Yöntem makalesi

Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Reperfüze Akut Miyokard Enfarktüsünde Kardiyak Hasar ve İmmün Yanıtın Eşzamanlı 3D Analizi

DOI:

10.3791/68347

⸱

26 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reperfüze akut miyokard enfarktüsünde (repAMI) kardiyak hasarın üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu, ilişkili hastalığı etkileyen paternlerin aslına uygun olarak ölçülmesini ve birlikte lokalizasyonunu sağlar. Burada, kardiyak hasarın, risk altındaki alanın ve bağışıklık hücresi tepkisinin eşzamanlı ölçümü için otomatikleştirilebilir bir ışık tabakası kılavuzluğunda görüntüleme yaklaşımı sağlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karmaşık hücresel etkileşimler, reperfüze akut miyokard enfarktüsü (repAMI) sırasında fonksiyonel ve yapısal doku yeniden şekillenmesini belirler. Bu süreçler, yaralı kalp kası farklı alanlara (hasar alanı, risk altındaki alan (AAR) ve uzak alan) bölündüğü için farklı uzamsal dağılım gösterir. Bu alanların üç boyutlu (3D) görselleştirilmesi, yerleşik kalp hücreleri ile sızan bağışıklık hücreleri arasındaki çeşitli etkileşimlerin analizi için gereklidir ve olası tedavi hedeflerinin belirlenmesini sağlar. Burada, repAMI'den sonra kardiyak hasar alanının, AAR'nin ve sızan bağışıklık hücrelerinin (örneğin nötrofiller) eşzamanlı ve otomatikleştirilebilir 3D görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu, AAR'nin retrograd antikor perfüzyonu ile ex vivo görüntülenmesini takiben kardiyak hasar alanının (CD31neg) ve nötrofil infiltrasyonunun (Ly6G+) intravital antikor aracılı boyanmasını ve ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) görüntüleme için daha fazla toksik olmayan doku temizlemeyi içerir. Bu teknik, hedef hücrelerin uzamsal analizine, örneğin repAMI'den sonra sağlam bir fare kalbindeki bağışıklık hücrelerine ve hasarlı alanlara sızmasına izin verir. Geleneksel histoloji ve immünohistokimya, bilgisayar destekli son işlem ile toksik olmayan doku temizleme ve görüntü elde etme işleminden sonra gerçekleştirilebilir. Bu, aynı fare kalbi içinde bilgi kazanımının çoğullanmasına izin verir, veri sağlamlığını güçlendirir ve özellikle repAMI gibi oldukça karmaşık bir yaralanmada önemlidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reperfüze akut miyokard enfarktüsünde (repAMI) doku hasarı, kardiyak yeniden şekillenme ve kalp yetmezliği gelişimi için ana itici faktördür1. Çoklu lokal aracılar ve yerleşik kalp hücreleri, aynı zamanda infiltre olan bağışıklık hücreleri, karmaşık bir etkileşim içinde genişlemesini etkiler 2,3. Bu süreçlerin mekansal organizasyonunu anlamak, repAMI sonrası doku hasarını sınırlamak ve kardiyak fonksiyonu iyileştirmek için yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesi için derin bilgi edinmek için gereklidir.

Kalp kasının kendisi far....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deney hayvanı prosedürleri, sorumlu yerel hükümet kurumu (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) tarafından onaylandı ve hayvanlar üzerinde test ve araştırma için ilgili tüm etik düzenlemelere uyuldu. Deneyler erkek C57BL/6J fareleri (9-30 haftalık) ile yapıldı. Hayvanlar, yerel hayvan barınağında 12 saat/12 saat gündüz ve gece döngüsünde belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında barındırıldı ve kullanıldı.

NOT: Tüm cerrahi girişimler, ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) kullanılarak intraperitoneal anestezi indüksiyonu altında izofluran (%....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) kullanılarak sunulan yaklaşım, repAMI sonrası AAR, endotel hasarı ve nötrofil infiltrasyonunun eş zamanlı analizine olanak tanır. Şekil 1A , repAMI indüksiyonundan 24 saat sonra C57BL/6J farelerinin intravital ve ex vivo antikor boyamasını göstermektedir. Kardiyak endotel hasarının boyanması (AlexaFluor 790 ile etiketlenmiş anti-CD31) ve nötrofil infiltrasyonu (AlexaFluor 647 ile etiketlenmiş anti-Ly6G) için antikorlar, kurbandan 10 dakika ön.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerde repAMI sırasında kalp dokusu hasarını tespit etmek için çeşitli görüntüleme varlıkları vardır. Bu teknikler farklı avantajlar sağlar ancak aynı zamanda sınırlamaları da vardır. TTC kullanılarak kalp hücrelerinin azalmış metabolik aktivitesinin boyanması, kardiyak I/R hasarının nicelleştirilmesi için en yaygın kullanılan yöntemdir ve AAR 13,14,15 ayrımı için Evan'ın mavi boyaması ile bi.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elias Haj-Yehia, gönderilen çalışmanın dışında kalan kişisel ücretleri ve AstraZeneca'dan diğerlerini bildiriyor. Simon F. Merz ve Lea Bornemann şu anda Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG tarafından istihdam edilmektedir. Matthias Totzeck ve Tienush Rassaf, gönderilen çalışmanın dışında kalan Edwards ve Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo ve Astra Zeneca'dan kişisel ücretleri ve diğerlerini bildiriyor. Tienush Rassaf ve Ulrike B. Hendgen-Cotta, kardiyoprotektif peptitlerin geliştirilmesine odaklanan bir şirket olan Bimyo'nun kurucu ortağı oldu. Matthias Gunzer, Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG'den genel araştırma fonu aldı. Diğer tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul etmektedir: Alman Araştırma Vakfı (UMEA Klinisyen Bilim İnsanı, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) ve Alman Kardiyak Derneği (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Bu çalışmaların bir kısmı, Almanya'daki Duisburg-Essen Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin bir Hizmet Çekirdek Tesisi olan Essen Görüntüleme Merkezi'nde (IMCES) gerçekleştirildi. IMCES personeline sürekli teknik destekleri ve cihazlarının kullanımı için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
27 G iğneBecton Dickinson305889BD Tutulması
3D görüntü işleme ve Analiz YazılımıBit düzlemiVers. 10.1.0Imaris Hakkında
5-0 dikişSerag-WiessnerIC108000İpek
6-0 dikişEtik SimgeEH7814 SerisiProlen
AlexaFluor 546 antikor etiketleme kitiDavetliA20183
AlexaFluor 790 antikor etiketleme kitiDavetliA20189
Anti-fare Ly6G antikoru (AlexaFluor 647)Biyolojik Efsane127610Klon: 1A8
Hücre süzgeci (100 µ m)Corning431752
Dimetil sülfoksit (DMSO)Carl Roth7029.1
EtanolCarl Roth0911.4
Etil sinnemat (ECi)Sigma-Aldrich112372
Dosya dönüştürücü yazılımıBit düzlemiVers. 10.1.0Imaris Hakkında
Gazlı bezFuhrmann Hakkında10021
Gellan sakızı tozuSigma-AldrichP8169Fitajel
Heparin (25.000 IE/5 mL)LEO İlaç15261203
Hidrojen peroksit (H2O2, %30)Carl Roth8070.2
Enjeksiyon şırıngasıB Braun9161502SOmnican F
Ketamin (100 mg/mL)Bela-İlaç402581.00.00
Işık tabakası mikroskop sistemiMiltenyi Biotec-UltraMikroskop Alevi
Luer kilit şırıngaBecton Dickinson303172BD Plastipak
Manyetik karıştırıcıVWR444-0572
Neo sCMOS fotoğraf makinesi (4.2 MP)Andor TeknolojisiZL41 Hücresi 4.2
NesnelMiltenyi Biotec130-133-625MI Planı 1,1x NA 0,1, WD 17,6 mm
Paraformaldehit (PFA, %4)Sigma-Aldrich1.00496%10 formalin, nötr tamponlu
Petri kabıGreiner Biyo-Bir632181
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco14190-094MgCl2/CaCl2
Polipropilen tüp (15 mL)Greiner Biyo-Bir188261
Polipropilen tüp (5 mL)Carl RothEKY9.1Siyah
Polipropilen tüp (50 mL)Greiner Biyo-Bir227261
Fare kalbi kanülasyonu için hazırlık kabıHugo Sachs Elektronik73-4327Kanül dahil
Saflaştırılmış anti-fare CD31 antikoruBecton Dickinson53369Klon: MEC13.3
Makaralı pompaIsmatecISM597-230
Sızdırmazlık filmiBemisPM-996Parafilm
Stereo mikroskopLeicaS6D
Tüp döndürücüHeidolph HakkındaPolymax 1040 Serisi
Beyaz ışık lazeriNKT fotonikSüper K ekstrem200 mW, 480– 2400 deniz mili
WT fare suşuJanvier Laboratuvarları-C57BL/6JRj
Ksilazin (%2)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

I k Sayfas MikroskopisiKardiyak Hasar AnaliziKalpte mm n Yan tMiyokard nfarkt s 3BDoku effafla t rmaN trofil nfiltrasyonuRisk Alt ndaki AlanAntikor BoyamaEndotelyal Hasar3B Kalp G r nt leme

İlgili makaleler