Yöntem makalesi

Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

DOI:

10.3791/68384

⸱

20 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ICFO-Institut de Ciències Fotòniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Ophthalmology Group, Hospital Universitari Vall d'Hebron, Vall d'Hebron Institut de Recerca (VHIR)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, tam montajlı retinal organoidlerin tam hacimli konfokal görüntülemesi için optik temizleme ve immün etiketlemeyi birleştirir. 3D yapıyı koruyarak, temel nöronal yolların ayrıntılı görselleştirilmesini sağlar, retina olgunlaşması, mekansal organizasyon ve hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıptaki potansiyel uygulamalarının incelenmesini geliştirir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen retinal organoidler, insan retinasını taklit eden karmaşık 3D yapılardır ve retina gelişimini, hastalık mekanizmalarını ve potansiyel terapötik stratejileri incelemek için güçlü bir platform sunar. Ayrıca, hastalardan türetildikleri için, kişiselleştirilmiş tıp için bir araç olarak büyük umut vaat ettikleri için giderek daha popüler hale geliyorlar. Geleneksel 2D hücre kültürlerinin aksine, retinal organoidler retinanın doğal 3D mimarisini koruyarak daha gerçekçi bir temsile izin verir ve fizyolojik olarak daha ilgili çalışmalara olanak tanır. Bununla birlikte, yapısal karmaşıklıkları, yüksek hücresel yoğunlukları ve çeşitli bileşimleri, karakterizasyon için önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır.

Bu zorlukların üstesinden gelmek ve 3D bağlamı korurken retinal organoid olgunlaşma anlayışımızı geliştirmek için, konfokal mikroskopi ile tam montajlı organoidlerin tüm yapısını görselleştirmek için optik temizleme yöntemlerini immünoetiketleme ile birleştirdik. Bunun için, düşük ve yüksek sayısal açıklık hedefleriyle uyumlu, tam hacimli görüntülemeyi kolaylaştıran ve hücresel çözünürlükle belirli ilgi alanlarını yakalayan bir temizleme yöntemi kullandık. Bu yaklaşımı kullanarak, görsel bilgi aktarımından sorumlu üç ana nöron yolunun morfolojisini ve dağılımını 3D olarak belirledik: koni ve çubuk fotoreseptörleri, bipolar ve ganglion hücreleri. Bulgularımız, organoid içindeki retina hücrelerinin mekansal organizasyonunu ele almak için görselleştirme tekniklerine daha fazla ışık tuttu.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina organoidleri

Retina organoidleri, insan retinasını taklit eden karmaşık 3D yapılardır ve retina gelişimini, hastalık mekanizmalarını ve potansiyel terapötik stratejileri incelemek için değerli bir platform sunar1. Retinanın doğal 3D mimarisini korurlar, transkriptomik sadakat ve fonksiyonel yeterlilik gösterirler, fototransdüksiyon ve sinaptik bağlantı üretirler2. Ek olarak, in vivo gelişimi 3,4 yakından taklit ederler ve düz hücre kültürlerine kıyasla daha gerçekçi bir temsil sağlarlar. Önceki çalışmalarda, Isla-Magrané ve ark. insan gözünün gelişimdeki hücresel özelliklerini modellemek için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) türetilen multioküler organoidleri elde etmek için iki aşamalı bir protokol oluşturmuştur 5,6. Fetal dokunun azlığı nedeniyle, insan gözü gelişimi araştırmaları anatomik çalışmalarla sınırlı kalmıştır.

Bu protokolle elde edilen retinal organoidler, uygun katmanlaşma sergiledi ve fotoreseptörler, bipolar hücreler, ganglion hücreleri, amakrin ve yatay hücreler ve makroglia gibi tüm ana retina hücre alt tiplerinin yanı sıra temel morfolojik özellikler ve doğru mekansal organizasyon ve bağlantıları içeriyordu. Organoid modeller, potansiyel bir çözüm olmasına rağmen, önemli değişkenlik gösterir ve bu da tutarlı sonuçlar elde etmeyi zorlaştırır. Bu nedenle, daha güvenilir insan modellerinde çeşitli ileri teknolojilerin kullanılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bugüne kadar, bu organoidler yalnızca histolojik bölümler kullanılarak incelenmiştir, çünkü karmaşık hücresel bileşimleri, yoğunlukları ve boyutları ışık penetrasyonunu engeller, bu da daha derin katmanlarda zayıf optik görüntüleme performansına neden olur ve böylece kapsamlı analizi sınırlar.

Tam montajlı görüntüleme

Sabit dokuların kesitlenmesini ve boyanmasını içeren geleneksel histolojik teknikler, belirli bölgeler hakkında ayrıntılı bilgi sağlayabilir, ancak tüm organoid içindeki genel mimariyi ve mekansal ilişkileri yakalayamaz. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, tam montajlı görüntüleme, retinal organoidleri incelemek için değerli bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Tam montajlı görüntüleme, hücre tiplerinin ve hücre dışı matris bileşenlerinin uzamsal dağılımını koruyarak tüm organoidin bozulmamış 3D biçiminde görselleştirilmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, organoidler içindeki ve arasındaki hücresel bileşimi araştırmak için özellikle faydalıdır ve gelişimsel süreçlerinin ve fonksiyonel organizasyonlarının daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bununla birlikte, hücresel yoğunlukları ve sıkışmaları nedeniyle, retinal organoidler opaktır (Şekil 1, netleşmemiş). Numunelerin doğal opaklığı, ışık saçılımına neden olur ve bu da mikroskopi kullanılarak iç yapıların ayrıntılı görselleştirilmesini engeller. Burada optik temizleme teknikleri güçlü bir araç olarak karşımıza çıkmaktadır.

Optik temizleme teknikleri

Optik temizleme, dokunun kırılma indisi (RI) gradyanlarını temizleme maddesininkilerle eşleşecek şekilde homojenize ederek ve ışık emici maddeleri uzaklaştırarak kalın biyolojik numuneleri şeffaf hale getiren fizikokimyasal işlemleri ifade eder7. Bu yöntemler ışık saçılımını önemli ölçüde azaltır ve şeffaflığı artırır. Bu dönüşüm, tüm retinal organoidi görmemizi sağlayarak, karmaşık hücresel organizasyonunun ve morfolojisinin tam montajlı görüntüleme teknikleri yoluyla kapsamlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar. Pratikte bu, numunenin yüksek RI maddesi ile emprenye edilmesi ve lipitlerin ve pigmentlerin uzaklaştırılmasıyla elde edilir.

Çeşitli yönlerden farklılık gösteren farklı temizleme yöntemleri mevcuttur (örneğin, şeffaflık derecesi, mikroskobik teknikler, numuneler ve floresan molekülleri ile uyumluluk, fizibilite, süre), ancak hiçbiri en iyi ortak protokol olarak öne çıkmaz8. Dört ana gruba ayrılırlar: (1) basit daldırma, (2) organik çözücü bazlı hidrofobik, (3) hiperhidrasyon bazlı ve (4) Avilov ve ark.7 tarafından güzel bir şekilde özetlendiği gibi doku dönüştürücü veya hidrojel gömme bazlı. Tüm yöntemler, genellikle numuneyi dokunun ortalama RI'si ile eşleşen bir çözeltiye daldırarak RI eşleşmesi için bir adım içerir. Hidrofobik yöntemlerde, lipitler ve su, numunenin artan bir organik çözücü konsantrasyonuna (metanol veya propanol gibi) daldırılmasıyla uzaklaştırılır.

Sunulan protokol, retinal organoidlerin konfokal mikroskopi ile tam montajlı 3D görselleştirmesini kolaylaştırmak için optik temizlemeyi immünoetiketleme ile entegre eden ve yapısal bütünlüğü korurken tam hacimli görüntülemeyi mümkün kılan optimize edilmiş bir yöntemdir. Bu yaklaşım, organoid içindeki anahtar retinal hücre tiplerinin tanımlanmasına izin vererek, araştırmacılara retinal organoid olgunlaşmasını ve mekansal organizasyonu fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda araştırmak için güçlü bir araç sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Özel yapım floresan ikincil antikorların hazırlanması

NOT: Bu yaklaşım, ticari floresan antikorların kullanımına bir alternatif olarak hizmet eder (floresan ikincil antikorların hazırlanmasının avantajları için tartışmaya bakınız). Ayrıca, bu protokol, doğrudan immünofloresan yapılması ve floresan primer antikorun ticari olarak mevcut olmaması durumunda, floroforların primer antikorlara konjuge edilmesi için kullanılabilir. Etiketleme reaksiyonundaki florofor miktarını ayarlayarak florofor-antikor oranını kontrol etmek, daha parlak konjuge antikorlar üretir. Bununla birlikte, özel yapım ikincil antikorlar daha az kararlıdır ve elde edilen konjugatın konsantrasyonu, ticari floresan antikorlarınkinden 10 kat daha düşüktür. Bu protokol, Bálint ve ark.9 tarafından açıklanan çalışmadan uyarlanmıştır.

  1. 1 mg floroforu susuz DMSO'da çözün ve tüp başına son 0.02 mg florofor için tüplere alikot yapın. 1 saat ve 30 dakika boyunca çalışan bir hızlı vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tüm DMSO'yu çıkarın. Alikotları -20 ºC'de ışıktan koruyarak saklayın. Alexa Fluor 405 için ultra saf H2O, alikot yapmak için uygun çözücüdür.
  2. Etiketleme reaksiyonunu gerçekleştirmek için, floroforun bir alikotunu 1-10 μL DMSO'da (veya Alexa Fluor 405 için ultra saf H2O) çözün.
    NOT: DMSO'nun kesin miktarı, önceki kontrol konjugasyon testleri ile belirlenir. Bu testler, yeni bir florofor partisi kullanılacağı zaman (veya önceki bir florofor partisi tükendiğinde) veya konjugasyonda ilk kez yeni bir florofor kullanıldığında gerçekleştirilir. Kontrol konjugasyon testi, konjugattaki optimal florofor-antikor oranını belirlemek için değişen miktarlarda florofor ile etiketleme reaksiyonlarının gerçekleştirilmesini içerir. Bizim durumumuzda, optimal oran tipik olarak 3 μL ile 5 μL arasındadır.
  3. 50 μL ikincil IgG (veya birincil), 6 μL 1 MNaHCO3 ve 1-5 μL floroforu ışıktan korunarak oda sıcaklığında (RT) oda sıcaklığında (RT) 40 dakika inkübe edin.
  4. Reaksiyon ilerlerken, kapaklarını çıkararak ve tamponun geçmesine izin vererek saflaştırma boyutu dışlama kolonlarını hazırlayın. Sütun boyunca 3 x 2-3 mL PBS geçirerek sütunu dengeleyin (her etiketleme reaksiyonu için bir tane). Son dengeleme adımının inkübasyon sona ermeden önce bitmesi durumunda, kurumasını önlemek için kapakları geri takın ve etiketleme reaksiyonu bitene kadar bekleyin.
    NOT: Saflaştırma boyutu dışlama kolonları yerçekimi ile çalışır. Kolonun herhangi bir anda kurumadığından emin olun, aksi takdirde arıtma reaksiyonu düzgün çalışmayacaktır.
  5. Reaksiyon bittiğinde (adım 1.3), hacmi yaklaşık 200 μL yapmak için etiketleme reaksiyonuna 140 μL PBS ekleyin ve girdaplayın. Bu çözeltiyi sütunun ortasına ekleyin, numunenin sütuna girmesine izin verin ve son damla ayrıldıktan sonra 550 μL PBS ekleyerek itin. Sıvı düşmeyi bıraktığında, 300 μL PBS ekleyerek elüte edin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
  6. Numunenin 280 nm'de absorbansını ve kullanılan floroforların absorbansını ölçerek antikor konsantrasyonunu ve etiketleme oranlarını hesaplayın. Konsantrasyonu (molarite cinsinden) belirlemek için Beer-Lambert Yasasını aşağıdaki gibi uygulayın:
    figure-protocol-1
    A, absorbansı temsil ederken, ε molar sönme katsayısını temsil eder ve CF280 , spesifik floroforun 280 nm'de sahip olduğu ve bir düzeltme faktörü olarak hizmet eden absorbansın bir ölçüsüdür. Daha sonra, antikorun konsantrasyonu:
    figure-protocol-2
    Ve etiketleme oranı:
    figure-protocol-3
  7. Etiketli antikorları 4 ºC'de, ışıktan koruyarak 6 aya kadar saklayın.

2. İmmünofloresan etiketleme

  1. Organoidleri RT'de %4 paraformaldehit (PFA) ile 45 dakika sabitleyin.
    NOT: İSTEĞE BAĞLI: Antijenlerin immünoreaktivitesini arttırmak için organoidleri bir antijen alma solüsyonu (adım 2.2 ve 2.3) ile inkübe edin.
  2. 0.117 mg sodyum sitrat tribazik dihidratı ultra safH2Oiçinde karıştırarak 40 mL antijen alma çözeltisi hazırlayın ve pH 9'a ayarlayın.
  3. Organoidleri, 1 saat boyunca 60 ° C'de hafif çalkalama (30 rpm) ile antijen alma çözeltisi ile inkübe edin.
  4. Organoidleri PBST (% 1 Triton X-100 ile PBS) ile RT'de 4 saat boyunca hafif çalkalama ile geçirgenleştirin.
  5. Organoidleri gece boyunca (veya 1 günden fazla) RT'de bloke edici solüsyon (% 0.1 Triton X-100 ile% 2 sığır serum albümini (BSA)) ile bloke edin.
    NOT: Primer ve sekonder antikor konsantrasyonları, belirli antikora bağlıdır. Tam montajlı numunelerin immünofloresanı için, kesitli numunelere kıyasla daha yüksek bir konsantrasyon kullanıyoruz. Primer antikoru 10 μg/mL'de inkübe ediyoruz, bu da çoğu durumda stoktan 1:100'e karşılık gelir (Tablo 1). Özel yapım sekonder antikorlarımızı 20-50 μg/mL'de inkübe ediyoruz.
  6. Organoidleri, yıkama çözeltisinde (% 0.1 Triton X-100 ile% 0.1 BSA) seyreltilmiş birincil antikorlarla 4 ° C'de 2 gün boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.
  7. Organoidleri 3 x 15 dakika boyunca RT'de hafif çalkalayarak yıkama solüsyonunda yıkayın.
  8. Organoidleri, yıkama solüsyonunda 4 ° C'de seyreltilmiş ikincil antikorlarla 2 gün boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.
  9. Organoidleri 3 x 15 dakika boyunca RT'de hafif çalkalayarak yıkama solüsyonunda yıkayın.
    NOT: İmmünoetiketlemeden sonra, tercih edilen floresan boyalar inkübe edilebilir. Normalde aktin filament ağını görselleştirmek için DAPI (1:1,000) ve DRAQ5 (1:500) veya phalloidin (1:100) gibi floresan çekirdek belirteçleri kullanırız.
  10. Organoidleri, RT'de yıkama çözeltisinde seyreltilmiş floresan boyalarla 1 saat boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.
  11. Organoidleri 3 x 15 dakika boyunca RT'de hafif çalkalayarak yıkama solüsyonunda yıkayın.

3. FluoClear BABB ile optik temizleme

NOT: 1-Propanol, özellikle uzun süreli maruz kalma için plastik kapları tehlikeye atabilir. Güvende olmak için cam kaplar kullanın.

  1. Dehidrasyon adımı






    1. figure-protocol-4

      figure-protocol-5

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: Üç temizleme yönteminin karşılaştırılması. Solda: (A) temizlenmemiş ve (B-D) temizlenmiş örneklerin parlak alan görüntüleri. Sağda: 10x hava objektifi (RI = 1.00) ile donatılmış konfokal lazer tarama mikroskobu ile elde edilen nükleer belirteç DRAQ5 (sarı) ile boyanmış 90 DIV retinal organoidinin xz ve yz ortogonal görünümlerine sahip Z-yığını. (A) Temizlenmemiş retinal organoid (N = 3). PFA ile sabitlenmiş retinal organoidler, 3D görselleştirme için yeterince şeffaf değildir. (B) Fruktoz / Gliserol ile temizlenmiş organoid (N = 3). (C) ECi ile temizlenmiş organoid (N = 3). (D) FluoClear BABB onaylı organoid (N = 3). Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: BF = parlak alan; CLSM = konfokal lazer tarama mikroskobu; RI = kırılma indisi; PFA = paraformaldehit; ECi = etil sinnamat; BABB = benzil alkol/benzil benzoat; DIV = in vitro günler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Nöroretinal organoidlerde immünofloresan çalışmaları için optik temizleme yöntemlerinin karşılaştırılması

Burada, retinal organoidleri şeffaf hale getirmek için FluoClear BABB'ın etkinliğini göstermek için üç temizleme yönteminin sonuçlarını sunuyoruz. Şekil 1'de, Fruktoz/Gliserol (Şekil 1B), ECi (Şekil 1C) ve FluoClear BABB (Şekil 1D) ile temizlenmiş retinal organoidleri gözlemliyoruz. Test edilen temizleme yöntemleri, hepsinin immünofloresan boyama ile uyumlu olduğu ve endojen proteinlerden (örneğin, GCaMP'lerde bulunan GFP) floresanı koruduğu10,11 kanıtlandığı için seçilmiştir.

Fruktoz/Gliserol12, dehidrasyon gerektirmeyen, diğer yöntemlere kıyasla işlem süresini önemli ölçüde azaltan, toksik olmayan, basit, daldırma temizleme protokolüdür. Çeşitli dokulardan türetilen organoidleri şeffaflaştırmak için etkili olduğu bildirilmiştir: hava yolları, böbrek, karaciğer ve insan meme kanseri12.

ECi (Etil Cinnamat)11, FDA onaylı bir gıda aroması ve kozmetik13,14 için katkı maddesidir, zararsız olarak kabul edilir ve memeli dokuları için mükemmel bir temizleme reaktifi olduğu kanıtlanmıştır. Hızlı temizleme kabiliyeti ve minimum doku distorsiyonu ile bilinir. Hidrofobik bir temizleme yöntemi olarak sınıflandırılır, ancak BABB bazlı çözücülerle karşılaştırıldığında toksik değildir ve floresan proteinlerden gelen floresansı daha uzun süre korur (14 güne kadar). Çoğu temizleme protokolünde yaygın olduğu gibi, ECi önceden bir dehidrasyon adımı gerektirir. En iyi sonuçlar için bu adım, numunenin giderek artan alkol konsantrasyonlarına sahip çözeltilere daldırılmasıyla elde edilir. ECi zararlı olmadığından, numune temizlendikten sonra güvenli bir şekilde manipüle edilebilir ve plastik kaplarda saklanabilir. Bununla birlikte, dehidrasyon adımları, bir davlumbaz altında manipüle edilmesi ve cam kaplarda saklanması gereken organik bir çözücü olan 1-propanol kullanılarak gerçekleştirilir.

FluoClear BABB10 , kırılma indisi eşleştirme çözeltisi olarak benzil alkol/benzil benzoat (BABB) bazlı hidrofobik bir protokolün varyant şeklidir. Çok toksik ve aşındırıcı olduğu bilinmektedir, bu nedenle dikkatli bir şekilde kullanılması gerekir. FluoClear BABB, GFP ve RFP'yi önceki sürümlerden daha iyi koruyan ve dehidrasyon ajanları olarak 1-propanol veya tert-bütanol kullanımına izin veren geliştirilmiş bir versiyon olarak tanımlanmıştır.

Üç temizleme yönteminin performansını değerlendirmek için, Z-düzlemlerini 10x NA0.4 hava objektifi ile donatılmış bir konfokal mikroskopla görüntüledik ve retinal organoidin tüm hacmini yakalamak için 2.5 x 2.5 x 2.56 mm'lik geniş bir görüş alanı (FoV) sağladık. Tüm retinal nöronları (ganglion hücreleri, bipolar hücreler ve fotoreseptörler) içeren, hücresel yoğunluğu ve sıkıştırmayı sağlayan ve dolayısıyla opak olan olgunlaşmanın ara aşamasında (90 gün in vitro (DIV)) retinal organoidler kullandık. Giriş bölümünde açıklandığı gibi, optik temizleme, görüntülenecek nesnenin her yerinde RI eşleştirildiğinde elde edilir. Bu nedenle, görüntüleme için kullanılan daldırma ortamı, elde edilen şeffaflığı büyük ölçüde etkileyecektir. Tablo 2 , daldırma ortamının RI'sini ve test edilen temizleme çözeltilerini detaylandırmaktadır.

ÇözümKırılma indisi
Daldırma ortamıHava1
Su1.33
Gliserol1.45
Yağ1.51
Takas çözümleriFruktoz/Gliserol1.468
Öcü1.558
FluoClear BABB1.56

Tablo 2: Işık mikroskobu için en çok kullanılan daldırma ortamının kırılma indisi (RI) ve retinal organoidleri temizlemek için test edilen optik temizleme metodolojileri. Kısaltma: RI = kırılma indisi.

Elde edilen konfokal görüntüler karşılaştırıldığında (Şekil 1, sağ panel), fruktoz/gliserol tedavisi şeffaflıkta en az iyileşme ile sonuçlandı, retina tabakalarının görselleştirilmesini sınırladı ve organoid çekirdeğin görselleştirilmesini engelledi. ECi, retina katmanlarının görselleştirilmesine izin vererek daha iyi şeffaflık elde etti, ancak numunenin iç kısımlarından floresan algılamayı engelleyen ışık saçılımı nedeniyle retina organoid çekirdeğinin görselleştirilmesini hala sınırladı. FluoClear BABB, retinal organoidin hem çekirdeğinin hem de korteksinin benzer floresan yoğunluğu ile daha yüksek çözünürlükte net bir şekilde görselleştirilmesini sağlayarak şeffaflıkta en büyük gelişmeyi sağladı.

Hem ECi hem de FluoClear BABB protokollerinin, temizlenmiş her retinal organoidin karşılık gelen parlak alan görüntüleriyle gösterildiği gibi, kayda değer numune büzülmesine neden olduğunu belirtmekte fayda var (Şekil 1, sol panel). Numune büzülmesi, suyu uzaklaştıran önceki dehidrasyon adımlarından kaynaklanır ve Fruktoz/Gliserol protokolünün numuneyi küçültmemesinin nedeni budur. Ancak bu küçülme, daha derin keşifler için eşsiz bir fırsat sunuyor. Organoidin toplam boyutunu sıkıştırmasına ve potansiyel olarak iç mesafeleri hafife almasına rağmen, aynı zamanda kompaktlığı da arttırır. Her yöne nispeten tekdüze olan bu izotropik kompaktlık, aksi takdirde daha kısa çalışma mesafeleri (WD) nedeniyle yalnızca en dıştaki hücre katmanını görüntüleyecek olan üstün çözme gücüne (daha büyük NA'ları nedeniyle) sahip yüksek büyütme hedeflerinden yararlanmamıza izin verir. Örneğin, 10x NA 0.4 hava hedefi 2.53 mm'lik bir WD sunarken, önemli ölçüde daha iyi çözünürlüğe sahip 63x NA 1.4 yağ hedefi yalnızca 0.14 mm'lik bir WD'ye sahiptir. BABB tarafından temizlenmiş, daha kompakt organoidleri kullanarak, bu sınırlamanın etkili bir şekilde üstesinden gelebilir ve organoidin iç kısmında bulunan ganglion hücre tabakası gibi daha derin yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülemesini sağlayabiliriz (Şekil 2).

figure-results-2
Şekil 2: Lazer taramalı konfokal mikroskop ile görüntülenen FluoClear BABB ile temizlenen bir retinal organoidin (200 DIV) 3D rekonstrüksiyonları. Mikroskop, (A) 10x NA 0.4 hava hedefi ve (B) 63x NA 1.5 yağ hedefi ile donatıldı. Temizleme ve görüntüleme, tüm organoidin görselleştirilmesine ve aynı zamanda bazı ilgi alanlarının ince ayrıntılarla görüntülenmesine olanak tanır. DRAQ5 (çekirdekler), opsin B+GR (koniler) ve TUJ1 (nöronlar). Kısaltmalar: DIV = in vitro günler; BABB = benzil alkol/benzil benzoat; NA = sayısal açıklık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuç olarak, temizleme için tercihimiz, tüm retinal organoidin yüksek çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı ile üstün görselleştirmesini sunduğu için FluoClear BABB oldu. Daha da önemlisi, organoidi izotropik olarak sıkıştıran BABB kaynaklı büzülme. Bu kompaktlık, daha derin yapıların ayrıntılı keşfi için yüksek büyütme hedeflerinden yararlanmamızı sağladı. Son olarak, BABB'ın yağa daldırma hedefleriyle uyumluluğu, minimum ışık saçılımı ve büyütme oranlarında yüksek kaliteli görüntüleme sağladı.

Olgunlaşma boyunca organoidler içindeki retina hücrelerinin tanımlanması ve uzay-zamansal dağılımı

Burada ayrıntılı olarak açıklanan metodolojiyi takiben ve Tablo 1'de ayrıntıları verilen spesifik antikorlarla immüno-etiketli organoidler üzerinde tam montajlı görüntüleme kullanarak, nöroretinanın erken gelişim aşamalarından (40 DIV) daha olgun aşamalara (250 DIV'e kadar) kadar farklı olgunlaşma noktalarında organoidlerden nasıl şekillendiğini inceledik ve iyi tanımlanmış bir 3D yapı sergiledik. Bu yaklaşım, bu bölümde açıklanan çeşitli retina bileşenlerinin oluşumunu ve organizasyonunu görselleştirmemize izin verdi.

AntikorÖzgüllüğüHedefRetina'daki Yeri[ ]final (seyreltme)Ev sahibi#RRDI
GFP KarşıtıGFP (GFP)GFP (GFP)GCaMP6s pozitif hücreler10 μg/mL (1:1.000)CanerAB_300798
Chx10 SerisiVentromedial hipotalamus homeobox 2 (Vsx2)Transkripsiyon faktörüNöroblastlar ve bipolar hücreler10 μg/mL (1:2)MsAB_10842442
Opsin BOpsin mavisiMavi konilerin dış segmentiMavi koniler10 μg/mL (1:100)RbAB_177457
Opsin RGOpsin yeşili ve kırmızıYeşil ve kırmızı konilerin dış kısmıYeşil ve kırmızı koniler10 μg/mL (1:100)CanerAB_11213279
RECOV (Keşif Noktası)Kurtarmak,Kalsiyum bağlayıcı proteinFotoreseptörler10 μg/mL (1:100)RbAB_2253622
RHO (RET-P1)RodopsinÇubukların dış segmentiÇubuk63 μg/mL (1:100)MsAB_260838
TUJ1Nörona özgü sınıf III beta-tubulinBeta-III tübülin izoformuNeurons50 μg/mL (1:200)MsAB_2315514

Tablo 1: Farklı olgunlaşma aşamalarından retinal organoidlerde test edilen birincil antikorlar.Kısaltmalar: Tavuk = Ch; Fare = Bayan; Tavşan = Rb.

Farklı belirteçlerle immüno-etiketleme, bu katmanlı yapıya uyan hücrelerin tanımlanmasına izin verdi. TUJ1, nörona özgü bir sınıf III beta-tübulin (Tablo 1), tipik olarak kesitli örneklerde retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler)15 bolluğu nedeniyle etiketlemek için kullanılır. TUJ1, tüm retinal nöronlarda16 ve nöral farklılaşmanın erken evrelerinden17 itibaren bulunur. TUJ1 ekspresyonu, organoidin korteksindeki tüm olgunlaşma aşamalarında bulundu ve retina hücrelerinin katmanlar halinde organizasyonunun takibine izin verdi. Şekil 3'te, gelişimin erken aşamalarında (40 DIV), TUJ1'in tek, ince ve düzgün bir tabaka halinde düzgün bir şekilde dağıldığını gözlemleyebiliriz. 90 DIV'den, organoidin apikal bölgesi, apikal bölgede biriken çok daha fazla hücre ile doldurulduğundan daha yoğun ve daha kompakt hale gelir. 170 DIV'de, retinal organoid, ayrı bir apikal tabakaya sahip 3D tabakalı bir retinal yapı elde etti. 200 DIV'de, organoidin içinde daha derinlerde bulunan, çok daha az sayıda olan uzun çıkıntılara uzanan başka hücre gövdeleri olduğunu görebiliriz. Son olarak, 250 DIV'de, üç nükleer katmandaki yapı belirgindir ve aşağıdakilere karşılık gelir: (1) olgun fotoreseptörler tarafından oluşturulan dış nükleer katman (ONL), (2) esas olarak bipolar hücreler tarafından doldurulan iç nükleer katman (INL) ve (3) Şekil 3'te (sağ altta) gösterildiği gibi RGC'ler tarafından oluşturulan ganglion hücre tabakası (GCL).

figure-results-3
Şekil 3: Tabaka tabakalı bir yapıda retinal organoidlerin olgunlaşması üzerine nöron organizasyonu. TUJ1 ile boyanmış FluoClear BABB ile temizlenmiş retinal organoidlerin konfokal görüntülerinin Z-yığını projeksiyonları. 40 DIV'de katmanlı yapılar oluşmaz. 170 DIV'den itibaren nöroretina katmanlara ayrılır. Retinal nükleer tabakalar belirtilmiştir: ONL, INL ve GCL (sarı ok uçları). Ölçek çubukları = 25 μm (solda) ve 10 μm (sağda). Kısaltmalar: BABB = benzil alkol/benzil benzoat; DIV = in vitro günler; ONL = dış nükleer katman, INL = iç nükleer katman; GCL = ganglion hücre tabakası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu metodoloji ile, akson demetlerinin montajını da rapor edebiliriz. Büyütülmüş bölgelerde görüldüğü gibi (Şekil 4), organoidin iç çekirdeğinden çevreye doğru uzanan ve birbirinden uzak bölgelere (1 mm'ye kadar) doğru çıkıntı yapan lif demetleri gözlemledik. İlginç bir şekilde, bu liflerin oluşumu olgunlaşmanın farklı aşamalarında meydana geldi. Organoid büyüdükçe, lifler kalınlaşır, daha karmaşık hale gelir ve daha fazla hücre projeksiyonu toplar (Şekil 4 [250 DIV] ve Ek Video S1). RGC'ler, retina gelişimi sırasında farklılaşan ilk hücrelerdir ve bu nedenle, gelişimin çok erken aşamalarından itibaren projeksiyonlarını düzenleyebilirler. RGC'ler, organoid içindeki son konumlarını oluşturmadan önce bile nörit uzantısını başlatabilir. Bulgularımız, retina ve beyin organoidlerinin ko-kültürlerinde optik sinir benzeri bir yapının oluşumunu gösteren önceki raporlarla18 uyumludur.

figure-results-4
Şekil 4: Olgunlaşmanın çeşitli aşamalarında nöronal projeksiyonların birleştirilmesi. Lifler, retinal organoidin iç düzlemlerinden çevreye doğru uzanır. Bu liflerin oluşumu, 40 DIV'den incelenen en eski olgunlaşma noktasına (250 DIV) kadar farklı olgunlaşma aşamalarında meydana geldi. Ölçek çubukları = 25 μm (üst sıra) ve 100 μm (alt sıra). Kısaltmalar: DIV = in vitro günler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Retinal organoidlerin apikal bölgesinde, bazı fotoreseptörler, loş ışık koşullarında monokromatik görmeyi tespit etmek için dış segmentlerde rodopsin içeren çubuklara olgunlaşırken, diğerleri mavi, yeşil ve kırmızı opsinleri ifade eden konilere olgunlaşır ve parlak ışık koşullarında renk ve yüksek keskinlikte görmeden sorumludur. Şekil 5 (üstte), mavi ve/veya yeşil/kırmızı opsinleri eksprese eden retinal organoid içindeki koni fotoreseptörlerinin popülasyonunu göstermektedir (OPSIN B ve GR, Tablo 1). Bu hücreler, çekirdek hariç, hücre gövdesi boyunca dağılmış farklı opsinlerle uzun bir morfoloji sergiler. Özellikle, bu hücrelerin dış ucu daha parlak görünür ve potansiyel olarak diskleri içeren fotoreseptörün dış segmentine benzer. Floresan tespiti için tek bir kanal kullanarak hem mavi hem de yeşil/kırmızı konileri görselleştirmek için, mavi-opsin (OPSIN B, tavşan) ve yeşil/kırmızı opsin'e (OPSIN GR, tavuk) karşı ikincil antikorlar aynı floroforla etiketlendi, kanal kullanımını optimize etti ve spektral örtüşmeyi önlerken görüntüleme sürecini kolaylaştırdı. Şekil 5'teki (altta) fotoreseptör hücrelerinin bir alt kümesi, rodopsin (RHO, Tablo 1 ve Ek Video S2) eksprese etti, bu da çubuklar olarak kimliklerini kesin olarak gösterdi. Bu çubuk hücreler, daha önce tarif edilen uzun morfolojiyi paylaşır, çekirdek merkezi olarak konumlandırılır ve opsin açısından zengin hücre gövdesi organoidin çevresine doğru yönlendirilir.

figure-results-5
Şekil 5: Gelişimin sonraki aşamalarından retinal organoidler. Üst: olgun koniler, alt: çubuklar. TUJ1 (nöronlar), DRAQ5 (çekirdekler), opsin-B+GR (koniler) ve RHO (çubuklar) ile boyanmış FluoClear BABB ile temizlenmiş retinal organoidlerin konfokal görüntülerinin Z-projeksiyonu. Şematik çizimler referans için gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 100 μm (solda) ve 10 μm (sağda). Kısaltmalar: DIV = in vitro günler; BABB = benzil alkol/benzil benzoat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bipolar hücreler ve uzay-zamansal dağılımları, 250 DIV olgunlaşma üzerinde Chx10 ekspresyonunun (Vsx2 olarak da bilinir) izlenmesiyle tanımlandı (Şekil 6). Chx10 (Tablo 1), gelişmekte olan retinada progenitör hücre proliferasyonu ve bipolar hücre tayini için kritik bir transkripsiyon faktörüdür19,20. Bir homeobox geni olarak, nöroblastlarda gelişimin erken aşamalarında eksprese edilir ve olgun retinada, sadece bipolar hücrelerde bulunur. Şekil 6, gelişmekte olan organoid içindeki Chx10 pozitif hücrelerin dağılımını göstermektedir. Başlangıçta, nöroretinal periferden merkeze doğru uzanan çok sayıda Chx10 pozitif hücre gözlenir. Organoid olgunlaştıkça, bu hücreler daha az miktarda bulunur ve bipolar hücrelerin bulunduğu INL'ye taşınır.

figure-results-6
Şekil 6: 250 DIV olgunlaşmanın üzerinde Chx10 ifadesi. DRAQ5 (çekirdekler) ve Chx10 (nöroblastlar ve olgun bipolar hücreler) ile boyanmış FluoClear BABB ile temizlenmiş retinal organoidin Z-projeksiyon konfokal görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: DIV = in vitro günler; BABB = benzil alkol/benzil benzoat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Son olarak, GCaMP kalsiyum belirteçlerinden gelen endojen GFP'nin bu metodoloji ile temizlendikten sonra korunduğunu gösterdik. Şekil 7'de, uzun süreli fiksasyondan sonra floresanı arttırmak için Ad5-CMV-GCaMP6'lar ile enfekte olmuş ve anti-GFP ile immün olarak işaretlenmiş 70 DIV retinal organoidinin nöroretinasını gözlemleyebiliriz (Tablo 1).

figure-results-7
Şekil 7: FluoClear BABB temizleme yönteminde korunan endojen GCaMP. Anti-GFP (GCaMP eksprese eden hücreler), Chx10 (nöroblastlar ve erken evre bipolar hücreler) ve DRAQ5 (çekirdekler) ile immün olarak işaretlenmiş Ad5-CMV-GCaMP6'lar ile enfekte olmuş 70 DIV retinal organoid. Ölçek çubukları = 100 μm (solda) ve 25 μm (sağda). Kısaltmalar: BABB = benzil alkol/benzil benzoat; DIV = in vitro günler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: Nöronal projeksiyonların bir araya getirilmesini sunan bir retinal organoidin 3D rekonstrüksiyonu. Mor ile temsil edilen TUJ1 (nöronlar) ve sarı ile temsil edilen DRAQ5 (çekirdekler) ile boyanmış 250 DIV'de FluoClear BABB ile temizlenmiş retinal organoidlerin konfokal görüntülerinin Z-projeksiyonu. Kısaltmalar: BABB = benzil alkol/benzil benzoat; DIV = in vitro günler. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: Gelişimin geç aşamalarında (200 DIV) bir retinal organoidin yüzeyinde hizalanmış çubukların 3D rekonstrüksiyonu. Yeşil ile temsil edilen RECOV (fotoreseptörler) ve mor renkte RHO (çubuklar) ile boyanmış 200 DIV'de FluoClear BABB ile temizlenmiş retinal organoidlerin konfokal görüntülerinin Z-projeksiyonu. Kısaltmalar: DIV = in vitro günler; BABB = benzil alkol/benzil benzoat. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, olgunlaşmanın farklı aşamalarında retinal organoidi oluşturan hücrelerin uzay-zamansal dağılımının incelenmesini kolaylaştırır ve doğal 3D mimarisini korur, bu modelleri gelecekteki kişiselleştirilmiş tıp bağlamında anlamak için kritik bir unsurdur. Farklı katmanlar ve bireysel hücre tipleri düzeyinde retina mimarisinin ayrıntılı bir görünümünü sağlayarak, küresel 3D bağlamı korurken hücre altı yapıların görselleştirilmesini sağlar.

Tam montajlı görüntülemenin alternatifi, konvansiyonel kesitlerde (parafinli veya kriyoprezervasyon) görüntüleme yapmak için numunenin sonradan işlenmesidir. Kesitleme, proteinlerin ve yapıların lokalizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlarken, bu veriler tek bir düzlemle sınırlıdır ve uzamsal hücresel bağlantıların anlaşılmasını sınırlar. Sonuç olarak, konilerin ve çubukların oranı veya belirli bölgelerde aksonal demetlerin oluşumu gibi özellikler doğru bir şekilde temsil edilemeyebilir ve bu da üç boyutta yorumlamayı zorlaştırır. Retinal organoidler oldukça heterojendir, farklı bölgeler potansiyel olarak farklı hücre tipleri içerir ve/veya değişen derecelerde karmaşıklık ve farklılaşma sergiler. Tam montajlı görüntüleme, numunenin tamamını temsil etmeyebilecek bir bölüm alt kümesinin seçimine güvenmeden heterojenlik gradyanlarının küresel olarak analiz edilmesine izin verdiği için bu sorunu çözer.

Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM)21,22,23, lazer taramalı konfokal mikroskopiye alternatif olarak kullanılabilir. LSFM'de, numune birkaç mikron kalınlığında ince bir ışık tabakası ile aydınlatılır ve aydınlatılan optik bölümden üretilen tüm floresan bir kamera kullanılarak tespit edilir. LSFM, büyük hacimlerin (santimetre ölçeğine kadar numuneler) minimum fotoağartma ve fototoksisite etkileriyle hızlı bir şekilde görselleştirilmesi için oldukça verimli bir stratejiyi temsil eden geniş alan tabanlı bir algılama tekniğidir. Bununla birlikte, organoidler önemli küresel sapma gösterebilir, çünkü kavisli yüzeylerden geçen ışık, geliş açısına bağlı olarak farklı şekilde kırılır. Bu deneylerde, bu bozulma odak kaybına neden oldu, bu da daha derin yapıların çözünürlüğünün bulanıklaşmasına ve tehlikeye atılmasına neden oldu. Retinal organoidlerimizi (yaklaşık 1 mm çapında) görüntülemek için lazer taramalı konfokal mikroskopi en etkili yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır.

Bu protokol deneysel gereksinimlerimize göre uyarlanmıştır. Optik olarak temizlenmiş retinal organoidlerin tam montajlı görüntülemesine giren araştırmacılar için bir başlangıç kılavuzu olarak kullanılabilir ve bunlar farklıysa uyarlanmalıdır. Bu bölümde, metodolojinin kritik adımları, değişiklikleri ve sınırlamaları ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Kritik bir adım, takas protokolüne ilişkin karardır. Birçok kriterin göz önünde bulundurulması gerekir. İlk olarak, numunenin tipolojisini göz önünde bulundurun. Kemikleri temizlemek, beyin dokusunu temizlemekle aynı şey değildir, tıpkı retina organoidlerini temizlemenin mide organoidlerini temizlemekten farklı olması gibi, her biri farklı bir yaklaşım gerektirir. Farklı bir tipteki temizlenmiş organoidleri görselleştirmek için, ilgilenilen örnek için özel olarak optimize edilmiş protokolleri belirlemek için literatürü gözden geçirmek önemlidir. Fruktoz/gliserol, farklı dokulardan (insan hava yolu, kolon, böbrek, karaciğer ve meme tümörü organoidleri ve fare meme bezi organoidleri) türetilen organoidlerin temizlenmesi için yararlı olduğu kanıtlanmış hızlı ve toksik olmayan bir temizleme yöntemidir.12 ancak insan retinal organoidlerini şeffaf hale getirmek için uygun değildi. Bildiğimiz kadarıyla, hiçbir çalışmada nöral doku/organoide fruktoz/gliserol uygulaması bildirilmemiştir. Bu nedenle, bu temizleme yönteminin nöral dokuları netleştirmek için uygun olmadığı sonucuna varıyoruz. Bu uyumsuzluğun altında yatan nedenleri aydınlatmak için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.

Dikkate alınması gereken bir diğer kritik faktör, görüntüleme stratejisini ve optik bileşenlerin seçimini doğrudan etkilediği için gereken FoV'dir. Büyük FoV'ler tipik olarak, genellikle daldırma ortamı olmadan kullanılmak üzere tasarlanmış düşük büyütme hedefleriyle elde edilir (örneğin, hava, RI = 1.00). Bu hedefler, BABB onaylı numuneleri görüntülerken (RI = 1.56) daha büyük bir RI uyumsuzluğu yaşar ve bu da işlem sonrası düzeltilmesi gereken derinlik odaklamasında kaymalara yol açar. Buna karşılık, yağa daldırma hedefleri (RI = 1,51), BABB (RI = 1,56) gibi temizleme çözümleriyle daha az RI uyumsuzluğu sunar ve bu nedenle yeniden kalibrasyon gerektirmez.

Basit daldırma yöntemleri genellikle yüksek şeffaflık sağlamaz ve tam montajlı numunelerin yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için uygun değildir. Doku temizleme protokolleri, numunelerin şişmesi veya büzülmesi yoluyla etkili çözünürlüğü etkiler. Deneyin amacına bağlı olarak, şişme veya büzülme faydalı olabilir. Örneği genişleten protokoller, daha önce aynı ayrıntıları gösteremeyen aynı optik sistemdeki ince ayrıntıların çözünürlüğünü artırabilir. Aksi takdirde numune haznesine sığmayacak veya objektif çalışma mesafelerine uyum sağlamayacak büyük numuneleri görselleştirmek için büzülme istenebilir. Bununla birlikte, büzülme numuneyi sıkıştırdığından ve iç mesafeleri bozabileceğinden, bu teknik, hücreler arası mesafelerin boyutsal değerlendirmesi veya hassas ölçümü için uygun değildir.

Dikkate alınması gereken bir diğer önemli faktör, floresan proteinleri ile uyumluluktur. Çoğunlukla organik solvent bazlı protokoller, yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duyduklarından veya RI eşleşen çözeltilerle gömülürken floresan proteinleri bozdukları için floresan proteinleri söndürür. Neyse ki, yöntemlerin çoğu immünoetiketleme teknikleriyle uyumludur. Bununla birlikte, her epitopun uyumluluğu deneysel olarak doğrulanmalıdır.

Ayrıca, büyük IgG moleküllerinin doku yoluyla penetrasyonu engellenebilir, bu da boyama verimliliğini azaltabilir ve hedeflenen yapının numune yüzeyine göre görselleştirilmesini sınırlayabilir. Tam montajlı numunelerin antikorlarla boyanması, numunenin boyutuna ve doğasına bağlı olarak birkaç gün (hatta haftalar) sürebilir ve bu da protokolün süresini önemli ölçüde artırır.

Son olarak, optik aletle uyumluluk zorunludur. Organik solvent bazlı yöntemlerin çoğu (ECi hariç) çok aşındırıcıdır ve ticari numune odaları ve daldırma hedefleriyle kimyasal olarak uyumlu değildir. Ayrıca, bazı temizleme çözümleri, mevcut hedeflerin (genellikle su) gerektirdiği aralığa uymayan bir RI'ye sahiptir.

Protokolde özel dikkat gerektiren bazı adımlar vardır. FluoClear BABB, hidrofobik bir temizleme yöntemi olarak, önceden bir dehidrasyon adımı gerektirir. pH, GFP gibi endojen proteinlerin floresansının korunmasında önemli bir rol oynar. Ardından, alkol çözeltilerinin pH'ının uygun şekilde ayarlandığından emin olmak çok önemlidir. Dehidrasyon, tam temizleme için anahtardır. Optimum sonuçlar, numunelerin artan bir alkol çözeltisi gradyanı ile inkübe edilmesiyle elde edilir.

Numunenin boyutu, antikorların spesifik hedeflerine ulaşmasına izin vermede önemli bir rol oynar. Antikorlar homojen bir şekilde nüfuz edemeyebilir ve numunenizin dışında tutulabilir. Böyle bir durumda, deterjanın ve antikorların konsantrasyonunu ve inkübasyon süresini artırarak başka bir deterjan türüne (Tween-20 veya Saponin) geçmeyi düşünün. Bu ayarlamalar yetersizse, alternatif stratejiler antikor geçirgenliğini iyileştirebilir. Büyük örneklerin (santimetre ölçeğinde) tam montajlı immüno-etiketlemesi için, araştırmacılar SDS'nin daha derin antikor penetrasyonunu kolaylaştırabileceğini bulmuşlardır24. SDS, antikorların üçüncül yapısında kısmi bir kayba neden olur, proteini etkili bir şekilde doğrusallaştırır ve dokuya daha derine nüfuz etmesine izin verir. Daha sonra, SDS'nin yıkanması, antikorların antijen bağlama özelliklerini geri kazandırır, daha kalın dokuların daha düzgün boyanmasını sağlar ve numunenin yüzeyinde yaygın olarak gözlemlenen daha güçlü etiketleme gradyanını azaltır.

Kendi floresan sekonder antikorlarınızı hazırlamak, immünoetiketleme tasarımında daha fazla esneklik sağladığı, spesifik florofor-sekonder antikor kombinasyonunun seçilmesine izin verdiği ve aynı numunede kullanılabilecek renk sayısını artırdığı için çeşitli avantajlar sunar. Ek olarak, florofor-antikor oranı ayarlanabilir, bu nedenle genellikle daha parlaktırlar. Ancak, bazı hususlar dikkate alınmalıdır. Özel yapım ikincil antikorlar genellikle ticari olarak mevcut olanlardan daha az kararlıdır ve taze olarak kullanılmalıdır. Çoğu, ligand afinitelerini 4 ° C'de 3-6 ay boyunca korur, ancak bazı kombinasyonlar daha hızlı bozulabileceğinden, stabilitenin deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Ayrıca, bazı antikor-florofor eşleşmeleri, antikorun epitopu için afinitesini değiştirebilir ve bu da kısmi veya tamamen spesifik olmayan etiketlemeye neden olabilir. Güvenilirliği sağlamak için, özel yapım ikincil antikorların deneysel örneklere uygulanmadan önce kültürdeki hücreler gibi kontroller kullanılarak test edilmesi tavsiye edilir.

Bu optimize edilmiş protokol, tam montajlı retinal organoidlerin konfokal görüntülemesini kolaylaştırmak için optik temizlemeyi immüno-etiketleme ile entegre eder. Yapısal bütünlüğü korur ve organoid içindeki temel retina hücre tiplerinin tanımlanmasını sağlar. Bu nedenle protokol, araştırmacılara retinal organoid olgunlaşmasını ve mekansal organizasyonu araştırmak için güçlü bir araç sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik destekleri için Angel Sandoval, Eric Calatayud, Gustavo Castro-Olvera, Marta Martin ve Alina Hirschmann'a (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) teşekkür ederiz. Bu çalışmayı destekleyen finansman kuruluşları Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad - Ar-Ge Mükemmeliyet Merkezleri için Severo Ochoa programı (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades - Agencia Estatal de Investigación (PID2021-122807OB-C31 ve PID21-122807OB-C32); Salud Carlos III Enstitüsü (PI22/01747); Fundación La ONCE; CERCA programı aracılığıyla Generalitat de Catalunya; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA no. 871124); ve Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x NA0.40 KURU objektifLeicaHC PL APO CS2-
63x NA1.40 YAĞ HEDEFİLeicaHC PL APO CS2-
anti-GFP antikoruAbcamAB13970-
Benzil alkol (BA)Sigma Aldrich13162-
Benzil benzoat (BB)Sigma AldrichW213802-
alttan camlı petri kabıMatTekP35G-1.5-14-C-
Sığır Serumu Albümin (BSA)Sigma AldrichA7030 Serisi-
Chx10 antikoruSta Cruz BiyoteknolojiSC-365519 (İngilizce)-
Cytiva Illustra Nap-5 jel filtrasyon kolonları, Sephadex G-25Sigma Aldrich17-0853-02-
DAPISigma AldrichD9542 Serisi-
DMSO'nunSigma AldrichD8418 Serisi-
DRAQ5Termo Balıkçı62251-
Boya (karboksilik asit, süksinimidil ester)Invitrogen veya Abberior--
ImageJ/Fiji NIH  v1.50i-
Ters konfokal lazer tarama mikroskobuLeica mikro sistemleriTCS SP8 STED 3X-FALCON-
LAS X 3D işleme yazılımıLeica mikro sistemleri--
mQ H2O--Synergy su arıtma sisteminden ultra saf su
NaHCO3Acros Organik424270010-
Etiketlenmemiş ikincil IgGJackson İmmünoaraştırma--
Opsin mavisi antikoruMillipore   AB5407 -
Opsin RG antikoruKırlangıçAB5745 -
Paraformaldehit (PFA) %4Thermo scientific J199943-K2-
PBS ÇözümüGibco18912-014-
Falloidin etiketleme problarıTermo Balıkçı--
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Gibco 10010023-
RECOV antikoruKırlangıçAB5585-I -
RHO (RET-P1) antikoruSigma AldrichO4886 -
Sodyum sitrat tribazik dihidrat Sigma AldrichC8532-
Triton X-100Sigma AldrichT8787-
TUJ1 antikoruCovance MMS-435P -

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, Y. J., Jo, D. H. Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review. Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).
  2. Onyak, J. R., Vergara, M. N., Renna, J. M. Retinal organoid light responsivity: Current status and future opportunities. Trans Res. 250, 98-111 (2022).
  3. O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746(2020).
  4. Wahle, P., et al. Multimodal spatiotemporal phenotyping of human retinal organoid development. Nat Biotechnol. 41 (12), 1765-1775 (2023).
  5. Isla-Magrané, H., Veiga, A., García-Arumí, J., Duarri, A. Multiocular organoids from human induced pluripotent stem cells displayed retinal, corneal, and retinal pigment epithelium lineages. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 581(2021).
  6. Isla-Magrané, H., Zufiaurre-Seijo, M., García-Arumí, J., Duarri, A. All-trans retinoic acid modulates pigmentation, neuroretinal maturation, and corneal transparency in human multiocular organoids. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 376(2022).
  7. Avilov, S. V. Navigating across multi-dimensional space of tissue clearing parameters. Methods Appl Fluoresc. 9 (2), 022001(2021).
  8. Brenna, C., et al. Optical tissue clearing associated with 3D imaging: application in preclinical and clinical studies. Histochem Cell Biol. 157 (5), 497(2022).
  9. Bálint, Š, Verdeny Vilanova, I., Sandoval Álvarez, Á, Lakadamyali, M. Correlative live-cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (9), 3375-3380 (2013).
  10. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).
  11. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  12. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  13. Wang, Y., Zhang, D. -H., Zhang, J. -Y., Chen, N., Zhi, G. -Y. High-yield synthesis of bioactive ethyl cinnamate by enzymatic esterification of cinnamic acid. Food Chem. 190, 629-633 (2016).
  14. Schellinger, A. P., Carr, P. W. Solubility of buffers in aqueous-organic eluents for reversed-phase liquid chromatography. LCGC North America. 22 (6), 544(2004).
  15. Jiang, S. -M., et al. β-III-Tubulin: A reliable marker for retinal ganglion cell labeling in experimental models of glaucoma. Int J Ophthalmol. 8 (4), 643-652 (2015).
  16. Guo, J., Walss‐Bass, C., Ludueña, R. F. The β isotypes of tubulin in neuronal differentiation. Cytoskeleton. 67 (7), 431-441 (2010).
  17. Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 453-459 (2005).
  18. Fernando, M., et al. Differentiation of brain and retinal organoids from confluent cultures of pluripotent stem cells connected by nerve-like axonal projections of optic origin. Stem Cell Rep. 17 (6), 1476-1492 (2022).
  19. Belecky-Adams, T., et al. Pax-6, Prox 1, and Chx10 homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 38 (7), 1293-1303 (1997).
  20. Rowan, S., Cepko, C. L. Genetic analysis of the homeodomain transcription factor Chx10 in the retina using a novel multifunctional BAC transgenic mouse reporter. Dev Biol. 271 (2), 388-402 (2004).
  21. Andilla, J., et al. Imaging tissue-mimic with light sheet microscopy: A comparative guideline. Sci Rep. 7, 44939(2017).
  22. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: A tutorial. Adv Opt Photonics. 10, 111(2018).
  23. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  24. Darche, M., et al. Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes. Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Retinal OrganoidlerB t n Ba laml G r nt lemeOptik Berrakla t rmaKonfokal Mikroskopimm n Boyama3B H cre G rselle tirmensan Pluripotent K k H creleriRetinal H cre TipleriBABB Berrakla t rmaFotoresept r Morfolojisi

İlgili makaleler