiştir. Kısaltmalar: RHIT = Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı; IVM = intravital mikroskopi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Karaciğer IVM için geleneksel ters konfokal mikroskop hazırla, Şekil 2'de gösterildiği gibi.
    1. Numuneyi yerleştirmek için bir sahne adaptörü yerleştirin. Bu protokolü takip etmek için, 35 mm dairesel açılış ve 40 mm kaplı camlı özel yapılmış metal bir iç kullanın.
    2. Her görüntülemeden önce ve sonra her iki tarafı da gerekirse %70 etanol kullanarak iyice temizleyin.
  2. Fare boyutuna göre uygun RHIT'i (Tablo 1) bant ile (isteğe bağlı) sabitleyin; RHIT açıklığı objektif lens ile hizalanıp metal ekteki görüntü kapak kılıfı üzerinde (Şekil 2G) kapak camının üzerine bant ile paralel hale getirilin.
  3. Görüntüleme için bir hedef, alan boyutu, mekansal çözünürlüğü ve görüntüleme süresine göre seçin; örneğin 25x/0.95 su hedefi.
    NOT: Daha yüksek büyütme çözünürlüğü artırırken, hareket artefaktlarının olasılığını da artırır.
    1. Hedefi örtü camına yakın düzleştirin.
  4. Dokunun konumlandırılmasına ve diğer karın organlarından ayrılmasına yardımcı olmak için RHIT penceresinin üzerine yaklaşık 1 x 8 cm, Şekil 2C,D boyutlarında bir gazlı bez şeridi bantla sabitleyin (Şekil 2C).
  5. RHIT'i yuvaya yerleştirilen bir ısı pediyle önceden ısıtın ve ısı probunu RHIT'in yanına sabitleyin (Şekil 2G,H) böylece görüntüleme sırasında farenin vücut sıcaklığını korursunuz.

4. Floresan etiketleme ve fare anestezisi

  1. Anestezik indüksiyon odasını dezenfekte ederek farenin stresini azaltarak hayvan kokusunun son izlerini giderin.
  2. Oksijen kondansatörü, bir çevre koruma sistemi (EPS) ve izofluran buharlaştırıcıyı açın.
  3. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve yaklaşık 3-5 dakika boyunca veya hayvan sabit nefes alma ve dikeleme ile pedal reflekslerini kaybedene kadar %2-3 izofluran ile anestezi yapın.
    1. Anestezi edildikten sonra, fareyi ısıtma pedine aktarın ve burun konisinden %1-2 isofluran ile anestezi sürdürün (Şekil 2D), işlem boyunca stabil cerrahi anestezi düzlemi sağlamak için gerekirse ayarlama yapılsın.
    2. Anestezi derinliğini, isteğe bağlı herhangi bir hareketi gözlemlemek için ayak parmağı sıkma testi yaparak değerlendirin.
  4. Lipid açısından zengin yapıları etiketlemek için, 31 G insülin şırıngası ile kuyruk damarı üzerinden PBS (toplam hacim 200 μL) içinde seyreltilmiş 200 nmol BODIPY 665/676 enjekte edilsin.
    1. Optimal sinyal için, görüntülemeden önce günde bir kez 2 gün ardışık BODIPY uygulanır. İkinci enjeksiyondan sonra en az 3-4 saat beklen, böylece arka plan sistemli olarak temizlendi ve doku sinyalinin stabilizasyonu sağlandı.
  5. Nükleer kontrast sağlamak için, Hoechst 33342'yi (2 μg/g vücut ağırlığı) 1x heparin çözeltisinde seyreltilmiş (120 μL heparin ile 180 μL tuzlu sin karıştırılıp, 400 U/mL elde edilerek hazırlanır) retro-orbital sinüs aracılığıyla 31 G insülin şırıngası ile enjekte edilir.
    NOT: Hoechst, diğer boyalarla karıştırıldığında çökelmeyi önlemek için ayrı ayrı uygulanır.
  6. Damarları görselleştirmek için, 31 G insülin şırıngasıyla karşı taraf retro-orbital sinüs üzerinden aynı 1x heparin çözeltisinde (70 kDa) vücut ağırlığında 18 μg/g floresan dextran (70 kDa) enjekte edilsin.
    NOT: Heparin, görüntüleme sırasında pıhtı oluşumunu azaltmak ve düzenli kan akışını teşvik etmek için dahil edilmiştir.
  7. Hoechst ve dekstran enjeksiyonlarından sonra ameliyat ve görüntülemeye başlamadan önce 10-15 dakika bekleyin.
Flüoresan MuhabirAmaçAğırlık başına doz (veya konsantrasyon)
Hoechst 33342Boyama çekirdekleri2 μg/g: heparin çözeltisi ile 50 μl'ye enjektan hacmi takviyesi
Bodiby 665/676Lipid damlalarını boyama.8 μg/g: Tuzlu çözeltide 200 μl enjektan hacmi takviyesi
2M tetrametil rodamin-dekstran (Dextran)Leke damarları18 μg/g: Heparin çözeltisiyle 50 μl'ye enjektan hacmi takviyesi

Tablo 2: Floresan muhabir seçenekleri. Bu tablo, in vivo görüntüleme için fare dokularını etiketlemek için kullanılan yöntemlerin ayrıntılı bir açıklamasını sunar. Heparin çözeltisi önce hazırlanır ve ardından DAPI-heparin ve dekstran-heparinçözeltileri 7 elde etmek için kullanılır. Hoechst 33342, bir göze retro-orbital olarak enjekte edilirken, BODIPY 2-3 gün önce doğrudan kuyruk damarına enjekte edilir; obez fareler için daha yüksek konsantrasyonla. Dextran diğer göze retro-orbital olarak enjekte edilir. Her gözde ayrı ayrı retro-orbital enjeksiyonlar yapılması önemlidir. Kısaltma: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol.

5. Fare cerrahi işlemi

  1. Karın tüyünü saç makası ve/veya tüy alma kremi ile tıraş edin. Saç kalıntılarını temizleyin ve açıkta kalan cildi temizlemek için %70 etanol kullanın.
    NOT: Kurumsal IACUC gereksinimlerine bağlı olarak, uygun cerrahi alan hazırlığını sağlamak için betadin ve etanol dönüşümlü bir fırçalama kullanılabilir.
  2. Ameliyattan önce anestezi derinliğini yeniden değerlendirin.
  3. Karaciğeri, kaburga kafesinin altından xiphoid'dan cerrahi makasla yatay 2-3 cm'lik bir kesi açarak açığa çıkarın; bu kesik üst karın sol yan tarafında sona erer.
  4. İlk kesiden sonra, karaciğerin sol lobunu ortaya çıkarmak için kas katmanında dikkatlice daha küçük ikincil bir kesi yapın, kanamayı önlemek için gerekirse (isteğe bağlı) koterize edin (Şekil 2E).
    1. Koterizörü kullanırken, karaciğer ile kas tabakası arasına tuzlu bir gazlı bez yerleştirerek kas tabakasının yayılan ısısını emerek karaciğere ısı hasarını önleyin.
    2. Aşırı kanama, cerrahi veya mekanik travma veya dış kompressiyondan kaçının.
  5. Karaciğer maruz kaldıktan sonra fareyi mikroskop aşamasına geçirin.

6. Mikroskop aşamasında fare yerleştirme

  1. Anestezi altındaki farenin karnını mikroskobun RHIT platformunun üstüne aşağıya bakacak şekilde konumlandırın.
    1. Burun konisini farenin anestezi altında kalması için ayarlayın.
    2. Karaciğerin sol yan lobunu örtü kılığına nazikçe hareket ettirmek ve torakal boşluğa hafif dış baskı uygulamak için tuzlu nemli pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
      NOT: Yerçekiminden faydalanarak karaciğeri dikkatlice dışarı çıkarıp kapağı camın üzerine yönlendirin.
    3. Farenin vücudundan karaciğeri nazikçe ayırmak için gazlı bez şeridi kullanın (Şekil 2E-H).
  2. Görüntüleme sırasında farenin anestezi altında kaldığından emin olmak için burun konisini tekrar kontrol edin.
  3. Açıkta kalan boşluğun kenarlarına su bazlı bir jel uygulayarak ve ısı pediyle doğrudan temas etmemek için doku susuzluğunu önleyin.
    NOT: Sıcaklık ve nemin korunması, kapalı nem odası 5,6,7 olan bir mikroskopla da desteklenebilir.
  4. Kornea kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın.
  5. 7,52 görüntülemeye başlamak için zaman geçişli IVM kurun.
    1. Lazer kepenkleri açın, floresan etiketlemeleri değerlendirin ve dikkat çekici bir kan akışı olan kararlı bir bölgeyi belirleyin. Uygun görüntü alım parametrelerini seçin; bunlar arasında görüntü formatı, alım hızı, görüntüleme aralıkları, toplam alım süresi ve satır/kare ortalaması (512 × 512 piksel; bölge başına 1-5 kare s⁻¹; görüntüleme aralıkları 5-30 saniye; toplam alım süresi 5-20 dakika; satır/kare ortalaması 2-8, deneysel gereksinimlere bağlı olarak). Kullanılan floroforlara uyum sağlamak için floresans flaş pozlamasını optimize edin.
    2. Z-yığınları için üst ve alt sınırları tanımlayın; alım panelinde Z-Yığını seçerek, üst ve alt odak düzlemlerini Z-konum kontrolleriyle ayarlayın ve aralığı Önce Set/Son Set' ile onaylayın; ardından Deneyi Başlat (veya Alma Başlat) tıklayarak zaman geçişi kaydını başlatın. Görüntülemenin sonunda, hayvanı kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi onayladığı protokollere uygun olarak ötenazi yapın.

figure-protocol-2
Şekil 3: SSIM ile RHIT'in iyileştirilmiş hepatik IVM stabilitesinin ölçülmesi. Sol alt karaciğer lobun hepatik IVM'i üç stabilizasyon koşulunda vardır: (A) hiç insert (YOK), (B) karton insert ve (C) RHIT. Dokular BODIPY (magenta, lipidler), Hoechst 33342 (yeşil, çekirdekler) ve Dextran (siyan, damar) ile etiketlenmiştir; A ve B panelleri görünür bozulma ve hareket artefaktları gösterirken, C RHIT ile artan netlik gösterir. (D) Yapısal benzerlik indeksi (SSIM) görüntü kararlılığını nicelendirmek için hesaplandı. Çubuklar ortalama ± SEM gösterir ve her renkli nokta bireysel biyolojik bir kopyayı temsil eder: RHIT (n = 14), Karton (n = 10), No Insert (n = 8). Bu gruplar, yaklaşık 50-70 fareden oluşan toplam deneysel kohorttan elde edilen alt kümelerdir. Yalnızca belirli görüntüleme kriterlerini karşılayan seanslar (örneğin, tutarlı çerçeve hizalanması ve görüntü kalitesi) SSIM ile analiz edildi. RHIT tutarlı olarak daha yüksek SSIM değerleri üretti (ortalama 0.511 ± SEM), bu da görüntüleme koşullarında daha iyi kararlılık ve çözünürlük göstermektedir. Ölçek çubukları = 15 μm. Temsilci görüntüler gösterilir; SSIM, gözlener doku hasarı veya bozulması olmadan seri IVM seanslarını yansıtır. Kısaltmalar: RHIT = Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı; IVM = intravital mikroskopi; SSIM = yapısal benzerlik indeksi; KART = karton ek. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RHIT, CAD uygulaması kullanılarak tasarlandı (Şekil 1). RHIT boyutları küçük, orta ve ağır boyutlu fareleri karşılayacak şekilde ölçeklendirilmiştir (Tablo 1). RHIT tasarımı, karaciğer görüntüleme için konumlandırılmış açıklığa sahip 107,50 mm uzunluğunda ABS düz bir malzemeden oluşur. IVM, optimal (RHIT) ve suboptimal (insert veya karton olmadan) koşullarda gerçekleştirildi (bkz. Şekil 3A-C). B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karaciğer intravital mikroskopisi kapsamlı şekilde incelenmiştir, ancak önceki yöntemler genellikle stabil terminal görüntüleme için yüksek invaziv ve standartlaşmamış cerrahiişlemler gerektirir 5,6,7,9,31,32. Hareket, hepatik IVM'de tekrarlanabilir görüntülemeyi engelleyen en zorlu engel ola...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri'ndeki Intramural Araştırma Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü ve NIH kütüphanesi tarafından desteklendi. H. Sanchez Cornejo, PE501087367-2024-PROCIENCIA numaralı hibe aracılığıyla Peru Ajansı CONCYTEC'e mali destek için teşekkür etmektedir. Porat-Shliom laboratuvarı üyelerine ve Cambridge Üniversitesi Kuantum Fiziği grubundaki işbirlikçilere eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyoruz, NIH kütüphane personeline ve teknik destek için Geneti Gaga'ya teşekkür etmek istiyoruz. Şekil 2A'daki 3D render edilmiş görüntü Biorender kullanılarak oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
½-inç maskeleme bandı3M Genel Amaçlı Maskeleme Bandı:b40069428
40 mm örtü kaydırmalarıBioptech40-1313-03191
%70 (v/v) etanolThermo Fisher ScientificBP2818-4Hacim olarak %70 etanol ve hacim olarak %30 su
Anestezi makinesi: AMD-3 PlusSomniAMD-17106
Aquasonic 100 ultrason iletim jeliParker Laboratuvarları  01 08
BODIPY 665/67Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)B3932Tablo 2'ye bakınız
CAD yazılımı (Autodesk Inventor veya eşdeğeri) Autodesk (temsilci CAD yazılımı)N/aYazılım
Kabat SistemiİkizlerGEM 5917
Klidoks dezenfektanİlaç Araştırma Laboratuvarları Inc.VWR, MSPP-96118F
Konfokal mikroskop (Leica SP8 veya eşdeğeri)LeicaSP8
Pamuk uçlu aplikatörlerPüriten Tıbbi Ürünler25-806 1WC
Özel yapımı alüminyum sahne sekti (3 mm kalınlığında, 35 mm çukurda)YokYok
FORANE (izofluran, USP) solunum için sıvı, 250 mLBaxter10019-360-60
Saç makası (isteğe bağlı)Onyx Fine InstrumentsASWRHC
Rektal problu ısı pediALA Bilimsel AletleriISITICI YASTIĞI 1/2
Heparin sodyum, 1000 USP U/mLHikma0641-0391-12
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)62249Tablo 2'ye bakınız
Fare ısı pederiALA Bilimsel AletleriISITICI YASTIĞI 1/2
Mus musculusJackson LaboratuvarıC57BL/6Laboratuvar faresi
Normal salin (%0,9 sodyum klorür)Thermo Fisher Scientific7210-16
RHIT (Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı) uygun boyutSağlananYokTablo 1'e bakınız
Cerrahi forseps, kavisli uçGüzel Bilim Araçları11251-23
Cerrahi gazlı bezMckesson6939
Cerrahi makasGüzel Bilim Araçları14001-14
Tetrametilrodamin DextranThermo Fisher Scientific (Invitrogen)D7139Tablo 2'ye bakınız
Ultra İnce U-100 İnsülin Şırıngaları, 31 GBetty MillsBD326730

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  2. Hor, J. L., Germain, R. N. Intravital and high-content multiplex imaging of the immune system. Trends Cell Biol. 32 (5), 406-420 (2022).
  3. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  4. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Syst. 4 (3), 277-290.e9 (2017).
  5. Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
  6. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  7. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  8. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (2), 232-240 (2000).
  9. Gola, A., et al. Commensal-driven immune zonation of the liver promotes host defence. Nature. 589 (7840), 131-136 (2021).
  10. Kamoun, W. S., Schmugge, S. J., Kraftchick, J. P., Clemens, M. G., Shin, M. C. Liver microcirculation analysis by red blood cell motion modeling in intravital microscopy images. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (1), 162-170 (2008).
  11. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2020).
  12. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  13. Soulet, D., Lamontagne-Proulx, J., Aube, B., Davalos, D. Multiphoton intravital microscopy in small animals: motion artefact challenges and technical solutions. J Microsc. 278 (1), 3-17 (2020).
  14. Mempel, T. R., Bauer, C. A. Intravital imaging of CD8+ T cell function in cancer. Clin Exp Metastasis. 26 (4), 311-327 (2009).
  15. Lee, S., Courties, G., Nahrendorf, M., Weissleder, R., Vinegoni, C. Motion characterization scheme to minimize motion artifacts in intravital microscopy. J Biomed Opt. 22 (3), 036005(2017).
  16. Rhodes, G. J. Surgical preparation of rats and mice for intravital microscopic imaging of abdominal organs. Methods. 128 (1), 129-138 (2017).
  17. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  18. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2019).
  19. Dawson, C. A., et al. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nat Protoc. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  20. Murphy, K. J., Reed, D. A., Trpceski, M., Herrmann, D., Timpson, P. Quantifying and visualising the nuances of cellular dynamics in vivo using intravital imaging. Curr Opin Cell Biol. 72 (1), 41-53 (2021).
  21. Pereira, E. N. G. dS., et al. Hepatic microvascular dysfunction and increased advanced glycation end products are components of non-alcoholic fatty liver disease. PLoS One. 12 (6), e0179654(2017).
  22. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  23. Lu, Z., et al. Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy. Nat Biotechnol. 43 (4), 569-580 (2025).
  24. Lu, Z., et al. A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics. Nat Protoc. 17 (8), 1953-1979 (2022).
  25. Zhang, Y., et al. Computational optical sectioning with an incoherent multiscale scattering model for light-field microscopy. Nat Commun. 12 (1), 6391(2021).
  26. Zhao, Z., et al. Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue. Cell. 186 (11), 2475-2491.e22 (2023).
  27. Lu, Z., et al. Virtual-scanning light-field microscopy for robust snapshot high-resolution volumetric imaging. Nat Methods. 20 (5), 735-746 (2023).
  28. Chen, S., et al. Hepatocyte-specific Mas activation enhances lipophagy and fatty acid oxidation to protect against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. J Hepatol. 78 (3), 543-557 (2023).
  29. Chen, S., et al. Myeloid-Mas signaling modulates pathogenic crosstalk among MYC+CD63+ endothelial cells, MMP12+ macrophages, and monocytes in acetaminophen-induced liver injury. Adv Sci. 11 (1), 2306066(2024).
  30. Wu, J., et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell. 184 (12), 3318-3332 (2021).
  31. Benechet, A. P., Ganzer, L., Iannacone, M. Intravital microscopy analysis of hepatic T cell dynamics. Methods Mol Biol. 1514 (1), 49-61 (2017).
  32. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following Leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics. J Vis Exp. 98 (1), e52303(2015).
  33. Heymann, F., et al. Long-term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (98), e52607(2015).
  34. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128 (1), 12-19 (2017).
  35. Wang, J., Kubes, P. A reservoir of mature cavity macrophages that can rapidly invade visceral organs to affect tissue repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  36. Wang, Y., Wang, J. Intravital imaging of inflammatory response in liver disease. Front Cell Dev Biol. 10 (1), 922041(2022).
  37. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  38. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  39. Liu, T. W., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, D. Multi-modal multi-spectral intravital microscopic imaging of signaling dynamics in real time during tumor-immune interactions. Cells. 10 (3), 499(2021).
  40. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  41. Kuss, M., Crawford, A. J., Alimi, O. A., Hollingsworth, M. A., Duan, B. Three-dimensional printed abdominal imaging windows for in vivo imaging of deep-lying tissues. Machines. 10 (8), 697(2022).
  42. Xie, W., et al. 3D-printed lightweight dorsal skin fold chambers from PEEK reduce chamber-related animal distress. Sci Rep. 12 (1), 11599(2022).
  43. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  44. Urciuolo, A., et al. Intravital three-dimensional bioprinting. Nat Biomed Eng. 4 (8), 901-915 (2020).
  45. Dul, S., Gutierrez, B. J. A., Pegoretti, A., Alvarez-Quintana, J., Fambri, L. 3D printing of ABS nanocomposites: comparison of processing and effects of multi-wall and single-wall carbon nanotubes on thermal, mechanical and electrical properties. J Mater Sci Technol. 121 (1), 52-66 (2022).
  46. Stansbury, J. W., Idacavage, M. J. 3D printing with polymers: challenges among expanding options and opportunities. Dent Mater. 32 (1), 54-64 (2016).
  47. Ligon, S. C., Liska, R., Stampfl, J., Gurr, M., Mulhaupt, R. Polymers for 3D printing and customized additive manufacturing. Chem Rev. 117 (15), 10212-10290 (2017).
  48. Das, A., et al. Current understanding and challenges in high-temperature additive manufacturing of engineering thermoplastic polymers. Addit Manuf. 34 (1), 101218(2020).
  49. Turaka, S., Jagannati, V., Pappula, B., Makgato, S. Impact of infill density on morphology and mechanical properties of 3D-printed ABS/CF-ABS composites using design of experiments. Heliyon. 10 (9), e29920(2024).
  50. Ahmad, M. N., Yahya, A. Effects of 3D printing parameters on mechanical properties of ABS samples. Designs. 7 (6), 136(2023).
  51. Nguyen, T. T., Tran, V. T., Nguyen, V., Nguyen, V. T. T. Effect of infill ratios in SLA 3D printing on mechanical properties of castable wax patterns for molded shells in investment casting. PLoS One. 20 (2), e0311245(2025).
  52. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  53. Wang, Z., Bovik, A. C., Sheikh, H. R., Simoncelli, E. P. Image quality assessment: from error visibility to structural similarity. IEEE Trans Image Process. 13 (4), 600-612 (2004).
  54. Madhav, B. T. P., Rao, M. V. G., Pisipati, V. G. K. M. Identification of liquid crystalline phases in 7O.O9 compound based on structural similarity index measure. Liq Cryst. 42 (2), 198-203 (2015).
  55. Zhou, W., Bovik, A. C. A universal image quality index. IEEE Signal Process Lett. 9 (1), 81-84 (2002).
  56. Winkler, S. Human Vision and Electronic Imaging IV. , 175-184 (1999).
  57. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Front Cell Dev Biol. 8 (1), 620471(2020).
  58. Matsumoto, S., Kikuta, J., Ishii, M. Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems: Methods and Protocols. Ishii, M. , 137-143 (2018).
  59. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  60. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (5), 551-558 (2013).
  61. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  62. de Paz, J. L., et al. Profiling heparin-chemokine interactions using synthetic tools. ACS Chem Biol. 2 (11), 735-744 (2007).
  63. Taqueti, V. R., Jaffer, F. A. High-resolution molecular imaging via intravital microscopy: illuminating vascular biology in vivo. Integr Biol (Camb). 5 (3), 278-290 (2013).
  64. Freund, J. B., Goetz, J. G., Hill, K. L., Vermot, J. Fluid flows and forces in development: functions, features and biophysical principles. Development. 139 (7), 1229-1245 (2012).
  65. Tabira, K., et al. An in vitro study of digital impressions and three-dimensional printed models of orbital defects using mobile devices and monoscopic photogrammetry. J Oral Sci. 65 (2), 127-130 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B Yazd r lm AraKaraci er G r nt lemeYeniden Kullan labilir G r nt leme CihazDoku StabilizasyonuKonfokal MikroskopiLipid Damlac G r nt lemeFare CerrahisiG r nt Tekrarlanabilirli iYap sal Benzerlik Endeksi

İlgili makaleler