Method Article

Fare Namlu Koreksinde Sirkadiyen Sinaptik Plastisitenin Analizi için Görselleştirme Tekniği Olarak Transmisyon Elektron Mikroskobu

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan protokol, esas olarak sinaps sayısı ve dendritik omurga morfolojisine odaklanarak, fare namlu korteksindeki sirkadiyen değişiklikleri ölçmek için transmisyon elektron mikroskobunun (TEM) kullanımını açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sirkadiyen sinaptik plastisitenin incelenmesi, farelerin farklı aydınlatma koşulları altında (aydınlık / karanlık döngüsü, LD 12:12 ve sabit karanlık, DD) barındırılmasını, çalışan tekerleklere erişim sağlanmasını ve bunları 24 saat içinde tanımlanmış dört zaman noktasında feda etmeyi gerektirir - günün başında ve ortasında / öznel gün ve gecenin başında ve ortasında / öznel gece. Beyinler daha sonra transmisyon elektron mikroskobu (TEM) için uygun şekilde sabitlenir. Varil korteksi, hassas somatotopik organizasyonu ile bu tür analizler için ideal bir model sağlar. Gerekli beyin alanını elde etmek için, beyinler bir vibratom ile teğetsel olarak kesilir ve daha sonra varil korteksini içeren bölümler seçilir ve Polybed reçinesine gömülür. Seçilen varilleri içeren hazırlanmış bloklardan ardışık ultra ince kesitler kesilir. Sinaptik yoğunluk, uyarıcı ve inhibitör, stereolojik disektör yöntemi kullanılarak elektron mikrograflarından analiz edilir. Ek olarak, TEM görüntüleri dendritik dikenlerin 3D rekonstrüksiyonları için kullanılır. Dendritik dikenlerin şeklindeki değişiklikler, gün boyunca nöronların yeniden şekillendiğini gösterir. Uyarıcı sinapsların sayısı farelerde uyku sırasında (gündüz) zirve yaparken, inhibitör sinapslar aktivite fazlarında (gecenin ortasında) zirve yapar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sirkadiyen ritimler, bir organizmadaki hemen hemen tüm süreçlerde sirkadiyen saatler tarafından üretilir. Hayvanlarda ve insanlarda, davranışlarının yanı sıra moleküler, hücresel ve tüm organizma seviyelerinde tespit edilmişlerdir. Bir organizmanın sirkadiyen sistemi, ana sirkadiyen saat (kalp pili) ve periferik saatlerden oluşur. Tüm sirkadiyen saatler, proteinleri tarafından kontrol edilen saat genlerinin döngüsel ifadesi yoluyla sirkadiyen salınımlar üretir. Saatin moleküler mekanizması, ~1 günlük bir periyodu olan (24 saatten daha uzun veya daha kısa) sirkadiyen ritimler üretir, ancak gündüz/gece koşullarında, endojen ritimlerin periyodu 24 saate senkronize edilir. Omurgasızların ve omurgalıların sinir sisteminin fizyolojisinde birçok sirkadiyen ritim tespit edilmiştir; Bununla birlikte, bazı çalışmalar, sinaptik ve nöronal plastisitede, yani sinapsların ve dendritlerinsayısındaki ve yapısındaki değişikliklerde de mevcut olduklarını göstermiştir 1,2,3,4.

Fare somatosensoriyel korteksi, iyi tanımlanmış organizasyonu ve hayvan lokomotor aktivitesi 5,6,7,8,9 ile doğrudan bağlantısı nedeniyle gün boyunca sinaptik plastisiteyi incelemek için mükemmel bir alan sağlar. Somatosensoriyel korteksin IV. katmanında, lekelenmemiş bir beyinde bile oldukça fark edilen belirgin nöral yapılar (fıçılar) vardır10,11. Düzenlemeleri, hayvanın burnundaki bıyıkların morfolojisini ve organizasyonunu yansıtır ve duyusal uyaranların hassas bir şekilde haritalanmasına izin verir. Büyük fıçılar, her biri dört ila yedi fıçı içeren beş düzenli sıra halinde düzenlenmiştir. Büyük bıyıklara karşılık gelen fıçı sıraları, A'dan E'ye kadar büyük harflerle işaretlenmiştir ve burun boyunca göz bölgesinden aşağıya doğru düzenlenmiş bıyıkları temsil eder. Her fıçı iki ana alandan oluşur: içi boş, nöropil ile dolu orta kısım ve yıldız hücrelerinin gövdelerinin hakim olduğu yan adı verilen duvar. Fıçılar, septa adı verilen daha düşük hücre yoğunluğuna sahip alanlarla birbirinden ayrılır. Her bir fıçı, hayvanın burnunun10,12 karşı tarafında bulunan belirli bir bıyıktan impuls alır.

Düzenli sıralar halinde düzenlenmiş belirli varillere bölünme, seçilen alanın10,13 hızlı ve kolay bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Sirkadiyen değişikliklerin analizi için B sırasından varil seçimi, aktiviteye bağlı plastisite 14,15,16,17 çalışmalarına dayanmaktadır. Sıra B, iyi tanımlanmış somatotopik sınırlarla karakterize edilir ve numunelerdeki konumunu basitleştiren yalnızca dört farklı büyük varil içerir. Merkezi konumu nedeniyle, B sırası nöronal aktivite, çevresel keşif ve lokomotor aktivite gibi doğal fare davranışları ile ilişkilidir. Dendritik dikenler ve şaftlar üzerindeki sinapsları saymak için, hücre gövdelerininseyrek olduğu varillerin merkezi kısımlarını seçmek önemlidir 12,15,18.

Konfokal mikroskopi görüntüleme ile kombine edilen immünohistokimya, farelerde sinaptik plastisitenin temel mekanizmalarının aydınlatılmasında çok önemli bir rol oynayan bir tekniktir. Konfokal mikroskopi kullanmak, azaltılmış arka plan floresansı ve gelişmiş hücresel yapı netliği ile yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlarken, foto ağartmadan muzdariptir ve biyolojik dokuların durumunu değiştirebilecek karmaşık numune hazırlığı gerektirir. Floresan belirteçlere olan bağımlılığı, örtüşmeleri nedeniyle aynı anda incelenebilecek protein türlerini sınırlayabilir. Konfokal immünofloresan mikroskobu, sabit doku kesitlerinde hedef antijenleri tespit etmek için antikorlar kullanarak spesifik proteinleri, ekspresyon seviyelerini ve sinaptik aktivite ile ilişkili lokalizasyonu etiketlemek için bir araç sağlar. Bu yöntem, nörotransmisyonda yer alan çeşitli proteinleri incelemek için özgüllük ve esneklik sunsa da, ilgili fiksasyon basamağı nedeniyle dinamik süreçler hakkında gerçek zamanlı veri sağlayamaması nedeniyle sınırlıdır. Antikor bağlanmasındaki tutarsızlık da güvenilmez sonuçlara neden olabilir 19,20,21.

Işık mikroskobu ile immünofloresan yöntemleri yerine elektron mikroskobunun kullanılması, hem lokalizasyon seçiminde hem de nöral yapıların ayrımında önemli ölçüde daha yüksek çözünürlük ve daha fazla hassasiyet sağlar. Seri transmisyon elektron mikroskobu (TEM) bölümleri, sinaptik yapıyı ultrastrüktürel düzeyde görselleştirmeye yardımcı olur ve sinaps oluşumunu veya eliminasyonunu incelemek için kullanılma avantajına sahiptir. TEM, araştırmacıların sinapsların fiziksel özelliklerini ve sinapsların plastisitesi olarak adlandırılan yoğunluk ve yapıdaki değişiklikleri analiz etmelerini sağlar. Numune hazırlama ve görüntüleme emek yoğun olmasına rağmen, TEM, öğrenme, hafıza oluşumu ve duyusal bilgilerin işlenmesi sırasında ve gün, yıl ve hayvan yaşı boyunca meydana gelen değişikliklerin daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Yöntemimiz, sinaptik yoğunluk ve morfolojinin sirkadiyen dinamiklerini, seri TEM görüntülerine dayalı stereolojik didikasyon yöntemi ile birlikte en az dört zaman noktası tabanlı bir yaklaşım kullanarak araştırmayı amaçlamaktadır. Stereolojik disektör yöntemi, yalnızca birkaç ultra ince seri bölüm 22,23,24,25,26 kullanıldığında bile sinaps sayılarının güvenilir bir şekilde tahmin edilmesini sağlar. Varil korteksinin iyi tanımlanmış somatotopik organizasyonu, çalışma yerlerinin hassas anatomik seçimini sağlarken, seri TEM, sinaps tiplerinin (uyarıcı ve inhibitör) ve konumlarının (dendritik dikenler ve şaftlar üzerinde) farklılaşmasına izin verir. Bu yöntem, günlük ve sirkadiyen nöroplastisiteyi araştıran araştırmacılar için değerli bir araç sağlayarak, çevresel ve iç faktörlerin sinaptik dinamikleri nasıl etkilediğinin araştırılmasını sağlar. Yöntemimizin bireysel bileşenleri, sirkadiyen ile ilgili değişikliklerle sınırlı olmamak üzere, çok daha geniş bir çalışma yelpazesinde nöroplastisite değişikliklerinin analizi için uygulanmasını sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler, uygun kurumsal etik kurul tarafından onaylanmıştır ve Avrupa Parlamentosu ve Konseyi'nin bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Direktifine ve ulusal düzenlemelere uygun olarak yürütülmüştür. Hayvanların çektiği acıyı en aza indirmek ve kullanılan hayvan sayısını azaltmak için tüm çabalar gösterildi.

1. Beyin dokularının hazırlanması

  1. Fareleri hem aydınlık / karanlık (LD 12:12) hem de sürekli karanlık (DD) koşullarında 24 saatlik bir döngü boyunca her 6 saatte bir dört farklı zaman noktasında kurban edin (Şekil 1). LD 12:12 koşullarında, ZT0'ın aydınlık fazın başlangıcına ve ZT12'nin karanlık fazın başlangıcına karşılık geldiği Zeitgeber Saati'ne (ZT) bakın. Sürekli karanlıkta, CT0'ın öznel günün başlangıcını temsil ettiği ve CT12'nin öznel gecenin başlangıcını ifade ettiği Sirkadiyen Zaman'a (CT) bakın.
    NOT: Zaman noktaları ZT0/CT0 (günün başlangıcı, öznel gün), ZT6/CT6 (gün ortası, öznel gün), ZT12/CT12 (gecenin başlangıcı, öznel gece) ve ZT18/CT18'dir (gece yarısı, öznel gece).
  2. Fare beyinlerini 0,1 M fosfat tamponunda (pH 7,4) %2,5 glutaraldehit ve %2 paraformaldehit ile perfüze edin ve sabitleyin.
  3. Her beyni kafatasından çıkarın ve 4 ° C'de 24 saat boyunca fiksatif bir çözelti (0,1 M fosfat tamponunda %2,5 glutaraldehit ve %2 paraformaldehit, pH 7,4) içinde bırakın.
  4. Beyni kesit almaya hazırlamak için beyinciği kesin ve beyni iki yarım küreye bölün (Şekil 2A,B).
  5. Bir yarım küre (sağ veya sol) seçin ve bölümler namlu korteksine teğet geçecek şekilde yönlendirin. Seçilen yarım küreyi vibratom aynasına monte edin ve sıkıca yapıştırın (Şekil 2C).
  6. Kesitleri 60 μm kalınlığında kesin (vibratom kesit hızı: 7.10 ve frekans: 5.00) (Şekil 2D) ve ardından bölümleri 0.1 M fosfat tamponu ve fiksatif çözelti (1:5 oran) karışımına aktarın.
  7. Kesitleri 4x büyütmeli bir ışık mikroskobu altında inceleyin ve bir sonraki adım için yalnızca görünür namlu alanı korteksine sahip olanları toplayın (Şekil 2E). Bölümün sürekli sıvı içinde kalmasını sağlamak için içbükey sürgüyü kullanın.

2. Beyin fiksasyonu ve kesit alma

  1. Bir boya fırçası kullanın ve dokuları nazikçe küçük bir cam Petri kabına aktarın. Daha sonra, beyin bölümlerini 0.1 M kakodilat tamponunda (BC, pH 7.4) 3 x 5 dakika durulayın.
  2. Bölümleri %1 Osmiyum tetroksit (OsO4) içinde 0,1 M BC'de %1,5 potasyum ferrisiyanür ile sabitleyin ve +4 °C'de 1 saat bekletin.
    NOT: OsO 4 kararsız olduğundan ve zamanla aktivitesi azaldığındanOsO4 çözeltisini kullanmadan hemen önce hazırlayın.
  3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0.1 M BC çözeltisinde% 1 OsO4 içinde sabitleme sonrası bölümler.
    NOT: OsO4 çok toksik olduğundan, tüm bu adımları koruyucu eldiven giyerken ve iyi çalışan bir havalandırmaya sahip çeker ocak altında gerçekleştirin.
    Atıklar sıkı bir kapakla ayrı bir şişede tutulmalıdır. Ürünün kanalizasyona girmesine izin vermeyin.
  4. Sabitlemeden sonra, bölümleri 2 x 5 dakika boyunca damıtılmış suda durulayın.
  5. Bir sonraki adımda,% 1 uranil asetat içeren% 70 etanol çözeltisinde beyin bölümlerini 40 dakika inkübe edin. Karıştırdıktan sonra, filtreli (25 mm) bir şırınga kullanın ve dokularla birlikte her bir Petri kabına 2 mL solüsyonu yavaşça dökün.
  6. Artan alkol konsantrasyonlarında dokuları dehidre edin: her biri 5 dakika boyunca %70, %80 ve %90 etanol ve her biri 3 x 5 dakika olmak üzere %100 etanol.
    NOT: Dokuları gece boyunca +4 °C'de %70 etanol içinde bırakmak mümkündür.
  7. Dokuları propilen oksit içinde 2 x 10 dakika yıkayın.
    NOT: Propilen oksit oldukça aşındırıcı bir kimyasaldır; Koruyucu eldiven giyerken ve çeker ocak altında çalışırken dikkatli kullanın. Bu adım için bir cam kap (cam Petri kabı) kullanmak çok önemlidir.
    Propilen oksit son derece yanıcı bir sıvı ve buhardır. Atıklar ayrı, sıkıca kapalı bir cam kapta tutulmalıdır. Ürünün kanalizasyona girmesine izin vermeyin; patlama riski vardır.
  8. Propilen oksidi Polybed reçine ve propilen oksit (1:1 oran) karışımıyla değiştirin. Bölümlerle birlikte her bir Petri kabına en az 2 mL çözelti dökün, bir kapakla örtün ve 40 dakika inkübe edin.
  9. Son olarak, beyin bölümlerini Polybed reçine ve propilen oksit (3:1 oranında) karışımına gömün. Petri kabı başına en az 2 mL karışım kullanın, üzerini örtün ve 1,5 saat bekletin.
    NOT: Dokuların tamamen daldırıldığından ve sıvının üzerinde yüzmediklerinden emin olun.
  10. Aclar filmi bir cam slaytın boyutuna uygun parçalar halinde kesin. Plastik bir pipet kullanarak, Aclar filme küçük bir hacimde reçine uygulayın ve beyin bölümlerini Petri kabından bir boya fırçası ile reçineye aktarın. Her bölümü iki Aclar film arasına gömün ve polimerize etmek için 65 ° C'lik bir fırında 48 saat inkübe edin.

3. Namlu korteks görüntüleme ve kesit alma

  1. Beyin bölümlerini ışık mikroskobu ile 2x objektif büyütmede fotoğraflayın (Şekil 2F).
  2. Tüm görüntüleri toplayın ve bunları grafik yazılımına aktarın.
    1. Görüntüleri açmak için Dosya |Açın ve Shift |Açık. Görüntüler ayrı pencerelerde açılacaktır.
    2. Görüntüleri korteksten (en küçük parça) istiflemeye başlayın ve tüm bölümler doğru şekilde hizalanana kadar devam edin.
    3. Katman 1'e sağ tıklayın |Her görüntüde Katmanı Çoğaltın. İletişim kutusunda, ad olarak görüntü numarasını girin, hedef dosya olarak bir görüntü seçin ve Tamam'ı tıklatın. Tüm görüntüler için bu adımları yineleyin ve bunları aynı hedef dosyaya çoğaltın.
    4. Namlu alanını yeniden yapılandırmak için görüntüleri hizalayın ve uygun anatomik düzeni sağlayın. Her katmanı manuel olarak konumlandırmak için Taşıma aracını kullanın ve ardından Düzenle |Dönüştür |Gerekirse yönü ayarlamak için Döndür veya Çevir aracı. Hizalamada ince ayar yapmak için Düzenle | Dönüştür | Görüntünün köşelerini anatomik yapılarla bağımsız olarak eşleşecek şekilde deforme edin ve hareket ettirin. Hizalamayı kolaylaştırmak için, Katmanlar Paneli'nde üst katmanın karıştırma modunu Kaplama olarak ayarlayın.
    5. Doğru konumlandırmayı sağlamak için namlu ana hatları ve kan damarları gibi anatomik yer işaretlerini karşılaştırın. Yığını kaydetmek için Dosya |Farklı kaydedin, dosyayı adlandırın ve biçimini seçin (PSD veya TIFF); ardından Tamam'ı tıklatın.
  3. Namlu alanını içeren birden çok bölümü sırayla gözden geçirin ve her bölümdeki görünür varilleri belirleyin.
  4. Tüm namlu alanının yeniden yapılandırılmasını sağlamak için her görünür namluyu ek bir ortak katman üzerinde manuel olarak ana hatlarıyla belirtin. Ek bir katman oluşturmak için, Katman |Yeni |Katman'ı seçin, katmanı adlandırın ve Tamam'ı tıklatın. Araç çubuğundan Fırça Aracı'nı seçin ve yeni katmanda, görünen her varili manuel olarak çizin.
    1. Daha fazla hassasiyet için yakınlaştırmayı kullanın ve fırça boyutunu gerektiği gibi ayarlayın. Görüntüyü yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için Yakınlaştırma Aracını kullanın veya Ctrl + "+" / Ctrl + "-" tuşlarına basın. Fırça boyutunu değiştirmek için, Fırça Aracı etkinken tuvale sağ tıklayın ve Boyut kaydırıcısını hareket ettirin.
  5. Bu rekonstrüksiyona dayalı olarak seçilen namluyu tanımlayın.
  6. Namlu alanının desenine (her biri dört ila yedi varilli beş sıra) ve namlu alanı içindeki konumunu gösteren kan damarlarının düzenine dayalı olarak seçilen namluyu ışık mikroskobu altında bulun.
  7. Görünür bir namlu korteksi olan her bölümde, seçilen namluyu bir stereomikroskop altında tanımlayın ve bir tıraş bıçağı kullanarak bitişik olanla birlikte kesin.
  8. Küçük parçayı bölümden çıkarın, bir reçine bloğuna yapıştırın ve kuruması için kaldırın. Daha sonra dokuyu çevreleyen fazla reçineyi kesin.
    NOT: Doku parçasını reçinenin yüzeyine düz bir şekilde yerleştirdiğinizden emin olun.
  9. Ultra ince ardışık kesitleri (3-6 bölüm, 65 nm kalınlığında) kesmek için bir ultramikrotom ve bir elmas bıçak kullanın (Şekil 3A) ve formvar kaplı, tek yuvalı nikel ızgaralarda (2 x 0,75 mm) toplayın.
  10. Kuruduktan sonra, numuneleri 3 dakika boyunca %2 uranil asetat ve 1,5 dakika boyunca %0,03 kurşun sitrat ile karşılaştırın.
    NOT: Kontrast oluşturmak için, ızgaraları birkaç kez yıkamak ve her adımdan sonra tamamen kurumaya bırakmak önemlidir. Uranil asetat ve kurşun sitrat için filtreli şırıngalar kullanın.
  11. Analiz için gereken alan ve hacme bağlı olarak 4K veya 8K büyütmelerde 80 kV hızlanma gerilimi altında seçilen namlunun (örneğin B2) oyuğundan ardışık görüntüler alın.
    NOT: Genellikle, hayvan başına en az 100μm3 toplam hacim analiz edilir.

4. Görüntü analizi

NOT: TEM görüntülerinin yığınlarının oluşturulması ve hizalanması, hem özgür yazılım (GIMP gibi) hem de ticari yazılım (örneğin, Photoshop) kullanılarak aynı şekilde yapılabilir. Rekonstrüksiyonlar da hem ticari yazılımlar (örneğin, 3D Studio Max) hem de Blender gibi tamamen ücretsiz programlar kullanılarak aynı şekilde gerçekleştirilebilir.

  1. Sinapsların yoğunluğunu tahmin etmek için, grafik yazılımında en az üç TEM görüntüsünü yığınlayın (Şekil 6). Seri görüntülerin sayısı ne kadar fazla olursa, hesaplamaların doğruluğu da o kadar yüksek olur.
    1. Görüntüleri açmak için Dosya |Açın ve Shift |Açık; Görüntüler ayrı pencerelerde açılacaktır.
    2. Her görüntü için Katman 1'e sağ tıklayın |Yinelenen Katman. İletişim kutusunda, ad olarak görüntü numarasını girin, hedef olarak bir görüntü seçin ve Tamam'ı tıklatın. Tüm görüntüler için aynı adımları tekrarlayın ve bunları aynı hedefte çoğaltın.
    3. Yığını kaydetmek için Dosya |Farklı kaydedin, dosyayı adlandırın, biçimini (PSD veya TIFF) seçin ve Tamam'ı tıklatın.
  2. TEM görüntülerini hizalamak için en üstteki görüntü katmanını seçin ve Katmanlar Paneli'nde karıştırma modunu Kaplama olarak ayarlayın. Düzenle'yi kullanma |Dönüştür |Görüntü yönünü ayarlamak için Döndür veya Çevir aracını kullanın. Yapıları hizalamak için Taşıma Aracı'nı kullanın.
    1. Daha hassas ayarlamalar için Düzenle |Dönüştür | Görüntünün köşelerini bağımsız olarak hareket ettirmek için Deforme Et. Hassasiyeti artırmak için Ctrl tuşunu basılı tutun ve köşe noktalarını tek tek sürükleyin. Görüntülerin doğru sırasını doğrulamak için ardışık TEM görüntüleri arasında mitokondri ve aksonal miyelin kılıflarının boyut ve şeklindeki değişiklikleri kullanın.
  3. Sinapsları saymak için bir disektör yöntemi kullanın.
    1. Katman |Yeni |Katman |TAMAM. Yeni katmanın saydam olduğundan emin olun (arka plan dolgusu olmadan).
    2. Analiz alanını tanımlamak için Katman |Yeni |Katman |TAMAM; tıklayın, sonra Dikdörtgen Aracı'nı seçin, Katman |Katman Stili |Kontur, kontur rengini, kalınlığını (Boyut) ve konumu (İç önerilir) ayarlayın, Tamam'ı tıklatın ve bir dikdörtgen çizin. Doldur'u seçin: %0. Dikdörtgenin iki bitişik seçili kenarını (örneğin, sağ ve alt veya üst ve sol) geçmeyen TEM görüntülerinde bulunan tüm sinapsları işaretleyin.
    3. Katman |Yeni |Katman |TAMAM. Yeni katmandaki sinapsları işaretlemek için Fırça Aracı'nı kullanın. Hassas işaretleme için Yakınlaştırma Aracını ve El Aracını kullanın.
    4. Uyarıcı sinapsları işaretlemek için bir renk ve inhibitör sinapslar için farklı bir renk seçin. Rengi değiştirmek için, araç çubuğundaki ön plan renk kutusunu tıklatın, Renk Seçici penceresinde bir renk seçin ve Tamam'ı tıklatın.
  4. TEM görüntüleri büyük yapılar içeriyorsa (örneğin, miyelinli sinir lifleri, büyük dendritler veya hücre gövdesinin parçaları), birden çok kareden oluşan bir ızgara kullanın. Bu, büyük yapılar tarafından tamamen işgal edilen karelerin hariç tutulmasına izin verir.
    1. Katman |Yeni |Katman |TAMAM. Görünüm'e tıklayarak ızgara görünümünü etkinleştirin |Göstermek |Izgara ve Görünüm'e tıklayarak ızgaraya yapışmayı etkinleştirin |Tutturmak |Izgara.
    2. Düzenle'ye tıklayarak ızgara aralığını ayarlayın |Tercihler |Kılavuzlar, Izgara ve Dilimler. Çizgi Aracı'nı seçin, modu Şekil veya Piksel olarak ayarlayın, çizgi kalınlığını ayarlayın (örn. 1 piksel) ve tüm görüntü alanını kaplamak için görünür ızgara boyunca dikey ve yatay çizgiler çizin.
  5. Her görüntü yığını için "üst" ve "alt" bölümleri tanımlayın. Yalnızca son görüntüde bulunmayan ancak önceki görüntülerde bulunan sinapsları sayın. Bu, sayılarını abartmadan sinapsların doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
  6. Görüntüdeki ölçeği kullanın ve örneğin hacmini hesaplayın (TEM görüntüleri yığını). Sinapsların sayıldığı alanı ölçün ve yığındaki TEM görüntülerinin sayısı ve ultra ince bölümlerin kalınlığı ile çarpın.
  7. Birim hacim başına sinaps yoğunluğunu belirlemek için sinaps sayısını hacme bölün.
  8. Dendritik bir omurgayı ve oluşturduğu sinapsları yeniden oluşturmak için dendritik bir omurga içeren tüm TEM görüntülerini (genellikle 10-12 ardışık elektron mikrografı) kullanın.
    1. Grafik yazılımında görüntü yığınını açın. Kırpma Aracı'nı seçin, yığında dendritik omurgayı içeren alanı işaretleyin ve Enter tuşuna basın. Seçilen alan tüm görünür katmanlarda kırpılacaktır. Aynı anda yalnızca birini görünür yapın, Katmanlar Panelindeki göz simgesini kullanarak diğer katmanları gizleyin.
    2. Dosya |Farklı kaydedin, dosyayı adlandırın, bir biçim seçin (JPG önerilir) ve Tamam'ı tıklatın. Yığındaki her katman için bu işlemi tekrarlayın.
      NOT: Görüntüleri bir 3B rekonstrüksiyon yazılımına aktarmadan önce, yeniden yapılandırılan öğeleri renklerle işaretlemek en iyisidir.
    3. Katman'a tıklayarak ek açıklama için yeni bir katman ekleyin | Yeni |Katman | TAMAM.
    4. Katmanlar Paneli'nde katman opaklığını %30-50 olarak ayarlayın.
    5. Fırça Aracını seçin, her yapı için farklı bir renk seçin (örneğin, dendritik omurga, sinaps) ve öğeleri işaretleyin. Orijinal görüntüyü korumak için yalnızca yeni katman üzerinde çalışın. Bitirdiğinizde, ek açıklama katmanını görüntüyle birleştirin, üst katmana sağ tıklayın ve Aşağı doğru birleştirin. Dendritik omurganın bir kesitini içeren her TEM görüntüsü için bu adımları tekrarlayın.
  9. Dendritik omurganın görünür kesitlerini içeren TEM görüntülerini 3D rekonstrüksiyon yazılımına aktarın. Varsayılan Küp nesnesini silmek için, nesneye sağ tıklayın ve silin. Görüntüleri yüklemeden önce görüntü alanı perspektifini hizalamak için Gezinme Gizmo'da Z'ye tıklayın veya Numpad 7'ye basın. Resimleri yüklemek için Ekle |Görüntü |Referans, ilk görüntüyü seçin ve onaylamak için üzerine çift tıklayın. Görüntü alanı perspektifinin baştan sona tutarlı kalmasını sağlamak için her görüntü için tekrarlayın.1
    NOT: Görünümü döndürmek için orta fare düğmesini basılı tutun ve fareyi hareket ettirin veya Gezinti Gizmo'sunu kullanın. Görünümü kaydırmak için Shift + orta fare düğmesini basılı tutun, fareyi hareket ettirin veya Görünümü taşı'yı kullanın.
  10. Ultra ince bölümlerin kalınlığını dikkate alarak TEM görüntülerini uygun mesafede düzenleyin (Şekil 4A). Son TEM görüntüsünü Z ekseni boyunca konumlandırmak için görüntüye tıklayın, Nesne Özellikleri'ne (sağ kenar çubuğu) tıklayın ve değeri Z Konumu'na girin. Görüntüler artık ilk ve son görüntü arasında dağıtılabilir. Bunları dağıtmak için tüm görüntüleri seçin, N panelini açmak için N tuşuna basın ve Düzenle sekmesine tıklayın (N panelinde) | Öğr.
    NOT: Herhangi bir ayarlama yapmadan önce, görüntü alanı perspektifini hizalayın ve Gezinti Aygıtı'nda Z'ye tıklayın veya Numpad 7'ye basın.
    Görüntüleri dağıtmak için Dağıt aracının etkinleştirilmesi gerekir. Etkinleştirmek için Düzenle | Tercihler | Uzantıları alın, "Dağıt" ı arayın ve Yükle'yi tıklayın. Dağıtım aracı etkinleştirildikten sonra oturumlar arasında etkin kalır ve programın aynı sürümü kullanıldığı sürece yeniden etkinleştirilmesi gerekmez.
  11. TEM görüntüsü başına tek bir eğri kullanarak her görüntüde dendritik omurganın şeklini manuel olarak ana hatlarıyla belirtin (Şekil 4B,C).
    1. Yalnızca ilk TEM görüntüsünün görünür olduğundan emin olun. Sahne Koleksiyonu'nda, göz simgesini kullanarak diğer tüm nesneleri gizleyin. Anahat için bir temel eğri oluşturmak için, Ekle |Eğri |Daire. BézierCircle nesnesini hareket ettirin, G tuşunu basılı tutun, fareyi hareket ettirin ve değişiklikleri kabul etmek için tıklayın.
    2. Dendritik omurga profilinin boyutunu eşleştirmek için nesneyi ölçeklendirin, S'yi basılı tutun, fareyi hareket ettirin ve tıklayın. BézierCircle nesnesi seçili olarak Modelleme sekmesine girin. Görüntü alanı perspektifini yeniden hizalayın ve Gezinti Gizmo'sunda Z'ye tıklayın veya Numpad 7'ye basın.
    3. Eğrinin şeklini ayarlamak için bir kontrol noktası seçin, G tuşunu basılı tutun, fareyi hareket ettirin ve tıklayın.
    4. Tutamaçların yönünü ve gücünü ayarlamak için bir tutamaç noktası seçin, hareket etmek için G'ye veya ölçeklendirmek için S'ye basın ve onaylamak için tıklayın. Her nokta için tekrarlayın.
    5. Yeni bir kontrol noktası eklemek için, mevcut iki kontrol noktasını seçin, Shift tuşunu basılı tutun ve her noktayı tıklayın, sağ tıklayın, Alt Gruplara Ayır'ı seçin. Eğri, dendritik omurga profilinin sınırına yeterince karşılık geldiğinde, Düzen sekmesine girin, BézierCircle nesnesine ve Nesneyi Çoğalt'a sağ tıklayın ve fareyi hareket ettirmeden tıklayın. Yeniden yapılandırma için kullanılan TEM görüntüleri ile aynı sayıda BézierCircle kopyası oluşturun. Bunları, adım 4.10'da olduğu gibi Dağıt aracını kullanarak düzenlenmiş TEM görüntüleriyle hizalayın.
    6. Modelleme sekmesindeki her BézierCircle eğrisini, her görüntüdeki dendritik omurga profiliyle eşleşecek şekilde ayarlayın. Aynı anda yalnızca şu anda düzenlenmiş olan BézierCircle nesnesinin ve karşılık gelen TEM görüntüsünün görünür olduğundan emin olun.
      NOT: Belirli adımlar için gereken tüm sağ tıklama eylemleri sahne sınırları içinde gerçekleştirilmelidir. Ardışık eğriler, ardışık dendritik omurga bölümlerinin sınırlarına karşılık gelmeli ve aynı sayıda kontrol noktası içermelidir.
  12. Sürekli bir yüzey oluşturmak ve son 3B şekli oluşturmak için 3B yeniden yapılandırma işlevini kullanarak bitişik çizgileri birleştirin (Şekil 4D).
    1. Yalnızca BézierCircle nesnelerinin görünür olduğundan emin olun. Sahne Koleksiyonu'nda, Kenar Çubuğu'ndaki göz simgesini kullanarak diğer tüm nesneleri gizleyin.
    2. Dendritik omurga nesnesini oluşturmak için Düzen sekmesine gidin, tüm BézierCircle nesnelerini seçin, sağ tıklayın ve Katıl'a tıklayın. Birleştirilen nesneyi sağ tıklayıp Dönüştür |Ağ.
    3. Birleştirilen nesnenin kenarlarını birleştirmek için Modelleme sekmesine girin, Edge Select moduna girmek için 2'ye basın |Seç |Tümü |sağ tıklama |Köprü Kenar Halkaları.
    4. Nesnenin üst kısmındaki boşluğu doldurmak için, nesnenin yanına tıklayarak tümünün seçimini kaldırın, Alt tuşunu basılı tutun ve üst çıkıntının bir kenar bölümünü tıklayın, sağ tıklayın, Kenarları Yükselt'i seçin, Z ekseninde yukarı doğru sürükleyin, S tuşuna basın ve yeni kenar döngüsünü küçültmek için fareyi hareket ettirin, değişikliği kabul etmek için tıklayın. Yeni kenar döngüsü seçili durumdayken, sağ tıklayın ve Kenarlar'dan Yeni Yüz'ü seçin. Aynı yöntemi kullanarak alt boşluğu doldurun.
    5. Nesneyi düzgünleştirmek için Düzen sekmesine girin, sağ tıklayın ve Gölge Düzgünleştir'i seçin. Şekli daha da düzgünleştirmek için Değiştiriciler (sağ kenar çubuğu) |Değiştirici Ekle |Oluştur |Alt bölüm yüzeyi. Hem Görüntü Alanı hem de Görüntü Oluşturma düzeylerini aynı değere ayarlayın (önerilen 1).
  13. Sinaps rekonstrüksiyonu için 4.11-4.12 adımlarını tekrarlayın (Şekil 4E,F).
  14. Her yapıya bir renk atayın ve son görüntüyü hazırlamak için oluşturma işlevini kullanın (Şekil 4G,H). Görüntü Alanı Gölgelendirme menüsüne gidin ve malzeme değişikliklerini önizlemek için İşlendi'yi seçin. Renklendirilecek nesneyi seçin ve Malzeme (sağ kenar çubuğu) |Yeni |temel rengi ayarlayın.
    1. Malzeme görünümünü iyileştirmek için Pürüzlülük veya Metalik kaydırıcıları gerektiği gibi ayarlayın. Her yapıya farklı bir renk atamak için bu yöntemi kullanın.
    2. Sahne aydınlatmasını ayarlamak için Işık nesnesine tıklayın, G tuşunu basılı tutun ve yeniden konumlandırmak için fareyi hareket ettirin. Işık yoğunluğunu değiştirmek için Veri'ye (sağ kenar çubuğu) gidin ve Güç değerini ayarlayın.
    3. Kamerayı konumlandırmak için, görüntü alanını son görüntüde görünmesi gerektiği gibi yeniden yapılandırılmış omurgaya bakacak şekilde yönlendirin, Ctrl + Alt + Sayısal Tuş Takımı 0 tuşlarına basın. Görünür Kamera çerçevesini seçin, G tuşunu basılı tutun ve gerekirse yeniden konumlandırmak için fareyi hareket ettirin.
    4. Oluşturmaya hazırlanmak için Çıktı'ya (sağ kenar çubuğu) gidin, Çözünürlük X ve Y değerlerini istediğiniz görüntüyle eşleşecek şekilde değiştirin. Görüntü kalitesini artırmak için Oluştur'a gidin (sağ kenar çubuğu) |Render, Samples değerini 120 ile 250 arasında ayarlayın. Saydam bir arka plan için şuraya gidin: Render |Filmler |Şeffaf'ı kontrol edin. Görüntüyü oluşturmak için F12 tuşuna basın veya Oluştur'a gidin (üst menü) |Görüntü Oluştur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yöntemimizi sirkadiyen sinaptik değişikliklerin analizine doğru bir şekilde uygulamak için, hayvanların aktivitesinin her aşaması için (her 6 saatte bir) iki nokta olmak üzere, eşit aralıklarla en az dört zaman noktası seçerek başlamak gerekir. Belirlenen bu zaman noktalarında hayvanlar kurban edilir ve beyinleri toplanır. Bu yaklaşım, sinaptik plastisitenin günlük veya sirkadiyen modellerinin tanımlanmasına izin verir ve bunları hayvanların lokomotor aktivitesindeki değişikliklere bağlar (Şekil 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, sinapsların sirkadiyen plastisitesini ve farelerin namlu korteksindeki dendritik dikenlerin yeniden yapılandırılmasını incelemek için kullanılan metodolojiyi sunduk. Güvenilir sonuçlar elde etmek için, sirkadiyen plastisite çalışması en az dört zaman noktası içermelidir. Araştırmamız, biri dinlenme aşamasında (gündüz) ve diğeri aktivite aşamasında (gece) olmak üzere iki zaman noktasından elde edilen verilerin, LD 12: 12 koşulları altındaki hayvanların aktivite aşamaları arasındak...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Polonya'daki Ulusal Bilim Merkezi, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366'dan EP'ye ve Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi, nr N41/DBS/001129'den MJ'ye verilen hibelerle desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aclar filmiAgar bilimselAGL4458
Blender yazılımı Sürüm: v. 2.91.2
Kakodilik asit, sodyum tuzu trihidratPolibilimler01131-100
İçbükey slaytMenzel9.161 151
Elmas bıçak Diyatom15-ABDBıçak açısı: Ultra 45°  
Dijital kamera Nikon DXM 1200 F
di-Sodyum Hidrojen Fosfat DodekahidratPOCH799280115
Gömme reçinesiPolibilimler08792-1Luft formülasyonu 
EtanolPol-AuraPA-11-0004
GIMP yazılımıSürüm: V 3.0.4
Kurşun sitratTAABL018
Işık mikroskobu Nikon Optiphot
Osmiyum tetroksit Polibilimler0223C-10Kristal (%99,95)
Paintbrush
Photoshop yazılımısürüm: CS5
Potasyum ferrisiyanürSigmaaldrich HakkındaP8131
Propilen oksit Sigmaaldrich Hakkında82320Puriss. p.a., ≥ %99,5 (GC)
Tek yuvalı ızgaralarAgar bilimselAGG25252 x 0,75 mm veya 2 x 1 mm
Sodyum klorür Chempur117941206
Sodyum dihidrojen fosfat dihidratChempur117991808
Stereo mikroskoppzo
Şıra filtresi BiyoduyarlılıkBS25PES045
TEM JoelJEM-2100 Serisi
UltramikrotomLeicaUC7
Uranil asetatLachema
TitreşimLeicaVT1000 S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jasinska, M., Pyza, E. Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons. Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).
  2. Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. Circadian plasticity in the brain of insects and rodents. Front Neural Circuits. 12, 32(2018).
  3. Mansilla, A., et al. Molecular mechanisms that change synapse number. J Neurogenet. 32 (3), 155-170 (2018).
  4. Frank, M. G. Renormalizing synapses in sleep: the clock is ticking. Biochem Pharmacol. 191, 114533(2021).
  5. Jasinska, M., et al. Daily rhythm of synapse turnover in mouse somatosensory cortex. Acta Neurobiol Exp. 74 (1), 104-110 (2014).
  6. Jasinska, M., et al. Circadian rhythmicity of synapses in mouse somatosensory cortex. Eur J Neurosci. 42 (8), 2585-2594 (2015).
  7. Jasinska, M., et al. Circadian clock regulates the shape and content of dendritic spines in mouse barrel cortex. PLOS ONE. 14 (11), e0225394(2019).
  8. Jasinska, M., et al. Circadian changes of dendritic spine geometry in mouse barrel cortex. Front Neurosci. 14, 578881(2020).
  9. Jasinska, M., et al. Light-modulated circadian synaptic plasticity in the somatosensory cortex: link to locomotor activity. Int J Mol Sci. 25 (23), 12870(2024).
  10. Woolsey, T. A., Vander Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
  11. Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the Sml-face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
  12. Armstrong-James, M., Fox, K. Spatiotemporal convergence and divergence in the rat SI barrel cortex. J Comp Neurol. 263 (2), 265-281 (1987).
  13. Barrel cortex. Fox, K. , Cambridge University Press. (2008).
  14. Jasinska, M., et al. Rapid, learning-induced inhibitory synaptogenesis in murine barrel field. J Neurosci. 30 (3), 1176-1184 (2010).
  15. Knott, G. W., Quairiaux, C., Genoud, C., Welker, E. Formation of dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in adult mice. Neuron. 34 (2), 265-273 (2002).
  16. Jasinska, M., et al. Effect of associative learning on memory spine formation in mouse barrel cortex. Neural Plast. 2016, 1-11 (2015).
  17. Jasinska, M., et al. Fear learning increases the number of polyribosomes associated with excitatory and inhibitory synapses in the barrel cortex. PLOS ONE. 8 (2), e54301(2013).
  18. White, E. L. Ultrastructure and synaptic contacts in barrels of mouse SI cortex. Brain Res. 105 (2), 229-251 (1976).
  19. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  20. Serrano, M. E., Kim, E., Petrinovic, M. M., Turkheimer, F., Cash, D. Imaging synaptic density: the next holy grail of neuroscience. Front Neurosci. 16, 796129(2022).
  21. Woelfle, S., et al. CLARITY increases sensitivity and specificity of fluorescence immunostaining in long-term archived human brain tissue. BMC Biol. 21 (1), 113(2023).
  22. Weibel, E. R. Stereological methods. Vol. 1: practical methods for biological morphometry. , Academic Press. London. (1979).
  23. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134 (2), 127-136 (1984).
  24. Gundersen, H. J. G. Stereology of arbitrary particles. J Microsc. 143 (1), 3-45 (1986).
  25. Fiala, J. C., Harris, K. M. Cylindrical diameters method for calibrating section thickness in serial electron microscopy. J Microsc. 202 (3), 468-472 (2001).
  26. Napper, R. M. A. Total number is important: using the disector method in design-based stereology to understand the structure of the rodent brain. Front Neuroanat. 12, 16(2018).
  27. Perez-Cruz, C., Simon, M., Czéh, B., Flügge, G., Fuchs, E. Hemispheric differences in basilar dendrites and spines of pyramidal neurons in the rat prelimbic cortex: activity- and stress-induced changes. Eur J Neurosci. 29 (4), 738-747 (2009).
  28. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  29. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nat Methods. 9 (12), 1198-1201 (2012).
  30. Videnovic, A., Zee, P. C. Consequences of circadian disruption on neurologic health. Sleep Med Clin. 10 (4), 469-480 (2015).
  31. Logan, R. W., McClung, C. A. Rhythms of life: circadian disruption and brain disorders across the lifespan. Nat Rev Neurosci. 20 (1), 49-65 (2018).
  32. Nassan, M., Videnovic, A. Circadian rhythms in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 18 (1), 7-24 (2021).
  33. Shen, Y., et al. Circadian disruption and sleep disorders in neurodegeneration. Transl Neurodegener. 12 (1), 8(2023).
  34. Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus. Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).
  35. Adler, P., et al. Aging disrupts the circadian patterns of protein expression in the murine hippocampus. Front Aging Neurosci. 11, 368(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyCircadian Synaptic PlasticityBarrel CortexMouse BrainSynaptic DensityDendritic Spine ReconstructionExcitatory SynapsesInhibitory SynapsesStereological Dissector MethodTangential Brain Sectioning

Related Articles