Yöntem makalesi

Mikroplarda Oransal Floresan Görüntüleme için Florofor Tabanlı Genetik Olarak Kodlanmış Biyosensörler

DOI:

10.3791/68339

⸱

1 Ağustos 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 2Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, 3Institute of Cell and Interaction Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 4Université de Lyon, INSA Lyon, CNRS, Université Claude Bernard Lyon 1

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kontrollü koşullar altında kantitatif oranlı floresan görüntüleme için florofor bazlı genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin mikroplarda uygulanmasını açıklar. Yöntem, bu biyo-algılama stratejilerini gelişmiş görüntüleme teknikleriyle entegre ederek, tek hücre düzeyinde yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı analiz sağlayarak küçük molekül dinamikleri hakkında daha derin bilgiler sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroplardaki küçük molekül dinamiklerini araştırmak, mikrobiyal fonksiyonun kapsamlı çalışmaları için çok önemlidir. Hem organizma içi hem de organizmalar arası küçük molekül dinamikleri mikrobiyal fizyoloji, simbiyoz ve hastalıkta kritik rol oynar. Bununla birlikte, mevcut tekniklerin çoğunu kullanarak bu dinamikleri izlemek oldukça zor olmaya devam etmektedir. Florofor bazlı genetik olarak kodlanmış biyosensörler, küçük molekül dinamiklerini in vivo olarak izlemek için güçlü araçlardır ve yeni keşifler yapmak için yüksek potansiyele sahiptir. Bu biyosensörler en yaygın olarak floresan görüntülemede, genellikle çevresel koşullar üzerinde hassas kontrol sağlayan perfüzyon cihazlarıyla birlikte kullanılır. Gelişmiş görüntüleme teknikleriyle entegre edildiğinde, bu yaklaşım yüksek çözünürlüklü, mekansal ve zamansal olarak çözülmüş veriler sağlayarak tek hücreli mikrobiyal tepkilere ilişkin içgörüler sağlar. Verdikleri sözlere rağmen, bu tür biyosensörlerin uygulanması teknik olarak zor olmaya devam ediyor. Temel adımları anlamak, daha geniş çapta benimseme için çok önemlidir. Burada, kontrollü koşullar altında kantitatif oranlı floresan görüntüleme için yeni tasarlanmış biyosensörlerin mikroplara etkili bir şekilde yerleştirilmesini desteklemek için tasarlanmış bir protokol sunuyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek florofor yoğunluğuna dayalı ve çift florofor biyosensörler, araştırmacılar tarafından çeşitli uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır1. Bazı çalışmalar, aynı hücreler içinde birden fazla sinyali aynı anda izlemek için multipleks biyosensör analizleri kullanmıştır2. Bu biyosensörlerin çoğu, bağlanma olaylarının floresan özelliklerini değiştiren konformasyonel değişikliklere neden olduğuligand bağlama alanlarına dayanır 3,4. Genetik olarak kodlanmış biyosensörler, bir dizi sistemde5 in vivo görüntüleme için temel araçlar haline gelmiştir ve uzay ve zamanda iyon ve metabolit seviyelerinin yüksek çözünürlüklü izlenmesini sağlar1. Bununla birlikte, erken biyosensörler dinamik aralık ve Sinyal-Gürültü Oranı (SNR) açısından sınırlıydı6. Konformasyonel olarak hassas Floresan Proteinlere (csFP'ler) dayalı tek florofor yoğunlaştırıcımetrik biyosensörlerdeki son gelişmeler, performansı önemli ölçüde iyileştirmiştir. Bununla birlikte, protein ekspresyon seviyelerindeki varyasyonlar, canlı hücrelerdeki sinyal moleküllerinive metabolitleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan genetik olarak kodlanmış florofor bazlı biyosensörler 6 kullanılarak in vivo ölçümleri etkileyebilir 7,8. Tek florofor yoğunlaştırıcı biyosensörler, in vivo olarak dalgalanabilen biyosensör ekspresyon seviyeleri için normalizasyona izin vermez. Bununla birlikte, bir referans floresan proteinin dahil edilmesi, tek florofor biyosensörleri çift florofor oranlı versiyonlara dönüştürerek daha güvenilir nicelikler sağlayabilir9. Işınımsal olmayan süreçlerden kaynaklanan enerji kaybı nedeniyle, floresan emisyon spektrumu, Stokes kayması10 olarak bilinen bir fenomen olan absorpsiyon spektrumuna göre kaydırılır. Büyük Stokes Kaydırmalı Floresan Proteini (LSSFP'ler), çift florofor oranlı biyosensörlerde 9,11 optimal referans floroforlar olarak kullanılmıştır. Son zamanlardaki bir gelişme, LSSmApple12 adı verilen kırmızı bir LSSFP içeren GA-MatryoshCaMP6s olarak bilinen monokromatik olarak uyarılabilir Yeşil Elma (GA) Matruşka biyosensörlerinin geliştirilmesidir. Mikroakışkan sistemler gibi mikro cihazlarla birleştirildiğinde, florofor bazlı genetik olarak kodlanmış biyosensörler, konfokal mikroskopi gibi teknikler kullanarak kantitatif oranlı görüntüleme için minimal invaziv bir yaklaşım sunar. Bu entegrasyon, çevresel stres altındaki tek hücrelerde küçük molekül dinamiklerinin yüksek hızlı görüntülenmesini ve gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Örneğin, cAMP ve glikoz biyosensörleri mayada başarıyla uygulanmıştır. Mutant suşlarla birlikte kullanıldığında, bu biyosensörler şeker alımını yöneten temel düzenleyici ağların aydınlatılmasına yardımcı olmuştur13,14. Önemli ilerlemelere rağmen, bu teknolojiler in vivo15 küçük molekül dinamiklerini içeren kritik biyolojik soruları araştırmak için henüz tam potansiyellerine ulaşmamıştır. Sonuç olarak, laboratuvarlar arasında yaygın olarak benimsenmeleri sınırlı kalmaktadır ve daha geniş uygulama için standartlaştırılmış metodolojiler hala eksiktir.

Oransal olmayan tek florofor biyosensörlere veya yığın düzeyinde ölçümlere dayanan geleneksel metodolojilerle karşılaştırıldığında, GA Matryoshka biyosensörlerine dayalı protokolümüz, kantitatif oransal analiz ile yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntüleme sağlar. Yöntem, büyük Stokes kaydırmalı floroforu dahili bir referans olarak entegre ederek, önceki tasarımların önemli bir sınırlaması olan biyosensör ifadesindeki değişkenliği telafi eder. Ek olarak, mikroakışkan cihazlarla kombinasyon, çevresel koşulların hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlayarak geleneksel perfüzyon odalarına veya statik kültür sistemlerine göre bir iyileştirme sunar12. Bu yaklaşım aynı zamanda, iletişim ve besin değişiminin moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak için hücresel düzeyde uzamsal ve zamansal çözünürlüğün gerekli olduğu bitki patojen etkileşimleri ve mikoriza gibi simbiyotik ilişkiler gibi mikroplar ve konakçıları arasındaki dinamik etkileşimleri incelemek için belirgin avantajlar sağlar.

Bu bağlamda, mikroplarda oransal biyosensör görüntüleme için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz. Mayadaki uygulama için özel olarak optimize edilmiş olmasına rağmen, bu protokol bakteriler de dahil olmak üzere diğer mikroplarda kullanım için uyarlanabilir ve bitkiyle ilişkili mikroplar gibi model olmayan organizmalara genişletilebilir. Örneğin, biyosensörler, mayadaki kalsiyum sinyalizasyonunun kantitatif floresan görüntülemesi için mikroakışkan sistemlerle birlikte kullanılabilir ve çevresel stres altında kalsiyum tepkilerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar14.

Bu protokol, araştırmacılara yeni tasarlanmış biyosensörleri etkin bir şekilde dağıtmada rehberlik etmeyi ve böylece mikrobiyal sistemlerde biyosensör tabanlı floresan görüntüleme yoluyla biyolojik süreçlerin araştırılmasını ilerletmeyi amaçlamaktadır. Maya kültürü koşulları, optimum uyarma/emisyon ayarları ve yaygın olarak kullanılan maya suşları (örneğin, K601 ve W303-1A MAT-a) ile uyumluluk hakkında pratik öneriler içerir. Dikkate değer sınırlamalar arasında uzun süreli görüntüleme seansları sırasında fotoağartma ve biyolojik örneklerde biyosensör ekspresyonu ile ilgili zorluklar yer alır. İn vivo biyosensör görüntüleme deneylerinin sonucunu çok sayıda faktör etkileyebileceğinden, bu adım adım protokol aynı zamanda araştırmacıların potansiyel zorlukları öngörmelerine ve üstesinden gelmelerine yardımcı olmayı ve böylece tekrarlanabilir uygulamaları kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oransal biyosensörlerin rasyonel tasarımı (Şekil 1)

NOT: İlgilenilen bağlayıcı protein, (i) özgüllük, (ii) afinite, (iii) yapısal bilgi ve (iv) ligand bağlanması üzerine konformasyon yeniden düzenlemesi dahil olmak üzere ilgili kriterlere dayalı olarak duyusal alan olarak seçilir. Özgüllük, biyosensörün çapraz reaktivite olmadan hedef moleküle seçici olarak yanıt vermesini sağlar. Afinitenin, biyolojik bağlamda hedef molekülün beklenen konsantrasyon aralığı ile uyumlu olduğu düşünülmektedir. AlphaFold tarafından oluşturulanlar gibi deneysel verilerden veya hesaplama modellerinden elde edilen yapısal bilgiler, duyusal alanın üç boyutlu organizasyonu ve ligandın neden olduğu konformasyonel değişiklikler hakkında içgörüler sağlar. Bu bilgiler, floroforlar için uygun yerleştirme noktalarını belirlemek için kullanılır. Daha sonra, amaçlanan uygulamalara bağlı olarak biyosensörün yanıt verebilirliğini ve dinamik aralığını değerlendirmek için bir doğrulama stratejisi geliştirilir.

  1. Yeşil Elma Matruşka12 kasetini, konformasyonel değişikliklere duyarlı olan dairesel olarak permütasyonlu Yeşil Floresan Proteini (cpGFP), duyusal alanın ligand bağlamasının neden olduğu yeniden düzenlemelerine yanıt verecek şekilde duyusal alana yerleştirerek Matryoshka tasarımını in silico olarak oluşturun.
    1. Bağlanma alanının yapısını analiz etmek için Chimera gibi moleküler görselleştirme yazılımları kullanın. Üç boyutlu yapı mevcut değilse, güvenilir bir model oluşturmak için AlphaFold'u kullanın.
    2. Protein yapısı içindeki esnek halkaları, proteinin genel işlevini veya stabilitesini bozmamak için seçilen çift florofor kaseti için zayıf noktalar ve potansiyel yerleştirme yerleri olarak tanımlayın.
    3. Eklenen çift FP kasetini içeren kimerik proteinin yapısını tahmin etmek için AlphaFold'u tekrar kullanın ve yerleştirmenin olumsuz yapısal değişiklikler getirmediğini doğrulayın.
    4. Biyosensör yapılarını, maya hücrelerinde ekspresyon sağlayan plazmit DNA'ya klonlayın. Spesifik olarak, yeni tasarlanan biyosensörü kodlayan geni, uygun bir klonlama tekniği 12,13,14 kullanarak, maya ekspresyonu için uygun elementler içeren maya mekik vektörü pAG416'ya yerleştirin.
    5. Klonlamayı takiben, plazmit DNA'sının amplifikasyonu için rekombinant plazmiti bakteri hücrelerine dönüştürün. Maya dönüşümü için saflaştırılmış plazmit DNA kullanın.
    6. Saflaştırılmış plazmiti, yayınlandığı gibi polietilen glikol (PEG) aracılı dönüşüm yoluyla maya hücrelerine sokun,16. Urasil eksikliği olan ortam üzerinde maya hücrelerini dönüştüren plaka, URA3 seçim işaretçisini taşıyan plazmidi içeren pozitif klonları seçer.

2. Numune hazırlama

  1. GA-Matryoshka biyosensörlerini eksprese eden çizgi maya dönüştürücüleri seçici ortam plakalarına (yani SC-Ura) dökün ve koloni büyümesine izin vermek için 30 ° C'de 2-3 gün inkübe edin.
    NOT: Maya suşu, plazmit üzerindeki URA3 geni ile tamamlanan ve urasil eksikliği olan ortamlarda seçim sağlayan bir ura3oksotrofisi taşır. Biyosensörü kodlayan plazmid, oksotrofiyi tamamlayan bir kaset içerir (örneğin, pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s).
  2. K601 / W303-1A MAT-a suşundan maya dönüştürücüleri oluşturun (genotip: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). Saccharomyces cerevisiae için yaygın olarak kullanılan pAG41612 gibi bir ekspresyon vektörü ile dönüşüm gerçekleştirin.
  3. Dönüşümden sonra, SC-Ura ortamında 30 ° C'de kültür mayası hücreleri, bağımsız olarak dönüştürülmüş koloniler ortaya çıkana kadar litre başına aşağıdaki gibi hazırlanır: 0.77 g CSM-Ura, amonyum sülfatlı 6.7 g Maya Azot Bazlı (YNB), 20 g glikoz, 20 g agar ve adenin, 150 μM'lik bir nihai konsantrasyona eklenir.
  4. Yetkili maya hücrelerini hazırlayın ve yerleşik bir protokole göre PEG 3350 aracılı dönüşümügerçekleştirin 16.
  5. Mikroakışkan hücre yakalama deneyleri için, %25 gliserol stoklarını SC-Ura plakalarına sürün ve bağımsız tek kolonilerin büyümesine izin vermek için 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin. Tek tek kolonileri 5 mL sıvı SC-Ura ortamında yeniden süspanse edin ve OD600 0.5-1.0'a ulaşana kadar çalkalayarak 30 °C'de inkübe edin, bu da onları perfüzyon sistemine yüklemeye uygun hale getirir.

3. Perfüzyon sisteminin hazırlanması (Şekil 2)

  1. Haploid maya hücreleri için mikroakışkan plakayı, GA-Matryoshka biyosensörlerini eksprese eden 50 μL maya hücresi ile birlikte büyüme için nihai SC-Ura ortamı ve tedaviler için tamponlu çözelti (örneğin, NaCl veya sorbitol) ile yükleyerek hazırlayın.
    1. Depolama çözeltisini 1-8 numaralı kuyulardan çıkarın. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisini kuyulardan aspire edin ve 400 μL steril su ekleyin.
    2. 1-6 ve 8 numaralı kuyuları yıkayın. Yıkama 1: Steril su solüsyonunu 1-8 numaralı kuyulardan aspire edin ve 400 μL steril su ekleyin. Yıkama 2: Aspire ederek ve 400 μL steril su ekleyerek yıkamayı tekrarlayın. Yıkama 3: 400 μL steril su ile bir kez daha tekrarlayın.
    3. Kuyu 1-6 için son dolum: Su çözeltisini aspire edin ve maya büyümesi için SC-Ura gibi 300μL nihai perfüzyon/büyüme çözeltileri veya tedavi için ilgilenilen analitleri içeren tamponlu bir çözelti ekleyin.
    4. Kuyu 8'de hücre yüklemesi: 50 μL maya hücresi süspansiyonu ekleyin (OD600 = 0.5-1.0).
  2. Plakaları mikroakışkan platformun sıcaklık kontrollü manifoldu ile kapatın ve canlı hücre görüntüleme sistemine bağlayın. Manifoldlar, 28 °C'lik bir sıcaklıkta stabil bir termal ortam sağlarken, boru ve bir pompa uygun sızdırmazlık ve sürekli perfüzyon sağlar.
    1. Plakayı manifoldun üzerine hizalayın. Vakumu açın. Mikroakışkan Platformu açın.
    2. Mühür'e basın ve yeşil ışık yanana kadar bekleyin. Mikroakışkan platform yazılımını açın, yeni bir deney oluşturun ve açılır listeden Uygun maya plakasını seçin.
    3. Sıvı Hazırlama Sırasını Çalıştır düğmesine tıklayın. Maya hücrelerini kuyu 8'den kültür odasına yüklemek için Hücre Yükleme Sırasını Çalıştır'a tıklayın, burada 28 ° C'de 10 kPa'da gece boyunca seçici ortam SC-Ura'nın sürekli perfüzyonu altında tuzağa düşürülecek ve büyütülecektir.
    4. Manuel Mod sekmesi altında, 30 °C'de sıcaklık, 10 kPa'da akış hızı, adım süresi (örn. 10 dakika) ve perfüzyon için açılacak kanallar gibi deneysel parametreleri ayarlamak için Özel Bir Dizi Çalıştır'a tıklayın veya Protokol Düzenleyici'yi kullanın.
  3. Hücreleri, 28 ° C'de seçici ortam SC-Ura ile sürekli perfüzyon altında ve 10-17 kPa'lık bir basınç altında kültür odasında gece boyunca büyütün.

4. Oransal floresan görüntüleme (Şekil 3, Şekil 4 ve Video 1)

  1. Hızlı bir mikroskobik görselleştirme ile hücre büyümesini ve floresansı değerlendirin.
    1. Mikroakışkan plakayı ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına yerleştirin. Hücreleri bulmak için görüntüleme alanının merkezine odaklanın.
    2. Hücre morfolojisini, canlılığını ve biyosensör ekspresyonunu değerlendirmek için parlak alan ve/veya floresan mikroskobu kullanın.
  2. Mikroakışkan sistemi ve uyumlu mikroakışkan plakaları 4,12,13,14 kullanarak hassas kontrollü koşullar altında kalsiyum kararlı durum dinamiklerini araştırın.
  3. A100x büyütme ve 1,40 sayısal diyafram açıklığına (NA) sahip ters lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Bir argon lazer kullanarak 488 nm'de heyecan verici GFP ve LSSmApple ile çift florofor biyosensörleri izleyin. GFP için 520 nm'de ve LSSmApple için 610 nm'de emisyon sinyallerini toplayın (Şekil 5) ve biyosensörün dinamik tepkilerini ölçmek için oransal floresan görüntüleme deneyleri yapın. Analit kaynaklı değişiklikleri izlemek için zaman içindeki emisyon yoğunluklarının (GFP/LSSmApple) oranını ölçün.

5. Açık kaynaklı yazılım kullanarak görüntü analizi (Şekil 6)

  1. CellProfiler'ı veya diğer benzer yazılımları resmi depodan edinin ve yerel bir iş istasyonuna kurun.
  2. Otomatik toplu işleme ile uyumluluğu sağlamak için hızlandırılmış floresan mikroskobu görüntülerini sıralı sırayla (örn. img_001.tif, img_002.tif vb.) düzenleyin.
  3. Yazılımı başlatın ve Yeni Proje'yi seçerek yeni bir analiz işlem hattı başlatın. Zaman atlamalı görüntü dizisini işlem hattı çalışma alanına aktarın.
  4. Floresan sinyaline veya morfolojik kriterlere göre her çerçevedeki hücreleri tek tek algılamak için IdentifyPrimaryObjects modülünü dahil edin.
  5. Çerçeveler arasında hücreler arasında zamansal yazışmalar kurmak için TrackObjects modülünü ekleyin ve zaman içinde tek hücreli izlemeyi etkinleştirin.
  6. İzlenen her hücre için floresan yoğunluğu parametrelerini (ör. ortalama, medyan ve entegre yoğunluk) ölçmek için MeasureObjectIntensity modülünü dahil edin.
  7. Aşağı akış analizi için nicel verileri tablo biçiminde (ör. CSV) derlemek ve dışa aktarmak için ExportToSpreadsheet modülünü kullanın.
  8. Elektronik tablo yazılımı gibi istatistiksel veya veri görselleştirme araçlarını kullanarak dışa aktarılan verileri analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiyal sistemlerdeki biyosensörlerin başarılı bir oransal görüntülemesini elde etmek için çeşitli teknik zorlukların ele alınması gerekir.

İfade Sistemi: İlk zorluk, ifade sisteminin seçiminde yatmaktadır; plazmid bazlı, kromozomal olarak entegre, kurucu veya indüklenebilir promotörler tarafından yönlendirilen ve hücre altı hedefleme etiketleri olsun veya olmasın. Bu faktörler, biyosensörün stabilitesini, toksisitesini ve hücreler içindeki lokalizasyonunu önemli ölçüde etkileyebilir (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetik olarak kodlanmış florofor bazlı biyosensörler, canlı hücrelerdeki hücre içi analit konsantrasyonlarının gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar1. Bu biyosensörler tipik olarak, konformasyonel değişiklikleri oransal veya yoğun olarak tespit edilebilen optik sinyallere dönüştürerek çalışır. Yoğunlaştırıcımetrik biyosensörler, tek bir FP'den gelen floresan yoğunluğu değişikliklerine dayanır, bu da onları biyosensör bolluğundaki değişikliklere karşı hassas ha...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Fransız "Agence National de la Recherche (ANR)- PROJET N° ANR-24-CPJ1-0014-01to M.S.'den bir Kıdemli Profesörlük Kürsüsü tarafından finanse edildi ve İspanyol "Agencia Estatal de Investigación (AEI), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades" (TED2021-129691B-I00) ve ayrıca VCR'ye verilen Malaga Üniversitesi Bursu (B1-2022_03) tarafından sağlanan hibelerle desteklendi. Heinrich Heine Üniversitesi'ndeki İleri Görüntüleme Merkezi'ne (CAi) ve Lyon Üniversitesi'nden Lyon Çok Ölçekli Görüntüleme Merkezi'ne (LyMIC) biyosensör görüntüleme ve/veya mikroskopi sistemlerine erişim hakkında verimli tartışmalar için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AğarSigma-Aldrich A.Ş.A5306-250G
CellASIC ONIX plakası Merck KGaAY04C-02-5PK
CellASIC ONIX2Merck KGaACAX2-S0000
CSM-UraThermo Fisher Scientific11387899
D-glukozSigma-Aldrich Co.G8270-100G
D-SorbitolSigma-Aldrich Co.S1876-10MG
NaClSigma-Aldrich CoS9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6sNA7SP8'de GA-MatryoshCaMP6'ların ekspresyonu için
STEDLeicaNA
Maya suşu K601 / W303-1A MAT-aNA8ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNBBocaScientificGCM16.0500
α -Çiftleşme Faktörü asetat tuzuSigma-Aldrich A.Ş.T6901-.5MG
Haploid maya hücreleri için Maya TCS

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38, 2833-2841 (2009).
  2. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nat Cell Biol. 20, 1215-1225 (2018).
  3. Deuschle, K., et al. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18, 2314-2325 (2006).
  4. Kaper, T., Lager, I., Looger, L. L., Chermak, D., Frommer, W. B. Fluorescence resonance energy transfer sensors for quantitative monitoring of pentose and disaccharide accumulation in bacteria. Biotechnol Biofuels. 1, 1-10 (2008).
  5. Yoshinari, A., et al. Using genetically encoded fluorescent biosensors for quantitative in vivo imaging. Arabidopsis Protoc. , 303-322 (2021).
  6. Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1833, 1787-1797 (2013).
  7. Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiol. 187, 485-503 (2021).
  8. Frei, M. S., Mehta, S., Zhang, J. Next-generation genetically encoded fluorescent biosensors illuminate cell signaling and metabolism. Ann Rev Biophys. 53 (1), 275-297 (2024).
  9. Ast, C., et al. Ratiometric Matryoshka biosensors from a nested cassette of green-and orange-emitting fluorescent proteins. Nat Commun. 8, 431(2017).
  10. Stokes, G. G. On the change of refrangibility of light. , Philosoph Transact Royal Soc London. 463-562 (1852).
  11. Santos, E. M., et al. Design of Large Stokes Shift Fluorescent Proteins Based on Excited State Proton Transfer of an Engineered Photobase. J Am Chem Soc. 143, 15091-15102 (2021).
  12. Ejike, J. O., et al. A Monochromatically Excitable Green-Red Dual-Fluorophore Fusion Incorporating a New Large Stokes Shift Fluorescent Protein. Biochemistry. , (2023).
  13. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Sadoine, M. S., Chermak, D., Frommer, W. B. Differential regulation of glucose transport activity in yeast by specific cAMP signatures. Biochem J. 452, 489-497 (2013).
  14. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem J. 432, 399-406 (2010).
  15. Nasu, Y., Shen, Y., Kramer, L., Campbell, R. E. Structure-and mechanism-guided design of single fluorescent protein-based biosensors. Nat Chem Biol. 17, 509-518 (2021).
  16. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2, 31-34 (2007).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9, 676-682 (2012).
  18. Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1833, 1787-1797 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikrobiyal FizyolojiK k Molek l DinamikleriFlorofor Biyosens rlern Vivo G r nt lemeMikrobiyal Yan tlarPerf zyon CihazlarKantitatif FloresanTek H cre G r nt leme
Video yakında

İlgili makaleler