Yöntem makalesi

Dev tek katmanlı vezikülleri güvenilir bir şekilde hazırlamak için damlacık transfer yöntemini kullanma

DOI:

10.3791/68340

⸱

19 Eylül 2025

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yeni başlayanlar kılavuzu, damlacık transfer yöntemi yoluyla Dev Tek Katmanlı Veziküllerin (GUV'ler) hazırlanması için genel bir protokol sunar, kritik adımları tartışır ve sentetik biyoloji ve mikrorobotik dahil olmak üzere farklı uygulamalar için gerekli olası ayarlamalara yardımcı olacak bilgiler sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yirmi yılda, ters çevrilmiş emülsiyon, çift emülsiyon, faz transferi veya emülsiyon transferi olarak da bilinen damlacık transfer yönteminin, Dev Tek Katmanlı Veziküllerin (GUV'ler) hazırlanmasında ve özellikle farklı kargolarla yüklenmesinde avantajlı olduğu kanıtlanmıştır ve bu nedenle sentetik biyolojide çok önemli bir rol oynamaktadır. Kapsüllemenin etkinliği ve uygulamanın basitliği nedeniyle, yapay hücrelerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Literatürde çeşitli parametrelerde büyük bir değişkenlik gözlenmektedir ve bu da son derece değişken sonuçlara yol açmaktadır. Bu kısmen, bu çok yönlü yöntemin farklı ihtiyaçları ve uygulamaları için gereken ayarlamalardan kaynaklanmaktadır, ancak bu tekniğe ilk kez yaklaşan araştırmacılar için kafa karıştırıcı olabilir.

Yeni başlayanlara yöntem ve kritik parametrelerin rolü hakkında temel bir anlayış sağlamak için, damlacık transferi yoluyla GUV oluşumunun altında yatan temel fizikokimyasal ilkelere ilişkin ipuçlarının yanı sıra bir protokol sunulmaktadır. GUV'ların hazırlanmasına yönelik bu adım adım kılavuz, literatüre ve doğrudan deneyime dayalı düşünceleri ve pratik önerileri içerir.

Olası değişkenlik kaynakları göz önüne alındığında, birkaç husus kritik olarak tanımlanmıştır: fosfolipidlerin ışığa, oksidasyona ve hidrolize duyarlılığı; fosfolipidleri çözmek için yağın seçimi (lipid çözeltisi veya LS); ve santrifüjlemeden sonra GUV'ların geri kazanılması. Atmosferik oksijen ve nemin girişimini en aza indirmek için uygun maliyetli önlemler önerilmektedir. Uygun yağ ve fosfolipid kombinasyonlarının belirlenmesine yardımcı olmak için genel protokol, LS'nin ilgili fizikokimyasal özellikleri üzerine bir tartışma ile tamamlanmaktadır. Son olarak, pratik olmayan prosedürlerden kaçınmak için, yağ fazını bir kerede tamamen çıkarmak ve temiz bir GUV dispersiyonu elde etmek için basit ve güvenli bir yöntem önerilmektedir. Bu önlemler, yeni GUV bileşimlerinde yapılan ayarlamaların uygulanmasını hızlandırarak, bunların sentetik biyoloji ve mikrorobotikler de dahil olmak üzere komşu alanlarda benimsenmesini potansiyel olarak genişletiyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipozomlar1 üretmek için daha önce tarif edilen bir tekniği uygulayan Pautot ve ark. çapı0,1 ila 1 μm arasında değişen çaplara sahip lipid veziküller üretmek için bir protokol oluşturmuştur 2. Damlacık transfer yönteminin, daha da büyük veziküllerin (1 μm'yi aşan çaplar)3 üretiminde etkili olduğu hızla kanıtlanmıştır ve uygulama kolaylığı ve yüksek kapsülleme verimliliği nedeniyle giderek daha fazla popülerlik kazanmaktadır. Gerçekten de, şişirme yöntemleriyle (jel şişirme veya elektroformasyon gibi) karşılaştırıldığında, bu protokol, karşılaştırılabilir sayıda vezikül ve ilgili atık oluşturmak için gereken kargo çözeltisinin hacmini azaltır4. GUV'lar, karşılaştırılabilir kapsülleme verimliliğine sahip alternatif yöntemlerle akışkan arayüzlerinden monte edilebilir. Bununla birlikte, mikroakışkan çipler 5,6 veya sürekli damlacık arayüzü geçiş kapsüllemesi (cDICE)7 tabanlı olanlarla karşılaştırıldığında, damlacık transferi, temel ekipmana sahip herhangi bir laboratuvarda uygun fiyatlı en basit kurulumu sunar. Ayrıca, mikroakışkan yöntemler, membranda istenmeyen yağ kalıntıları olan GUV'lara yol açabilir. Bu nedenlerden dolayı damlacık transferi, yapay hücreler 3,8,9,10 ve son zamanlarda mikrorobotik 11,12 alanlarında GUV'lara değerli kargoların yüklenmesi için tercih edilen yöntem olmuştur.

Yöntem, fosfolipidlerin aracılık ettiği su/yağ arayüzlerinin stabilizasyonu yoluyla membran yaprakçıklarının oluşumuna dayanmaktadır. İlk olarak, fosfolipidler bir yağda (lipid çözeltisi, LS) çözülür, daha sonra yağlı LS'de istenen GUV kargosunu (iç çözelti, IS) içeren sulu çözelti ile bir yağ içinde su emülsiyonu hazırlanır. Emülsiyon daha sonra başka bir sulu çözeltinin (dış çözelti, OS olarak adlandırılır) bir su-yağ arayüzü oluşturmak üzere daha önce LS ile dengelendiği bir tüpe aktarılır. GUV'ler, su damlacıkları santrifüjleme yoluyla bu OS/LS arayüzünü geçmeye zorlandığında oluşur: GUV'ların iç broşürü IS damlacıklarının yüzeyinde oluşurken, dış broşür OS ve LS arasında oluşur (Şekil 1).

Birçok protokol varyantı, koşullu deneysel ihtiyaçlara göre ayarlanmış parametrelerle tanımlanmıştır. Süreci optimize etmeye yönelik ilk kapsamlı girişim Moga ve ark.13 tarafından tanımlanırken, Zhang ve ark. ilgili örneklerin çoğunu yakın tarihli bir incelemede14 topladı. Protokolü etkileyen açıklanan birçok parametreye rağmen, yeni bir GUV formülasyonu için bir optimizasyon sürecinin nasıl yürütülebileceğine veya üretimden sonra GUV geri kazanımı ve manipülasyonu için en iyi uygulamalara dair hiçbir gösterge yoktur. Mevcut bilimsel literatüre ve doğrudan deneyimlerimize dayanarak, burada temel ilkeleri tartışırken GUV'ları üretmek için genel bir protokol sunuyoruz. Bunu yaparak, yeni GUV formülasyonlarının optimizasyonu için yararlı endikasyonlar ve protokol için her zaman geçerli olan iki önlem sağlıyoruz: LS'nin kontrollü bir ortamda hazırlanması ve temiz bir GUV numunesinin geri kazanılması için üst yağ fazının kolayca çıkarılmasına yönelik bir yöntem. İki örnek seçtik: biri IS olarak 240 mM sükroz ve LS olarak silikon yağı AR20'de 0,2 mM DOPC (koşul E [boş], bkz. Tablo 1) ve diğeri IS olarak 240 mM sükroz içinde %0,2 1,1 μm polistiren mikropartiküllerden ve LS olarak mineral yağda 3,18 mM DOPC'den oluşur (koşul P [parçacıklarla], Tablo 1'e bakınız). Her iki numune de OS olarak 240 mM glikoz ile üretildi. Bu ozmolariteyi, fizyolojik koşullarda gevşemiş bir lipid zarına (düşük zar gerilimi) sahip GUV'lar elde etmek için seçtik.

figure-introduction-1
Şekil 1: Damlacık transfer yönteminin şematik gösterimi. (A) Ayrı şişelerde üç çözelti hazırlanır: bir lipit çözeltisi oluşturmak için yağdaki fosfolipidler (sarı faz), iç çözelti olarak sakaroz içeren bir çözelti (camgöbeği içinde) ve dış çözelti olarak bir eşosmolar glikoz çözeltisi (beyaz). (B) LS daha sonra kararlı bir emülsiyon oluşturmak için IS ile karıştırılır, daha sonra (C) (D) emülsiyon üzerine dökülmeden önce OS ve LS arasındaki bir arayüzün dengelenmesine izin verilir. (E) Su damlacıkları, (F) GUV'ların oluşumuna izin vermek için merkezkaç kuvveti ile LS/OS arayüzünü geçmeye zorlanır. Şekil ölçekli değildir ve yalnızca yöntemin bir şemasını sağlamayı amaçlamaktadır. Kısaltmalar: LS = lipid çözeltisi; IS = iç çözüm; OS = dış çözüm; GUV = dev tek katmanlı vezikül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Aksi belirtilmedikçe işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Çözeltilerin hazırlanması

  1. Sulu çözeltilerin hazırlanması (IS ve OS)
    1. İki farklı tartım teknesinde 2.16 g glikoz ve Tablo 1'de belirtilen sakaroz miktarını tartın. Tozları iki adet 150 mL'lik behere ekleyin, 40 mL ultra saf su ekleyin ve karıştırarak karıştırın.
    2. Çözeltileri iki adet 50 mL'lik silindire aktarın ve Tablo 1'de belirtilen konsantrasyonlarda 240 mM glikoz çözeltileri ve sakaroz çözeltileri elde etmek için 50 mL'ye kadar ultra saf su ekleyin. Silindirleri bir parça parafilm ile örtün ve silindirleri birkaç kez ters çevirerek çözeltileri karıştırın.
    3. Mikroorganizmalardan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için çözeltileri 50 mL şırıngalar ve 0,22 μm filtrelerle filtreleyin.
    4. P koşulu için aşağıdaki karışımı hazırlayın: 2 μL 100 mg/mL 1.1 μm polistiren partikül dispersiyonu, adım 1.1.1'de hazırlanan 24 μL sakaroz çözeltisi ve 100 μL'ye kadar ultra saf su (nihai süspansiyon: 240 mM sükroz çözeltisinde %0,2 mikropartiküller). Çözeltileri +4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın veya 1,5 mL'lik tüplerde 1 mL alikot hazırlayın ve uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın.
  2. LS'yi kontrollü bir ortamda hazırlamak için bir eldiven odasının kurulması
    1. İç çapı 7 mm, dış çapı 13 mm ve Tablo 2'de belirtilen uzunluklara (1 ila 5 arası borular) sahip beş adet silikon boru kesin.
    2. İç çapı 3 mm, dış çapı 7 mm ve Tablo 2'de belirtilen uzunluklara (6 ila 9 numaralı borular) sahip dört adet silikon boru kesin.
    3. Boru 1'in bir ucunu iki bir vanaya ve diğer ucunu üç bir bağlantıya bağlayın (Şekil 2A).
    4. Boru 2'yi iki vananın diğer uçlarına bağlayın, ardından boru 3'ü ve boru 4'ü, boru 3, boru 1'in karşısındaki uca bağlı olacak şekilde üç bağlantıya bağlayın (Şekil 2A).
    5. Borunun 4 serbest ucunu eldiven haznesinin girişine bağlayın (giriş borusu, Şekil 2B).
    6. Torpido gözüyle birlikte verilen üç vanayı çıkışa bağlayın , ardından vanayı boruya 5 bağlayın (çıkış borusu, Şekil 2C).
    7. Boru 6'nın bir ucunu 18 G'lik bir iğneye ve diğer ucunu iki yönlü bir bağlantıya bağlayın. Bunu boru 7 ve 21 G iğne ile tekrarlayın (Şekil 2D).
    8. İki iğneyi septumlu bir flakon kapağına yerleştirin: bu iğneli kapak, nitrojenin kontrollü girişine ve nitrojen ve kloroformun çıkışına izin verecektir. İğnelerle teması önlemek için kapağı boş kapaksız 50 mL'lik bir tüpte saklayın (Şekil 2D).
    9. Sırasıyla 8 ve 9 numaralı boruları eldiven odasının iç tarafından giriş ve çıkış açıklıklarına sıkıştırın ve yerleştirin (Şekil 2E).
  3. LS'nin Hazırlanması
    1. Torpido gözünü kimyasal başlığın içine veya yanına hareket ettirin. Eldiven haznesini açın ve haznenin dibine silika parçacıklarıyla dolu bir kristalleştirici yerleştirin (Şekil 2F). Kristalizatörü beyaz destek yüzeyi ile örtün ve kağıt havluyla örtün.
    2. Gerekli tüm malzemeleri torpido gözüne yerleştirin (Şekil 2G): bir higrometre, kloroform çözeltisi içinde 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC), yağ(lar) (Tablo 1), temiz 20 mL koyu cam şişeler (açılmış ve ilgili kapaklarla), bir Hamilton şırıngası (Tablo 1), bir P10000 mikropipet ve uçlar. Kloroform solüsyonunu içeren cam şişeyi bir mantar halka tutucuya, 150 mL'lik bir behere veya operatör tarafına mümkün olduğunca yakın başka bir uygun tutucuya koyun.
      NOT: Bu önlem, vakum ve nitrojen akışı döngüleri boyunca eldivenlerin şişmesi ve sönmesi nedeniyle şişelerin devrilmesini önleyecektir.
    3. Torpido gözünü kapatın, iki yarının kaymadığından emin olun ve torpido gözüyle birlikte verilen plastik vidalarla kapatın.
    4. Çıkış vanasını kapatın ve boruyu 5 yarısı suyla dolu 500 mL'lik bir behere daldırın (Şekil 2H).
    5. Giriş borusunun (boru 2) valf ayarlı ucunu vakum hattına ve diğer ucunu nitrojene (boru 3, Şekil 2A) bağlayın. Torpido gözü şimdi Şekil 2J'de gösterildiği gibi tamamen ayarlanmıştır.
    6. Basınçsızlaştırma eldivenleri bükülemeyecek kadar sert hale gelene kadar şişirene kadar valfi ve vakum hattını açın. Vakum hattını ve valfi kapatın.
    7. Basınç eldivenleri eldiven haznesinden çıkacak noktaya kadar söndürene kadar nitrojeni açın. Azot hattını kapatın.
    8. 1.3.6 ila 1.3.7 arasındaki adımları en az 10x tekrarlayın ve iç nemin %40'ın altına düştüğünden emin olun.
    9. Operatörün eldiven giymesini kolaylaştırmak için iç basıncı vakum ve nitrojenle kontrol edin.
    10. Hamilton şırıngasını kullanarak, Tablo 1'de belirtilen kloroform çözeltisindeki DOPC hacmini koyu renkli bir cam şişeye aktarın. Şişeyi adım 1.2.9'da hazırlanan iğneli kapakla kapatın.
    11. Boru 6'yı boru 8'e ve boru 7'yi boru 9'a iki yönlü bağlantılar üzerinden bağlayın (Şekil 2I).
    12. Eldivenleri çıkarın ve çıkış valfini açın.
      NOT: İkinci bir operatör, işlemi hızlandırmak için 1.3.13 ila 1.3.15 arasındaki adımlarda yardımcı olabilir.
    13. Nitrojen akışını çok yavaş açın ve daha önce 5 numaralı borunun yerleştirildiği beherde kabarcıklar gözlemleyerek gaz akışını kontrol edin (adım 1.3.4). Nitrojen akışını, tek tek kabarcıkların gözlemlenebilir kaldığı nispeten yüksek bir hıza ulaşana kadar kademeli olarak ayarlayın. Nitrojenin 3 dakika akmasına izin verin, ardından nitrojen hattını kapatın.
      NOT: Aşırı nitrojen basıncı, kloroformdaki DOPC çözeltisinin şişe boyunca dağılmasına neden olarak sonraki lipid çözeltisi (LS) için mevcut fosfolipid miktarını azaltabilir. Ek olarak, yüksek basınç, iğnelerin şişeden dışarı atılma riskini artırır. Bu nedenle nitrojen akışını, kontrolsüz sıçramaya neden olmadan kloroformu hafifçe karıştıracak optimum seviyeye dikkatli bir şekilde ayarlamak önemlidir.
    14. Bu arada, bir kristalizatörde bir su banyosu hazırlayın ve sıcak bir plaka üzerinde 80 °C'de ısıtın.
    15. Beherdeki son kabarcık çıkana kadar bekleyin, ardından çıkış vanasını kapatın. Eldivenleri tekrar giyin ve 8 ve 9 numaralı boruları iki yönlü bağlantı noktalarından ayırın.
    16. Koyu renkli şişedeki tüm kloroformun buharlaştığını kontrol edin, ardından açın ve kapağı tekrar 50 mL'lik tüpe taşıyın. Yağ şişesini açın, gerekli hacimde yağı (Tablo 1) koyu renkli şişeye aktarın ve kapakla kapatın. Eldivenleri çıkarın ve torpido gözünü açın.
    17. LS'yi parafilm ile kapatın. Şişeyi en az 30 saniye kuvvetlice vorteksleyin. Adım 1.3.14'te hazırlanan su banyosunda 80 °C'de 30 dakika inkübe edin. Şişeyi en az 30 saniye kuvvetlice vorteksleyin. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    18. GUV'ların hazırlanmasına devam edin veya +4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
      NOT: Asimetrik GUV preparatlarında, iki farklı membran yaprakçığı15 elde etmek için arayüz ve emülsiyon için iki farklı LS kullanılabilir.

2. GUV üretimi

  1. Yağın kolayca çıkarılması için bir kap kurma
    1. Bir makasla 5 mL'lik bir tüpün kapağını kesin. Kapağın ortasına ~8 mm'lik bir delik açın ve deliğin bir P1000 ucunun sığmasına ve kilitlenmesine izin verecek kadar geniş olup olmadığını kontrol edin (Şekil 3A). Delik çok darsa, önceki iki adımı tekrarlayın; Çok genişse, kapağı atın ve Adım 2.1.1'den itibaren yenisiyle yeniden başlatın.
    2. 2 x 5 cm'lik bir zımpara kağıdı parçası kesin ve deliği zımparalayın. Delikli kapağı tekrar 5 mL'lik tüpün üzerine yerleştirin ve delikten kalan tüm plastik kalıntıları çıkarmak için 3.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Kapağı çıkarın ve tüpü atın.
    3. Yeni bir 5 mL'lik tüpün kapağını kesin ve delikli kapakla değiştirin. Kapağın üstüne bir O-ring yerleştirin ve delikten bir P1000 ucu sokun. O-halkasını uç ile kapak arasına kilitleyin ve ucun borudan daha fazla aşağı itilemeyeceğini doğrulayın (Şekil 3B). 5 mL'lik tüpü ucundan 5,5 mL OS ile doldurun.
  2. OS/LS arayüz oluşumu
    1. Bir kristalleştiricide su banyosu hazırlayın ve sıcak bir plaka üzerinde 50 °C'de ısıtın.
    2. Bölüm 1.3'te hazırlanan LS şişesini en az 30 saniye kuvvetlice vorteksleyin. LS'yi su banyosunda 50 °C'de 30 dakika ısıtın.
    3. Bölüm 1.1'de hazırlanan su çözeltilerini oda sıcaklığında en az 10 dakika dengeleyin.
    4. 1,5 mL'lik bir tüpe veya adım 2.1'e göre modifiye edilmiş 5 mL'lik bir tüpe 300 μL OS pipetleyin. İşletim sisteminin üzerine 100 μL LS'yi yavaşça pipetleyin ve tüpte iki farklı ve sürekli fazın oluştuğundan emin olun. Arayüzün 10 dakika dengelenmesine izin verin.
      NOT: Homojen bir fosfolipid tek tabakasının oluşumuna izin vermek için, LS OS'nin üstüne homojen bir şekilde dağıtılmalıdır (Şekil 4A). LS tabakası sürekli değilse, LS hacmini bir mikropipetle yeniden dağıtın veya LS hacmini artırın (bu, parafin gibi yüksek viskoziteli yağlarda çok yardımcı olabilir).
  3. Yağda su emülsiyonu oluşumu
    1. 2 mL'lik bir tüpte, pipet, bu sırayla, %2,5 yağ içinde su emülsiyonu için 250 μL LS ve 6,25 μL IS.
      NOT: Deneyimlerimize göre, bu yağdaki su oranı büyük olasılıkla stabil bir emülsiyon sağlar ve böylece protokol başarı oranını artırır (Şekil 5). GUV verimini artırmak için IS/LS oranı yerine emülsiyon hacminin artırılmasını öneririz.
    2. Karışım homojen ve stabil görünene kadar aşağıdaki yöntemlerden birini veya birkaçını kullanarak iki fazı karıştırın: vorteks, standart bir mikrotüp rafı üzerinde mekanik çalkalama veya tüpe parmakla vurma (homojen emülsiyon örnekleri için Şekil 5'i kontrol edin).
    3. Bölüm 2.2'de hazırlanan OS/LS arayüzünün üzerine 200 μL emülsiyon aktarın.
    4. 1,5 mL'lik bir tüp kullanıyorsanız, tüpü kapatmanız yeterlidir; Bölüm 2.1'deki modifiye edilmiş 5 mL'lik tüp kullanılıyorsa, ucun üstüne lastik bir kapak yerleştirin ve tüpü dikkatlice 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  4. Santrifüjleme yoluyla damlacık transferi
    1. Tüpleri Tablo 1'deki göstergeleri izleyerek oda sıcaklığında santrifüjleyin. Santrifüjlemenin sonunda, tüpün dibinde opak bir pelet ve üst kısımda berrak bir yağ fazı olduğunu doğrulayın.

3. GUV kurtarma

  1. Yağ giderme
    NOT: Deneysel ihtiyaçlara göre yağ üç farklı alternatif adımda uzaklaştırılabilir.
    1. GUV'lar standart 1,5 mL'lik tüplerde hazırlanmışsa, peletin bozulmadığından emin olarak son damlalar için bir P1000 pipet ve bir P200 yardımıyla yağı yavaşça çıkarın.
      NOT: Daha dar uçlar yağın çıkarılmasına yardımcı olur, bu nedenle daha küçük hacimler (10-200 μL) için bir ucun P1000 ucuna yerleştirilmesi bu adımın doğruluğunu artıracaktır.
    2. Farklı 1,5 mL'lik tüplerde birden fazla GUV preparatı ile uğraşıyorsanız, yağı bir Büchner şişesi yardımıyla çıkarın. Kalın bir silikon borunun bir parçasını (iç çap 7 mm, dış çap 13 mm) vakum hattına bağlayın ve şişe açıklığına başka bir boru yerleştirin ve lastik bir conta ile kapatın. Bu borunun diğer ucuna bir P1000 ucu yerleştirin, parafilmle sarın, ucun yaklaşık 3 mm'sini kesin ve bir P200 ucuna yerleştirin. Vakumu açın ve yağı P200 ucuyla aspire edin, ardından vakumu kapatın ve son damlaları bir P200 pipetinden çıkarın.
    3. GUV'lar adım 2.1'de ayrıntıları verilen kapta hazırlanmışsa, lastik kapağın çıkmadığından emin olarak ucu tüpten çıkarın (Şekil 3D). Ardından ucu atın ve lastik kapağı, O-halkayı ve delikli kapağı yeniden kullanmak üzere saklayın.
    4. Bir P1000 mikropipet yardımıyla, OS'yi tüpten çıkarın (Şekil 3E), hacmin yaklaşık 50 μL'sini bırakarak peletin bozulmadığından emin olun.
    5. Ucu değiştirin, peleti kalan hacimde yeniden süspanse edin ve 2 mL'lik temiz bir tüpe aktarın.
  2. GUV yıkamaları
    NOT: Bu adımların amacı, adım 3.1'de giderilmeyen yağ fazının izlerini ortadan kaldırmaktır. Gerekirse, tüpte yağ düşüşü gözlenene kadar 3.2.1 ve 3.2.2 adımları tekrarlanmalıdır.
    1. Tüpü 2 mL OS ile doldurun ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüjleyin.
    2. Peletin bozulmadığından emin olarak yaklaşık 50 μL hacim bırakarak işletim sistemini çıkarın.
    3. Son iki adımı tekrarlayın.
  3. Hacim dengeleme
    NOT: Bu bölümü, farklı GUV preparatları arasındaki verimlerin karşılaştırılmasına izin vermek için dahil ediyoruz.
    1. Bir P200 mikropipet ile, peleti adım 3.2.2'nin son tekrarından kalan hacmin 50 μL'sinde yeniden süspanse edin.
    2. Pipeti 20'ye ayarlayarak ve sıvının ucun içine akmasını sağlamak için tüp duvarına dokunmadan uç GUV dispersiyonuna daldırılarak hacmi artırarak bu hacmi ölçün.
    3. 100 μL'lik son hacme ulaşmak için işletim sistemi ekleyin.

4. Gözlem ve boyutsal analiz

  1. Mikroskobik görüntü elde etme
    1. Tüpe parmağınızla vurarak GUV dağılımını hafifçe karıştırın.
    2. Bir Burker haznesine 10 μL GUV numunesi yükleyin ve GUV'ların haznenin dibinde çökelmesine izin vermek için en az 5 dakika bekleyin.
    3. Numuneyi faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin. Burker çizgilerini referans olarak kullanarak, numune boyunca hareket edin ve gözlem alanlarının çakışmadığından emin olarak en az 20 görüntü elde edin.
  2. Boyutsal analiz
    1. Görüntüleri ImageJ'ye yükleyin.
    2. Piksel/μm dönüştürme faktörünü hesaplamak için, Burker odasının 50 x 50 μm karesini gösteren bir resim seçin (doğru tanımlama için üreticinin veri sayfasına bakın), ardından düz çizgi seçim aracını seçin, karenin ardışık iki köşesi arasına bir çizgi çizin ve Analiz | Ölçün. 3x tekrarlayın ve ortalama değeri hesaplayın.
    3. Analiz Et'e tıklayarak dönüşüm faktörünü ayarlayın | Ölçeği ayarlayın. Adım 4.2.2'deki değeri Piksel cinsinden Mesafe kutusuna girin, ardından Bilinen Mesafe alanına 50 değerini ve Uzunluk birimine μm değerini girin.
    4. Analiz Et'e tıklayın | Ölçümleri ayarlayın ve Alan kutusunu seçin. Oval seçim aracını seçin, ardından farenin sol düğmesine tıklayın ve ortaya çıkan daireyi bir GUV'un etrafında üst üste bindirmek için shift tuşunu basılı tutun. Analiz Et'e tıklayarak çapı ölçün | Ölçün. Bunu her görüntüdeki her GUV için tekrarlayın.
    5. Sonuçlar penceresinde, Dosya | Farklı kaydet... GUV'un alanının csv dosyasını dışa aktarmak için, ardından GitHub16'da bulunan komut dosyasıyla boyut dağılımını analiz edin.
      NOT: Adım 4.2.3'ü atlamak ve piksel/μm dönüştürme faktörünü belirten komut dosyasını çalıştırmak mümkündür. Bu değeri hesaplamak için 4.2.2 adımında elde edilen değeri 50'ye bölün.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimal bir GUV hazırlığı, berrak bir yağ fazı ve farklı bir pelet oluşumu ile karakterize edilir (Şekil 4A). Su damlacıklarının GUV'lara dönüşemediği durumlarda, tipik olarak çökerler ve OS/LS arayüzünde fosfolipid kalıntıları bırakırlar (Şekil 4C). Bu etki büyük olasılıkla, su/yağ arayüzünde fosfolipidlerin yetersiz dengelenmesinden kaynaklanan, fosfolipidlerin ve diğer moleküllerin yağ fazından toplanmasından kaynaklanır. Bununla birlikte, görünür bir topak olmamasına veya arayüzde döküntü bulunmasına rağmen, GUV'lar hala oluşabilir ve bu da sürecin devam etmesine izin verir. Yıkama adımları tüm fosfolipid kalıntılarının giderilmesinde tamamen etkili olmasa da, yağ damlacıklarının ortadan kaldırılmasına önemli ölçüde yardımcı olarak genel numune kalitesini artırır ( Şekil 6A ve Şekil 6B'yi karşılaştırın).

Yüksek nem koşullarında hazırlanan eski LS veya LS'nin kullanımı, genellikle daha düşük verim ve büyük olasılıkla fosfolipidler ve yağ fazından diğer moleküller tarafından oluşturulan daha yüksek düzensiz agrega içeriği ile azaltılmış GUV dispersiyonları ile sonuçlanır (Şekil 6C). Yüksek nem koşullarında hazırlanan LS için, GUV üretiminde (çok az GUV içeren numunelerle) 0,8'in üzerinde varyasyon katsayıları gözlemledik, modifiye edilmiş eldiven haznesinde hazırlanan LS için ise varyasyon katsayısı 0,5'in altındaydı.

Farklı santrifüjleme koşulları GUV verimini ve kalitesini etkileyebilir. Kalitatif bir analizden, 3.300 × g'da 20 dakika, sakaroz yüklü GUV'ler için iyi bir koşul olarak tanımlandı (örnek E). Hızın düşürülmesi (500 × g'da 45 dakika) verimin düşmesine neden olurken, bir artış (16.600 × g'da 5 dakika) daha yüksek düzensiz fosfolipid agregatlarının oluşumuna yol açtı. Zayıf bir merkezkaç kuvveti, birçok damlacığın OS/LS arayüzünü geçmesini engelleyebilir, dolayısıyla verim azalırken, güçlü bir kuvvet, arayüz geçişi sırasında dış broşür üzerindeki fosfolipidlerin organizasyonu için yeterli zaman sağlamayabilir (Şekil 7). Mikropartiküllerin kapsüllenmesi, mikropartiküllerin kütle yoğunluğunun kabaca IS'ninkiyle eşleşmesi koşuluyla, santrifüjleme parametrelerinde yapılan ayarlamalarla da optimize edilebilir. Bu amaçla, santrifüjleme ivmesinin düşürülmesi (ve dolayısıyla santrifüjleme süresinin arttırılması), katı parçacıkların uyguladığı kuvvet nedeniyle fosfolipidik membranın kırılmasını önleyerek parçacıkların daha homojen bir şekilde kapsüllenmesine olanak tanır (iyi bir kapsülleme örneği, optimal santrifüjleme parametrelerinin araştırılması halen devam ederken Şekil 6D'de gösterilmektedir17).

Fosfolipidlerin difüzyonu yağ fazından etkilenebileceğinden, emülsiyonun stabilitesini değerlendirmek için basit bir kalitatif test yapılabilir (Şekil 5). Görselleştirmeyi iyileştirmek için IS'de çözünmüş bir renklendirici boya (Brilliant Blue FCF) yardımıyla, farklı su/yağ oranlarına sahip emülsiyonlar hazırlanabilir ve zaman içinde gözlemlenebilir. Stabilitedeki kayıp, su damlacıklarının toplanması ve bunun sonucunda yağ fazından ayrılması ile görselleştirilebilir. Büyük damlacıkların (çıplak gözle görülebilen) GUV'lara dönüşme olasılığı daha düşük olduğundan, en az faz ayrımı sağlayan emülsiyon koşulunu kullanmanızı öneririz.

Protokoldeki varyasyonların etkisi, protokol bölüm 4'te açıklandığı gibi bir boyut dağılım analizi ile doğrulanabilir: GUV'ların çapları, faz kontrastlı mikroskop görüntülerinden ImageJ kullanılarak ölçülebilir ve boyut dağılımı, GitHub16'da bulunan bir komut dosyası ile analiz edilebilir. Bu protokolü takiben, örneğin, silikon yağı AR20 yerine mineral yağ seçildiğinde daha büyük çaplı GUV'larda bir artış gözlemlemek mümkün olmuştur (Şekil 8).

figure-results-1
Şekil 2: Torpido gözü kurulumu. Bu şekil, lipid çözeltisi hazırlama için torpido gözündeki ana değişiklikleri göstermektedir. (A) Azot ve vakum ile giriş bağlantısı; (B) torpido gözü ile giriş bağlantısı; (C) çıkış valfi; (D) solvent buharlaştırması için iğne taşıyan kapak; (E) solvent buharlaşması için ince borular; (F) nemi emmek için silika parçacıkları; (G) torpido gözüne yerleştirilecek öğeler: dijital termo-higrometre (1), organik çözücü içinde lipit çözeltisi (2), mantar halka tutucu (3), cam şırınga (4), septum ve iğneli açık kapak (5), yağ çözeltisi (6), kapaklı açık koyu renkli flakon (7), 10 mL uçlar (8), P10000 pipet (9); (H) çıkış borusu ucu suya batırılmış; (I) giriş ve çıkışa bağlı iğneli kapakla kapatılmış şişe; (J) modifiye edilmiş eldiven odasının şemaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 3: Yağın kolayca çıkarılmasını sağlayan kap. Protokol bölüm 2.1'e göre yağın kolayca çıkarılması için GUV'ların bir kapta hazırlanmasındaki ana adımlar. (A) Bir P1000 ucunun sığmasına izin vermek için 5 mL'lik bir tüp kapağında bir delik açılır; daha sonra (B) kapak, ucu bir O-ring aracılığıyla deliğe sokulacak şekilde 5 mL'lik boş bir tüpe yerleştirilir. (C) Çözeltiler, protokol bölümleri 2.2 ve 2.3'e göre tüpe yerleştirilir, uç kapatılır ve tüp 50 mL'lik bir tüpün içine yerleştirilir. Silikon yağında 0,2 mM DOPC'den hazırlanan GUV'lar, görselleştirmeyi geliştirmek için 230,7 mM sükroz ve 3,1 mM Brilliant Blue FCF ile yüklendi. (D) Santrifüjlemeden sonra, üst yağ fazı, GUV tamponunun bir kısmı ile birlikte ucun içinde tutulur (damlacıkların bir kısmının GUV'lara dönüşememesi ve boyayı işletim sisteminde serbest bırakması nedeniyle camgöbeği görünür). Kauçuk kapak sayesinde uç, sıvı içeriğiyle birlikte 5 mL'lik tüpten kolayca çıkarılabilir, böylece tüm yağ fazının hızlı ve kolay bir şekilde çıkarılmasına olanak tanır. (E) GUV peleti, faz kontrast mikroskobu ile doğrulandığı (F) gibi, belirgin bir yağ kirliliği olmaksızın, berrak bir dispersiyon halinde bir tüpün dibinden kolayca toplanabilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: LS = lipid çözeltisi; IS = iç çözüm; OS = dış çözüm; GUV = dev tek katmanlı vezikül; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 4: GUV oluşumu. (A) OS/LS arayüzü, (B) berrak bir yağ fazına sahip temiz bir GUV peleti ve (C) OS/LS arayüzünde döküntü bulunan bir GUV peleti örnekleri (bu GUV popülasyonunun IS'si görselleştirmeyi geliştirmek için 1.65 mM Yeni Kok boyası ile desteklendiği için döküntü ve pelet kırmızımsı görünür). Kısaltmalar: LS = lipid çözeltisi; IS = iç çözüm; OS = dış çözüm; GUV = dev tek katmanlı vezikül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 5: Farklı yağ ve yağ içinde su oranlarında emülsiyon stabilitesi. Şekil, yağın türüne ve kullanılan su/yağ (w/o) oranına bağlı olarak emülsiyonların zaman içindeki stabilitesini göstermektedir. IS, emülsiyonların görselleştirilmesini geliştirmek için 230.7 mM sükroz ve 3.1 mM Brilliant Blue FCF'den oluşuyordu. Mineral yağ ile hazırlanan emülsiyonlar, AR20 silikon yağı ile yapılan muadillerine göre daha az kararlıdır. Bu etki, artan w/o oranlarıyla daha da güçlendirilir. Silikon yağı AR20'deki emülsiyonlar önemli ölçüde daha kararlı olmasına rağmen, emülsifikasyondan hemen sonra görülebilen faz ayrımı ile w/o oranı arttıkça stabiliteleri de azalır ('da silikon yağı AR20). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 6: GUV'ların faz kontrast mikroskobu ile gözlemlenmesi. Mineral yağda 3,18 mM DOPC'den oluşan bir LS'den hazırlanan sakaroz yüklü GUV'ların 20x büyütmesi. (A) Yağın çıkarılmasından sonra geri kazanılan numune; (B) yıkama adımlarından sonra geri kazanılan numune; (C) düzenlenmemiş oksijen ve nem içeren ortamlarda hazırlanan bir LS'den elde edilen zayıf GUV verimi; (D) mikropartikül yüklü GUV'lar. Ölçek çubuğu = 10 μm; Yağ damlaları daire içine alınır ve düzensiz fosfolipid ve yağ molekülleri kümelerinin örnekleri bir okla gösterilir. Kısaltmalar: LS = lipid çözeltisi; GUV'lar = dev tek katmanlı veziküller. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 7: Farklı santrifüj koşullarının GUV oluşumu üzerindeki etkisi. AR20 silikon yağı içinde 0,2 mM DOPC'den oluşan bir LS ile hazırlanan sakaroz yüklü GUV'ların faz kontrastlı görüntüleri. Şekil, (A) 5 dakika boyunca 16.600 × g , (B) 20 dakika boyunca 3.300 × g ve (C) 45 dakika boyunca 500 × g'da GUV'ların kalitatif bir karşılaştırmasını göstermektedir. Yüksek santrifüjleme hızı, fosfolipid agregalarının daha yüksek varlığına neden olurken, düşük santrifüjleme hızı, verimin düşmesine neden olur. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: LS = lipid çözeltisi; GUV = dev tek katmanlı vezikül; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 8: Boyut dağılımı analizi. Mineral yağda (A) 0,2 mM DOPC ve (B) silikon yağı AR20'de 0,2 mM DOPC'den elde edilen iki sakaroz yüklü GUV numunesinin karşılaştırılması (*numune, faz kontrast mikroskobu altında GUV'ların net bir şekilde ayırt edilmesini sağlamak için 10 kat seyreltildi). Protokol bölüm 4'ü takiben gerçekleştirilen analiz, silikon yağı AR20 numunelerine göre mineral yağ numunesi için daha yüksek çaplara doğru kaymış bir boyut dağılımını göstermektedir. Bununla birlikte, silikon numunesinin verimi neredeyse 20 kat daha yüksektir. Kısaltmalar: GUV = dev tek katmanlı vezikül; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

AdımDurum EDurum PAçıklama
1.1.14,11 gr17,11 grSükroz kütlesi
1.1.12,16 gr2,16 grGlikoz kütlesi
1.1.2240 milyon1000 milyonSükroz konsantrasyonu
1.1.2240 milyon240 milyonGlikoz konsantrasyonu
1.3.2Silikon yağıMineral yağLS için yağ fazı
1.3.20,1 mL cam şırınga0,5 mL cam şırıngaDOPC'yi kloroform çözeltilerinde aktarmak için cam şırınga
1.3.1063 μL500 μLKloroform çözeltisindeki DOPC hacmi
1.3.1610 milyon L5 milyon litreYağ hacmi
2.4.13300 gr 20 dakika500 gr 45 dakikaSantrifüj koşulu

Tablo 1: Protokoldeki varyasyonlar. Tablo, iki farklı GUV popülasyonu hazırlamak için protokolün çeşitli adımları (ilk sütunda belirtilmiştir) için varyasyonları bildirmektedir: sakaroz yüklü GUV'ler (koşul E) ve mikropartikül yüklü GUV'ler (koşul P).

KİMLİĞİİlgili adımlarİç çap (mm)Dış çap (mm)Uzunluk (mm)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

Tablo 2: Torpido gözündeki gaz ve vakum bağlantıları için borular. Tablo, torpido gözünü nitrojen ve vakum hatlarına bağlamak için kullanılan silikon boruların boyutlarını listeler. Montaj sürecini kolaylaştırmak için referans kimlikleri sağlanır.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GUV üretim yöntemleri iki ana gruba ayrılabilir: hidrasyon yoluyla substratlardan şişmeye dayalı yöntemler ve sıvı arayüzlerinden montaja dayalı yöntemler. Birinci gruptaki yöntemler, lipid membranların veya transmembran proteinlerin biyofiziksel karakterizasyonları için büyük GUV popülasyonları sağlamada çok etkilidir. Buna karşılık, damlacık transferi gibi yöntemler, daha az kargo tüketimi ve daha yüksek kapsülleme verimliliği nedeniyle öncelikle kargo kapsülleme için seçilir18.

Bu nedenle, GUV'larda çok sayıda farklı kargo kapsüllenmiştir, bu da damlacık transferini yapay hücreler 3,8,9,10 için bir referans süreci ve yeni biyomimetik mikrorobotlar 11,12 oluşturmak için olası bir çözüm haline getirmektedir. GUV membranlarının fizikokimyasal özelliklerini modüle etmek için, iyonik fosfolipidler10, yağ asitleri19, PEG20 gibi polimerler veya kolesterol21 gibi farklı moleküller dahil edilebilir (kolesterol gibi hidrofobik moleküllerin yağ için yüksek bir afinitesi olmasına rağmen, şişme yöntemlerine göre membran bileşiminin daha düşük bir kontrolü ile sonuçlanır22). Protokol, bu değişikliklere izin verecek kadar çok yönlüdür, ancak bazı adımların etkisi diğerlerinden daha yüksektir.

Yöntemin kritikliklerini tartışmak için, burada iki farklı GUV popülasyonunun hazırlanması için bir protokol tanımladık: bir sakaroz çözeltisi içeren GUV'ların bir preparatı ve bir mikropartikülleri kapsülleyen GUV'ların preparatı. Protokoldeki farklılıklar Tablo 1'de koşul E (boş) ve koşul P (parçacıklarla) olarak detaylandırılmıştır. Bu yöntem, fosfolipidler23 tarafından yönlendirilen ve ilgili üç fazın (IS, OS ve LS) fizikokimyasal özelliklerinden etkilenen iki durumlu bir süreçte su damlacıklarını bir yağ fazından bir su fazına aktararak GUV'ların oluşumuna izin verir.

Üçü arasında LS, fosfolipidlerin ışığa, oksidasyona ve hidrolize duyarlılığı nedeniyle en hassas olanıdır 24,25,26. Bu nedenle, fosfolipidlerin -20°C'de uzun süreli depolanması için kullanılan organik çözücünün (tipik olarak kloroform veya metanol) buharlaştırılmasının ilk adımı, nitrojen veya argon akışı altında kehribar şişelerde gerçekleştirilmelidir. Laboratuvar ortamında düşük nem seviyeleri sağlanmazsa fosfolipitler zarar görebilir13, 14, 27. Bu nedenle LS, torpido gözü veya bu protokolde açıklanan uygun maliyetli modifiye torpido gözü gibi kapalı bir ortamda hazırlanmalıdır. Yağ, lipit filme eklendikten sonra, LS eldiven odasından çıkarılabilir ve fosfolipidlerin tamamen çözünmesi, çözeltinin vortekslenmesi ve ısıtılmasıyla gerçekleştirilir.

Bazı protokoller bu adım13'te sonikasyonu içermesine rağmen, sıcaklıktaki lokalize artışlar bazı LS formülasyonları için henüz tanımlanmamış hasarlara yol açabilir. Bu nedenle çözeltinin su banyosunda ısıtılması daha kontrollü ve homojen bir işlem sağlayabilir. LS'ye zarar verme olasılığını daha da azaltmak için, bu protokol iki farklı sıcaklığın kullanılmasını önerir: yeni hazırlanmış bir LS'nin çözünmesi, önceden çözünmüş bir LS'den daha yüksek enerji gerektirdiğinden (cam şişenin yüzeyine yayılan filmde fosfolipid moleküllerinin daha yoğun bir şekilde paketlenmesi nedeniyle), ilk lipid film çözünmesi için 80 °C ve fosfolipidleri kullanımdan hemen önce basitçe yeniden çözmek için 50 °C benimsenmiştir. Mineral yağda 3.18 mM DOPC için genellikle zaman içinde performans değişkenliğinde bir artış gözlendiğinden (Şekil 4C), LS'nin bir hafta içinde kullanılması genel olarak önerilen bir uygulamadır. Bununla birlikte, bazı yağ ve fosfolipid kombinasyonlarının kullanım ömürleri uzayabilir ve bir eldiven odasının kullanılması da zaman içinde LS'nin stabilitesini iyileştiriyor gibi görünmektedir.

GUV membranlarının belirli fosfolipid kombinasyonlarıyla özelleştirilmesi, protokolün özel olarak uygulanmasını gerektirebilir. Tüm olası varyasyonlar arasında gezinmek için, LS'nin fizikokimyasal özelliklerinden rehberlik alınabilir. LS'deki kritik misel konsantrasyonları (CMC) ve fosfolipidlerin yayılımı, çözelti28'deki moleküllerle kimyasal etkileşimlerden etkilenir. Bu nedenle IS/LS emülsiyonunda su damlacıklarının oluşumu, fosfolipidlerin yağ fazında ne kadar hızlı yayılabildiğinden ve stabil bir tek tabaka (zarın iç yaprakçığı) oluşturmak için su/yağ arayüzlerine ulaşabildiğinden etkilenir. Bu protokolde kullanılan iki yağ için difüzivitede farklılıklar gözlendi ve silikon yağı AR20, IS/LS emülsiyonunun daha yüksek bir stabilitesini sağladı (Şekil 6). Her iki yağ için de en kararlı emülsiyon, su %2,5 oranında dağıldığında gözlemlendiğinden (mineral yağ13'teki önceki gözlemlerle tutarlı olarak), bunu genel olarak geçerli bir oran olarak sabitledik.

Bununla birlikte, daha yüksek oranlar faydalı özellikler sağlayabileceğinden (örneğin, mineral yağdaki POPC daha büyük GUV'lara13 doğru bir kayma gösterdi), emülsiyonun stabilitesi ve dolayısıyla kapsüllemenin beklenen verimliliği hakkında bilgi sahibi olmak için Şekil 6'da bildirilenlere benzer bir ön kalitatif test yapmanızı öneririz. Burada, okuyuculara emülsiyonun oluşumu için kesin zamanlamaya veya prosedürlerin yinelemelerine güvenmemelerini tavsiye ediyoruz çünkü etkinlik kesinlikle operatöre veya benimsenen cihaza bağlıdır. Bunun yerine, operatörün emülsiyon kalitesinin - en azından teorik olarak - damlacıkları GUV'lara dönüştürme şansını en üst düzeye çıkaracak kadar iyi olduğunu anlamasına yardımcı olacak bir kontrol noktası sağlıyoruz. Fosfolipidlerin yağdaki yayılımı, damlacık transferi sırasında yeniden düzenlenme ve GUV membranının 2,7,18,29 dış broşürünü oluşturma yeteneklerini de etkiler. Bu adım, LS/OS arayüzünün uygun bir şekilde dengelenmesiyle desteklenir. Bu protokol tarafından benimsenen inkübasyon süresi genel tavsiyeler18 ile uyumlu olsa da, önceki raporlardan7 alınan arayüzey gerilimi ölçümleri ve ön deneylerimiz ile farklı LS ile hazırlanan GUV'lar daha uzun inkübasyon süresinden faydalanabilir.

Dış broşürün oluşumu, üç fazın30 yoğunluğuna ve viskozitesine bağlı bir adım olan LS/OS arayüzünü geçen su damlacıklarının hızından da etkilenir. Yoğunluk farklılıkları her zaman şu sırayı takip etmelidir: IS > OS > LS. Bu, önce IS damlacıklarının LS/OS arayüzüne doğru çökelmesine, ardından GUV'lara dönüştürülmek üzere arayüzün geçişine ve tüpün dibine doğru çökelmesine izin vermek için gereklidir. Deiyonize su hem IS hem de OS23 olarak kullanıldığında bile süreç kendiliğinden gerçekleşebilse de, GUV oluşumunu desteklemek için IS ve OS arasında bir yoğunluk farkı ortaya konmuştur31. Bu amaç için en yaygın çift, IS'deki sakaroz ve OS'deki glikozdur: ozmotik stres nedeniyle oluşan GUV'ların zarar görmesini önlemek için gereken eşozmolar konsantrasyonlarda sakaroz, glikozdan daha yoğun bir çözelti sağlar. Yoğunluk farkı bu çözeltilerin ozmolaritesi ile arttığından, GUV'ların verimi buna göre değişir ve 600 mOsm13'ün ötesinde başka bir gelişme gözlenmez.

Optimum santrifüjleme koşulları, üç fazın yoğunluğu ve viskozitesi ile fosfolipidlerin yayılımı ile sıkı bir şekilde bağlantılıdır. Üç fazın tam bir karakterizasyonunun yokluğunda, birden fazla koşul taranmalıdır. Kalitatif testlerden (Şekil 4E ve Şekil 5) ve ön sistematik analizden17, bu protokolde açıklanan iki numune için iyi santrifüj koşulları tanımlamak mümkün olmuştur; Yine de, daha fazla koşul taranırsa numunelerin kalitesi iyileştirmeye açıktır. LS'deki fosfolipid yayılımı ile üç fazın yoğunluğu ve viskozitesi arasındaki denge düzgün bir şekilde korunmadığında, fosfolipidler LS/OS arayüzünde dengelenmek ve su damlacıkları OS'ye doğru hareket ettikçe doğru şekilde yeniden düzenlemek için yeterli zamana sahip değildir. Bu genellikle, muhtemelen santrifüjleme sırasında GUV'larda bir araya gelemeyen damlacıklar tarafından sürüklenen fosfolipidler ve diğer yağ fazı moleküllerinden oluşan, arayüzde veya hemen altında beyazımsı bir çökelti oluşumuna yol açar.

Homojen bir çözeltinin kapsüllenmesi, OS ile ozmotik bir dengeyi korurken (sakaroz-glikoz çifti için olduğu gibi) IS yoğunluğunun arttırılmasıyla gerçekleştirilebilir, ancak bir mikropartikül dispersiyonunun kapsüllenmesi, sulu fazın yoğunluğunun mikropartiküllerin32 yoğunluğuyla eşleşmesini gerektirir. Kargo kapsüllemenin verimliliği, kargo çözeltisinin/dispersiyonunun kimyasal bileşiminden de etkilenir. Önceki raporlar, büyük olasılıkla fosfolipidlerin zwitteriyonik hidrofilik başlarının net yükündeki etkileşimler veya kaymalar nedeniyle, birçok alkali metal halojenür33 veya pH varyasyonlarının13 neden olduğu GUV verimi üzerinde olumsuz bir etki göstermiştir. Bu nedenle, biyolojik reaksiyonların (enzimatik veya hücresiz protein sentezi gibi) kapsüllenmesi, pH ve tuz konsantrasyonlarının (KCl veya NaCl gibi) reaksiyonun kendisi için optimal olmayan seviyelere ayarlanması gerektiğinden, genellikle bir uzlaşma gerektirir. Bununla birlikte, hücresiz protein sentezi gibi karmaşık reaksiyon karışımları bile, fonksiyonel GUV bazlı yapay hücreler sağlamak için modifiye edilebilir34.

Pratik açıdan bakıldığında, damlacık transfer yöntemi çok basit bir süreç sunsa da, GUV'ların işletim sisteminden kurtarılması bazı sınırlamalar getirebilir. Santrifüjleme adımından sonra yağın üst fazdan çıkarılmasına yardımcı olmak için, daha ince bir çıkarma için iki pipet ucundan (protokol adımı 3.1.1) veya birden fazla numune hazırlandığında daha hızlı çıkarma için bir Buchner şişesinden (protokol adımı 3.1.2) yararlanmak mümkündür. Bununla birlikte, yağ tamamen uzaklaştırılmadığından, temiz bir GUV dispersiyonu elde etmek için bir yıkama adımı gerçekleştirmek gerekir (protokol adımı 3.2). Yıkama adımları, kayda değer bir GUV kaybı olmadan artık yağ damlacıklarının etkili bir şekilde uzaklaştırılmasıyla sonuçlansa da (Şekil 4A,B), bu geçiş yüksek viskoziteli yağ ile daha az basit olabilir ve birden fazla GUV formülasyonu hazırlanırken çok zaman alıcı olabilir. Yağın çıkarılmasını atlamak ve GUV'yi bir iğne35 yardımıyla açılan bir delikten tüpün tabanından kurtarmak için alternatif bir yöntem tarif edildi. Ancak bu işlem, tüp uygun konumda delinmezse GUV peletinin tamamen geri kazanılmasına izin vermeyebilir ve ayrıca operatör için potansiyel olarak zararlıdır.

GUV geri kazanımına yardımcı olmak için, burada yağ fazını hızlı bir şekilde çıkarmak için yeni ve basit bir yaklaşım sunuyoruz. Bu, üst, daha az yoğun yağ fazının kapaklı bir pipet ucunda tutulmasına dayanır, böylece santrifüjlemeden sonra uç, sıvı damlamayacak şekilde çıkarılabilir. Bu basit strateji, tüm yağ fazının bir kerede hızlı ve kolay bir şekilde çıkarılmasını sağlayarak bu zaman alıcı adımı sürekli olarak basitleştirir.

Protokolün verimliliğini değerlendirmek için, sayımı ve boyut dağılımı analizini hızlandırmak için GUV'ların otomatik tespiti için birkaç yöntem uygulanmıştır. GUV'ların floresan problarla etiketlenmesi, hem akış sitometrisine36,37 hem de daire algılama algoritmaları 13,37,38,39 ile birlikte mikroskop görüntülemeye uygulanan basit ve etkili bir strateji sağlar. Daha yakın zamanlarda, bu süreci iyileştirmek için nesne algılama için yapay zeka tabanlı araçlar araştırılmaktadır40,41. Bununla birlikte, floresan boyalar potansiyel olarak GUV özelliklerini etkileyebilir ve dolayısıyla analizde artefaktlara neden olabilir. Tespit edilebilir floresan sinyali hariç tutulursa, mikroskopi en güvenilir seçenek olmaya devam etmektedir ve faz kontrast mikroskobu, optimum görselleştirme18 ve daire algılama algoritmalarının38 uygulanması için tercih edilen yöntemdir.

Alternatif olarak, benzersiz tespit stratejileri için belirli formülasyonların kendine özgü özelliklerinden yararlanmak mümkündür. Örneğin Hadorn ve diğerleri, empedans tabanlı bir hücre sayacı33 ile GUV'ları tespit etmek için IS'deki elektrolitlerin varlığından yararlandı. Bu otomatik veya formülasyona özgü yöntemlerin hiçbiri mümkün olmadığında, manuel daire açıklaması evrensel olarak uygulanabilir bir geri dönüş olmaya devam eder. Bu gibi durumlarda ImageJ, süreci hızlandırmak ve bu protokolde açıklandığı gibi ham çap ölçümlerini kolayca çıkarmak için pratik bir araç sunar.

Damlacık transfer yönteminin geniş çapta benimsenmesine rağmen, yeni GUV formülasyonları için gerekli optimizasyon süreçlerine çok az dikkat edilmektedir. Bu çalışmada, bu optimizasyonu yönlendirmek ve basitleştirmek için sistematik bir protokol uygulamak için literatürden elde edilen bilgileri topladık. Bu pratik kılavuz, yeni GUV formülasyonlarının üretiminde ve protokol13,14'ün genellikle gözden kaçan bir yönü olan minimum düzeyde yağ ile kirlenmiş bir numunenin geri kazanılmasında yer alan temel ilkeleri ele almaktadır. Herhangi bir GUV formülasyonunun gerektirdiği optimizasyonu tahmin etmek mümkün olmasa da, bu kılavuz, potansiyel olarak yapay hücreler ve mikrorobotlar dahil olmak üzere uygulamalara yol açan yeni GUV'ların uygulanmasını hızlandırmak için yararlı ipuçları ve bilgiler sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek hiçbir çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu sonuçlar, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı (Hibe sözleşmesi No. 948590) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) fon alan CELLOIDS (Hücreden ilham alan parçacık tabanlı akıllı mikrorobotlar) projesinin bir parçasıdır. Bu çalışma kısmen Avrupa Komisyonu tarafından NextGenerationEU BRIEF Projesi aracılığıyla desteklenmiştir. Torpido gözünün kurulumundaki teknik destek ve yağın kolayca çıkarılması için kabın uygulanmasına ilişkin faydalı tartışma için Michele Ibrahimi'ye teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 &mikro; m karışık selüloz esterleri membranı  Şırınga filtreleriMerckSLGSVR255F
1,5 mL'lik tüplerBiyosınıf06.0279.00
100 μ L cam şırıngaMerck20737
150 mL beherAvantor 213-1123En az 3
20 mL koyu cam şişeler ND24Avantor 548-9001A
2 mL'lik tüplerBiyosınıf07.3534.99
50 mL silindirAvantor 612-3843
500 μ L cam şırıngaHamilton549-1166
50 mL Falcon tüpüMerckCLS352070
50 mL Şırınga Fisher Bilimsel8SS50L1
5 mL'lik tüplerGreiner biyo-on622201
600 mL beherAvantor 213-1126
Bü Chner ŞişesiMerckZ740682
Yuvarlak tabanlı şişeler için mantar halkalarAvantor 217-1000
KristalleştiriciDutscher080474A
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG8270 Serisi
D-(+)-SükrozSigma-AldrichS9378 Serisi
Dijital termo-higrometreBohlenderV1863-07 Serisi
Görüntü YönetmeniAvanti Araştırma850375C
AlıştırmaDremel4000
Erioglaucine disodyum tuzu (Brilliant Blue FCF)Sigma-Aldrich861146
G18 şırınga iğnesiTerumoAN1838R1
G21 şırınga iğnesiTerumoAN2138R1
Torpido gözüBel-SanatF50030-0000 SerisiVarsa torpido gözü kullanılabilir ancak nem oranı düşük laboratuvarlarda gerekli olmayabilir
Sıcak plaka manyetik karıştırıcıLLG Laboratuvar Gereçleri6.263 448
Hafif mineral yağSigma-Aldrich330779
Yeni kokinSigma-Aldrich199737
Nitril Kauçuk O-Ring O-Ring, 8mm Delik, 12mm Dış ÇapRS196-4863
Septum ND24 ile açık vidalı kapaklarAvantor 548-0031A
P1000 mikropipetFisher Bilimsel12346132
P10000 mikropipetAvantor 89079-978
P200 mikropipetFisher Bilimsel12326132
Kağıt havlularAvantor KIMB6657
ParafilmAvantor 291-1214
Pipet uçları (1000)Eppendorf Belediyesi0030000919
Pipet uçları (10000)Eppendorf Belediyesi0030000765
Pipet uçları (200)Eppendorf Belediyesi0030000870
Polistiren parçacıklar, 1.1 µ mSigma-AldrichLB11-1ML
Kauçuk kapakBiyosınıf S.r.l.12.2300.05
Kauçuk konik contaAvantor 217-0211
Vida kapakları  ND24Avantor 548-0161A
Silikon yağı AR20Sigma-Aldrich10836
Silikon boru (iç çap 1,6 mm, dış çap 3 mm)RS667-8441
Silikon boru (iç çap 6 mm, dış çap 12 mm)RS273-2541En az 6 m
Üç kavşakRS795-405
İki yönlü kavşakRS419-7287
İki vanaŞakacı91280
Ultra saf suThermo Fisher Scientific 22934Mevcut olduğunda, bu ürün Milli-Q sistemleri aracılığıyla arıtılmış su ile değiştirilebilir
Üniversal MakasBochem4154

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Träuble, H., Grell, E. Carriers and specificity in membranes. IV. Model vesicles and membranes. The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles. Neurosci Res Program Bull. 9 (3), 373-380 (1971).
  2. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  3. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
  5. Ernits, M., et al. Microfluidic production, stability and loading of synthetic giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 14 (1), 14071(2024).
  6. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), (2011).
  8. Elani, Y., Law, R. V., Ces, O. Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with spatially segregated reaction pathways. Nat Commun. 5 (1), 5305(2014).
  9. Heili, J. M., et al. Controlled exchange of protein and nucleic acid signals from and between synthetic minimal cells. Cell Syst. 15 (1), 49-62.e4 (2024).
  10. Shimane, Y., Kuruma, Y. Rapid and facile preparation of giant vesicles by the droplet transfer method for artificial cell construction. Front Bioeng Biotechnol. 10, 873854(2022).
  11. Sato, Y., Hiratsuka, Y., Kawamata, I., Murata, S., Nomura, S. M. Micrometer-sized molecular robot changes its shape in response to signal molecules. Sci Robot. 2 (4), eaal3735(2017).
  12. De Remigis, E., et al. Infiltration of cell-inspired ultra-deformable magnetic microrobots in restrictive environments. IEEE Trans Med Robot Bionics. 7 (1), 123-129 (2024).
  13. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  14. Zhang, Y., Obuchi, H., Toyota, T. A practical guide to preparation and applications of giant unilamellar vesicles formed via centrifugation of water-in-oil emulsion droplets. Membranes. 13 (4), 440(2023).
  15. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  16. Palagi, S. GUV-dimensional-analysis. , https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0 (2025).
  17. De Remigis, E., et al. Optimisation of encapsulation technique for confining microparticles in lipid membranes. Zenodo. 2023, DOI: 10.5281/zenodo.8069819 (2023).
  18. Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. Preparation methods for giant unilamellar vesicles. Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).
  19. Tyler, A. I. I., Greenfield, J. L., Seddon, J. M., Brooks, N. J., Purushothaman, S. Coupling phase behavior of fatty acid containing membranes to membrane bio-mechanics. Front Cell Dev Biol. 7, (2019).
  20. Hamada, S., et al. Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone. Chem Commun. 50 (22), 2958(2014).
  21. Roberti, E., Petrocelli, E. L., Cecchi, D., Palagi, S. Dimensions, stability, and deformability of DOPC-cholesterol giant unilamellar vesicles formed by droplet transfer. Open Res Eur. 5 (77), (2025).
  22. Weakly, H. M. J. Several common methods of making vesicles (except an emulsion method) capture intended lipid ratios. Biophys J. 123 (19), 3452-3462 (2024).
  23. Ito, H., et al. Dynamical formation of lipid bilayer vesicles from lipid-coated droplets across a planar monolayer at an oil/water interface. Soft Matter. 9 (40), 9539-9547 (2013).
  24. Reis, A., Spickett, C. M. Chemistry of phospholipid oxidation. Biochim Biophys Acta BBA Biomembr. 1818 (10), 2374-2387 (2012).
  25. Storage and handling of lipids. , https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids (2025).
  26. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  27. Faizi, H. A., Tsui, A., Dimova, R., Vlahovska, P. M. Bending rigidity, capacitance, and shear viscosity of giant vesicle membranes prepared by spontaneous swelling, electroformation, gel-assisted, and phase transfer methods: a comparative study. Langmuir. 38 (34), 10548-10557 (2022).
  28. Lehtinen, O. -P., et al. Effect of temperature, water content and free fatty acid on reverse micelle formation of phospholipids in vegetable oil. Colloids Surf B Biointerfaces. 160, 355-363 (2017).
  29. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  30. Whittenton, J., Harendra, S., Pitchumani, R., Mohanty, K., Vipulanandan, C., Thevananther, S. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  31. Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M., Takagi, M. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
  32. Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
  33. Hadorn, M., Boenzli, E., Hotz, P. E. A quantitative analytical method to test for salt effects on giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 1 (1), 168(2011).
  34. Toparlak, ÖD., et al. Artificial cells drive neural differentiation. Sci Adv. 6 (38), eabb4920(2020).
  35. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoc. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  36. Matsushita-Ishiodori, Y., Hanczyc, M. M., Wang, A., Szostak, J. W., Yomo, T. Using imaging flow cytometry to quantify and optimize giant vesicle production by water-in-oil emulsion transfer methods. Langmuir. 35 (6), 2375-2382 (2019).
  37. Caliari, A., Hanczyc, M. M., Imai, M., Xu, J., Yomo, T. Quantification of giant unilamellar vesicle fusion products by high-throughput image analysis. Int J Mol Sci. 24 (9), 8241(2023).
  38. van Buren, L., Koenderink, G. H., Martinez-Torres, C. DisGUVery: a versatile open-source software for high-throughput image analysis of giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 12 (1), 120-135 (2023).
  39. Pazzi, J., Subramaniam, A. B. Nanoscale curvature promotes high yield spontaneous formation of cell-mimetic giant vesicles on nanocellulose paper. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (50), 56549-56561 (2020).
  40. Ekosso, C., Liu, H., Glagovich, A., Nguyen, D., Maurer, S., Schrier, J. Accelerating the discovery of abiotic vesicles with AI-guided automated experimentation. Langmuir. 41 (1), 858-867 (2025).
  41. Lee, I. -H., Passaro, S., Ozturk, S., Ureña, J., Wang, W. Intelligent fluorescence image analysis of giant unilamellar vesicles using convolutional neural network. BMC Bioinformatics. 23 (1), 48(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Em lsiyon TransferiSentetik BiyolojiVezik l Kaps llemeLipid S spansiyonuYa Faz n n Uzakla t r lmasMikrorobotikSantrif jleme ProtokolFosfolipid Membran

İlgili makaleler