Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Reperfüze Akut Miyokard Enfarktüsünde Kardiyak Hasar ve İmmün Yanıtın Eşzamanlı 3D Analizi

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68347

⸱

26 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Reperfüze akut miyokard enfarktüsünde (repAMI) kardiyak hasarın üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu, ilişkili hastalığı etkileyen paternlerin aslına uygun olarak ölçülmesini ve birlikte lokalizasyonunu sağlar. Burada, kardiyak hasarın, risk altındaki alanın ve bağışıklık hücresi tepkisinin eşzamanlı ölçümü için otomatikleştirilebilir bir ışık tabakası kılavuzluğunda görüntüleme yaklaşımı sağlanmıştır.

Özet

Karmaşık hücresel etkileşimler, reperfüze akut miyokard enfarktüsü (repAMI) sırasında fonksiyonel ve yapısal doku yeniden şekillenmesini belirler. Bu süreçler, yaralı kalp kası farklı alanlara (hasar alanı, risk altındaki alan (AAR) ve uzak alan) bölündüğü için farklı uzamsal dağılım gösterir. Bu alanların üç boyutlu (3D) görselleştirilmesi, yerleşik kalp hücreleri ile sızan bağışıklık hücreleri arasındaki çeşitli etkileşimlerin analizi için gereklidir ve olası tedavi hedeflerinin belirlenmesini sağlar. Burada, repAMI'den sonra kardiyak hasar alanının, AAR'nin ve sızan bağışıklık hücrelerinin (örneğin nötrofiller) eşzamanlı ve otomatikleştirilebilir 3D görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu, AAR'nin retrograd antikor perfüzyonu ile ex vivo görüntülenmesini takiben kardiyak hasar alanının (CD31neg) ve nötrofil infiltrasyonunun (Ly6G+) intravital antikor aracılı boyanmasını ve ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) görüntüleme için daha fazla toksik olmayan doku temizlemeyi içerir. Bu teknik, hedef hücrelerin uzamsal analizine, örneğin repAMI'den sonra sağlam bir fare kalbindeki bağışıklık hücrelerine ve hasarlı alanlara sızmasına izin verir. Geleneksel histoloji ve immünohistokimya, bilgisayar destekli son işlem ile toksik olmayan doku temizleme ve görüntü elde etme işleminden sonra gerçekleştirilebilir. Bu, aynı fare kalbi içinde bilgi kazanımının çoğullanmasına izin verir, veri sağlamlığını güçlendirir ve özellikle repAMI gibi oldukça karmaşık bir yaralanmada önemlidir.

Giriş

Reperfüze akut miyokard enfarktüsünde (repAMI) doku hasarı, kardiyak yeniden şekillenme ve kalp yetmezliği gelişimi için ana itici faktördür1. Çoklu lokal aracılar ve yerleşik kalp hücreleri, aynı zamanda infiltre olan bağışıklık hücreleri, karmaşık bir etkileşim içinde genişlemesini etkiler 2,3. Bu süreçlerin mekansal organizasyonunu anlamak, repAMI sonrası doku hasarını sınırlamak ve kardiyak fonksiyonu iyileştirmek için yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesi için derin bilgi edinmek için gereklidir.

Kalp kasının kendisi farklı hücre tiplerinden oluştuğundan, her hücre tipi iskemi ve reperfüzyon hasarı 4,5 sırasında kendi spesifik direnç kapasitesini gösterdiğinden, kardiyak hasarın ayrıntılı analizi zordur. RepAMI bağlamında önemli bir ayırt edici özellik, endotel hücre fonksiyonunun bozulmasının eşlik ettiği büyük bir damar sistemi kaybıdır6. Farelerde ve insanlarda vasküler yapının tasviri ve endotel disfonksiyonunun analizi için kullanılan en köklü belirteç, endotel hücre yüzeyindeeksprese edilen bir adezyon molekülü olan CD31'dir (PECAM-1 olarak da bilinir) 7. Farklı iskemi/reperfüzyon modellerinde, CD31 kaybının endotel dokusu hasarının ayrımı için iyi bir vekil belirteç olduğu gösterilmiştir 8,9,10. Ayrıca, repAMI sırasında tüm kalp boyunca üç ana yaralanma bölmesi ayırt edilir. İskemi/reperfüzyon (I/R) hasarından etkilenmeyen kardiyak doku uzak bölgeyi temsil eder. Bir damar tıkanıklığının aşağı akışındaki miyokard, risk altındaki bir alan (AAR) olarak tanımlanır11,12. Reperfüzyonun başlamasından sonra, AAR'nin içinde, önceki iskemi (hasar alanı) tarafından hasar görmüş olan farklı bir kalp dokusu alanı ayırt edilebilir13. Farelerde kardiyak I/R hasarının geleneksel değerlendirmesi, hasarlı kalp hücrelerinin metabolik aktivitesinde azalma gösteren seri kalın kesitlerde trifenil tetrazolyum klorür (TTC) kullanır13,14. Eş zamanlı olarak AAR15'in tayini için ex vivo Evan'ın mavi boyaması eklenebilir. Bununla birlikte, bu yerleşik yöntemler, bağışıklık hücresi infiltrasyonunun birlikte değerlendirilme olasılığının azalması, hücre tipine özgü hasarın ayırt edilmesi ve doğru 3D doku rekonstrüksiyonu dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalara sahiptir.

Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM), bozulmamış, temizlenmiş tüm fare organlarını hücresel seviyeye kadar floresan sinyal çözünürlüğü ile görselleştirme imkanı sağlar. Son zamanlarda, sağlam fare kalplerinin 3D görselleştirilmesi için etil sinamat (ECi) kullanılarak geliştirilmiş toksik olmayan bir doku temizleme yöntemi tanıtıldı8. TTC/Evan'ın mavi boyamasının sınırlamalarını ele almak için, intravital antikor bazlı CD31 floresan boyaması kullanıldı ve repAMI8 sırasında CD31 boyaması olmayan alanlar (CD31negatif) olarak kardiyak endotel hasarı ortaya çıktı. İntravital boyamada olduğu gibi başka bir floresan spektrumuna sahip bir florofor konjuge anti-CD31 antikoru ile ex vivo retrograd aort enjeksiyonunun ek uygulanması, AAR'nin eşzamanlı 3D tasvirini açıklar. Ayrıca, bu yöntem, repAMI sırasında nötrofil fonksiyonunun anlaşılmasını iyileştirmek için uzak alan, AAR ve kardiyak endotel hasarı hacmi ile ayrılmış hücre dağılım analizine izin veren nötrofil boyama eklenerek genişletilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deney hayvanı prosedürleri, sorumlu yerel hükümet kurumu (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) tarafından onaylandı ve hayvanlar üzerinde test ve araştırma için ilgili tüm etik düzenlemelere uyuldu. Deneyler erkek C57BL/6J fareleri (9-30 haftalık) ile yapıldı. Hayvanlar, yerel hayvan barınağında 12 saat/12 saat gündüz ve gece döngüsünde belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında barındırıldı ve kullanıldı.

NOT: Tüm cerrahi girişimler, ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) kullanılarak intraperitoneal anestezi indüksiyonu altında izofluran (% 1.5 Hacim) kullanılarak yapıldı. Hayvanların çektiği acıyı azaltmak için, tüm hayvanlara gece boyunca buprenorfin içeren içme suyu ile birlikte anestezi öncesi ve sonrası gün boyunca 0,1 mg/kg buprenorfin deri altı enjeksiyonu uygulanmıştır. RepAMI'yi indüklemek için cerrahi protokol daha önce başka bir yerde tanımlanmıştır16,17. İntravital antikor enjeksiyonuna başlamadan önce, aşağıda açıklanan sonraki adımlarda ex vivo retrograd antikor enjeksiyonu için kullanılan iki adet 6 cm'lik Petri kabı hazırlayın. Fazla çevre dokusunun kalpten kaba bir şekilde çıkarılması için buz üzerinde PBS'li sığ bir petri kabına ihtiyaç vardır (daha sonraki işleme sürecini kolaylaştırmak için kabın içinde boyuta göre kesilmiş gazlı bez parçalarının kullanılması önerilir). Kanül çentiği üzerinde gevşek bir 5-0 sütür düğümü ile buz üzerinde PBS'ye batırılmış 20 G'lik künt çelik kanül iğnesi ile aort kanülasyonu için başka bir çanağa ihtiyaç vardır. Koroner damarları tıkayabilecekleri ve toplam perfüzyonu önleyebilecekleri için kanül içindeki hava kabarcıklarından kaçının veya çıkarın.

1. İntravital antikor enjeksiyonu

  1. Fareyi ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) kullanarak uyuşturun.
  2. Doğrudan etiketlenmiş fare anti-CD31 (klon: MEC13.3; florofor: AlexaFluor 790) ve fare anti-Ly6G (klon: 1A8; florofor: AlexaFluor 647) antikorlarının her birine 10 μg enjekte edin PBS'de toplam hacim g vücut ağırlığı başına 5 μL (20 g fare için 100 μL) intravenöz kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla.
    NOT: Bu antikor enjeksiyonu, kalbin içindeki tüm endotelyumu etiketleyecektir ve repAMI yaralanma boyutunu ölçmek içindir.
  3. Prosedüre devam etmeden önce enjekte edilen antikorların 10 dakika dolaşmasına izin verin.

2. Kalp hasadı

NOT: Bölüm 2 ve 3 zaman açısından kritiktir ve 6 dakikadan daha kısa sürede tamamlanması gerekir.

  1. Antikor enjeksiyonundan 10 dakika sonra hayvanı servikal çıkık ile kurban edin. Refleksleri değerlendirerek ölümü kontrol edin.
    NOT: Kan örneklerine ihtiyaç duyulursa, bir sonraki adıma geçmeden önce bunları alın.
  2. Fareyi stereo mikroskop altına yerleştirin.
  3. Göğüs boşluğunu açın ve göğüs kafesinden boyuna damarın çıkışına yakın açıkta kalan superior vena kavayı kesin.
    NOT: Ex vivo retrograd antikor enjeksiyonu için gerekli olduğu için aortu sağlam tutun.
  4. Kalpleri sağ ve sol atriyal kulak kepçesi yoluyla heparin içeren PBS (20 IE/mL) ile 27 G'lik bir iğne ve makaralı pompa (70 μL/s) kullanarak toplam 3 dakika boyunca yerinde perfüze edin. Yeterli kardiyak kan çıkarılması, kalbin yüzeysel damar çekiminin azalması ve akciğer ve karaciğerin beyazlaması ile fark edilir hale gelir.
    NOT: Işık tabakası floresan mikroskobu sırasında görüntüleme artefaktlarına neden olabileceğinden sağ veya sol ventrikül yoluyla kalp perfüzyonundan kaçının.
  5. Kalbi ve kalan en az 5 mm'lik aortu çevreleyen akciğer dokusuyla birlikte çıkarın.
    NOT: Işık tabakası floresan mikroskobu sırasında doku hasarını ve görüntüleme artefaktlarını önlemek için eksizyon sırasında kalp kasını doğrudan tutmayın.

3. Ex vivo retrograd antikor enjeksiyonu

  1. Kalbi buz gibi PBS ve önceden hazırlanmış gazlı bezle 6 cm'lik bir Petri kabına aktarın.
  2. Sadece yaklaşık 5 mm aortlu kalp kalana kadar kalan akciğer, yağ ve damar dokusunu kesin.
  3. Kalbi aort kanülasyonu için hazırlanan yemeğe aktarın.
  4. Kalan aortu 20 G künt çelik kanülün üzerine çekin ve ön düğüm 50 sütür ile kanül çentiğine bağlayın.
    NOT: Perfüzyon sıvısının sızmamasını sağlamak için kanül ucu aort kapağına yakın itilmelidir.
  5. Sol ön inen arteri (LAD), daha önce repAMI indüksiyonu için kullanılan tam yerde 6-0'lık bir dikişle kalıcı olarak yeniden bağlayın.
  6. AlexaFluor 546 ile etiketlenmiş 20 μg fare anti-CD31 (klon: MEC13.3) antikoru içeren 400 μL PBS'yi, yerleştirilmiş kanül yoluyla retrograd olarak enjekte edin.
    NOT: Koroner arterler yoluyla tam antikor perfüzyonu sağlamak için enjeksiyon şırıngası ile yerleştirilen kanül arasındaki bağlantıyı sızdırmazlık filmi ile kapatın. Bu antikor enjeksiyonu sadece AAR dışındaki endotelyumu boyayacaktır ve bu nedenle AAR ölçümü için kullanılabilir.
  7. Yerleştirilen kanülü aorttan dışarı çekin.
  8. Kalbi 10 mL %4 paraformaldehit (PFA) içeren 15 mL'lik bir polipropilen reaksiyon tüpüne aktarın ve gece boyunca karanlıkta 4 °C'de çalkalamadan inkübe edin.

4. Numune işleme ve temizleme

  1. Sabitlenmiş kalbi, karanlıkta oda sıcaklığında (RT) her biri 10 dakika boyunca 5 mL PBS'lik üç değişiklikte yıkayın, her zaman 5 mL'lik polipropilen reaksiyon tüplerinde baş üstü rotasyona yakın bir şekilde çalkalayın.
  2. Dehidrate edilmiş kalbi deiyonize suda% 50,% 70 ve% 100'de 5 mL yükselen etanol serisinde, her biri karanlıkta RT'de en az 2 saat boyunca, her zaman 5 mL'lik polipropilen reaksiyon tüplerinde yakın baş üstü rotasyonla çalkalayın.
    NOT: %50 ve %70 etanolde inkübasyon ertesi güne kadar uzatılabilirken, %100 etanolde inkübasyon 3 güne kadar uzatılabilir.
  3. Karanlıkta 4 °C'de 4 saat çalkalanmadan %5 DMSO ve %5 H2O2 ile 10 mL etanol içeren 10 mL polipropilen reaksiyon tüplerinde susuz kalbi ağartın.
    NOT: Ağartma işlemi sırasında tüpün içinde basınç oluşuyor olabilir; Daha sonra tüpü açarken dikkatli olun.
  4. Ağartılmış kalbi 5 mL %100 etanol içinde karanlıkta RT'de her biri 12 saat boyunca üç kez yıkayın, her zaman 5 mL'lik polipropilen reaksiyon tüplerinde baş üstü rotasyona yakın bir şekilde çalkalayın.
    NOT: Her inkübasyon adımı 3 güne kadar uzatılabilir.
  5. Kalbi, doku temizliği için 4 mL Etil sinnemat (ECi) içeren 5 mL'lik bir polipropilen reaksiyon tüpüne aktarın ve karanlıkta RT'de 3 gün boyunca çalkalamadan inkübe edin.
    NOT: Temizlenmiş kalp, RT'de karanlıkta doğru depolama altında floresan yoğunluğunda bir azalma olmadan en az 3 ay ECi'de kalabilir. ECi'yi saklamayın veya numuneler ECi'de saklanan 6 °C'nin altında, çünkü ECi bu sıcaklıkta donar ve işlem sırasında numuneye zarar verir.

5. Gellan sakız bloklarının hazırlanması

  1. 1 g gellan sakızı tozunu 100 mL ısıtılmış musluk suyunda (50-60 °C) karıştırın.
  2. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak tamamen çözülene kadar karıştırmaya bırakın.
    NOT: Toz düzgün bir şekilde çözülmüyorsa, çözeltiyi mikrodalgada kaynayana kadar ısıtın.
  3. Gellan sakızı çözeltisini 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
  4. Filtrelenmiş çözeltiyi 10 cm'lik sığ bir Petri kabına koyun.
  5. Jel sertleşene kadar soğumaya bırakın.
  6. Jeli 15 mm 15 mm 5 mm'lik bloklar halinde kesin.
  7. Deiyonize suda %50 ve %70'te 50 mL yükselen etanol serisindeki blokları dehidre edin, her biri RT'de en az 2 saat boyunca her zaman bir 50 mL'lik polipropilen reaksiyon tüpünde neredeyse baş üstü dönüşle çalkalayın.
    NOT: Jel blokları ekledikten sonra reaksiyon tüpünü etanol ile doldurun. Reaksiyon tüpünü sadece yarısına kadar jel bloklarla doldurun.
  8. Susuz blokları 50 mL'lik %100 etanol içinde RT'de her biri 12 saat boyunca üç kez inkübe edin ve her zaman 50 mL'lik bir polipropilen reaksiyon tüpünde baş üstü rotasyona yakın bir şekilde çalkalayın.
    NOT: Jel blokları ekledikten sonra reaksiyon tüpünü etanol ile doldurun. Reaksiyon tüpünü sadece yarısına kadar jel bloklarla doldurun. Jel blokları, ECi'de temizlenene kadar %100 etanol içeren son reaksiyon tüpünde uzun süre kalabilir.
  9. Blokları 25 mL ECi içeren 50 mL'lik bir polipropilen reaksiyon tüpüne aktarın ve RT'de 3 gün boyunca çalkalamadan inkübe edin.
    NOT: Artefaktları temizlemekten kaçınmak için ECi ile bir reaksiyon tüpüne sadece birkaç blok koyun. Temizlenen bloklar ECi'de en az 6 ay kalabilir ve RT'de saklanabilir.

6. Görüntüleme

  1. Temizlenmiş jellan sakız bloklarını, temizlenmiş kalbi mikroskop numune tutucusunda stabilize etmek için gereken boyutta kesin.
    NOT: Gellan sakız blokları birden fazla kez tekrar kullanılabilir.
  2. İlgilenilen floresan sinyallerini tespit edin (Otofloresan, AAR boyama [AlexaFluor 546 ile etiketlenmiş anti-CD31 antikoru], AlexaFluor647-bağlı anti-Ly6G antikoru ve CD31neg boyama [AlexaFluor 790 ile etiketlenmiş anti-CD31 antikoru]) uygun uyarma ve emisyon filtresi ayarlarıyla. Çekim için, 17,6 mm çalışma mesafesine sahip 0,1 NA objektif lens kullanın.
    NOT: Beyaz ışık lazeri (200 mW; 480-2400 nm) ile sinyalleri algılayın. Bağ dokusundan türetilen otofloresansın tespiti için 470/30 nm bant geçiren uyarma filtresi ve 525/50 nm bant geçiren emisyon filtresi kullanın; AlexaFluor 546'ya bağlı antikor ile CD31 boyama, 520/40 nm bant geçiren uyarma filtresi ve 585/40 nm bant geçiren emisyon filtresi ile tespit edilir; AlexaFluor 647-bağlı antikor ile Ly6G boyama, 630/30 nm bant geçiren uyarma filtresi ve 680/30 nm bant geçiren emisyon filtresi ile tespit edilir; AlexaFluor 790'a bağlı antikor ile CD31 boyama, 740/40 nm bant geçiren uyarma filtresi ve 824/55 nm bant geçiren emisyon filtresi ile tespit edilir. Aydınlatma süreleri ve lazer zayıflama yüzdesi sinyal kalitesine göre ayarlanmalıdır.
  3. Işıklı tabaka mikroskobu görüntüleme için aşağıdaki ayarları seçin:
    1. 0.079'luk NA levhasını seçin, bu da 5 μm'lik hafif bir levha kalınlığı elde edilmesini sağlar.
    2. İki ayrı z düzlemi arasındaki mesafe olarak 10 μm seçin.
      NOT: Bu, izleme ve hacim ölçümleri için yetersiz örneklemeye ve ardından hassasiyet kaybına neden olur. Bunu önlemek için, iki ayrı z-düzlemi arasındaki mesafe, hafif tabaka kalınlığının yarısına eşit olmalıdır, yani bu durumda 2,5 μm. Bu çalışma, azaltılmış görüntüleme süresi ve veri yığını boyutuyla elde edilen faydalar, minimum analiz hassasiyeti kaybından daha ağır bastığından, verileri yetersiz örneklemeyi seçti.
    3. Numunenin homojen bir şekilde aydınlatılmasını sağlamak için %100'lük bir tabaka genişliği kullanın.

7. Görüntü işleme sonrası

NOT: Elde edilen dijital görüntü verileri, Malzeme Tablosunda listelenen bilimsel bir 3D görüntü işleme ve analiz yazılımı kullanılarak daha fazla işlendi.

  1. Imaris dosya dönüştürücü 10.1 yazılımını başlatın ve görüntü dosyalarının bulunduğu klasörü Imaris dosya dönüştürücü penceresine sürükleyip bırakarak veya Gözat'a tıklayıp görüntü dosyalarının bulunduğu klasöre giderek ham veri kümesini yazılıma yükleyin.
  2. Klasör Seç aracılığıyla çıktı klasörünü seçin.
  3. Tümünü Başlat'a tıklayın ve dosyaların .ims Imaris dosyalarına dönüştürülmesini bekleyin.
  4. Yazılımı başlatın ve sol üst köşedeki Aş'ı seçin.
  5. Seçerek görüntü yığınlarını açın Aç ve uygun .ims veri dosyasını seçin.
  6. Tüm kalbin otomatik olarak oluşturulmuş bir yüzeyini oluşturmak için 3B Görünüm ve Yüzeyler'i seçin.
  7. Algoritma Ayarları bölümünde Yüzeyleri Sınıflandır'ı devre dışı bırakırkenYalnızca İlgi Alanını Seç, Son olarak tüm Görüntüyü işle ve Nesne-Nesne İstatistikleri'ni seçin.
    NOT: Nesne-Nesne İstatistiklerinin etkinleştirilmesi, farklı yüzeylerin ve spot fonksiyonlarının bindirme hesaplamasına olanak tanır.
  8. Sonraki adımlara devam etmek için Oluştur sayfasının sağ alt köşesindeki mavi ok düğmesini tıklayın.
  9. Görüntü görünümünde görünen manipülatörleri kullanarak üç boyutlu ilgi alanını belirleyin.
  10. Kaynak kanalı (Otofloresan kanalı) seçerek bir sonraki adıma geçin.
  11. Pürüzsüz'ü etkinleştirin ve varsayılan ayar olan 11.8 μm'yi seçin.
  12. Bir sonraki adıma geçin ve görüntü görünümünün içinde görünen optik olarak tatmin edici bir üç boyutlu yüzey oluşturmak için gereken eşiği belirleyin.
  13. Son adımda, filtre türü olarak Voksel Sayısı'nı seçerek ve eşik olarak 10'u belirleyerek yüzey filtresini ayarlayın.
  14. Oluştur bölümünün sağ alt köşesindeki yeşil ok düğmesini tıklatarak bir yüzey oluşturun. Renk sayfasını kullanarak, oluşturulan yüzeyin malzemesini ve rengini gerektiği gibi değiştirin.
  15. 3D View ve Surfaces'ı bir kez daha seçerek AAR (AlexaFluor 546 kanalında CD31neg hacmi) ve kardiyak endotel yaralanma hacmi (AlexaFluor 790 kanalında CD31neg hacmi) için manuel olarak oluşturulmuş iki ek yüzey oluşturun.
  16. Algoritma Ayarları bölümünde Yüzeyleri Sınıflandır'ı devre dışı bırakırken Yalnızca İlgi Alanını Segmentlere Ayır, Tüm Görüntüyü Son Olarak İşle ve Nesne-Nesne İstatistikleri'ni seçin ve Otomatik oluşturmayı atla, manuel olarak düzenle'ye tıklayın.
  17. Pano sayfasının içinde, yönlendirme için XY'yi seçin, görünürlük için yok ve çözünürlük denetleyicisini manuel olarak maksimuma ayarlayın.
  18. Model sayfasına gidin, Mesafe simgesine tıklayın ve köşe aralığını 100 μm olarak ayarlayın.
  19. Her 10 görüntü diliminde bir AlexaFluor 546 kanalında veya AlexaFluor 790 kanalında CD31neg alanlarını çiz ve çevrele'yi etkinleştirin.
  20. İlgili tüm alanları çevrelemeyi bitirdikten sonra Otomatik Sığdır'ı ve Otomatik Sığdır'ı seçin.
  21. Yüzey Oluştur'a tıklayın ve Renk sayfasında oluşturulan yüzeylerin malzemesini ve rengini ayarlayın.
  22. Nötrofilleri Ly6G+ noktaları olarak görüntülemek için 3B Görünüm ve Noktalar'ı seçerek bir nokta işlevi oluşturun.
  23. Yalnızca İlgi Alanını Segmente Et, Tüm Görüntüyü Son Olarak İşle ve Nesne-Nesne İstatistikleri'ni devre dışı bırakırken Algoritma Ayarları bölümünde Noktaları Sınıflandır'ı seçin.
  24. Oluştur sayfasının sağ alt köşesindeki mavi ok düğmesini kullanarak sonraki adımlara geçin.
  25. Yukarıda belirtildiği gibi görüntü görünümünde görünen manipülatörleri kullanarak üç boyutlu ilgi alanını belirleyin.
  26. Kaynak kanalı (AlexaFluor 647 kanalı) kullanarak bir sonraki adıma geçin.
  27. Tahmini XY Çapını 10 μm olarak ayarlayın, Z ekseni boyunca Model PSF uzamasını etkinleştirin ve tahmini Z Çapını 20 μm olarak ayarlayın.
  28. Arka Plan Çıkarma işlemini devre dışı bırakın.
  29. Bir sonraki adıma geçin, filtre olarak Yoğunluk Min'i seçin ve uygun bir eşik ayarlayın.
    NOT: Eşik seviyesinin tahmini için, program penceresinin üst kısmındaki Dilim'e tıklayın ve AlexaFluor 647 kanalını seçin. İmleci ham görüntü diliminde pozitif bir Ly6G boyamasını temsil eden farklı noktaların üzerine getirin ve program penceresinin sol alt köşesindeki yoğunluk değerini okuyun.
  30. Oluştur sayfasının sağ alt köşesindeki yeşil ok düğmesine tıklayarak noktalar oluşturun.
  31. Yarıçap Ölçeği'ni Oluştur sayfasının Nokta Stili/Kalitesi bölümünde 3,0 olarak ayarlayın.
  32. Nokta renginin istendiği gibi ayarlanması için Renk sayfasına ulaştım.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) kullanılarak sunulan yaklaşım, repAMI sonrası AAR, endotel hasarı ve nötrofil infiltrasyonunun eş zamanlı analizine olanak tanır. Şekil 1A , repAMI indüksiyonundan 24 saat sonra C57BL/6J farelerinin intravital ve ex vivo antikor boyamasını göstermektedir. Kardiyak endotel hasarının boyanması (AlexaFluor 790 ile etiketlenmiş anti-CD31) ve nötrofil infiltrasyonu (AlexaFluor 647 ile etiketlenmiş anti-Ly6G) için antikorlar, kurbandan 10 dakika ön...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Farelerde repAMI sırasında kalp dokusu hasarını tespit etmek için çeşitli görüntüleme varlıkları vardır. Bu teknikler farklı avantajlar sağlar ancak aynı zamanda sınırlamaları da vardır. TTC kullanılarak kalp hücrelerinin azalmış metabolik aktivitesinin boyanması, kardiyak I/R hasarının nicelleştirilmesi için en yaygın kullanılan yöntemdir ve AAR 13,14,15 ayrımı için Evan'ın mavi boyaması ile bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Elias Haj-Yehia, gönderilen çalışmanın dışında kalan kişisel ücretleri ve AstraZeneca'dan diğerlerini bildiriyor. Simon F. Merz ve Lea Bornemann şu anda Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG tarafından istihdam edilmektedir. Matthias Totzeck ve Tienush Rassaf, gönderilen çalışmanın dışında kalan Edwards ve Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo ve Astra Zeneca'dan kişisel ücretleri ve diğerlerini bildiriyor. Tienush Rassaf ve Ulrike B. Hendgen-Cotta, kardiyoprotektif peptitlerin geliştirilmesine odaklanan bir şirket olan Bimyo'nun kurucu ortağı oldu. Matthias Gunzer, Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG'den genel araştırma fonu aldı. Diğer tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul etmektedir: Alman Araştırma Vakfı (UMEA Klinisyen Bilim İnsanı, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) ve Alman Kardiyak Derneği (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Bu çalışmaların bir kısmı, Almanya'daki Duisburg-Essen Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin bir Hizmet Çekirdek Tesisi olan Essen Görüntüleme Merkezi'nde (IMCES) gerçekleştirildi. IMCES personeline sürekli teknik destekleri ve cihazlarının kullanımı için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
27 G iğneBecton Dickinson305889BD Tutulması
3D görüntü işleme ve Analiz YazılımıBit düzlemiVers. 10.1.0Imaris Hakkında
5-0 dikişSerag-WiessnerIC108000İpek
6-0 dikişEtik SimgeEH7814 SerisiProlen
AlexaFluor 546 antikor etiketleme kitiDavetliA20183
AlexaFluor 790 antikor etiketleme kitiDavetliA20189
Anti-fare Ly6G antikoru (AlexaFluor 647)Biyolojik Efsane127610Klon: 1A8
Hücre süzgeci (100 µ m)Corning431752
Dimetil sülfoksit (DMSO)Carl Roth7029.1
EtanolCarl Roth0911.4
Etil sinnemat (ECi)Sigma-Aldrich112372
Dosya dönüştürücü yazılımıBit düzlemiVers. 10.1.0Imaris Hakkında
Gazlı bezFuhrmann Hakkında10021
Gellan sakızı tozuSigma-AldrichP8169Fitajel
Heparin (25.000 IE/5 mL)LEO İlaç15261203
Hidrojen peroksit (H2O2, %30)Carl Roth8070.2
Enjeksiyon şırıngasıB Braun9161502SOmnican F
Ketamin (100 mg/mL)Bela-İlaç402581.00.00
Işık tabakası mikroskop sistemiMiltenyi Biotec-UltraMikroskop Alevi
Luer kilit şırıngaBecton Dickinson303172BD Plastipak
Manyetik karıştırıcıVWR444-0572
Neo sCMOS fotoğraf makinesi (4.2 MP)Andor TeknolojisiZL41 Hücresi 4.2
NesnelMiltenyi Biotec130-133-625MI Planı 1,1x NA 0,1, WD 17,6 mm
Paraformaldehit (PFA, %4)Sigma-Aldrich1.00496%10 formalin, nötr tamponlu
Petri kabıGreiner Biyo-Bir632181
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco14190-094MgCl2/CaCl2
Polipropilen tüp (15 mL)Greiner Biyo-Bir188261
Polipropilen tüp (5 mL)Carl RothEKY9.1Siyah
Polipropilen tüp (50 mL)Greiner Biyo-Bir227261
Fare kalbi kanülasyonu için hazırlık kabıHugo Sachs Elektronik73-4327Kanül dahil
Saflaştırılmış anti-fare CD31 antikoruBecton Dickinson53369Klon: MEC13.3
Makaralı pompaIsmatecISM597-230
Sızdırmazlık filmiBemisPM-996Parafilm
Stereo mikroskopLeicaS6D
Tüp döndürücüHeidolph HakkındaPolymax 1040 Serisi
Beyaz ışık lazeriNKT fotonikSüper K ekstrem200 mW, 480– 2400 deniz mili
WT fare suşuJanvier Laboratuvarları-C57BL/6JRj
Ksilazin (%2)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Kaynaklar

  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis. Circ Res. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Koch, A., et al. Capillary endothelia and cardiomyocytes differ in vulnerability to ischemia/reperfusion during clinical heart transplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 20 (5), 996-1001 (2001).
  5. Singhal, A. K., Symons, J. D., Boudina, S., Jaishy, B., Shiu, Y. T. Role of endothelial cells in myocardial ischemia-reperfusion injury. Vasc Dis Prev. 7, 1-14 (2010).
  6. Robbers, L. F., et al. Magnetic resonance imaging-defined areas of microvascular obstruction after acute myocardial infarction represent microvascular destruction and haemorrhage. Eur Heart J. 34 (30), 2346-2353 (2013).
  7. DeLisser, H. M., Newman, P. J., Albelda, S. M. Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31. Immunol Today. 15 (10), 490-495 (1994).
  8. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10 (1), 2312(2019).
  9. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  10. Zhong, X., et al. Tubular epithelial cells-derived small extracellular vesicle-VEGF-A promotes peritubular capillary repair in ischemic kidney injury. NPJ Regen Med. 7 (1), 73(2022).
  11. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).
  12. Arai, A. E. Magnetic resonance imaging for area at risk, myocardial infarction, and myocardial salvage. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 313-320 (2011).
  13. Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Res Cardiol. 113 (5), 39(2018).
  14. Rassaf, T., et al. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circ Res. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  15. Haj-Yehia, E., et al. CD47 blockade enhances phagocytosis of cardiac cell debris by neutrophils. IJC Heart Vasculature. 48, 101269(2023).
  16. Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury. J Biol Methods. 3 (4), e57(2016).
  17. Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. J Vis Exp. (137), e57621(2018).
  18. Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2435-H2443 (2008).
  19. Clasen, L., et al. Cardiac ischemia and reperfusion in mice: a comprehensive hemodynamic, electrocardiographic and electrophysiological characterization. Sci Rep. 13 (1), 5693(2023).
  20. Lang, C. I., et al. Expedient assessment of post-infarct remodeling by native cardiac magnetic resonance imaging in mice. Sci Rep. 11 (1), 11625(2021).
  21. Coolen, B. F., et al. Three-dimensional T1 mapping of the mouse heart using variable flip angle steady-state MR imaging. NMR Biomed. 24 (2), 154-162 (2011).
  22. Zhong, X., et al. Comprehensive cardiovascular magnetic resonance of myocardial mechanics in mice using three-dimensional cine DENSE. J Cardiovasc Magn Reson. 13 (1), 83(2011).
  23. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  25. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nat Commun. 10 (1), 1944(2019).
  26. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy. J Vis Exp. (123), e55450(2017).
  27. Taki, J., et al. 14C-Methionine uptake as a potential marker of inflammatory processes after myocardial ischemia and reperfusion. J Nucl Med. 54 (3), 431-436 (2013).
  28. Michel, L., et al. PD1 deficiency modifies cardiac immunity during baseline conditions and in reperfused acute myocardial infarction. Int J Mol Sci. 23 (14), 7533(2022).
  29. Park, K. C., Gaze, D. C., Collinson, P. O., Marber, M. S. Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease. Cardiovasc Res. 113 (14), 1708-1718 (2017).
  30. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Curr Protoc Neurosci. 81 (2), 28.21-28.28 (2017).
  31. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using light sheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  32. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nat Protoc. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  33. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  34. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  35. Merz, S. F., et al. High-resolution three-dimensional imaging for precise staging in melanoma. Eur J Cancer. 159, 182-193 (2021).
  36. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Front Immunol. 11, 599495(2020).
  37. Pichardo, A. H., et al. Optical tissue clearing to study the intra-pulmonary biodistribution of intravenously delivered mesenchymal stromal cells and their interactions with host lung cells. Int J Mol Sci. 23 (22), 14171(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Işık Sayfası MikroskopisiKardiyak Hasar AnaliziKalpte İmmün YanıtMiyokard İnfarktüsü 3BDoku ŞeffaflaştırmaNötrofil İnfiltrasyonuRisk Altındaki AlanAntikor BoyamaEndotelyal Hasar3B Kalp Görüntüleme
Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Reperfüze Akut Miyokard Enfarktüsünde Kardiyak Hasar ve İmmün Yanıtın Eşzamanlı 3D Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.