Method Article

Uzun Okuma Dizileme Teknolojilerini Kullanarak Amplikon Dizileme

DOI:

10.3791/68370

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis'teki 18 ilaca dirençli bölgenin uzun okumalı bir dizileme platformu kullanılarak hedeflenen derin dizilimi için optimize edildi ve ardından uzun okunan veriler için tasarlanmış tüberküloza özgü bir biyoinformatik boru hattı ile analiz edildi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dünya Sağlık Örgütü (WHO), tüberküloz (TB) ve ilaca dirençli TB (DR-TB) için hızlı, uygun maliyetli ve kullanıcı dostu bir tanı yöntemine olan acil ihtiyacı vurgulamaya devam etmektedir. DSÖ tarafından onaylanan yeni nesil dizileme (NGS) teknolojileri, DR-TB'nin tespitini önemli ölçüde iyileştirmiştir. Bunlar arasında, hedeflenen NGS (tNGS), ilaç direnci ile ilişkili genetik mutasyonların odaklanmış tespitini sağlayarak geleneksel kültür tabanlı tanı ihtiyacını ortadan kaldırır. Yaygın olarak kullanılan bir tNGS testi, hızlı ve kapsamlı ilaç duyarlılık testi sağlar, ancak öncelikle yüksek doğrulukta sıralama platformları için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu sıralama sistemlerinin yüksek maliyeti, düşük ve orta gelirli ülkelerde, özellikle Afrika'da sınırlı erişilebilirliğe sahiptir. Taşınabilir dizileme teknolojileri, esneklik ve azaltılmış altyapı gereksinimleri sunarak umut verici bir alternatif sunar. Bu çalışmada, DNA, rifampisine dirençli TB (RR-TB) izolatlarından ekstrakte edildi, bir tNGS testi kullanılarak amplifiye edildi ve taşınabilir bir dizileme platformunda dizilendi. Aynı amplifikasyon ürünleri, referans olarak hizmet etmek için yüksek hassasiyetli bir kısa okuma dizileme platformunda da sıralandı. Taşınabilir dizileyiciden gelen veriler, uzun okuma dizilemesi için tasarlanmış bir biyoinformatik boru hattı kullanılarak işlenirken, kısa okuma dizileme verileri, yerleşik bir web tabanlı uygulama kullanılarak analiz edildi. Analiz, uzun okuma dizileme yaklaşımının, kısa okuma dizileme ile tespit edilen yüksek frekanslı dirençle ilişkili varyantları başarılı bir şekilde tanımladığını, ancak düşük frekanslı varyantları tespit etmede sınırlamalar sergilediğini gösterdi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüberküloz (TB) küresel olarak önemli bir ölüm nedeni olmaya devam etmektedir ve özellikle düşük ve orta gelirli ülkelerde devam eden bir halk sağlığı sorunu oluşturmaktadır 1,2. Tüberküloz kontrol önlemlerini geliştirmeyi amaçlayan girişimlere rağmen, kısmen hızlı, doğru, uygun maliyetli ve kapsamlı tanı tekniklerinin elde edilmesindeki zorluklar nedeniyle ilerlemeler yavaş olmuştur 3,4,5. Hat prob testleri (LPA'lar) ve otomatik nükleik asit amplifikasyon testleri (NAAT'ler) gibi moleküler tanı yöntemleri, TB ve ilaca dirençli TB'NIN (DR-TB) tanımlanmasını hızlandırırken, sınırlı mutasyon tespiti, kapsamlı ilaç duyarlılık testini (DST) kısıtlar. Bu sınırlama özellikle TB yükünün yüksek olduğu ülkelerdeönemlidir 6,7,8,9.

Bu sınırlamaları ele almak için, Dünya Sağlık Örgütü (WHO), TB sürveyansı ve direnç tespiti için güçlü araçlar olarak ortaya çıkan yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerinin kullanılmasını önermiştir10,11. Hem tüm genom dizileme (WGS) hem de hedeflenmiş NGS (tNGS) yaklaşımları, daha geniş mutasyon kapsamı sunarak birden fazla ilaçta dirençle ilişkili varyantların tanımlanmasını sağlar 8,12,13,14,15. Tüm genom dizilimi (WGS) kapsamlı bir DST raporu sağlarken, kültüre olan bağımlılığı, kültür altı haftaya kadar sürebileceğinden, hızlı teşhis için uygun değildir, 15,16,17. Hedeflenen NGS, kültüre bağlı olmadığı için daha iyi bir alternatif sunar; Dizileme doğrudan klinik örneklerdenyapılabilir 18. Sonuç olarak, DSÖ, DST için üç tNGS testinin kullanılmasını önermiştir: Deeplex Myc-TB testi: Bu test, rifampisin, izoniazid, florokinolonlar, aminoglikozitler (amikasin, kanamisin, kapreomisin), etambutol, pirazinamid ve etiyonamide direnci tespit eder 19,20,21. Sentinel TB testi: Bu, rifampisin, izoniazid, florokinolonlar ve ikinci basamak enjekte edilebilir ilaçlara karşı direnci hedefler18,20. AQ-TB testi: Bu, rifampisin, izoniazid, florokinolonlar ve ikinci basamak enjekte edilebilir ilaçlara karşı direnci tanımlar. Bu tahliller, yüksek doğruluğu nedeniyle kısa okuma platformunda kullanım için optimize edilmiştir20. Öte yandan, ONT MinION uzun okuma platformları gerçek zamanlı veri, taşınabilirlik ve uygun maliyetli uygulama potansiyeli sağlar22,23. Bununla birlikte, NGS'nin yaygın kullanımı, özellikle kısa okuma sistemlerinde altyapı ve maliyet talepleri ile sınırlıdır10.

Deeplex testi, önerilen üç testten en kapsamlısıdır. Test başlangıçta 13 anti-TB ilacına dirençle ilişkili 18 bölgede multipleks PCR gerçekleştirmek için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, DSÖ, yeterli duyarlılık ve özgüllüğü gösteren 10 anti-TB ilacı için önermiştir. Bu çalışma, uzun okumalı bir sıralama platformu olan ONT MK1B MinION ile kullanım için optimize etti. Bu platformun taşınabilir ve yeniden kullanılabilir akış hücresi sistemi, numune başına hem altyapı hem de potansiyel olarak sıralama maliyetlerini azaltır 4,22,23. Diğer uzun okuma uyumlu tahliller geliştirilmiş olsa da, tipik olarak yalnızca dar bir direnç geni aralığını hedefleyen sınırlı bir DST kapsamına sahip olma eğilimindedirler. Buna karşılık, tahlil geniş hedef kapsamı sunarak onu merkezi olmayan DST24,25 için daha kapsamlı bir teşhis aracı haline getirir. Test tarafından amplifiye edilen genomik hedeflerin ve bunlara karşılık gelen ilaç ilişkilerinin ayrıntılı bir listesi, testin teşhis yeteneklerini vurgulayan Tablo 1'de verilmiştir25.

DNA ekstraksiyonundan önce, numuneler gerekli güvenlik önlemleri25,26,27 izlenerek Biyogüvenlik Seviye 3 (BSL-3) koşulları altında dekontamine edilmeli ve inaktive edilmelidir. Dahili amplifikasyon ve harici kontroller her çalışmaya dahil edilmeli, kontaminasyon negatif kontroller ve rutin laboratuvar değerlendirmeleri yoluyla izlenmelidir25. Okuma derinliği, kapsama genişliği ve amplifikasyon başarısı dahil olmak üzere önemli kalite ölçümleri, sıralamadan sonra değerlendirilmelidir. Hedeflenen dizileme için DSÖ, her amplikon için minimum 100x okuma derinliği ve %≥5 oranında mevcut olan küçük varyantların tespit edilmesine izin vermek için hedeflenen tüm ilaca direnç bölgelerinin yeterli kapsamını önermektedir28. Dünya Sağlık Örgütü, kalite güvence sistemlerinin kurulduğunu ve tüm hedef bölgelerin yeterince kapsandığını varsayarak, birinci ve ikinci basamak ilaçlara karşı direnci belirlemek için bu hedefe yönelik sıralama yöntemlerini onaylamaktadır28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, 20 Ekim 2021 tarihinde Stellenbosch Üniversitesi'nde İnsan Araştırmaları Etik Kurulu'ndan (HREC) (N21/09/093) etik onay alan TS ELiOT projesinin bir parçası olarak gerçekleştirilmiştir. Ek olarak, devlet tesislerinin kullanımı için Western Cape Health Research'ten yetki aldı. Örnekler, NHLS Green Point ve Stellenbosch Üniversitesi ile ortak bir çaba yoluyla, SU HREC onay numarası N09/11/296 altında toplandı. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Numune hazırlama

  1. Isı inaktivasyonu
    1. BSL-3 koşulları altında tam ısı inaktivasyonu elde etmek için MGIT kültürlerini 80 ° C'de 1 saat inkübe edin.
    2. InstaGene yöntemini kullanarak DNA ekstraksiyonuna devam edin29.
  2. DNA ekstraksiyonu
    1. 5 mL ısıyla inaktive edilmiş MGIT kültürünü 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    2. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 4000 x g'da santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı pipetleyerek dikkatlice çıkarın ve tortuyu bırakın.
    4. Tortuya 200 μL şelasyon bazlı DNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve 56 °C'de 15 dakika inkübe edin.
    5. Çözeltiyi 2 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve her birine üç adet 2 mm çapında cam boncuk ekleyin.
    6. Hücreleri yaymak için 10 saniye boyunca vorteksleyin ve tüpleri 8 dakika boyunca 100 ° C'de kuru bir banyo inkübatörüne yerleştirin.
    7. Damla çırpıcı homojenizatörü kullanarak numuneleri aşağıdaki ayarlarla homojenize edin: 4,0 m/s'de 20 sn'lik 3 döngü.
    8. RT'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve 130 μL süpernatanı (DNA içeren sıvı) tortu ve döküntülerden kaçınarak 1.5 mL'lik bir tüpe dikkatlice aktarın.
    9. Boncukları fiske vurarak veya girdaplayarak yeniden süspanse edin ve ekstrakte edilen DNA'yı içeren 1.5 mL'lik tüpe 156 μL boncuk ekleyin.
    10. Karıştırmak için 10 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
    11. DNA'ya bağlı boncukları ayırmak için tüpleri 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.
      NOT: Tüpün mıknatısa bakan tarafında, süpernatantın çıkarılmasına hazır olduğunu gösteren, koyu renkli manyetik boncuklardan oluşan kompakt bir peletin üzerinde şeffaf bir süpernatan görünmelidir.
    12. Boncukları rahatsız etmeden süpernatanı pipetleyin.
    13. Raftayken boncuk peletine 100 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin ve 30 saniye bekletin, ardından etanolü çıkarın. Yıkama adımını tekrarlayın.
    14. Boncuk peletini RT'de 5 dakika havayla kurutun. Bir sonraki adıma geçmeden önce boncuk peletinin mat göründüğünden ve görünür sıvı kalmadığından emin olun.
    15. Tüpü manyetik raftan çıkarın.
    16. 25 μL Nükleaz İçermeyen Su (NFW) doğrudan kurutulmuş boncuklara ekleyin ve 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
    17. RT'de 5 dakika inkübe edin.
    18. Tüpü 5 dakika daha manyetik rafa geri koyun.
    19. Ayrıştırılan DNA'yı (süpernatant) dikkatlice 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
    20. Yüksek hassasiyetli floresan bazlı dsDNA kantifikasyon reaktifini kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: DNA -20 °C'lik bir dondurucuda saklanabilir veya PCR ile devam edilebilir.
  3. Amplifikasyon (PCR)
    1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak multipleks PCR ve PCR sonrası temizleme25.
    2. Yüksek hassasiyetli floresan bazlı dsDNA kantifikasyon reaktifini kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.
  4. Jel elektroforezi
    1. Agaroz tozunu 1x TAE tamponunda mikrodalga ısıtmada tamamen eriyene kadar çözerek %2'lik bir agaroz jeli hazırlayın.
    2. Erimiş agaroza 5 μL toksik olmayan floresan DNA jel boyası ekleyin ve iyice karıştırın.
    3. Jel karışımını, kuyular oluşturmak için bir tarakla donatılmış bir jel döküm tepsisine dökün.
    4. Jelin RT'de katılaşmasına izin verin.
    5. Katılaştıktan sonra tarağı çıkarın ve jel tepsisini 1x TAE tamponu ile doldurulmuş elektroforez tankına yerleştirin.
    6. İlk kuyucuğa 5 μL yükleme tamponu ile karıştırılmış 5 μL kb DNA merdiveni yükleyin.
    7. Her PCR ürünü için, 5 μL ürünü 5 μL yükleme tamponu ile karıştırın ve ayrı kuyucuklara yükleyin.
    8. Jeli 1 saat boyunca 100 V'ta çalıştırın.
    9. Transillüminasyon ile jel dokümantasyon sistemini kullanarak DNA bantlarını görselleştirin.

2. ONT kütüphanesi hazırlığı

  1. Son hazırlık
    1. Konsantrasyona bağlı olarak her amplikon örneğinin 100 ng'sini hesaplayın ve gerekli hacmi temiz bir PCR tüpüne aktarın.
    2. Belirli bir numunedeki amplikonların toplam kütlesini (ng cinsinden) hesaplamak için, kalite kontrolünden (QC) sonra numunenin konsantrasyonunu (ng/μL) kalan hacmi (μL) ile çarpın.
      NOT: Örneğin, bir numunenin konsantrasyonu 2 ng/μL ve kalite kontrol sonrası kalan hacmi 1 μL ise, toplam amplikon kütlesi:
      Toplam kütle = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      Dizileme için 10 ng amplikon hazırlamak için seyreltme formülünü kullanın:
      C1V1 = C2V2
      Nerede: C1 = 45 ng, V1 = bilinmiyor, C2 = 10 ng, V2 = 1 μL, V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      Bu nedenle, dizileme için 10 ng DNA elde etmek için ilk amplikon örneğinin μL'si kullanılmalıdır.
    3. NFW kullanarak her bir numunenin toplam hacmini 12,5 μL'ye ayarlayın.
    4. Numuneleri 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve kısa bir süre döndürün.
    5. Her numuneye 1.75 μL son onarım ve A-kuyruk reaksiyonu tamponu ve 0.75 μL son onarım ve A-kuyruk enzim karışımı ekleyin.
    6. 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve kısa bir süre döndürün.
    7. Tüpleri bir termosiklerde 25 ° C'de 30 dakika, ardından 65 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Bu aşamada, kullanıcı işlemi durdurmaya karar verirse, son hazırlanmış DNA'nın saflaştırılması için boncukların kullanılması tavsiye edilir. Saflaştırılmış DNA daha sonra maksimum yedi gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  2. Yerel barkod ligasyonu
    1. Üreticinin talimatlarına göre DNA saflaştırma ve boyut seçimi, paramanyetik DNA temizleme boncukları, EDTA ve yerel barkodlar (NB01-96) için manyetik boncukları çözün ve hazırlayın ve ardından buzun üzerine yerleştirin.
    2. Yeni PCR tüplerine sırayla aşağıdakileri ekleyin: 2,75 μL nükleaz içermeyen su, 1 μL uçtan hazırlanmış DNA, 1,25 μL doğal barkodlar (NB01-96) ve 5 μL DNA ligasyon enzim karışımı.
    3. Her reaksiyonu 10 kez hafifçe pipetleyerek karıştırın, bir mikrosantrifüj kullanarak kısa bir süre döndürün ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
    4. Her oyuğa 1 μL EDTA ekleyin, pipetleyerek iyice karıştırın ve kısa bir süre döndürün.
    5. Havuz barkodlu numuneleri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne koyun.
    6. DNA temizleme boncuklarını girdaplama yoluyla yeniden süspanse edin ve toplam havuzlanmış numune hacminin 0,7 katını ekleyin (örneğin, toplam hacmi 253 μL olan 23 numune için 177,1 μL boncuk ekleyin).
    7. Çözeltiyi pipetleyerek karıştırın ve RT'de 10 dakika boyunca bir HulaMixer üzerinde inkübe edin.
    8. 1600 μL saf etanolü 400 μL NFW ile karıştırarak 2 mL %80 etanol hazırlayın.
    9. Tüpü, elüat berrak ve renksiz olana kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.
    10. Peleti bozmadan süpernatanı çıkarın ve atın.
    11. Boncukları peleti bozmadan 700 μL taze hazırlanmış %80 etanol ile yıkayın, ardından etanolü çıkarın ve atın.
    12. Etanol yıkama adımını tekrarlayın.
    13. Tüpü kısa bir süre santrifüjleyin, manyetik rafa geri dönün ve kalan etanolü çıkarın.
    14. Boncukların 30 saniye kurumasına izin verin.
    15. Tüpü manyetik raftan çıkarın, boncukları 35 μL nükleaz içermeyen suda hafifçe vurarak yeniden süspanse edin ve 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
    16. Elüat berrak ve renksiz olana kadar tüpü manyetik rafa geri koyun.
    17. Sonraki adımlar için 35 μL elüatı temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Kütüphane bu aşamada gece boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  3. Adaptör ligasyonu ve temizleme
    1. Hızlı DNA ligasyon reaktif kitini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve buzun üzerine yerleştirin.
    2. Yerel Adaptörü (NA) ve Quick Ligase'i pipetleyerek karıştırın, ardından buzun üzerine yerleştirin.
    3. Elüsyon tamponunu (EB) RT, vorteks, santrifüjde çözün ve buzun üzerine yerleştirin.
    4. Kısa Parça Tamponunu (SFB) RT, girdap, santrifüjde çözün ve buzun üzerine yerleştirin.
    5. 1.5 mL'lik düşük bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakileri karıştırın: 30 μL havuzlanmış barkodlu numune, 5 μL Doğal Adaptör (NA), 10 μL hızlı ligasyon reaksiyonu tamponu ve 5 μL hızlı etkili T4 DNA ligaz.
    6. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin, kısaca santrifüjleyin ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
    7. DNA temizleme boncuklarını girdaplama ile yeniden süspanse edin ve reaksiyona 20 μL (0.4x) boncuk ekleyin.
    8. Pipetleyerek nazikçe karıştırın ve RT'de 10 dakika boyunca bir HulaMixer üzerinde inkübe edin.
    9. Boncukları manyetik bir rafa peletleyin ve peleti bozmadan süpernatanı aspire edin.
    10. 125 μL Kısa Parça Tamponu (SFB) ekleyerek boncukları yıkayın, fiske vurarak yeniden süspanse edin, kısa bir süre santrifüjleyin ve manyetik rafa geri dönün.
    11. Boncukları peletleyin ve süpernatanı aspire edin; Yıkama adımını bir kez tekrarlayın.
    12. Kısa bir süre santrifüjleyin, tüpü manyetik rafa geri koyun ve kalan süpernatanı aspire edin.
    13. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları 15 μL Elüsyon Tamponu (EB) içinde yeniden süspanse edin.
    14. DNA'yı elüte etmek için kısaca santrifüjleyin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    15. Tüpü manyetik rafa yerleştirin, elüat berrak ve renksiz olana kadar boncukları peletleyin ve 15 μL elüatı temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aspire edin.
    16. Elüatın 1 μL'sini ölçün.
    17. Kitaplığı 20 fmol'e seyreltin (NEB hesaplayıcısını kullanarak hesaplayın) ve R10.4.1 akış hücresinde sıralama için 20 fmol hazırlanmış kitaplığın 12 μL'sini kullanın.
      NOT: Kitaplık artık -20 °C'de saklanabilir ve tekrar tekrar kullanıma izin verir.
  4. Nanopor sıralama akış hücresinin hazırlanması ve yüklenmesi
    1. Sıralama Tamponunu (SB), Kitaplık Boncuklarını (LIB), Akış Hücresi Bağını (FCT) ve Akış Hücresi Yıkamasını (FCF) RT'de çözün, girdaplayarak karıştırın ve döndürün.
    2. 5 μL Sığır Serum Albümini (BSA, 50 mg / mL), 30 μL Akış Hücresi Bağlantısı (FCT) ve 1170 μL Akış Hücresi Yıkamayı (FCF) birleştirerek, çözeltiyi ters çevirerek ve pipetleyerek karıştırarak akış hücresi hazırlama karışımını hazırlayın.
    3. Akış hücresinin doldurma portunu açın, hava kabarcıklarını gidermek için ~20 μL tamponu aspire edin, hava kabarcıkları oluşturmadan 800 μL hazırlama karışımını doldurma portuna yükleyin ve 5 dakika bekleyin.
    4. 37,5 μL Dizileme Tamponu (SB), 25,5 μL Kütüphane Boncukları (LIB) veya Kütüphane Çözeltisi (LIS) ve 12 μL 20 fmol DNA kütüphanesini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırarak kitaplığı hazırlayın ve pipetleyerek iyice karıştırın.
    5. Akış hücresi numune portu kapağını nazikçe kaldırarak, 200 μL astar karışımını hava kabarcıkları oluşturmadan astarlama portuna yükleyerek ve kitaplığı yükleme için hazırlayarak akış hücresini tekrar hazırlayın.
    6. Hazırlanan kitaplığı pipetleme ile nazikçe karıştırın ve kitaplığın 75 μL'sini sıralama akış hücresi numune portuna damla damla yükleyin, bir sonrakini eklemeden önce her damlanın porta aktığından emin olun.
    7. Akış hücresi numune portu kapağını kapatın, sapın akış hücresi numune portuna girdiğinden emin olun, ardından hazırlama portunu kapatın.
    8. Taşınabilir dizileme cihazını bir bilgisayara (kesintisiz güç kaynağı ile) bağlayın ve bir sıralama cihazı kontrol ve analiz yazılımı kullanarak sıralamayı başlatın.
  5. Yazılım parametreleri
    NOT: ONT tarafından geliştirilen bu yazılım uygulaması, sıralama çalışmalarının kapsamlı yönetimi ve ayrıntılı raporların oluşturulması için kullanılır.
    1. Sıralama işlemini başlatmak için lütfen Başlat seçeneğini ve ardından Sıralamayı başlat'ı seçin.
      NOT: Daha sonra dosya depolama için bir klasör belirlemeniz ve sıralama çalışmanız için bir ad sağlamanız istenecektir, örneğin "sequencing_run_1". Daha sonra, library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96 gibi uygun kit adını seçmek için Ayarlara devam et'e tıklayın ve istenen çalışma süresini özelleştirin, örneğin, 20 saat (maksimum çalışma süresi 72 saattir).
    2. Ardından, ham çıktı okumaları için POD5 ve temel çağrılan çıktılar için FASTQ gibi seçenekler arasından seçim yaparak çıktı dosyası türünü seçin. Ardından, FAST-Basecalling modelini seçin.
    3. Varsayılan ayarlardan bazılarının her 1,5 saatte bir sık gözenek taraması, minimum okuma uzunluğu 200 bp ve minimum 8 kalite puanı içerdiğini lütfen unutmayın. Son olarak, ayarları gözden geçirin ve okuma işlemine başlayın.

3. Sıralama sonrası analiz

  1. Sistem Gereksinimleri
    NOT: ONT-TB-NF boru hattını kullanarak ortamı kurma ve Mycobacterium tuberculosis amplikon dizileme verilerini analiz etme kılavuzu. Talimatlar hem Windows (WSL aracılığıyla ) hem de macOS kullanıcılarına hitap eder.
    1. Aşağıdakileri kullanın - İşletim Sistemi: Windows 10/11 (WSL2 ile) veya macOS; Bellek: Minimum 8 GB RAM (16 GB önerilir); Depolama: En az 50 GB boş disk alanı; İnternet: Paketleri ve verileri indirmek için gereklidir; İzinler: Yazılım yükleme ve ortamları yönetme yeteneği.
  2. Aşağıdaki ortam kurulumundan emin olun: Windows Kullanıcıları (WSL2 kullanarak). WSL2'yi etkinleştirin.
    1. PowerShell'i Yönetici olarak açın ve şunu çalıştırın: wsl - install.
    2. İstendiğinde bilgisayarı yeniden başlatın.
  3. Ubuntu'yu yükleyin
    1. Yeniden başlattıktan sonra Microsoft Store'u başlatın, Ubuntu'yu arayın ve tercih edilen sürümü yükleyin (ör. Ubuntu 22.04 LTS).
    2. Ubuntu'yu Başlat Menüsünden başlatın.
    3. İstendiğinde yeni bir UNIX kullanıcı adı ve parolası oluşturun.
    4. Güncelleme paketi Listeleri: sudo apt update & sudo apt upgrade -y.
  4. macOS Kullanıcıları
    1. Homebrew'i yükleyin (önceden kurulu değilse): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
    2. Gerekli paketleri yükleyin: brew install git wget
  5. Conda veya Mamba'yı yükleme
    1. İşletim sistemi için doğru yükleyiciyi indirmek için Miniconda indirme sayfasını ziyaret edin.
    2. Miniconda'yı yüklemek için yükleyiciyi çalıştırın ve ekrandaki talimatları izleyin. Kurulum tamamlandıktan sonra lütfen terminali yeniden başlatın.
    3. Conda Kanallarını Yapılandırın:
      conda config --kanal varsayılanları ekle
      conda config --kanal ekle bioconda
      conda config --add channels conda-forge
    4. Mambaforge (Mamba) Kurulumu
      Linux için:
      wget (İngilizce)
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      macOS için:
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. Mambaforge'u yükleyin: bash Mambaforge-*.sh
    6. Kurulumu tamamlamak için istemleri izleyin ve Mamba'yı etkinleştirmek için terminalinizi yeniden başlatın.
  6. ONT-TB-NF işlem hattını ayarlama
    1. Yeni bir Conda ortamı oluşturun: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. Alternatif olarak, Mamba'yı kullanın: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. Ortamı etkinleştirin: conda activate ont_tb_env
    4. Nextflow'u yükleyin: curl -s https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
    5. ONT-TB-NF deposunu klonlayın: git clone https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
    6. Gerekli Docker Görüntülerini Çekme (Docker kullanılıyorsa)
      Docker Pull hkubal/clair3:v0.1-r12
      Docker çekme quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. İşlem hattını çalıştırma
    1. Aşağıdaki komutu kullanarak her örneğin Basecalled FASTQ dosyalarını bağımsız olarak birleştirin.
      kedi *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      nextflow run run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /yol/için/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /yol/için/amplicon_regions.bed \
      Konu 16 \
      output_dir /mutlak/yol/için/output_directory
  8. Çıktı dosyaları ve yorumlama
    1. Başarılı bir şekilde yürütüldükten sonra, işlem hattının belirtilen çıkış dizininde aşağıdaki çıkışları oluşturduğundan emin olun:
      1. Hizalanmış Okumalar: *.bam dosyaları.
      2. Varyant Çağrıları: *SNP'leri ve indelleri içeren .vcf dosyaları.
      3. Özet Raporlar: *.csv veya *.tsv dosyaları, ilaç direnci mutasyonlarını ve diğer ilgili ölçümleri özetler.
      4. Kalite Kontrol Raporları: *MultiQC gibi araçlar tarafından oluşturulan .htmL dosyaları.
      5. Günlükler: İşlem hattı yürütmesinin ayrıntılı günlükleri.
      6. Ara Dosyalar: work/ dizininde saklanır (başarılı çalıştırmadan sonra silinebilir).
        NOT: İzin hatalarıyla karşılaşılması durumunda, dosya okumak ve yazmak ve ayrıca komut dosyalarını çalıştırmak için gerekli izinlere sahip olunduğunu doğrulamak önemlidir. Çevresel konularla ilgili olarak, lütfen boru hattını yürütmeden önce uygun Conda ortamının etkinleştirildiğinden emin olun. Docker profillerini kullananlar için Docker'ın hem kurulu hem de çalışır durumda olduğunu doğrulamak zorunludur. Ek olarak, yürütme sırasında herhangi bir bellek veya depolama sınırlamasını önlemek için sistem kaynaklarının titizlikle izlenmesi gerekir. Bu metodolojilere genel bir bakış Şekil 1'de sunulmuştur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seçilen DNA ekstraksiyon yöntemi, diğer hızlı tekniklere kıyasla verimliliği ve üstün verimi nedeniyle seçilmiştir. Sürekli olarak yüksek kaliteli genomik DNA (gDNA) üretti ve boncuk bazlı bir temizleme adımını entegre etmek, numune başına maliyetleri düşürürken işlem süresini en aza indirmeye yardımcı oldu. Bu, tek DNA miktar tayin aracı olarak florometri ile spektrofotometrik ölçümler gibi ek kalite kontrol değerlendirmelerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak başarıldı. Post-PCR konsan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun okunan dizileme platformu, bu çalışmada, özellikle sürekli olarak yüksek kapsama genişliği ile hızlı dizileme elde etme yeteneği olmak üzere dikkate değer avantajlar gösterdi. Başarılı bir şekilde dizilenmiş tüm izolatlarda, dirençle ilişkili genomik bölgelerin neredeyse tam temsilini gösteren% 99.9'luk bir kapsama genişliği elde edildi. Hedeflenen tüm genlerde ortalama kapsama derinliği 4462X iken, eis geni 22.242.08X ile en yüksek derinliği ve rrs geni 99.46X ile...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stellenbosch Üniversitesi'ndeki SAMRC Tüberküloz Merkezi'ne gerekli kaynakları ve tesisleri sağladığı için en içten şükranlarımızı sunarız. Ayrıca, bu çalışmanın ayrılmaz bir parçası olan örnekleri sağladığı için TS ELiOT Çalışmasına da derinden müteşekkiriz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL & 1.5 mL veya 2 mL Lo-bağlanma TüpleriEppendorfEP0030108051-250EA
1kb merdivenThermo Fisher ScientificSM0311
2 mL vida kapaklı tüplerBilimsel Uzmanlıklar ŞirketiP2TUB056C-0001.5ST
2 mm steril cam boncuklarSigma-AldrichZ273627-1EA
AMPure XP BoncukBeckman ColterA63881
Deeplex Myc-TB GenoScreen20090205
Elektroforez odasıThermo Fisher ScientificA25977
Etil alkol, safSigma-AldrichE7023-500ML
FastPrep HomojenizerMP Biyomedikal116005500
Filtre pipet uçları (10 & mikro; L) Biyo-Akıllı BilimselFT-10-R
Filtre pipet uçları (1000 µ L) Biyo-Akıllı BilimselFT-1000-R
Filtre pipet uçları (20 & mikro; L) Biyo-Akıllı BilimselFT-20-R
Filtre pipet uçları (200 & mikro; L) Biyo-Akıllı BilimselFT-200-R
Akış-hücresi Oxford Nanopore TeknolojileriFLO-MIN114
Isıtma bloğuEppendorf5382000031
InstaGene MatrisiBio-RadBBRD7326030
Manyetik Raf Thermo Fisher Scientific 12321D
MikrosantrifüjEppendorf 5406000046
MinIONOxford Nanopore TeknolojileriMK1B
Yerel barkod kiti V14 Oxford Nanopore TeknolojileriSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367
NEBNext Hızlı Ligasyon ModülüNEBE6056
NEBNext Ultra II Son Tamir/dA-tailing ModülüNEBE7546
Nükleazsız su (NFW)Thermo Fisher ScientificAM9937
Pipetler (P10, P20, P200 ve P1000)EppendorfEP3123000918-1EA
Kubit Analiz TrublarıThermo Fisher ScientificQ32856
Qubit dsDNA HS Test KitiThermo Fisher ScientificQ33231
Kubit florometreThermo Fisher ScientificQ33226
SYBR Güvenli DNA Jel TürüThermo Fisher ScientificS33102
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific17852
Evrensel Hood III transilluminatör (Moleküler Görüntüleyici Jel Doc XR Sistemi)Bio-Rad170-8170
Vortex mikserLasecWMBB0L0E0216

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuberculosis report. Baltimore Health News. , WHO. (2022).
  2. WHO Malaria Department report. Report 20-23. , WHO. (2023).
  3. The End Strategy TB. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).
  4. Cabibbe, A. M., et al. Application of targeted nextgeneration sequencing assay on a portable sequencing platform for culturefree detection of drugresistant tuberculosis from clinical samples. J Clin Microbiol. 58 (10), e0063220(2020).
  5. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culturefree prediction of susceptibility or resistance to 13 antituberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  6. NG, K. C. S., et al. How well do routine molecular diagnostics detect Rifampin. J Clin Microbiol. 57 (1), e0128723(2019).
  7. MacLean, E., Kohli, M., Weber, S. F., Suresh, A. Advances in molecular diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 58 (10), e0158219(2020).
  8. Sibandze, D. B., et al. Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing. Genome Med. 14 (1), 42(2022).
  9. Shah, M., Chihota, V., Coetzee, G., Churchyard, G., Dorman, S. E. Comparison of laboratory costs of rapid molecular tests and conventional diagnostics for detection of tuberculosis and drugresistant tuberculosis in South Africa. BMC Infect. Dis. 13 (1), 352(2013).
  10. Hu, T., Chitnis, N., Monos, D., Dinh, A. Nextgeneration sequencing technologies: An overview. Hum Immunol. 82 (10), 801-811 (2021).
  11. Pervez, M. T., et al. A comprehensive review of performance of nextgeneration sequencing platforms. Biomed Res Int. 2022, 3457806(2022).
  12. Tafess, K., et al. Targetedsequencing workflows for comprehensive drug resistance profiling of Mycobacterium tuberculosis cultures using two commercial sequencing platforms: Comparison of analytical and diagnostic performance, turnaround time, and cost. Clin Chem. 66 (6), 809-820 (2020).
  13. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. WHO rapid communication. , WHO. https://www.who.int/publications/i/item/9789240076372 (2023).
  14. Hazra, D., et al. Impact of wholegenome sequencing of Mycobacterium tuberculosis on treatment outcomes for MDRTB/XDRTB: A systematic review. Pharmaceutics. 15 (6), 1408(2023).
  15. Shea, J., et al. Comprehensive wholegenome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).
  16. Meehan, C. J., et al. Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis: Current standards and open issues. Nat Rev Microbiol. 17 (10), 533-545 (2019).
  17. Heupink, T. H., Verboven, L., Warren, R. M., Van Rie, A. Comprehensive and accurate genetic variant identification from contaminated and lowcoverage Mycobacterium tuberculosis whole genome sequencing data. Microb Genom. 7 (1), e000555(2021).
  18. Wang, X., et al. Interpretation of the third edition of WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis: Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Chin J Antituberc. 46 (2), 120-130 (2024).
  19. Kambli, P., et al. Targeted nextgeneration sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drugresistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127 (1), 102051(2021).
  20. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. Rapid Communication. , WHO. 1-8 (2023).
  21. Nandlal, L., Perumal, R., Naidoo, K. Rapid molecular assays for the diagnosis of drugresistant tuberculosis. Infect Drug Resist. 15 (1), 4971-4984 (2022).
  22. Dippenaar, A., et al. Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis: A critical review of the literature, new developments, and future opportunities. J Clin Microbiol. 60 (5), e0123422(2022).
  23. Chan, W. S., et al. Rapid and economical drug resistance profiling with nanopore MinION for clinical specimens with low bacillary burden of Mycobacterium tuberculosis. BMC Res Notes. 13 (1), 123(2020).
  24. Feuerriegel, S., et al. Rapid genomic first and secondline drug resistance prediction from clinical Mycobacterium tuberculosis specimens using DeeplexMycTB. Eur Respir J. 57 (4), 2004784(2021).
  25. GenoScreen product brochure. Deeplex MycTB. , GenoScreen. (2023).
  26. Mtafya, B., et al. A practical approach to render tuberculosis samples safe for application of tuberculosis molecular bacterial load assay in clinical settings without a biosafety level 3 laboratory. Tuberculosis. 138 (1), 102194(2023).
  27. Suganthi, P., Usharani, B., Venkateswari, R., Muthuraj, M. Biosafety practices in mycobacteriology laboratory. Research Advances in Microbiology and Biotechnology. 3, B P International (a part of SCIENCEDOMAIN International). Chennai. 1-39 (2023).
  28. consolidated guidelines on tuberculosis. Module 4: Treatment and care. WHO guideline. , WHO. (2022).
  29. Williams, J., et al. Matrixbased DNA extraction for targeted nextgeneration sequencing on decontaminated sputum samples. J Vis Exp. (181), e68147(2025).
  30. Delahaye, C., Nicolas, J. Sequencing DNA with nanopores: Troubles and biases. PLoS One. 16 (2), e0245534(2021).
  31. Zhao, K., et al. Rapid identification of drugresistant tuberculosis genes using direct PCR amplification and Oxford Nanopore Technology sequencing. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2022, 8845672(2022).
  32. Tagliani, E., et al. Culture and nextgeneration sequencingbased drug susceptibility testing unveil high levels of drugresistantTB in Djibouti: Results from the first national survey. Sci Rep. 7 (1), 15076(2017).
  33. Smith, C., Halse, T. A., Shea, J., Modestil, H., Fowler, R. C. Assessing nanopore sequencing for clinical diagnostics: For Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 59 (7), e0123421(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Long Read SequencingAmplicon SequencingDrug Resistant TuberculosisTargeted NGSPortable SequencingDNA Library PreparationResistance Variant DetectionFlow Cell PrimingGel ElectrophoresisBioinformatics Pipeline

Related Articles