Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fotosentetik Mikropların ve Virüslerinin Çevresel Örneklemesi: Tarladan Laboratuvara

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68379

⸱

3 Temmuz 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, siyanofajları (ve konakçılarını) izole etmek için deniz ve tatlı su ekosistemlerinin öfotik bölgelerinden örnekleme yöntemlerini ve tek genotipleri zenginleştiren ve virüs-konak etkileşim dinamiklerini karakterize eden örnekleme sonrası süreçleri açıklıyoruz.

Özet

Fotosentetik mikroorganizmaların ve virüslerinin çevresel örneklemesi, çağdaş deniz ve tatlı su biyoçeşitliliği ve ekosistem dinamiklerinin yanı sıra iklim değişikliğiyle ilgili faktörlerin (örneğin, artan sıcaklıklar ve asitlenme) türlerin ve topluluk kompozisyonunun evrimsel yörüngeleri üzerindeki etkilerini anlamada kritik bir rol oynamaktadır. Ne yazık ki, virosferin çeşitliliği tek bir evrensel örnekleme ve deneysel iş akışını desteklememektedir. Gerçekten de, her virüs sisteminin benzersiz özellikleri vardır, araştırma hedeflerine ulaşmak için virolojideki standart protokollerde değişiklik gerektiren. Virüs keşfi ve karakterizasyonu, hedef sisteme özgü yaklaşımlar gerektirse de, tüm virüsler için araştırma amaçları benzerdir: virüsü izole etmek; ana bilgisayar aralığını belirlemek; üretken enfeksiyonu onaylayın; ve virüsü, konakçıyı ve virüs-konak dinamiklerini karakterize eder. Virüs konak sistemlerinin sağlam tanımları, asgari düzeyde morfoloji, fizyoloji, biyokimya ve omik profillerin aydınlatılmasından oluşur. Enfeksiyonun çokluğu, sıcaklık, pH, konak anahtarı, yönlendirilmiş evrim gibi faktörleri değiştirerek veya virüs-konak sistem tepkisini gözlemlemek için ilaçlar uygulayarak sistemi manipüle ederek daha fazla bilgi elde edilebilir. Laboratuvarımız, yaşamın farklı alanlarındaki (Arkeler, Bakteriler ve Ökarya) virüsleri inceler. Bu raporda, siyanobakterilerin bakteriyofajını (yani siyanofajı) izole etmeye odaklanarak, tatlı su ve deniz ortamlarının öfotik bölgesinden fotosentetik mikroplardan numune alma yöntemlerini detaylandırıyoruz. Siyanobakteriler, bu su ekosistemlerinde birincil üretim ve besin döngüsü için kritik olan kilit taşı türlerdir. Açıklanan iş akışı, farklı derinliklerde sulardan numune alınmasından, sıvı ve katı ortam kültürü, gelişmiş moleküler/genetik yöntemler ve analitik yaklaşımlar kullanılarak virüs-konak sistem özelliklerinin karakterize edilmesine kadar uzanır. Açıklanan yöntemler, yaşam alanları boyunca virüs konak sistemlerinde bakteriyofaj ve virüs keşfine uyarlanabilir.

Giriş

Siyanofajların ve konakçılarının enfeksiyon dinamiklerini ve evrimsel ilişkilerini karakterize etmek, deniz ve tatlı su ekosistemlerinin mevcut ve gelecekteki durumlarını anlamanın anahtarıdır. Gelişmiş yüksek verimli dizileme teknikleri ve modern analitik yöntemler, virüs-konak ilişkilerini incelemek için siyanofaj (ve konakçı) genomlarının hızlı dizilenmesine izin verir 1,2. Bununla birlikte, iş akışları, virüsleri ve konakçılarını izole etmek ve tanımlamak için çevresel örnekleme ile başlar 3,4,5. Virosferin çeşitliliği nedeniyle, tüm virüsleri ve bakteriyofajları örneklemek ve karakterize etmek için tek bir protokol yoktur. Gerçekten de, her virüs konak sisteminin kendine özgü özellikleri vardır. Bununla birlikte, araştırılan virüs sisteminden bağımsız olarak temel hedefler benzerdir: virüsü izole etmek; ana bilgisayar aralığını belirlemek; bir veya daha fazla konakçıda üretken enfeksiyon göstermek; Kalitatif ve kantitatif yaklaşımlar kullanarak virüs, konak ve virüs-konak enfeksiyon dinamiklerini karakterize eder. Virüs sisteminin ileri düzeyde anlaşılması, sistemi bozarak incelenebilir. Enfeksiyon çokluğu (MOI)6, sıcaklık, pH, konak suşu gibi parametrelerin değiştirilmesi veya sistemin nasıl tepki verdiğini belirlemek için ilaçların uygulanması, virüs-konak dinamiklerinin doğası hakkında ek bilgi sağlar. Yönlendirilmiş evrim gibi daha gelişmiş manipülasyon, sistemin potansiyel evrimsel yörüngesi ve birlikte evrimsel uç noktaların daha büyük mikrobiyal topluluğu ve ekosistemi nasıl etkileyebileceği hakkında ek bilgi sağlayabilir.

Bu çalışmada, deniz, tatlı su ve diğer su ekosistemlerinde besin döngüsünde ve birincil üretimde kritik bir rol oynayan siyanobakteriler ve mikroalgler gibi fotosentetik mikropların çevresel örneklemesi için model (ancak kolayca uyarlanabilir) bir protokol sunuyoruz 7,8,9,10,11 . İş akışı, konakçıları deniz ve tatlı su ortamlarının öfotik bölgelerinden ve bu ekosistemlerdeki temel itici güçler olan virüs ve bakteriyofajlarından izole etmeye odaklanır12. Hem virüsler hem de bakteriyofajlar hem ökaryotik hem de prokaryotik popülasyon yapılarını etkiler ve ekosistem çeşitliliğini ve üretkenliğini büyük ölçüde etkiler13. Bu nedenle, buradaki amaç, araştırmak için ana bilgisayarların ve virüslerin zenginleştirilmesini kolaylaştıran bir örnekleme protokolü ve örnekleme sonrası iş akışı sağlamaktır: tek virüs/tek ana bilgisayar, çoklu virüs/tek ana bilgisayar, tek virüs/çoklu ana bilgisayar ve çoklu virüs/çoklu ana bilgisayar dinamikleri; -virüs-konak enfeksiyon dinamiklerinin altında yatan omik substratlar; ve incelenen virüs-konak sistemini ve virüslerin ve konağın çıkarıldığı daha büyük ekosistemi etkileyen potansiyel ortak evrimsel yörüngeler ve evrimsel uç noktalar.

Spesifik olarak, çevresel numune alma, numunelerin sahada ön işlenmesi (yani laboratuvara ulaşmadan önce), bakteriyofajın (ve virüslerin) izolasyonu için son işleme, mikroorganizmaların karışık tür kültürlerinin izin verilen konakçıları tanımlamaya yönelik olarak zenginleştirilmesi, varsayılan konakçıların tek koloni izolatlarının geliştirilmesi, iyi niyetli bir durumun doğrulanması için bir iş akışını açıklıyoruz virüs-konak ilişkisi (ör., üretken enfeksiyon) ve temel enfeksiyon özelliklerinin karakterize edilmesi (ör., virülans). Enfeksiyon tahlilleri sadece nispi virülans (VR)14 ve konak direncinin (RR)15 hesaplanmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda gözlemlenen fizyolojinin altında yatan -omik substratları araştırmak için kilit zaman noktalarında kültür örneklerinin çıkarılması için adımları da içerir (yani, virüs-konak etkileşim dinamikleri). Son olarak, olası tuzakları, sorun gidermeyi ve çözümleri ve ayrıca belirli taksonları hedeflemek için belirli adımları değiştirmenin yollarını tartışıyoruz. İş akışı, siyanofaj-siyanobakteriler, fikodnavirüs-mikroalgler ve termofilik fusellovirüs-arkeal sistemlere16,17 uygulanabilir ve yaşamın üç alanındaki virüsleri karakterize etmedeki faydasını gösterir: Bakteriler, Ökarya ve Arkeler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Çevresel örnekleme

NOT: Bu protokol, güney Kaliforniya kıyılarındaki kıyı şeridinin 5 mil içindeki öfotik bölgeden fotosentetik mikroplar için açık deniz örneklemesini açıklar. Bununla birlikte, protokol göllerden, donmuş göllerden veya jeotermal kaplıcalardan alınan örneklemeye uyarlanmıştır (Şekil 1).

  1. Güney Kaliforniya kıyı şeridi boyunca açık denizde çevresel örnekleme
    NOT: Çift 150 hp dıştan takma motora sahip 6 m, derin V, orta konsollu bir tekne (yani tekne) araştırma ekipmanı ile yüklenmiştir (Malzeme Tablosu). Öfotik bölge örneklemesi için üç bölge seçilmiştir: (a) Yer 1: N 30° 15.436, W 117° 31.551; (b) Yer 2: K 33° 12.521, G 117° 25.275; ve (c) Site 3: N 32° 59.914, W 117° 17.058. Her sahada, gün ortasında her sahada üç farklı derinlikten 20 L su numunesi çıkarıldı: < 3 m (yüzey numunesi), 6 m ve 14 m.
    1. Transfer pompası tertibatı: Her bir numune sahasına ulaştığınızda, tekne çapasını açın ve navigasyon sisteminden GPS koordinatlarını kaydedin. Örnekleme sistemini monte edin.
      1. Kısacası, pompa sistemine büyük döküntülerin girmesini önlemek için 2.54 cm ID flex-plus mavi PVC borunun (50 ft.) bir ucunu 2.54 cm'lik bir emme süzgecine takın. Süzgeç borusu bağlantısını koli bandı ile sabitleyin. Borunun diğer ucunu 1 hp paslanmaz çelik transfer pompasının emme manifolduna takın.
      2. Pompanın çıkışına 10 cm ID çökmeye dayanıklı kauçuk esnek hortumun 2.54 ft'lik bir bölümünü takın. Transfer pompası elektrik kablosunu gazla çalışan 3800 W inverter jeneratöre takın. Monte edildikten sonra, transfer pompasını doldurun ve pompa sisteminin çalışır durumda olduğundan emin olmak için test edin (Şekil 1, üst sıra).
    2. Transfer borusunun ağırlıklandırılması: 25 m uzunluğunda, 1,25 cm çapında naylon deniz halatının bir ucunu 14 kg'lık bir mantar çapanın deliğine sabitleyin. Süzgecin kuma yerleşmesini veya su altındaki kayalara çarpmasını önlemek için emme süzgeci ankrajın yaklaşık 3 m yukarısına yerleştirilmiş olarak ipi her 1 m'de bir mavi PVC boruya sabitlemek için koli bandı kullanın. Transfer tüpünü (mavi PVC tüp) daldırmak ve güçlü alt akıntıların tekne ile tüp arasında yanlış numune derinlikleri verecek geniş bir açı oluşturmasını önlemek için ankrajı kullanın. Ankraj/halat ve boru tertibatını derinliğe indirin.
    3. Deniz suyu numunelerinin çıkarılması: Süzgeçli boru ucu istenen derinliğe geldiğinde jeneratöre ve pompaya güç verin. Suyun derinlikten pompalamaya başlamasını sağlamak için pompayı yeniden doldurun veya transfer borusunu sallayın. Derinlikten sabit bir su akışı aktarıldıktan sonra, istenen derinlikten gelen suyun pompadan akmasını sağlamak için 1-2 tüp hacmini okyanusa geri boşaltın. Su örneklerini 20 L'lik su sürahilerinde toplayın (Şekil 1, üst sıra, en sağda).
    4. Numunenin saha istasyonuna taşınması: Taşıma sırasında su numuneleri ve üst boşluk arasında gaz değişimine (örn. O2/CO2) izin vermek için 20 L'lik su sürahisini yaklaşık 18 L'ye kadar doldurun. Su sürahilerini kapatmadan önce, ham su örneklerinden sıcaklık, pH ve tuzluluğu kaydedin. Ardından, su sürahilerini alt güverte deposundaki bir buz yatağının üzerine kapatın ve yerleştirin ve güneş ışığına ve yüksek sıcaklıklara aşırı maruz kalmayı önlemek için hafif bir örtü ile örtün.
  2. Su numunelerinin sahada ön işlenmesi
    NOT: Bir kara tesisine (örneğin, otel odası/konferans salonu/saha istasyonu) varışta, su numunelerindeki mikrobiyal içeriği korumak ve deniz suyu numunelerinin farklı fraksiyonlarını partikül boyutuna göre ayırmak için bir dizi ön işleme adımı gerçekleştirilmiştir.
    1. Filtrasyon sistemi tertibatı: 1 m uzunluğunda 9.525 mm ID şeffaf vinil borunun bir ucunu, portatif hava diyaframlı vakum pompasının vakum portundaki hortum dikeni girişine sabitleyin. Aynı hortumun diğer ucunu 1.0 L, 0.45 μm filtre vakum kabı tertibatına sabitleyin. Deniz suyu numunesinin farklı fraksiyonlarını aşağıda açıklandığı gibi ayırmak için sırayla hem 0,45 μm hem de 0,22 μm filtre kabı tertibatlarını kullanın.
    2. Sistemi sızıntı veya arızalı/yırtık filtreler açısından test etmek için, 0,45 μm polietersülfon (PES) membran filtre kabından 0,25 L deniz suyunu filtreleyin. Sızıntı yapmayan bir sistem, deniz suyu numunesi tamamen filtrelendikten sonra filtre ile ızgara arasında emiş gösterecektir.
    3. 0,45 μm PES membran filtre kabı tertibatı ile filtreleme: Fotosentetik mikroorganizmaları (örn. mikroalgler ve siyanobakteriler) izole etmek için amaç, iki adet 1 L filtre kabı (veya dört adet 500 mL filtre kabı) kullanarak 0,45 μm PES membran filtre kabından 2 L deniz suyu numunesini filtrelemektir. Tüm süzüntü şişelerini filtre boyutu, numunenin alındığı derinlik, tarih ve numune alma yeri belirleyicisi ile uygun şekilde etiketleyin. Son olarak, aşırı güneş ışığını önlemek için vidalı kapak ve 0.45 μm filtrat içeren şişeleri yarı saydam bir bez veya kılıf ile kapatın.
      NOT: Filtre kabındaki filtrenin kuru çalışmasına izin vermeyin. Filtrenin üzerinde her zaman ince bir sıvı tabakası bulundurun. Filtre biyolojik kalıntıları (örneğin hücreler) biriktirecektir. Filtre pisliklerle tıkanırsa, kap tertibatını dikkatlice sökün ve kullanılmış filtre kabını bir kenara koyun, ancak tıkalı kabı atmayın. Yeni bir 0,45 μm filtre takın ve devam edin.
    4. 0,22 μm PES membran filtre kabı tertibatından filtreleme: Büyük ökaryotik virüsleri izole etmek için, önceki adımdan (adım 1.2.3) 0,45 μm'lik filtratın 1 L'sini kullanın ve 0,22 μm'lik bir filtre kabından süzün. Ultrafiltrat şişesini filtre boyutu, numunenin alındığı derinlik, tarih ve numune alma yeri belirleyicisi ile uygun şekilde etiketleyin. Son olarak, 0.22 μm ultrafiltrat içeren şişeyi kapatın ve kapatın (0.45 μm filtratın filtrelenmesinden).
      NOT: Filtre kabındaki filtrenin kuru çalışmasına izin vermeyin. Filtrenin üzerinde her zaman ince bir sıvı tabakası bulundurun. Filtre, biyolojik numuneler içeren biyolojik kalıntıları biriktirecektir. Filtre tıkanırsa, kap tertibatını sökün ve kullanılmış filtre kabını bir kenara koyun. Tıkalı kabı atmayın. Yeni bir 0,22 μm filtre takın ve devam edin.
    5. 0,45 μm filtreden konsantre biyokütle: İki steril 50 mL konik polipropilen santrifüj tüpünün her birine 48 mL süzüntü (0,22 μm filtrasyondan) dökün. Kap tertibatı içinde harcanan 0.45 μm filtrenin en dış kenarı boyunca eşit şekilde kesmek için steril bir neşter kullanın. Biyokütle yüklü ve nemli filtreyi çıkarmak için steril forseps kullanın. İkiye bölün. Filtre kağıdının yarısını 50 mL'lik bir konik tüpe sarın. Filtre membranının ikinci yarısı ve ikinci tüp ile tekrarlayın. Boru kapaklarını vidalayın ve şeffaf film ile sabitleyin. Tüpü etiketleyin.
    6. Büyük virüs biyokütlesini 0,22 μm filtreden konsantre edin: İki steril 15 mL konik polipropilen santrifüj tüpünün her birine 14 mL ultrafiltrat dökün. Kap tertibatı içinde kullanılan 0.22 μm filtrenin dış kenarı boyunca kesmek için steril bir neşter kullanın. Biyokütle yüklü ve nemli filtreyi çıkarmak için steril forseps kullanın. İkiye bölün. Filtre kağıdının yarısını sarın ve 15 mL konik tüplerden birine yerleştirin. Filtre membranının ikinci yarısı ve ikinci 15 mL konik tüp için tekrarlayın. Tüp kapaklarını vidalayın ve şeffaf bir filmle (örn. Parafilm) sabitleyin. Her tüpü filtre boyutu (yani 0,22 μm), yer, derinlik ve tarih ile etiketleyin.
    7. Kalan 0,45 μm filtratı ve kalan 0,22 μm filtratı laboratuvara geri göndermek için saklayın. Her derinlik ve örnekleme alanı için tüm bu filtreleme işlemini (1.2.2 ila 1.2.6 arasındaki adımlar) tekrarlayın.
      NOT: Ultrafiltrat laboratuvarda bir ortam tabanı olarak kullanılır (doğal mineraller ve diğer besinlerle birlikte).
      Ham numune mikroskobu (İsteğe bağlı): İçinde 0,45 μm filtre bulunan 50 mL'lik bir konik tüp alın ve hafifçe sallayın. 50 mL'lik konik tüpten 30-50 mL deniz suyu almak için plastik bir damlalık (veya pipetleyici) kullanın ve numune ve bir lam ile bir cam mikroskop lamı hazırlayın. Bir alan mikroskobu ve bir bilgisayar kullanarak, gözlemlenen mikroorganizmaların özelliklerini tespit etmek ve kaydetmek için mikroskop slayt içeriğini görüntüleyin (Şekil 2D).

2. Virüsleri/bakteriyofajları konsantre etmek ve konakçıları zenginleştirmek için numune işleme

NOT: Bu protokol, numuneler saha sahasından laboratuvara ulaştığında gerekli olan ilk işlem adımlarını açıklar. Uçakla ve karayolu taşıtlarıyla yapılan taşımacılık, farklı hususlar gerektirebilir. Çevresel numune canlılığı, sıcaklık, pH, tuzluluk, ışığa maruz kalma veya maruz kalma eksikliği, çözünmüş gaz (örneğin, CO2 ve O2) konsantrasyonu ve çevresel ekstraksiyon ile laboratuvar işleme arasındaki süredeki ani değişikliklerle azalacaktır.

  1. Virüsleri ve bakteriyofajları yoğunlaştırma ve depolamayı döndürün
    NOT: Numuneler laboratuvara ulaştıktan sonra, varıştan sonraki 8 saat içinde işlemek, numune sahasının çıkarılması ile laboratuvara varış arasındaki zaman aralığı nedeniyle canlı mikrop kaybını en aza indirebilir. Aşağıda verilen adımlar, uzun süreli depolama ve kullanım için konsantre bakteriyofaj (veya virüs) süspansiyonunun (yani çalışma stoklarının) alikotlarını sağlayacaktır.
    1. Konsantre ultrafiltrat: Sahaya göre her numune alma derinliği için kalan ~ 800 mL ultrafiltratı laboratuvara gönderin. 3K NMWL 15 mL santrifüj spin filtre kullanın ve 50-100 mL ultrafiltratı 1.0-1.5 mL'ye kadar konsantre etmek için 10-20 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen konsantre ultrafiltratta herhangi bir virüs benzeri parçacık (VLP) olup olmadığını değerlendirmek için daha önceaçıklandığı gibi 16 TEM görüntüleme için ızgaralar hazırlayın. VLP'ler tespit edilirse, konsantreyi 100 mL alikotlara bölün. 4 °C'de (veya daha uzun süreli depolama için -20 °C'de) saklayın.
    2. 0,22 μm filtreden partiküllerin konsantre edilmesi: 0,22 μm filtrelerden gelen kalıntıları, filtrelerin taşındığı 50 mL tüpler içindeki ultrafiltrata nazikçe kazımak için steril bir neşter kullanın. 50-200 mL süspansiyonu ~3 mL numune tutma hacmine kadar konsantre etmek için 10K NMWL spin yoğunlaştırıcı kap düzeneği kullanın. 0,22 μm filtrenin yüzeyinde yakalanmış olabilecek 0,45 μm filtrattan VLP'ler olup olmadığınıbelirlemek için daha önce açıklandığı gibi 16 TEM görüntüleme için ızgaralar hazırlayın. VLP'ler tespit edilirse, konsantreyi 100 mL alikotlara bölün ve 4 °C'de (veya daha uzun süreli depolama için -20 °C'de) saklayın.
  2. 0,45 μm filtrelerden sıkma konsantresi ve zenginleştirici retentate.
    NOT: Karışık mikroorganizma kültürleri, yukarıda izole edilen virüsler ve bakteriyofaj için konakçılar içerebilir (adım 2.1.1 ve 2.1.2). Spin konsantrasyonu ve karışık kültürlerin zenginleştirilmesi, varsayılan konakçıların saf kültürlerini geliştirmek için çalışma stokları sağlar (bkz. adım 3).
    1. Konsantre karışık süspansiyonlar: Sahaya göre her numune alma derinliği için, hücre kalıntısı yüklü 0,45 μm filtreli ~ 100 mL ultrafiltratı laboratuvara geri gönderin. 0,45 μm'lik filtredeki kalıntıları, taşındıkları 50 mL'lik tüplerdeki ultrafiltrata kazımak için steril bir neşter kullanın. Biyokütleyi peletlemek için numuneyi 2000 x g'da 10 dakika, 4 °C santrifüjleyin. Peleti 5 mL 1:8'de yeniden süspanse edin, BG-11 ortamını1: 8 bir pipetle hafifçe ezerek seyreltin.
    2. 0.45 μm filtreden zenginleştirme retentat: 50 mL BG-11 ortamı (3 şişe) ve numune bölgesinden (40 mL) artı BG-11 (10 mL) içeren 250 mL şaşkın Erlenmeyer şişelerinde altı paralel kültür hazırlayın. Her şişeyi 0.5 mL hücre konsantresi ile aşılayın (adım 2.2.1'den itibaren). Işık yoğunluğu 20-40 mmol foton/m2/s olarak ayarlanmış ışık yoğunluğu ile 25 ° C'de en az 7-10 gün boyunca bir fotobiyoreaktörde hafif çalkalama ile inkübe edin.19 Büyüme sağlam olduğunda (örneğin, OD730nm = 0.8), peletlemek için 2000 x g, 10 dakika, 4 °C'de santrifüjleyin. Peletleri 10 mL 1:8 seyreltik BG-11 ortamında bir pipetle hafifçe ezerek yeniden süspanse edin. -80 ° C depolama için vidalı kriyotüplerde 0.5 mL hücre süspansiyonundan 10-20 alikot hazırlayın.

3. Mikrobiyal konakçıların tek genotip saf kültürlerinin geliştirilmesi

NOT: Bu protokol, toplanan çevresel örneklerden işlenen karışık kültürlerden virüsler ve bakteriyofaj için varsayılan mikrobiyal konakçıların izole edilmesi ve saflaştırılması için prosedürleri açıklar. Birden fazla konak fenotipi izole edilebilir ve saflaştırılabilir, böylece depolanan su örneklerinde bulunan virüsler ve bakteriyofaj için izin veren konakçıların tespit edilme olasılığı artar (adım 2.1.1-2.1.2).

  1. Çizgi plakaları ve tek koloni izolatlarının seçilmesi
    NOT: Çevresel örnekleme sırasında yakalanan duyarlı ve izin verilen bir virüs veya bakteriyofaj konakçısını izole etme olasılığını artırmak ve virüslerin ve bakteriyofajın konakçı aralığını araştırmak için karışık kültürlerden çoklu tek genotip saf kültürler geliştirilmiştir.
    1. Aşağıda tarif edildiği gibi tek koloni izolatları (SCI) geliştirin.
      1. BG-11 agar plakalarını hazırlayın20. -80 °C'de saklanan karışık süspansiyonun bir parçası olan buz üzerinde çözdürün (adım 2.2.2'den itibaren). Standart teknikleri20 kullanarak BG-11 agar plakalarına çizgi hücresi konsantreleri oluşturmak için steril bir halka kullanın. Çizgili plakaları bir fotobiyoreaktörde ~ 10 gün boyunca 25 ° C'de, 20-40 mmol foton / m2 / s'de ışık yoğunluğu ile veya plakalar üzerinde koloniler görünene kadar inkübe edin.
      2. 5 mL BG-11 ortamı ve / veya numune bölgesinden 5 mL ultrafiltrat karışımı ve BG-11 ile 20 mL kültür tüplerinde ~ 10 tohum kültürü hazırlayın. Steril bir kürdan ile plakadan bir SCI seçin ve her tüpe bir kürdan bırakarak her tüpü ayrı ayrı aşılayın. Bir fotobiyoreaktörde 25 ° C'de en az 10-15 gün boyunca, ışık yoğunluğu 20-40 mmol foton /m2 / s'ye ayarlanmış olarak veya büyüme tespit edilene kadar (örneğin, OD730nm = 0.4-0.8) hafif çalkalama ile inkübe edin.
        NOT: İlk çizgi plakasında birden fazla koloni fenotipi (örn. morfoloji, şeffaflık, renk) varsa, bir dizi koloni fenotipinden aşılama için tek tek kolonileri seçin.
    2. Çalışan stokların saf kültürlerinin geliştirilmesi: Pozitif tohum kültürü büyümesi tespit edildiğinde, plakalar üzerinde yalnızca tek bir koloni fenotipi görünene kadar çizgi prosedürlerini tekrarlayın (Şekil 3B ve Şekil 4B). Yukarıda açıklandığı gibi (adım 2.2.2) tohum kültürlerini 250 mL şaşkın şişelerde (Şekil 3C ve Şekil 4C) 50 mL kültürlere yükseltin. ~ 20 adet 0.5 mL SCI hücre süspansiyonu hazırlayın ve -80 ° C saklama için 1.0 mL vidalı kriyotüplere pipetleyin.
      NOT: Saf siyanobakteri kültürlerinin geliştirilmesi için, kültür kontaminasyonunu azaltmak için antibiyotikler veya antifungaller (örn., imipenem, sikloheksimid) gerekebilir21. Kaplama prosedürü, siyanobakterilerin veya mikroalglerin izolasyonunun hedeflenebileceği bir pivot noktasıdır. İnkübasyon sırasındaki ışık parametreleri, ışık yoğunluğu veya açma-kapama döngüleri açısından değişebilir.
  2. Tek genotip karakterizasyonu ve çalışma stoklarının depolanması
    NOT: Bireysel varsayılan konakçı genotiplerinin izolasyonunu ve zenginleştirmesini doğrulamak için, saf kültürler morfolojik ve genetik olarak karakterize edilir.
    1. Morfolojik karakterizasyon: Sıvı kültür ve katı ortam plakası çalışma döngüleri tek bir hücre fenotipi ile sonuçlandığında, mikrobiyal morfotipleri hem ışık mikroskobu (Şekil 2A-C) hem de varsa transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve/veya taramalı elektron mikroskobu (SEM; Şekil 3A ve Şekil 4A). Işık mikroskobu altında (ör., 60x-100x büyütme) yeşil, açık kahverengi veya şeffaf tek hücreli, koloniyel, filamentli, spiral, dallı veya trikom hücresel organizasyon gözlenebilir. Bu, olası bir taksonomik atamayı gösterecektir.
    2. Genetik Karakterizasyon: Tek bir mikroorganizma genotipinin izolasyonunu, varsayılan saf kültürlerden DNA ekstraksiyonu ve ardından kısmi genom dizilimi ile doğrulayın. Siyanobakterilerde, 16S rRNA geni genellikle bir hedeftir (Şekil 5A)22. Bir 16S filogenetik analizi, taksonomik gruplamayıtanımlayabilir 22. Mikroalglerde, 18S rRNA genellikle23'ü hedef alır. İlgilenilen izolatlar veya yeni izolatlar için, tüm genom dizilimi takip edilebilir.

4. Tek genotip virüs/bakteriyofaj süspansiyonlarının geliştirilmesi

NOT: Bu protokol, çevresel numunelerden çoklu tek genotip viral ve bakteriyofaj süspansiyonlarının izole edilmesi ve saflaştırılması için prosedürleri açıklar.

  1. VLP konsantrelerinin seyreltilmesi ve TEM'i
    NOT: TEM ve plaka bazlı plak tahlilleri24 kullanılarak, VLP'lerin konakçı hücreleri enfekte eden iyi niyetli bakteriyofaj (veya virüsler) olduğu doğrulanır.
    1. Filtratların transmisyon elektron mikroskobu (0.45 μm ve 0.22 μm): Ham su numunelerinin 0.45 μm ve 0.22 μm filtrasyonundan elde edilen konsantreleri kullanın (bkz. adım 2.1) TEM ızgaralarını16 hazırlamak ve virüs partikül heterojenliğini (yani, morfotiplerin çeşitliliği) incelemek için görüntü. %30-%50 birleşme elde etmek için sonraki adımları tamamlamadan önce yüksek birleşmeli ızgaralarla (örn. %90) sonuçlanan numuneleri seyreltin. Izgaralar üzerindeki hücre birleşmesini tahmin etmek için manuel partikül sayımı veya görüntüleme yazılımının kullanılması kullanılabilir.
      NOT: Izgaralar üzerindeki yüksek birleşim, seçilebilecek tek tek plakların ortaya çıkmasından ziyade, katı ortam plakaları üzerindeki ana çimlerin temizlenmesine neden olabilir. Bu nedenle, plak tahlillerinden önce numunelerin seyreltilmesi zaman kazandırabilir. Alternatif olarak, birden fazla konak çim plakası, VLP konsantrelerinin seri dilüsyonları kullanılarak konak-virüs etkileşimleri için test edilebilir.
    2. Konukçu çimlerde bakteriyofaj (veya virüs) aktivitesinin tespit edilmesi: BG-11 agar plakalarında, çalışan stoklardan varsayılan siyanobakteri (veya mikroalg) konakçı çimleri büyütün (adım 3.1.2). 0,5 mL VLP süspansiyonunu 4,5 mL ortamda çimlerin üzerine pipetleyin (Şekil 6A, solda) ve çimin tüm yüzeyi süspansiyonla kaplanana kadar hafifçe döndürün. Bir fotobiyoreaktörde 25 ° C'de 3-10 gün boyunca, 20-40 mmol foton/m2 / s'de ışık yoğunluğu ile veya plakalar üzerinde plaklar görünene kadar inkübe edin (Şekil 6A, sağ).
  2. Plakların kazınması ve tek genotip virüs veya bakteriyofaj süspansiyonlarının geliştirilmesi
    NOT: Bireysel plak fenotiplerinin kazınması ve konağın sıvı kültürlerinde bakteriyofajın çoğaltılmasıyla, iyi niyetli konak-bakteriyofaj (veya konak-virüs) etkileşimleri doğrulanır ve enfeksiyon tahlilleri için bakteriyofaj (veya virüs) çalışma stoklarının geliştirilmesine izin verilir. Bakteriyofajın (veya virüsün) çalışma stokları, tanımlanmış bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) enfeksiyon testlerine devam etmek için çeşitli yöntemlerden biri (örneğin, qPCR, plak testleri) ile titrelenmelidir.
    1. Bir bakteriyofaj (veya virüs) genotipinin izole edilmesi ve çoğaltılması: Plakalar üzerinde tek tek plaklar görüldüğünde (VLP konsantresinin yeterli seyreltilmesi nedeniyle), tek bir plağı kazımak için steril bir halka kullanın. Döngüyü, konağın 10 mL'lik bir tohum kültüründe döndürün (Şekil 6B, solda). Hafif çalkalama ile inkübe edin (ör., 70-120 rpm) bir fotobiyoreaktörde 3-10 gün boyunca 25 ° C'de 20-40 mmol foton / m2 / s'ye ayarlanmış ışık yoğunluğu ile veya OD730nm damlaları veya hücre kalıntısı tespit edilene kadar tüpün dibinde hücre ölümünü/parçalanmasını gösterir (Şekil 6B, sağ)25.
      NOT: Ev sahibi çimlerde plaklar oluşuyorsa ancak sıvı kültürde herhangi bir enfeksiyon belirtisi yoksa, plaklar bir bakteriyofaj (veya virüs) yerine bir bakteriyosin26 tarafından oluşturulmuş olabilir. TEM, bakteriyofaj (veya viral) enfeksiyonu ile hücre ölümünü göstererek plaka testlerini destekleyebilir.
    2. Bakteriyofaj (veya virüs) çalışma stokları için titrenin ölçülmesi: Bakteriyofaj (veya virüs) izolasyonu, yukarıda açıklanan filtrasyon ve spin konsantrasyon yöntemleri kullanılarak elde edilir. Seri seyreltme plak testleri27 ile bakteriyofaj (veya virüs) süspansiyonları için titreleri ölçün. Alternatif olarak, sonraki enfeksiyon tahlilleri için çalışma stokları oluşturmak üzere bakteriyofajın qPCR tabanlı titremesini yürütmek için primerler geliştirmek üzere DNA ekstraksiyonu ve tüm virüs genom dizilimi ve filogenetik (Şekil 5B) gerçekleştirin.
      NOT: Tek bakteriyofaj (veya virüs) genotiplerinin çoğaltılması, titre veya çalışma stoğu hacimleri deneysel ihtiyaçlar için çok düşükse, 50 mL veya 100 mL kültürlere yükseltilebilir. Bakteriyofaj (veya virüslerin) çalışma stokları geliştirilirken, virüs-konak sisteminin doğasını (örneğin, yüksek virülans veya düşük virülans), enfeksiyon tahlilleri için planlanan enfeksiyon çokluğunu (MOI) ve bir proje için kaç enfeksiyon tahlilinin tamamlanacağını göz önünde bulundurun. Virüs stoklarının çözülmesi ve yeniden dondurulması tavsiye edilmez. Her deney için aynı titrede aynı preparatın kopyalarından bir tam virüs stoğunu çözün ve kullanın. Elektrosprey iyonizasyon/kütle spektrometresi (ESI/MS)28 dahil olmak üzere diğer titre teknikleri açıklanan yöntemleri tamamlayabilir.

5. Enfeksiyon tahlilleri

NOT: Bu protokol, aşağıdakiler için kullanılan konak-faj (veya konak-virüs) enfeksiyon testlerini açıklar: katı ortam üzerinde virülansı, konak aralığını ve enfeksiyon fenotipini (replikasyon stratejisinin bir göstergesi) kalitatif olarak karakterize etmek; ve sıvı kültürde büyüme kinetiğini, virüs virülansını14 ve konakçı direncini15 kantitatif olarak değerlendirin.

  1. Katı besiyerinde bağıl bakteriyofaj (veya virüs) virülansı ve konak aralığının belirlenmesi
    NOT: Çim üzerinde nokta deneyleri, tek plakalı seri seyreltme plak testleri ve konak direnç plakası testleri dahil olmak üzere tüm katı ortam testleri, virüs virülansı, konak aralığı ve replikasyon stratejisi gibi bakteriyofaj-konak enfeksiyonu parametreleri hakkında nitel veriler sağlar. Sıvı kültür büyüme deneyleri, virüs-konak dinamiklerinin daha kantitatif ölçümlerine ve modellenmesine izin verir.
    1. Çimde nokta tahlilleri: Konukçu aralığını belirlemek için, çevresel örneklerden veya diğer laboratuvarlardan veya kültür koleksiyonlarından elde edilen suşlardan izole edilmiş birden fazla varsayılan konukçudan oluşan çimler hazırlayın. Çimlerde, bir pipetle çimlerin üzerine 2 μL bakteriyofaj (veya virüs) süspansiyonu tespit edin. Aynı plakanın ayrı bir bölgesinde, sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak aynı hacimde Triton X-100 ve nanopure (18MW) suyu tespit edin16. Bakteriyofajın16 konak aralığını değerlendirmek için birden fazla konakta belirli bir bakteriyofaj (veya virüs) ile birden fazla çim üzerinde nokta testi yapın. Plak fenotipleri, bakteriyofaj (veya virüs) replikasyon stratejisi hakkında bilgi verir. Keskin kenarları olan ve agar'a kadar berraklaşan plaklar litik replikasyonu gösterirken, dağınık kenarlıklı veya haleli plaklar litik olmayan replikasyonu gösterebilir 16,17.
      NOT: Alternatif olarak, tek plakalı seri seyreltme plak deneyleri, plak boyutu ile bakteriyofaj titresi arasında doğrusal bir ilişki olup olmadığını gösterir. Plakayı bir ızgaraya veya pasta bölümlerine bölmek için plakanın arka tarafında bir işaretleyici kullanın. Daha sonra, aynı hacmi (yani 2 mL) kullanarak, ancak bakteriyofaj süspansiyonunun seyreltmeleriyle (örneğin, 1: 1, 1: 4, 1: 16, 1: 64), tek bir ana plaka üzerinde çim üzerinde nokta tahlili yapın.
    2. Konak direnci testleri: Bir bakteriyofaj takımının belirli bir konakçıda enfeksiyon oluşturup oluşturmayacağını belirlemek için, yukarıda açıklandığı gibi bir plaka üzerinde bir konakçı çimi hazırlayın. Plakanın arka tarafındaki bir işaretleyici kullanarak, plakayı bir ızgaraya veya pasta bölümlerine bölün. Daha sonra, kontrol olarak Triton X-100 ve nanosaf su kullanarak, her bir bakteriyofaj (veya virüs) süspansiyonunun 2 mL'sini ızgaranın (veya pastanın) bir bölümüne yerleştirin. Tüm bakteriyofaj (veya virüs) süspansiyonları eşit titrelerde eklenirse, konakçıdaki bakteriyofaj suşları (veya virüsler) arasındaki nispi virülansı kalitatif olarak değerlendirin (yani, daha büyük plak = daha öldürücü virüs).
  2. Sıvı kültür enfeksiyonu testlerinde virülans, dayanıklılık ve büyümenin ölçülmesi
    NOT: İlk kalitatif sonuçlar, belirli bakteriyofaj-konak çiftlerini hedeflemek ve virüs-konak etkileşim dinamiklerinin daha nicel analizlerini yapmak için bir temel sağlar. Sıvı kültürde, enfekte olmuş bir konak büyüme eğrisi oluşturulur ve enfekte olmayan (kontrol) konak büyümesi ile karşılaştırılır.
    1. Aşağıda açıklandığı gibi sıvı kültür tek virüs/tek konaklı enfeksiyon testi gerçekleştirin.
      1. Katı ortam plakası tahlilleri (adım 5.1) ile duyarlı ve izin verilen bir mikroorganizmanın (örneğin bir siyanobakteri) paralel sıvı kültürlerini (~ 6-12) oluşturun: 1.0 L (320 mL kültür), 500 mL (160 mL kültür) veya 250 mL (80 mL kültür) - daha önce tarif edildiği gibi şaşkın kültür şişeleri17. Önceden tanımlanmış bir zaman noktasında (tipik olarak 0.5 veya 1 konak ikiye katlama süresi), eşdeğer hücre yoğunluğunda (örneğin, OD730nm = 0.08) bakteriyofaj süspansiyonu ile üçlü kopya halinde paralel kültürlerin bir alt kümesini aşılayın mevcut çalışma stok titresi ile önceden seçilmiş bir enfeksiyon çokluğu (MOI) elde etmek için gereken uygun hacmi kullanarak.
      2. Diğer paralel kültürleri (ayrıca üç kopya halinde) aşılanmamış (yani enfekte olmamış) kontrol olarak bırakın. İsteğe bağlı olarak, seçilen bakteriyofaj-konak eşleşmeleri arasındaki karşılaştırmalar için üçüncü bir paralel kültür setini farklı bir bakteriyofaj (veya virüs) suşu ile aşılayın. Kültürlerin bir fotobiyoreaktörde 25 ° C'de 3-10 gün boyunca büyümesine izin verin ve ışık yoğunluğu 20-40 mmol foton/m2 / s olarak ayarlayın.
      3. Bakteriyofaj ile enfekte olmuş ve enfekte olmamış (kontrol) kültürlerden düzenli zaman aralıklarında (örn., 8 saat) OD730nm okumaları alarak konakçı büyüme eğrileri oluşturun (Şekil 7A). Enfekte olmamış kontrol kültürlerinin (Şekil 7C) ve konak hücre kültürlerinde üretken enfeksiyonun (Şekil 7D) TEM doğrulamasını kullanın. Sitopatik etkiler 29,30 enfekte olmuş hücrelerin çoğunda kolayca gözlemlenebilirken, enfekte olmamış hücreler morfolojik dönüşüm veya stres belirtileri göstermez.
    2. Sıvı kültür enfeksiyonu tahlilleri için temel analitik: Tek virüs/tek konaklı (SVSH) sıvı kültür enfeksiyonu tahlillerinden, maksimum spesifik büyüme hızı (maksimumμ)31, nispi bakteriyofaj (veya virüs) virülansı14 ve nispi konak direnci15- bakteriyofaj-konak veya virüs-konak dinamiklerinin daha nicel bir açıklaması için (Şekil 7B). Standart raporlanabilir metrikler, enfekte olmamış bir konak kontrolü ve/veya aynı konak üzerinde ayrı bir bakteriyofaj ile karşılaştırıldığında büyüme oranını (genellikle maksimum spesifik büyüme oranı veyamaksimum μ olarak rapor edilir) ve nispi virülansı (VR)14 içerir. Sistem taşıma kapasitesi (Nasimptot) ve konakçı göreceli esnekliği (RR)15 gibi diğer ölçümler de rapor edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Taşınabilir bir benzinle çalışan elektrik jeneratörü, bir su transfer pompası ve çökmeye dayanıklı boruların kullanılması, okyanustan, göllerden, donmuş göllerden ve diğer su ortamlarından (örn. lagünler) belirli derinliklerde su örneklerini çıkarmanın etkili bir yolu olarak hizmet eder (Şekil 1, ilk üç sıra). Jeotermal kaplıcaların, havuzların ve çamurlukların pH < 4'e ve 90 °C'den daha yüksek sıcaklıklara sahip olabilen yüksek sıcaklıktaki asitli suları iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Virosfer geniş ve çeşitlidir, bu nedenle farklı virüs sistemlerini incelemek için farklı deneysel yaklaşımlar gerektirir. Bu, virüsleri ve konakçılarını farklı ortamlardan izole etmek için farklı stratejileri ve ham örneklerden saf konak kültürlerinin ve virüslerinin üretilebilmesini sağlamak için farklı işleme yöntemlerini içerir. Bu saf kültürler, hem katı ortamda hem de sıvı kültürde SVSH enfeksiyon testlerinde kullanılabilir, böylece sistem özellikleri ve virüs-konak dinamiklerinin k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen ABD Ulusal Bilim Vakfı (NSF) OISE hibe no. 1856091 (PI-Ceballos) ve NSF DBI hibe no. 2119968 (PI-Ceballos) tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, King Mongkut'un Thonburi Teknoloji Üniversitesi'nden (Tayland) Dr. Chinnapong Wangnai ve Dr. Chakrit Tachaapaikoon'un sırasıyla çevresel örnekleme için videografi ve saha desteği sağlayan katkılarını kabul etmektedir. Yazarlar ayrıca, Kosta Rika'daki Milli Parklardan numune alma izinlerinin alınmasındaki ve jeotermal havuzlardan numune toplanmasına yardımcı olan Kosta Rika - Guanacaste Üniversitesi'nden Dr. Jorge Armando Leiva Sanabria'ya teşekkür eder. Yazarlar aynı şekilde, sırasıyla güney Kaliforniya kıyılarından ve kuzey Minnesota'daki göllerden numune alınmasına yardımcı olan Bay Enrique Marroquin, Jr. (California Merced Üniversitesi) ve Bayan Alexia Maceda'ya (Maine Üniversitesi, Orono, ME, ABD) teşekkür eder. Yazarlar, φSBL14-SWII veri seti için enfeksiyon parametrelerini hesaplayan Bayan Socheata Hour'un teknik desteğine teşekkür eder ve teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 hp paslanmaz çelik transfer pompası Utilitech, Charlotte, Kuzey Carolina, ABDYOK
1,5 ml'lik tüplerwww.eppendorf.com30123611
10K NMWL Centricon Plus 70 spin-konsantratör www.sigmaaldrich.comUFC701008
250 mL baffled Erlenmeyer mataraları www.sigmaaldrich.comCLS4450250
3800-Watt İnverter Jeneratör WEN Ürünleri, West Dundee, IL, ABDWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 mL www.sigmaaldrich.comUFC800308
500 mL baffled Erlenmeyer mataraları www.sigmaaldrich.comCLS4450500
5 galonluk su sürahileri www.homedepot.comYOK
80 ft uzunluğunda, 0,5" çap, naylon https://facomex.mx/producto/combo/YOK
26 ft. derinlikte V merkez konsol Sailfish 2660, iki Yamaha 150 hp dıştan takma motorlu https://yamahaoutboards.com/YOK
Amonyum asetat (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
Borik asit (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
Santrifüj 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
Sitrik Asit (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
Kobalt(II) nitrat heksahidrat [Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
Çökmeye dayanıklı kauçuk flex hortum swanhose.comCELTF58050
Bakır(II) sülfat pentahidrat (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Corning 50 mL santrifüj tüpleri www.sigmaaldrich.comCLS430291
Dipotasyum fosfat (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
Disodyum etilendiamintetraasetik asit (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume ve Spektrofotometre ve Florometrewww.denovix.comYOK
Koli bandı www.homedepot.comYOK
Eppendorf tüpleriwww.sigmaaldrich.comEP022364120
Etanolwww.sigmaaldrich.com64175
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
Ferrik amonyum sitrat (C6H8O7· xFe3+· yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
Flex-plus mavi PVC boru www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - İstiflenebilir İnkübatör Çalkalayıcıwww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 Masaüstü Elektron Microscope_Transmission elektron mikroskobu (TEM)delongamerica.comYOK
Magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
Manganez(II) klorür tetrahidrat (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
Mantar Çapa siyah Vinil Kaplama/30 lbswww.homedepot.comYOK
Petri kapları, polistirenwww.sigmaaldrich.comP5481
0,22 mm'lik polietersülfon (PES) membran filtre kabıwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
0,45 mm'lik polietersülfon (PES) membran filtre kabıwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
Potasyum etil ksantojenat (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
Sodyum karbonat (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
Sodyum dodesil sülfat [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
Sodyum molibdat dihidrat (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
Sodyum nitrat (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
Tris(hidroksimetil)metil]-2-aminoetansülfonik aci (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
Triton X-100 www.sigmaaldrich.comT8787
Trizma hidroklorür (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
Vakum/basınç pompası Cole-Parmer; Vernon Hills, IL, ABDEW-79204-00 Serisi
Vinil tüp www.homedepot.comYOK
Çinko sülfat heptahidrat (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

Kaynaklar

  1. Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
  2. Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Freshwater Cyanophages. , National University of Singapore. Doctoral dissertation (2022).
  3. Sime-Ngando, T. Environmental bacteriophages: viruses of microbes in aquatic ecosystems. Front Microbiol. 5, 355(2014).
  4. Sigee, D. C. Freshwater microbiology: biodiversity and dynamic interactions of microorganisms in the aquatic environment. , John Wiley & Sons. (2005).
  5. Jacquet, S., Miki, T., Noble, R., Peduzzi, P., Wilhelm, S. Viruses in aquatic ecosystems: important advancements of the last 20 years and prospects for the future in the field of microbial oceanography and limnology. Adv Oceanography Limnol. 1 (1), 97-141 (2010).
  6. Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Appl Environ Microbiol. 71 (2), 629-635 (2005).
  7. Bhardwaj, A., et al. Cyanobacteria: a key player in nutrient cycling. Cyanobacteria. , 579-596 (2024).
  8. Douterelo, I., et al. Methodological approaches for studying the microbial ecology of drinking water distribution systems. Water Res. 65, 134-156 (2014).
  9. Brandt, J. P., Flannigan, M. D., Maynard, D. G., Thompson, I. D., Volney, W. J. A. An introduction to Canada's boreal zone: ecosystem processes, health, sustainability, and environmental issues. Environ Rev. 21 (4), 207-226 (2013).
  10. Ramanan, R., Kim, B. H., Cho, D. H., Oh, H. M., Kim, H. S. Algae-bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications. Biotechnol Adv. 34 (1), 14-29 (2016).
  11. Atkinson, C. L., Capps, K. A., Rugenski, A. T., Vanni, M. J. Consumer-driven nutrient dynamics in freshwater ecosystems: From individuals to ecosystems. Biol Rev. 92 (4), 2003-2023 (2017).
  12. Mojica, K. D., Brussaard, C. P. Factors affecting virus dynamics and microbial host-virus interactions in marine environments. FEMS Microbiol Ecol. 89 (3), 495-515 (2014).
  13. Graham, E. B., et al. Microbes as engines of ecosystem function: when does community structure enhance predictions of ecosystem processes. Front Microbiol. 7, 214(2016).
  14. Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: when µ max fails and AUC alone just is not enough. J General Virol. 102 (1), 001515(2021).
  15. Hour, S., Pierce, A. J., Heng, S. Y., Plymale, R., Ceballos, R. M. Quantifying Resilience in Single-Host/Single-Virus Infections. Appl Microbiol. 5 (1), 18(2025).
  16. Ceballos, R. M., et al. Differential virus host-ranges of the Fuselloviridae of hyperthermophilic Archaea: implications for evolution in extreme environments. Front Microbiol. 3, 295(2012).
  17. Ceballos, R. M., Drummond, C. G., Stacy, C. L., Padilla-Crespo, E., Stedman, K. M. Host-dependent differences in replication strategy of the Sulfolobus spindle-shaped virus strain SSV9 (aka, SSVK1): infection profiles in hosts of the family Sulfolobaceae. Front Microbiol. 11, 1218(2020).
  18. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
  19. Kliphuis, A. M., Janssen, M., van den End, E. J., Martens, D. E., Wijffels, R. H. Light respiration in Chlorella sorokiniana. J Appl Phycol. 23, 935-947 (2011).
  20. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. J Vis Exp. (111), e54001(2016).
  21. Noroozi, M., Amozegar, M. A., Rahimi, R., Shahzadeh Fazeli, S. A., Bakhshi Khaniki, G. The isolation and preliminary characterization of native cyanobacterial and microalgal strains from lagoons contaminated with petroleum oil in Khark Island. Biol J Microorg. 5 (20), 33-41 (2017).
  22. Nübel, U., Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (8), 3327-3332 (1997).
  23. Tragin, M., Lopes dos Santos, A., Christen, R., Vaulot, D. Diversity and ecology of green microalgae in marine systems: an overview based on 18S rRNA gene sequences. Perspect. Phycol. 3 (3), 141-154 (2016).
  24. Uchida, H., et al. A coupled assay system for the lysis of cyanobacteria. Japanese J Water Treatment Biol. 34 (1), 67-75 (1998).
  25. Drummond, C. Characterization of Sulfolobus. Spindle-shaped Virus replication. , Portland State University. (2010).
  26. Flores, E., Wolk, C. P. Production, by filamentous, nitrogen-fixing cyanobacteria, of a bacteriocin and of other antibiotics that kill related strains. Arch Microbiol. 145, 215-219 (1986).
  27. Wick, C., McCubbin, P. Characterization of purified MS2 bacteriophage by the physical counting methodology used in the integrated virus detection system (IVDS). Toxicol Methods. 9 (4), 245-252 (1999).
  28. Marei, E. M., Elbaz, R., Hammad, A. Induction of temperate cyanophages using heavy metal-copper. Int J Microbiol Res Rev. 5 (5), 472(2013).
  29. Bratchkova, A., Kroumov, A. D. Microalgae as producers of biologically active compounds with antibacterial, antiviral, antifungal, antialgal, antiprotozoal, antiparasitic and anticancer activity. Acta Microbiol Bulgarica. 36 (3), 79-89 (2020).
  30. Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence. Phage. 1 (1), 27-36 (2020).
  31. Omata, T., Murata, N. Isolation and characterization of three types of membranes from the cyanobacterium (blue-green alga) Synechocystis PCC 6714. Arch Microbiol. 139, 113-116 (1984).
  32. Wilson, W. H., Joint, I. R., Carr, N. G., Mann, N. H. Isolation and molecular characterization of five marine cyanophages propagated on Synechococcus sp. strain WH7803. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3736-3743 (1993).
  33. Grasso, C. R., et al. A review of cyanophage-host relationships: Highlighting cyanophages as a potential cyanobacteria control strategy. Toxins. 14 (6), 385(2022).
  34. Srivastava, A., Gupta, N., Mishra, A. K. Cyanophages: interacting mechanism and evolutionary significance. Cyanobacteria. , 255-282 (2024).
  35. Cai, L., et al. Abundant and cosmopolitan lineage of cyanopodoviruses lacking a DNA polymerase gene. ISME J. 17 (2), 252-262 (2023).
  36. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86 (4), 295-335 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Siyanobakteri Vir sleriVir s Konak DinamikleriBakteriyofaj zolasyonuTransmisyon Elektron MikroskobuPlak AnaliziKonak Yelpazesinin BelirlenmesiY ksek Verimli DizilemeFilogenetik Analiz
Fotosentetik Mikropların ve Virüslerinin Çevresel Örneklemesi: Tarladan Laboratuvara
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.