Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Viral Yaşam Döngülerini In Vitro Araştırmak için SARS-CoV-2 Virüsü Benzeri Bir Parçacık Sisteminin Üretimi

1.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68389

⸱

6 Haziran 2025

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Gerçek virüsü yakından taklit eden SARS-CoV-2 virüsü benzeri parçacıklar üretmek için optimize edilmiş bir in vitro protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, bir biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarı gerektirme kısıtlamaları olmadan viral enfeksiyon, montaj ve çıkış mekanizmalarının araştırılmasını sağlar.

Özet

Şiddetli akut solunum sendromu-koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) virüs benzeri parçacık (SC2-VLP) yöntemi, biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL-3) laboratuvarlarına ihtiyaç duymadan SARS-CoV-2 yaşam döngüsünü incelemek için güçlü ve erişilebilir bir araç sunar. Bu sistem, viral partikül üretiminin hassas ve hassas tespiti için T20 sinyaline kaynaşmış bir lusiferaz raportörü kullanarak montaj, genom paketleme ve çıkış dahil olmak üzere viral yaşam döngüsünün kritik aşamalarını etkili bir şekilde taklit eder. SC2-VLP'ler, HEK-293T hücrelerinde RNA paketleme sinyali ile birlikte membran (M), nükleokapsid (N), zarf (E) ve spike (S) dahil olmak üzere SARS-CoV-2 yapısal proteinlerinin birlikte eksprese edilmesiyle üretilir. Geleneksel virüs benzeri parçacık sistemlerinin aksine, SC2-VLP yöntemi, doğru miktar tayini ve doğal viral yaşam döngüsüne daha fazla sadakat sağlar. Ayrıca, S proteininin HIV bazlı lentiviral partiküllere dahil edilmesi yoluyla viral girişi incelemekle sınırlı olan lentiviral psödotipleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, SC2-VLP sistemi, SARS-CoV-2 biyolojisinin birden fazla aşamasını keşfetmek için daha kapsamlı bir platform sağlar. Bu yöntem, canlı virüsü işleme risklerini atlar ve erişilebilirliği genişletir. SC2-VLP yöntemi, antiviral araştırmalarda ve SARS-CoV-2'ye karşı terapötik stratejilerin geliştirilmesinde önemli bir ilerlemeyi temsil eder.

Giriş

COVID-19 salgını, modern tarihin en yıkıcı küresel sağlık krizlerinden biri olarak ortaya çıkmış ve dünya çapında milyonlarca ölümle sonuçlanmıştır1. Virüsten sorumlu SARS-CoV-2, enfeksiyon, genom replikasyonu, montaj ve çıkış gibi temel aşamaları içeren karmaşık bir yaşam döngüsünü takip eder. Enfeksiyon süreci, viral spike proteini (S) konak hücre reseptörü olan Anjiyotensin Dönüştürücü Enzim 2'ye (ACE2) bağlandığında başlar ve viral genomun konak hücre2,3'e salınmasını kolaylaştırır. Viral RNA'ya bağımlı RNA polimeraz (RdRp) daha sonra genomik RNA'nın replikasyonunu katalize eder. Bu RNA, nükleokapsid proteini (N) ile kompleks halinde, zar proteini (M) tarafından tanınan kararlı bir yapı oluşturur. M proteini, RNA-N kompleksini, S'yi ve zarf proteinini (E) işe alarak viral montajda merkezi bir rol oynar4,5. Montajdan sonra, virion, kanonik olmayan lizozom aracılı bir kaçakçılık yolu6 aracılığıyla çıkışını tamamlar.

Pandemiye yanıt olarak, aşılar, nötralize edici antikorlar ve antiviral ilaçlar geliştirmek için önemli küresel kaynaklar seferber edildi. Bu müdahalelerin değerlendirilmesi, SARS-CoV-2 araştırmalarının ilerletilmesinde çok önemli olmuştur7. Bununla birlikte, virüsü içeren deneylerin Biyogüvenlik Seviye 3 (BSL-3) laboratuvarlarında yapılması gerektiğinden, canlı virüsü incelemek önemli lojistik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. BSL-3 tesislerinin sınırlı mevcudiyeti, SARS-CoV-2'yi anlamayı ve bunlarla mücadele etmeyi amaçlayan araştırmaların hızını kısıtlamıştır.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, SARS-CoV-2 araştırmalarında iki ana sistem - virüs benzeri parçacık (VLP) ve lentiviral psödotipleme - yaygın olarak benimsenmiştir ve her ikisi de BSL-3 muhafazası8 gerektirmez. VLP sistemi, birlikte virüs benzeri parçacıklar üreten M, S, E ve N dahil olmak üzere viral yapısal proteinleri kodlayan genlerle hücrelerin birlikte transfeksiyonunu içerir. Bu parçacıklar virüsün yapısal ve işlevsel özelliklerini taklit eder, bu da onları SARS-CoV-2 yaşam döngüsündeki temel süreçleri incelemek için değerli bir araç ve hatta aşı geliştirme için etkili bir antijen haline getirir 9,10,11.

Tersine, lentiviral psödotipleme sistemi, lentivirüsteki Veziküler Stomatit Virüsü (VSV) G proteininin SARS-CoV-2 S proteini ile değiştirilmesini içerir ve lusiferaz veya GFP gibi raportör genleri içerebilen lentiviral partiküllerin üretimini sağlar. Bu sistem özellikle S-ACE2 etkileşimini bloke eden nötralize edici antikorları araştırmak için kullanışlıdır12. Bununla birlikte, lentiviral psödotipleme, plazma zarında partikül salınımına aracılık eden HIV yapısal proteinlerinin kullanımı nedeniyle SARS-CoV-2 viral montajını veya çıkışını yansıtmaz.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, Syed ve ark. yakın zamanda RNA genomu içinde SARS-CoV-2 paketleme sinyalini tanımladı ve bu da N proteininin viral genom tanımaya yönelik özgüllüğünü gösteriyor13. Bu paketleme sinyalini raportör genlere kaynaştırarak, bu genleri SARS-CoV-2 virüsü benzeri parçacıklara (SC2-VLP'ler) verimli bir şekilde dahil etmek mümkündür13. Bu strateji yalnızca SARS-CoV-2 montaj ve çıkış süreçlerini kopyalamakla kalmaz, aynı zamanda enfeksiyon adımlarının hassas bir şekilde ölçülmesine de olanak tanır. Bu çalışmada, SC2-VLP sistemini kullanmak için deneysel metodolojiyi tanıtıyoruz ve bu yaklaşımı yürütmek için temel hususları vurguluyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. SC2-VLP'lerin Oluşturulması

  1. %10 v/v FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş, DMEM tam ortamlı 10 cm çapında doku kültürü plakasında ~3.0 × 10 6 HEK-293T hücresi tohumlayın.
    NOT: Yüksek transfeksiyon verimliliği ve optimum SC2-VLP üretimini sağlamak için, HEK-293T hücreleri düşük geçiş sayılarında ~ 10 tutulmalıdır.
  2. HEK-293T hücresini 37 °C'de, %5 CO2'de yaklaşık 24 saat kültürleyin ve mikroskop altında hücre birleşmesini kontrol edin. ~%70 birleşikse devam edin.
  3. 60 μL PEI'yi 1 mg / mL stoktan serum içermeyen ortam ile 200 μL'ye seyreltin.
  4. 200 μL serumsuz ortama 6.7 μg N plazmit, 10 μg Luc-T20 plazmit, 0.016 μg S plazmid ve 3.3 μg M-IRES-E plazmidi ekleyin (bkz. Ek Dosya 1).
  5. Adım 1.3'ten seyreltilmiş PEI'yi, adım 1.4'ten viral yapı proteinlerini kodlayan plazmitleri içeren çözeltiye yavaşça ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bu transfeksiyon çözümüdür.
  6. Transfeksiyon solüsyonunu adım 1.5'ten HEK-293T hücrelerine dikkatlice bırakın ve iyice karıştırmak için doku kültürü plakasını hafifçe döndürün.
  7. Enfeksiyondan 6 saat sonra hücre kültürü ortamını DMEM tam ortamı ile değiştirin ve transfekte edilmiş HEK-293T hücrelerini 37 ° C'de,% 5 CO2'de 48 saat boyunca inkübe edin.
  8. SC2-VLP'leri içeren enfekte HEK-293T hücrelerinin süpernatantını toplayın ve ardından hücre kalıntılarını gidermek için süpernatanı 0.45 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün. Bu SC2-VLP ortamıdır.
    NOT: HeLa, Vero E6 ve Caco2 hücre hatlarında SC2-VLP'ler üretmeye çalıştık, ancak protokolün HEK-293T hücreleri için özgüllüğünü gösteren ölçülebilir bir viral titre elde edilmedi.

2. SC2-VLP etkinliğinin incelenmesi

NOT: ACE2 ve TMPRSS2'yi stabil bir şekilde eksprese eden HEK-293T hücre hattı, bir lentiviral transdüksiyon yaklaşımı14,15 kullanılarak kurulmuştur. Hem ACE2 hem de TMPRSS2'nin protein ekspresyonu, Adım 3'te (SC2-VLP kompozisyon analizi) tarif edilene benzer bir protokol izlenerek western blot analizi ile doğrulandı.

  1. 4.0 × 104 HEK-293T hücresini, ACE2'nin kararlı ekspresyonu ile tohumlayın ve 96 oyuklu bir plakada TMPRSS2 ve adım 1.8'den itibaren 50 μL SC2-VLP ortamı ekleyin.
  2. 96 oyuklu doku kültürü plakasını 37 ° C'de% 5 CO2 ile 24 saat inkübe edin.
  3. Ortamı 96 oyuklu plakadan çıkarın ve 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 ve 1.8 mM KH2PO4 içeren 37 ° C'de 100 μL PBS tamponu ile bir kez yıkayın.
  4. HEK-293T ACE2/TMPRSS2 hücrelerini 20 μL pasif lizis tamponu ile parçalayın, numuneyi oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca hafifçe sallayın.
    NOT: Lizis tamponu 25 mM Tris-fosfat (pH 7.8), 2 mM DTT, 2 mM 1,2-diaminosikloheksan-N,N,N',N'-tetraasetik asit, 1.25 mg/mL lizozim, 2.5 mg/mL BSA, %10 gliserol ve %1 Triton X-100 içerir).
  5. 96 oyuklu plakayı soğutmalı bir mikroplaka santrifüjünde 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.000 × g'da döndürün ve ardından plakayı hemen bir buz banyosuna aktarın.
  6. Opak beyaz 96 oyuklu bir plakaya 100 μL sulandırılmış lusiferaz tahlil tamponu alın ve adım 2.5'ten 20 μL lizat ekleyin. 2-3 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek kısa bir süre karıştırın.
  7. Aşağıdaki parametrelere sahip bir plaka okuyucu kullanarak lüminesansı ölçün: Algılama modu: Lüminesans; Dalga boyu aralığı: Tam spektrum; Plaka formatı: 96 oyuklu standart opak plaka; Entegrasyon süresi: 200 ms.

3. SC2-VLP bileşiminin incelenmesi

  1. Adım 1.8'den itibaren 10 mL SC2-VLP ortamına %50 PEG 8000 ve %2.2 NaCl içeren 1.36 mL PEG 8000 çözeltisi ekleyin.
  2. Karışımı bir orbital çalkalayıcı üzerinde tutun ve çözeltiyi gece boyunca 4 °C'de yavaşça karıştırın.
  3. Çözeltiyi 4 ° C'de, 2.000 × g'da 30 dakika santrifüjleyin ve batı lekeleme analizi16 için SC2-VLP peletini toplayın.
    NOT: Western blotlama analizi için antikorlarla ilgili tüm bilgiler Malzeme Tablosunda verilmiştir.

4. SC2-VLP üreten hücrelerde S ve mutantlarının hücre altı lokalizasyon analizi

  1. ~ 3.0 × 106 HEK-293T hücresini 15 mm çapında cam tabanlı kültür kabına eşit şekilde tohumlayın ve daha sonra hücrelerin transfeksiyondan önce ~% 70 birleşene kadar yapışmasına ve büyümesine izin verin.
  2. Transfeksiyon prosedürünü 1.3 ila 1.7 arasındaki adımlarda açıklandığı gibi tekrarlayın ve yalnızca plazmit miktarlarını aşağıdaki gibi değiştirin: N plazmit: 1.3 μg, Luc-T20 plazmit: 2 μg, S plazmit: 0.0032 μg ve M-IRES-E plazmit: 0.66 μg.
  3. Kültür kabını 1 mL buz gibi soğuk PBS ile iki kez nazikçe yıkayın ve ardından oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) fiksasyon solüsyonu ekleyin.
  4. Hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın ve ardından RT'de 1 mL %0.25 Triton X-100 10 dakika ekleyerek hücrelere geçirgen hale getirin.
  5. Hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın ve daha sonra spesifik olmayan antikor etkileşimlerini bloke etmek için RT'de 1 saat boyunca 1 mL% 5 sığır serum albümini (BSA) ekleyin.
  6. ~ 200 μL primer antikor çözeltisi (cam tabanı kaplayacak kadar) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Birincil antikor çözeltileri, aşağıdaki seyreltme oranlarında PBS içinde çözünmüş %5 BSA içinde seyreltilerek hazırlanır: fare anti-S antikoru 1:200'de, tavşan anti-Sec61β antikoru 1:200'de, tavşan anti-GM130 antikoru 1:200'de ve tavşan anti-ERGIC53 antikoru 1:200'de. % 5 BSA / PBS çözeltisi, sonraki immünofloresan boyama prosedürleri sırasında spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için hem seyreltici hem de bloke edici tampon görevi gördü.
  7. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve ardından hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  8. RT'de 1 saat boyunca floresan konjuge ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve daha sonra hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    NOT: Floresan konjugatların foto-ağartılmasını önlemek ve sinyal bütünlüğünü korumak için sonraki tüm adımlar karanlıkta veya minimum ışığa maruz kalma altında gerçekleştirilmelidir. Fare veya tavşandan türetilen iki tip floresan konjuge ikincil antikor, S proteinini veya hücre organel işaretleyici proteinlerini boyamak için kullanılır.
  9. Çekirdekleri RT'de 2.5 μg / mL Hoechst çözeltisi ile 5 dakika boyayın ve ardından hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  10. S proteini veya organel boyamasını gözlemleyin ve aşağıdaki parametrelerle konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüler elde edin: Otomatik konfokal diyafram açıklığına sahip VBF (ortalama yok, satır sıralı tarama) olarak ayarlanmış PMT modu. Kanal 1 (FITC) için, 488 - 25 nm emisyon, HV 500 V, 525x kazanç ve %525 ofset ile %1 güçte 5 nm lazeri kullanın. Kanal 2 (Alexa Fluor 594) için, 594 nm lazeri 25 - 610 nm emisyon, HV 670 V, kazanç 500x ve %1 ofset ile %5 güçte kullanın. Kanal 3 (DAPI) için, 430 - 470 nm emisyon, HV 490 V, kazanç 1x kazanç ve %5 ofset ile %25 güçte 405 nm lazeri kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

SARS-CoV-2 yaşam döngüsünün çıkış ve montaj adımları, enfeksiyon ve replikasyon adımlarından daha az çalışılmıştır17,18. SC2-VLP yöntemi geliştirilmeden önce, bu süreçler yalnızca canlı SARS-CoV-2 kullanılarak araştırılabiliyordu ve araştırmayı BSL-3 laboratuvarlarıyla sınırlıyordu13. Şekil 1'de gösterilen SC2-VLP iş akışı, deneysel protokolün ana hatlarını çizer ve SARS-CoV-2 yaşam döngüsünün bu adımlarında y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

BSL-3 laboratuvarlarının kısıtlamaları olmadan hücre kültürü sistemlerinde SARS-CoV-2 yaşam döngüsünü modellemek için basit ve etkili bir yöntem, anti-SARS-CoV-2 araştırmaları için çok önemli bir ilerlemeyi temsil eder. SC2-VLP yöntemi, sağlam ve erişilebilir bir platform sunarak bu ihtiyacı karşılar. Bu çalışmada, SC2-VLP'lerin üretilmesi için kritik deneysel adımların ana hatlarını çizen SC2-VLP yöntemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Ek olarak, SARS-CoV-2 biyolojisi anlayışımız...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki (BUCM) (90011451310011) Başlangıç fonu programı tarafından desteklenmiştir. Deneylerle ilgili paha biçilmez tartışma ve yardım için BUCM'deki Dr. Ma laboratuvarının tüm üyelerine şükranlarımızı sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serumu Albümini (BSA)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi9998S
Konfokal Lazer Tarama MikroskobuOlympusFV3000
DMEMCorning10-013-CV
Fetal Sığır Serumu (FBS)ThermofisherA5670402
Keçi Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 488) antikoruInvitrogenA11001seyreltme oranı: IF 1: 1000
Keçi Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 594) antikoruAbcamab150080seyreltme oranı: IF 1:1000
HEK-293T hücre hattıUlusal Hücre Hattı Kaynak Altyapısı (NICR)NICR-293T-001Yüksek transfeksiyon verimliliği ve optimum SC2-VLP üretimi sağlamak için, HEK-293T hücreleri düşük geçiş sayılarında (≤ P10) olarak adlandırılır.
Hoechst 33342InvitrogenH1399Çalışma konsantrasyonu: 2.5 μ g / mL
Lusiferaz Raportör Test SistemiPromegaE1500
Luc-T20Addgene177941
Fare monoklonal anti-GAPDHProteintech60004-1-Igseyreltme oranı: WB 1: 20.000
Fare monoklonal anti-S RBDAbklonalA23771seyreltme oranı: IF 1:200
OptiMEMThermofisher31985070transfeksiyon için serumsuz ortam
PEG3350Sigma-AldrichP3635
PEG8000Sigma-AldrichP2139
Penisilin-StreptomisinThermofisher15140122
Polietilenimin (PEI)Thermofisher43896.01
Promega pasif lizis tamponuPromegaE1941
Tavşan poliklonal anti-ACE2Proteintech21115-1-APseyreltme oranı: WB 1:1000
Tavşan poliklonal anti-ERGIC53Proteintech13364-1-APseyreltme oranı: IF 1:200
Tavşan poliklonal anti-GM130Proteintech11308-1-APseyreltme oranı: IF 1:200
Tavşan poliklonal anti-SAbcamab272504seyreltme oranı: WB 1:1000
Tavşan poliklonal anti-Sec61 ve beta;Proteintech15087-1-APseyreltme oranı: IF 1:200
Tavşan poliklonal anti-TMPRSS2Abcamab109131seyreltme oranı: WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E plazmitAddgene177938
SARS-CoV-2 N plazmitAddgene177959
SARS-CoV-2 Nükleoprotein Tavşan mAbAbklonalA21042seyreltme oranı: WB 1:4000
SARS-CoV-2 S plazmidAddgene177960
İkincil Antikor, HRP, Keçi anti-Fare IgG (H+L)İnvitrojen31460seyreltme oranı: WB 1:5000
İkincil Antikor, HRP, Keçi anti-Tavşan IgG (H+L)İnvitrojen31430seyreltme oranı: WB 1:5000
SpectraMax i3x plaka okuyucu ve nbsp;Moleküler CihazlarSpectraMax i3x

Kaynaklar

  1. Narayanan, S. A., et al. A comprehensive SARS-CoV-2 and COVID-19 review, Part 2: host extracellular to systemic effects of SARS-CoV-2 infection. Eur J Hum Genet. 32 (1), 10-20 (2024).
  2. Shang, J., et al. Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2. Nature. 581 (7807), 221-224 (2020).
  3. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Structure of SARS-CoV-2 membrane protein essential for virus assembly. Nat Commun. 13 (1), 4399(2022).
  5. Han, Y., et al. SARS-CoV-2 N protein coordinates viral particle assembly through multiple domains. J Virol. 98 (11), e0103624(2024).
  6. Ghosh, S., et al. beta-coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535.e14 (2020).
  7. Andrews, H. S., Herman, J. D., Gandhi, R. T. Treatments for COVID-19. Annu Rev Med. 75, 145-157 (2024).
  8. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).
  9. Sultana, R., Stahelin, R. V. Strengths and limitations of SARS-CoV-2 virus-like particle systems. Virology. 601, 110285(2025).
  10. Xu, R., Shi, M., Li, J., Song, P., Li, N. Construction of SARS-CoV-2 virus-like particles by mammalian expression system. Front Bioeng Biotechnol. 8, 862(2020).
  11. Plescia, C. B., et al. SARS-CoV-2 viral budding and entry can be modeled using BSL-2 level virus-like particles. J Biol Chem. 296, 100103(2021).
  12. Cruz-Cardenas, J. A., et al. A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept. Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).
  13. Syed, A. M., et al. Rapid assessment of SARS-CoV-2-evolved variants using virus-like particles. Science. 374 (6575), 1626-1632 (2021).
  14. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  15. Matsuyama, S., et al. Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (13), 7001-7003 (2020).
  16. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 463, 573-599 (2009).
  17. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 155-170 (2021).
  18. Yang, H., Rao, Z. Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development. Nat Rev Microbiol. 19 (11), 685-700 (2021).
  19. Katiyar, H., Arduini, A., Li, Y., Liang, C. SARS-CoV-2 assembly: Gaining infectivity and beyond. Viruses. 16 (11), 1648(2024).
  20. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nat Commun. 11 (1), 5885(2020).
  21. Li, Y., et al. SARS-CoV-2 spike host cell surface exposure promoted by a COPI sorting inhibitor. Acta Pharm Sin B. 13 (7), 3043-3053 (2023).
  22. Dey, D., et al. A single C-terminal residue controls SARS-CoV-2 spike trafficking and incorporation into VLPs. Nat Commun. 14 (1), 8358(2023).
  23. Christie, S. M., et al. Single-virus tracking reveals variant SARS-CoV-2 spike proteins induce ACE2-independent membrane interactions. Sci Adv. 8 (49), eabo3977(2022).
  24. Guo, L., et al. Targetable elements in SARS-CoV-2 S2 subunit for the design of pan-coronavirus fusion inhibitors and vaccines. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 197(2023).
  25. Mi, D., Hu, J., Qian, Z. A lentiviral pseudotype system to characterize SARS-CoV-2 glycoprotein. Methods Mol Biol. 2610, 187-199 (2023).
  26. Swann, H., et al. Minimal system for assembly of SARS-CoV-2 virus like particles. Sci Rep. 10 (1), 21877(2020).
  27. Xia, B., et al. Extracellular vesicles mediate antibody-resistant transmission of SARS-CoV-2. Cell Discov. 9 (1), 2(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

SARS-CoV-2 VLP'lerVirüs Benzeri PartiküllerViral Yaşam DöngüsüHEK-293T HücreleriSpike ProteiniPlazmit TransfeksiyonuWestern BlotKonfokal MikroskopiACE2 TMPRSS2Lüsiferaz Analizi
Viral Yaşam Döngülerini In Vitro Araştırmak için SARS-CoV-2 Virüsü Benzeri Bir Parçacık Sisteminin Üretimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.