Yöntem makalesi

Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi ve apoplastik RNA'nın izolasyonu ve analizi için aşamalı bir kılavuz

DOI:

10.3791/68406

⸱

8 Ağustos 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis bitkilerinin yaprak yüzeyinden ve apoplastından hücre dışı RNA'yı izole etmek için basit ama oldukça tekrarlanabilir bir yöntem tarif ediyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki yapraklarının yüzeyi ve yapraklar içindeki hücreler arası boşluk (apoplast), bitkiler ve etkileşime giren mikropları arasındaki moleküler değişim için anahtar arayüzler olarak hizmet eder. Önceki çalışmalarda, Arabidopsis rozetlerinin apoplastında çok çeşitli RNA türlerinin varlığını gösterdik. Daha yakın zamanlarda, bulgularımız Arabidopsis bitkilerinin de yaprak yüzeylerine aktif olarak RNA salgıladığını ortaya koydu. Bunu araştırmak için, aynı Arabidopsis bitki setinden hem yaprak yüzeyi yıkama (LSW) hem de apoplastik yıkama sıvısı (AWF) toplamak için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdik. Ek olarak, yaprak yüzeyini steril pamuk uçlu çubuklarla nazikçe temizleyerek RNA'yı toplamamızı sağlayan yaprak yüzey swabını (LSS) içeren invaziv olmayan bir tekniği araştırdık. Mikrobiyal kontaminasyon riskini en aza indirmek için, hücre dışı RNA'yı (exRNA) izole etmeden önce LSW, AWF ve LSS fraksiyonlarını filtreledik. Denatüre edici RNA jel elektroforezi kullanılarak saflaştırılmış exRNA'yı analiz ettikten sonra, LSW, LSS ve AWF RNA örneklerinde çok çeşitli uzun ve küçük RNA türleri gözlemledik. ExRNA örnekleri ve deneysel koşullar arasında daha fazla nicelik belirleme ve karşılaştırmalı analiz, ücretsiz olarak erişilebilen ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu protokol, bitki yapraklarından küçük miktarlarda exRNA'yı izole etmek ve analiz etmek için verimli, uygun maliyetli bir yaklaşım sağlar. Bu RNA preparatları, dizileme ve diğer moleküler analizler yoluyla daha da karakterize edilebilir ve exRNA'nın bitki-mikrop etkileşimlerindeki dinamik rolleri hakkında içgörüler sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapraklar, bitkileri biyotik ve abiyotik stres faktörlerinden korumaya yardımcı olabilecek ve sonuçta bitki büyümesini ve gelişimini destekleyen bakteriler, mantarlar, oomycetes ve protistler dahil olmak üzere çeşitli mikroplar tarafından kolonize edilir 1,2,3,4. Bitki yaprağının etkileşen mikroplarını barındırmak için iki ana bölmesi vardır: epifitik (yaprak yüzeyi) ve endofitik (apoplast)2. Yaprak yüzeyi, su kaybını önleyen ve balmumu ve kütin gibi bileşenleri içeren hidrofobik bir kütikül tabakası ile korunmaktadır. Üst (adaksiyal) yaprak yüzeyi genellikle UV ışığına karşı koruma sağlayan, sıcaklığı düzenleyen ve otçullara karşı caydırıcı olarak hizmet eden trikom adı verilen özel tüy benzeri epidermal hücreleri içerir. Buna karşılık, apoplast fotosentez için gaz ve su değişimini kolaylaştırır ve mikrobiyal kolonizasyona elverişli nemli bir ortam sağlar5. Bu farklılıklara rağmen, her iki yaprak bölmesi de belirli mikropları tercih eder, epifitik mikrobiyal ağlar, endofitik mikrobiyal ağlara kıyasla çeşitlilik açısından daha karmaşıktır5. Bu mikrobiyal toplulukların yapısının her bir hücre dışı bölmede nasıl düzenlendiği tam olarak anlaşılamamıştır. Mikrobiyal topluluk yapısının, kısmen, konakçı bitki tarafından salgılanan hücre dışı RNA (exRNA) tarafından belirlenebileceğini tahmin ediyoruz.

Son çalışmamızda, yaprak yüzeyinde apoplast veya hücre lizatlarındaki RNA'dan farklı çeşitli RNA türlerinin varlığını bildirdik6. Bitkilerde exRNA'lar üzerine yapılan araştırmaların çoğu, mikroRNA'lar (miRNA'lar) ve küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNA'lar) gibi küçük kodlamayan RNA'lara odaklanmış olsa da, özellikle RNA girişim mekanizmalarına sahip olmayan türlerde, dizi tamamlayıcılığından bağımsız olarak hücresel süreçleri potansiyel olarak düzenleyebilen rRNA ve tRNA'dan türetilmiş fragmanlar gibi diğer RNA türlerine daha az dikkat edilmiştir 7,8, 9.

Burada tanımladığımız yöntem, aynı Arabidopsis bitkileri setini kullanarak hem yaprak yüzeyi yıkamadan (LSW) hem de apoplastik yıkama sıvısından (AWF) RNA'nın sıralı izolasyonunu sağlar. Ek olarak, püskürtülen yaprak yüzeyini steril pamuk uçlu çubuklarlanazikçe sürünerek RNA'nın toplanmasını sağlayan bir yaprak yüzeyi swabını (LSS) içeren invaziv olmayan bir ortogonal tekniği tarif ediyoruz 6. Mikrobiyal kontaminasyon riskini en aza indirmek için, hücre dışı RNA'yı izole etmeden önce hem LSW hem de AWF fraksiyonlarını filtreliyoruz. exRNA örneklerinin miktarını ve boyut dağılımını değerlendirmek için, ücretsiz olarak erişilebilen ImageJ yazılımını kullanarak görüntü analizi ile birlikte denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezi kullanan bir protokolü açıklıyoruz. Bu protokol, küçük miktarlarda exRNA'yı izole etmek ve analiz etmek için verimli, uygun maliyetli bir yaklaşım sağlar. Bu RNA preparatları, bitki-mikrop etkileşimlerinde hücre dışı RNA'nın dinamik rolleri hakkında içgörüler sunan dizileme ve moleküler analizler yoluyla daha da karakterize edilebilir.

Aşağıda açıklanan protokol, RNA'yı bitki hücre dışı veziküllerinden10 izole etmek için daha önce açıklanan protokolümüzden farklıdır. Mevcut protokol herhangi bir ultrasantrifüj aşaması gerektirmez ve RNA'nın sadece hücre dışı veziküllerden değil, toplam hücre dışı yıkama sıvısından izolasyonunu sağlar. En önemlisi, RNA'yı yaprak yüzeyinden izole etmek için iki ortogonal yöntem sağlar. Bildiğimiz kadarıyla, RNA'nın yaprak yüzeylerinden izolasyonu, son yayınımız6'dan önce tanımlanmamıştır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tampon hazırlama ve sterilizasyon

  1. 1 L damıtılmış suda 20 mM 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES), pH 6.0, 2 mM CaCl2 ve 0.01 M NaCl içeren vezikül izolasyon tamponu (VIB) hazırlayın.
    NOT: Yaprak apoplastın iyonik konsantrasyonunu taklit etmek için VIB'deki NaCl konsantrasyonunda 0.1 M ila 0.01 M arasında küçük ayarlamalar yapılmıştır.
  2. VIB'yi 121 ° C'de, sıvı döngüsünde 20 dakika otoklavlayın. Alternatif olarak, 0,45 μm'lik bir vakum filtresi kullanarak VIB'yi filtreyle sterilize edin.
    NOT: Bu adım, herhangi bir mikrobiyal kontaminasyon bitkilerin ortaya çıkmasına ve dolayısıyla sonuçlarda değişkenliğe yol açabileceğinden, tamponun steril olmasını sağlamak içindir. Bu tampon, kısa süreli depolama için oda sıcaklığında (sterilizasyon sonrası kapağı açmadan) veya uzun süreli depolama için 4 °C'de saklanabilir.

2. Bitki materyali ve büyüme durumu

  1. Arabidopsis thaliana Col-0 yabani tip (WT) tohumları standart bir saksı karışımı içeren 4 inçlik yuvarlak plastik saksılara ekin. Ekimden sonra tohumları biyolojik bir mantar ilacı (600 mg/L) ile ıslatın, üzerini şeffaf plastik bir kubbe ile örtün ve senkronize çimlenmeyi sağlamak için 4 °C'de 3 gün karanlıkta tutun.
  2. Tohumlu saksıları, bitki düzeyinde 150 μmol·m−2·s−1 fotosentetik foton akı yoğunluğu ile 9 saat ışık/15 saat karanlık fotoperiyot altında 24 °C'ye ayarlanmış, sıcaklık kontrollü kısa günlük büyüme odasına aktarın (50:50 3.500 ve 5.000 K spektrumlu 32 watt floresan ampul karışımı).
  3. Yaklaşık 10 gün sonra, tek tek fideleri saksı karışımı içeren 36 hücreli tepsi eklerine aktarın ve 1-2 hafta boyunca şeffaf plastik bir kubbe ile örtün.
    NOT: Tipik bir deney, her genotip/tedavi için ~ 12-24 sağlıklı bitki gerektirir. 6-7 haftalık bitkilerin, en düşük hücresel kontaminasyon riski ile optimum miktarda LSW ve AWF RNA verdiği kaydedilmiştir.
  4. Kullanılan saksı karışımına bağlı olarak, kuraklık veya sel stresini önlemek için bitkileri her 10-15 günde bir sulayın.

3. Yaprak yüzeyi RNA'sının toplanması

  1. Santrifüj esaslı yöntem (Yaprak Yüzey Yıkama; LSW)
    1. Her çoğaltma için 6-7 haftalık Arabidopsis bitkileri kullanın.
    2. LSW'nin izolasyonuna başlamadan önce% 0.001'lik bir nihai konsantrasyonda (100 mL VIB'de 1 μL) steril VIB'ye Silwet-L77 (bundan böyle ıslatıcı ajan olarak anılacaktır) ekleyin.
      NOT: Silwet-L77, yüzey gerilimini azaltan ve tamponun yaprak yüzeylerini kaplamasını sağlayan bir ıslatıcı maddedir.
    3. 100 mL VIB'yi 500 mL'lik bir sprey şişesine aktarın.
    4. Arabidopsis rozetlerini ince makas kullanarak köklerinden dikkatlice ayırın.
    5. Yumuşak bir fırça kullanarak yaprak sapındaki fazla toprağı alın.
    6. Rozetleri, abaksiyal yüzeyi yukarı bakacak şekilde düz bir tepsiye yerleştirin.
    7. Sprey şişesinin beş pompasını kullanarak abaksiyal yüzeye VIB + ıslatıcı madde püskürtün.
    8. Rozetleri dikkatlice çevirin ve adaksiyal yüzeye beş kez VIB + ıslatıcı madde püskürtün.
    9. LSW'yi geri kazanmak için, püskürtülen rozetleri, 250 mL santrifüj şişelerinin içine yerleştirilmiş, altta delikli iğnesiz 60 mL şırıngaların içine dikkatlice yerleştirin (şırınga başına en fazla iki adet 6 haftalık rozet sığabilir). Şırınga ucunu şişenin dibinin üzerine asmak için şırıngayı boynun etrafına parafilm ile sarın (Referans için Şekil 1'e bakın).
      NOT: Delikli 60 mL şırıngaların hazırlanmasıyla ilgili ayrıntılar için daha önce yayınlanan protokol11'e bakın.
    10. Yüklü şişeleri 100 g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin (JA-14 rotor).
    11. LSW'yi 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve süzüntüyü buz üzerine yerleştirilmiş 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
      NOT: Tipik olarak, 12 tesis bu protokolü kullanarak sonunda yaklaşık 30 mL LSW verecektir. Ancak bu, her adımda gerçekleştirilen püskürtme sayısına dayalı bir tahmindir. Bu hacim normalde püskürtülen hacimden daha azdır, çünkü püskürtülen tamponun bir kısmı kullanım sırasında kaybolur.
  2. Yaprak yüzey çubuğu (LSS) yöntemi
    1. Ayrılmış rozetlere önceki bölümde açıklandığı gibi VIB + ıslatıcı madde püskürtün (adım 3.1.1-3.1.7).
    2. LSS'yi geri kazanmak için, steril pamuk uçlu çubuklar kullanarak adaksiyel ve abaksiyal yüzeyleri temizleyin ve sıvıyı sıkmak için ıslatılmış uçları 15 mL'lik bir santrifüj tüpünün iç duvarına bastırın.
      NOT: Abaksiyal ve abaksiyal LSS numuneleri, deney düzeneğine ve beklenen sonuca bağlı olarak ayrı tüplerde toplanabilir.
    3. LSS numunelerini 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden buz üzerine yerleştirilmiş 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün.
      NOT: Sürüntü alınan bitki sayısına bağlı olarak, deney başına değişen hacimlerde LSS toplanabilir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Yaprak yüzeyi yıkama ve apoplastik yıkama sıvısı izolasyonu için kullanılan aletler. (A) LSW ve AWF'yi toplamak için, iki bütün Arabidopsis thaliana rozeti, yıkamanın akması için kanallar oluşturmak üzere ısıtılmış forseps ile şırınganın ucuna eritilen sekiz ek deliğe sahip 60 mL'lik bir şırıngaya yerleştirilir. (B) Bu iğnesiz şırınga daha sonra gösterildiği gibi boyun bölgesinde parafilm ile sarılır. (C) Bu adım, şırınganın şişenin dibine dokunmadan 250 mL'lik bir santrifüj şişesine sığmasını sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Apoplastik yıkama sıvısının (AWF) toplanması

  1. LSW veya LSS izolasyonu için kullanılan aynı bitki setini bir behere yerleştirin ve damıtılmış su ile iki kez nazikçe durulayın.
  2. Rozetleri VIB ile 20 saniye boyunca aşağıdaki gibi vakumla sızdırın:
    NOT: Vakum sızma işlemi daha önce yayınlanmış bir protokol11'de iyi bir şekilde tanımlanmış olsa da, mevcut protokolü açıklığa kavuşturmak için burada yeniden üretilmiştir.
    1. Rozetleri 300-500 mL VIB içeren bir French press kahve makinesine dikkatlice yerleştirin. Kapağı French press'in üzerine yerleştirin ve bitkiler tamamen suya batırana kadar pistonu yavaşça indirin.
    2. French press'i bitkilerle birlikte yerleştirin ve bir vakum odasına tamponlayın. Bir vakum pompası kullanarak 20 saniye boyunca vakum uygulayın. Tampon kaynamaya başlamalıdır.
    3. Vakumu serbest bırakın ve French press'i vakum odasından çıkarın, kapağı çıkarın ve VIB'yi ayrı bir 500 mL plastik kabın içine dökün. French press'ten rozetleri çıkarın.
      NOT: VIB, bir genotip için aynı gün içinde birden çok kez yeniden kullanılabilir, ancak bir kez vakum sızması için kullanıldığında, VIB başka bir gün kullanılmak üzere saklanmamalıdır.
    4. Yaprakları bir kağıt havlu üzerinde hafifçe sallayarak ve ardından fırçalayarak bitkilerdeki fazla VIB'yi çıkarın.
  3. Kurutma kağıdı ile nazikçe lekeleyerek yaprak yüzeylerindeki fazla tamponu çıkarın.
  4. Apoplastik yıkama sıvısını (AWF) toplamak için, rozetleri LSW toplama için tarif edildiği gibi 250 mL santrifüj şişelerinin içine yerleştirilmiş 60 mL iğnesiz şırıngaların içine yerleştirin ve yavaş ivmelenme ile 600 × g'da 30 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin.
  5. Havuzlanmış AWF'yi 0,22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve süzüntüyü buz üzerine yerleştirilmiş 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
    NOT: Tipik olarak, 12 tesis bu protokolü kullanarak sonunda yaklaşık 6 mL AWF verir. Filtrelenmiş LSW, AWF ve LSS hemen kullanılabilir veya daha fazla kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir.
  6. AWF izolasyonundan sonra her çoğaltma için kullanılan bitkilerin taze ağırlığını (FW) kaydedin. Daha sonra, her numunedeki RNA miktarını normalleştirmek için bu okumayı kullanın (Şekil 2).

figure-protocol-2
Şekil 2: Protokolün ve yaprak yüzeyi sürüntü yönteminin şematik çizimleri. (A) Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi yıkama ve apoplastik yıkama sıvısının izolasyonu için kademeli protokolün şematik gösterimi. (B) Yaprak yüzeyi RNA'sını izole etmek için yaprak yüzeyi swab (LSS) yönteminin şematik gösterimi. Borniego ve ark., 2025 Şekil S1 ve Şekil S4'ten uyarlanan şekiller6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. RNA'nın çökelmesi

  1. Gerekli hacimde AWF, LSW veya LSS'yi 0.1 hacim 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 1.0 hacim soğuk izopropanol ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde karıştırarak RNA'yı çökeltin.
  2. 20 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona glikojen (20 mg / mL stok) ekleyin.
    NOT: RNA'yı çökeltmek için kullanılan santrifüj tüplerinin 13.000 × g gibi yüksek bir hızda santrifüjlenebildiğinden emin olun. Bu aşamada tüplerin kırılması, RNA örneklerinin kaybına neden olabilir.
  3. Karışımı -20 °C'de en az 1 saat veya gece boyunca inkübe edin.
  4. Tüpleri 13.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin (JA-25.50 rotor).
  5. Peleti buz gibi p EtOH ile iki kez yıkayın ve en fazla 10 dakika kurumaya bırakın.
  6. Peletleri 100 μL ultra saf DNase/RNaz içermeyen su veya VIB içinde yeniden süspanse edin ve RNA'yı 1.5 mL santrifüj tüplerine aktarın.
    NOT: Bu adımdan sonra, çökelmiş RNA -80 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.

6. TRIzol tabanlı RNA izolasyonu

  1. Her tüpe 1 mL TRIzol Reaktifi ekleyin ve bir döndürücü üzerinde çalkalayarak karıştırın.
    DİKKAT: TRIzol'u kullanmak için çeker ocakta kullanın, eldiven ve göz koruması kullanın.
  2. Tüpleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca bir masa üstü döndürücüye yerleştirin.
  3. Her tüpe 200 μL kloroform ekleyin, ardından kısa ama güçlü bir girdap adımı izleyin.
    DİKKAT: Kloroformu işlemek için çeker ocakta kullanın, eldiven ve göz koruması kullanın.
  4. Tüplerin RT'de yaklaşık 3 dakika durmasına izin verin ve ardından 13.000 × g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
  5. Sulu fazı etiketli 1.5 mL santrifüj tüplerine aktarın ve 10 μg RNaz içermeyen glikojen ve bir hacim soğuk izopropanol ekleyin.
    DİKKAT: Üretilen biyolojik olarak tehlikeli atıklar (fenol atıkları gibi) için, organik çözücüleri kurumsal yönergelere göre belirlenmiş atık kaplarında toplayın.
  6. Tüpleri -20 ° C'de en fazla 1 saat inkübe edin.
    NOT: Bu adımda RNA'yı 1 saatten fazla çökeltmek, RNA izolasyonunun verimliliğini azaltır ve çok düşük bir RNA konsantrasyonuna yol açar.
  7. RNA'yı peletlemek için tüpleri 13.000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
  8. RNA peletlerini buz gibi p EtOH kullanarak iki kez yıkayın ve 10-20 μL ultra saf DNaz/RNaz içermeyen suda yeniden süspanse etmeden önce kurumaya bırakın.
  9. Yeniden süspanse edilmiş RNA'yı kısa veya uzun süreli depolama için sırasıyla -20 °C veya -80 °C'de saklayın.

7. Fenol veya guanidin kontaminasyonunun giderilmesi

  1. RNA örneklerinden fenol veya guanidin kontaminasyonunu gidermek için,% 96 EtOH ve amonyum asetat ile bir veya iki seri çökeltme gerçekleştirin.

figure-protocol-3

figure-protocol-4





figure-protocol-5

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis bitkilerinden yaprak yüzey yıkama (LSW) ve apoplastik yıkama fraksiyonlarının (AWF) izole edilmesi için yukarıda açıklanan aşamalı protokolün şematik bir genel bakışı Şekil 2A'da gösterilmektedir. Bu yöntem, hem LSW hem de AWF'nin replikat başına en az üç ila altı bitkiden ekstraksiyonuna izin verirken, her iki fraksiyondan da tutarlı bir şekilde eşdeğer miktarlarda RNA verir. Hücre lizatlarındaki RNA konsantrasyonunu ölçmek için NanoDrop spektrofotometrisini kullanıyoruz. Bununla birlikte, LSW, LSS ve AWF'den türetilen RNA örnekleri için, SYBR Altın lekeli poliakrilamid jellerinin densitometrik miktar tayinine güveniyoruz. Bu niceleme adımı gereklidir, çünkü hücre dışı fraksiyonlar, bazen absorbansa dayalı RNA niceleme yöntemleriyle birlikte saflaştırabilen ve müdahale edebilen ve RNA konsantrasyonunun fazla tahmin edilmesine yol açabilen bilinmeyen bir kirletici (muhtemelen polisakkaritler) içerir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, gelecekteki çalışmalarımızda fenol bazlı olmayan RNA saflaştırma yöntemlerini kullanmayı planlıyoruz.

Denatüre edici RNA jel analizi, LSW ve AWF'de hem uzun hem de küçük RNA'lar dahil olmak üzere çok çeşitli RNA türlerinin varlığını ortaya çıkardı (Şekil 3). Özellikle, eşdeğer RNA miktarları hem yaprak yüzeyinden hem de apoplastik fraksiyonlardan başarılı bir şekilde izole edildi ve RNA miktarları bitkinin taze ağırlığı (FW) başına normalleştirildi. Şaşırtıcı bir şekilde, LSW ve AWF fraksiyonlarının RNA boyut profilleri birbirinden ve toplam hücre lizatı (CL) RNA'sının profilinden önemli ölçüde farklıydı. Bu farklılıklar, exRNA fraksiyonlarının hücresel RNA ile kontamine olmadığını göstermektedir. Üç fraksiyon arasında, apoplastik RNA (AWF), boyut dağılımında en büyük çeşitliliği sergiledi, bu da apoplastik RNA'nın yaprak yüzeyi RNA'sından daha fazla bozulduğunu düşündürdü.

Arabidopsis yapraklarının yüzeyindeki RNA'nın varlığını daha fazla incelemek için pamuklu çubuklar kullandık. Bu yöntem, adaksiyel (üst) ve abaksiyal (alt) yaprak yüzeylerinden ayrı ayrı ve sıralı olarak RNA toplamamıza izin verdi6. Bu analizler, her iki yaprak yüzeyinin de benzer miktarda RNA içerdiğini ortaya koydu. Ayrıca, santrifüjlemeye gerek kalmadan yaprak yüzeyinden tamponu emerek RNA'nın basitçe toplanabilmesi, RNA'nın santrifüjleme sırasında stomalardan ekstrakte edilmek yerine gerçekten yaprak yüzeyinde bulunduğu sonucunu daha da desteklemektedir.

Bol miktarda yaprak yüzeyi RNA'sı çıkarmamıza izin veren birincil ayarlamalardan biri, ıslatıcı maddenin eklenmesiydi. VIB'ye ıslatıcı ajan (% 0.001 gibi çok düşük bir konsantrasyonda) ekledikten sonra neredeyse iki kat daha fazla RNA geri kazandık. Silwet L-77 ile ve Silwet L-77 olmadan elde edilen RNA konsantrasyonundaki bu fark, bir ıslatıcı ajanın kullanılmasının RNA'nın yaprak yüzeyinde çözünmesini iyileştirdiğini gösterir. Bununla birlikte, ıslatıcı ajanın konsantrasyonunun %0.001'den %0.01'e çıkarılması, LSW RNA izolasyonunu arttırmamıştır (Şekil 4). Özellikle, LSW RNA'nın aynı yapraklardan izolasyonunun tekrarlanması, ek RNA (ilk yıkamadan elde edilen geri kazanımın yaklaşık% 63'ü) verdi, bu da yaprakların sürekli olarak yüzeye RNA salgıladığını ve bunun yaklaşık üçte ikisinin yaprakları işlemek için gereken yaklaşık 30 dakika içinde değiştirildiğini gösteriyor. Bitki materyali sınırlandığında toplam LSW RNA verimini artırmak için, aynı yaprakları art arda birden çok kez yıkamak mümkündür. Bununla birlikte, ilgili işlem, yıkama sıvısının yeşil renklenmesiyle değerlendirildiği gibi yaprak malzemesinde kümülatif hasara yol açabileceğinden, üçten fazla yıkama önermiyoruz. Bu deneyler için, RNA konsantrasyonu, RNA jel bazlı dansitometri analizi kullanılarak tahmin edildi. Bununla birlikte, yukarıda açıklanan mikrotitre plaka bazlı RNA miktar tayini yöntemi, aynı anda birden fazla numuneyi değerlendirirken RNA'nın doğru miktar tayini için kullanılabilir (Şekil 5).

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yaprak yüzeyi yıkamanın (LSW), yaprak yüzey swabının (LSS) ve apoplastik yıkama sıvısının (AWF) sağlıklı Arabidopsis rozetlerinden nasıl izole edileceğini ve ardından RNA ekstraksiyonunun nasıl yapılacağını detaylandırır. Kritik adımlar, deneyi gerçekleştirmeden önce VIB'nin hazırlanmasını ve sterilizasyonunu, bitkilerin kontrollü koşullar altında yetiştirilmesini ve yaprak yüzeyinin VIB tarafından uygun şekilde kaplanmasını sağlamak için Silwet-L77'nin kullanılmasını içerir. Bu prosedürler, yaprak taze ağırlığı ile normalize edilmiş hem LSW hem de AWF'den eşit miktarda RNA vermelidir. Bu hücre dışı fraksiyonlardan RNA'nın geri kazanımı, özellikle çökeltme adımlarını takip eden RNA peletleri ile ilgili olarak dikkatli bir işlem gerektirir.

Yukarıdaki protokol Arabidopsis yaprakları için optimize edilmiş olsa da, sadece küçük değişikliklerle diğer bitki türlerinde de başarıyla kullandık. Yaprak yüzeyinden RNA ekstraksiyonu, iki birincil ayarlama uygulanarak optimize edilebilir: birincisi, birden fazla LSW izolasyonu turu gerçekleştirerek ve ikincisi, ıslatıcı maddenin konsantrasyonunu artırarak. Pirinç12,13 gibi çok hidrofobik yaprak yüzeylerine sahip bitki türleri, daha yüksek konsantrasyonlarda ıslatıcı madde gerektirebilir.

Ek olarak, pamuk uçlu swablar kullanarak yaprak yüzeyi RNA'sını toplamak için invaziv olmayan bir yöntem tanımladık. Bu yaprak yüzeyi RNA izolasyon yöntemi ile toplama tüpünün bir buz kovasına yerleştirilmesini sağlıyoruz. Yaprak yüzeyindeki RNA'nın oda sıcaklığında salgılandığını ve biriktiğini göz önünde bulundurursak, toplama işlemi sırasında bile stabil kalacağını varsayıyoruz. LSW ve LSS RNA'nın bantlama modellerini de karşılaştırdık ve bozunma açısından çok fazla fark göstermiyorlar.

Yukarıdaki protokol, RNA'yı LSW, LSS veya AWF'den saflaştırmak için TRIzol reaktifini kullanır. Bu reaktif, proteinleri uzaklaştırmak için fenol kullanır. Bununla birlikte, TRIzol bazlı saflaştırmanın, LSW ve AWF6'da bol miktarda bulunan pektin gibi polisakkaritleri uzaklaştırmadığını bulduk. Bu tür birlikte saflaştırıcı moleküller, spektrofotometri veya florometri kullanılarak RNA miktar tayini ile ilgili sorunlara neden olabilir. Bu nedenle, exRNA konsantrasyonlarını değerlendirmek için RNA jel bazlı dansitometri analizine güveniyoruz. Şu anda, RNA'nın polisakkaritlerden daha iyi ayrılmasını sağlaması gereken sütun bazlı saflaştırma yöntemlerini araştırıyoruz. Bununla birlikte, silika zarı ~200 nükleotidden daha büyük RNA moleküllerini bağlamak için optimize edildiğinden, bu yöntemler genellikle küçük RNA'ların geri kazanımını sınırlar. Küçük RNA'lar bağlanma sırasında zardan geçebilir veya yıkama adımlarında kaybolabilir. Bu nedenle, şimdiye kadar, küçük RNA'lar da dahil olmak üzere tüm RNA boyutlarının daha kapsamlı bir şekilde geri kazanılması için yalnızca TRIzol tabanlı yönteme güveniyoruz, ancak dikkatli bir şekilde ele alınması ve faz ayrımı gerektiriyor.

Ek olarak, RNA jel analizi yaparken, esas olarak büyük miktarlarda rRNA ve tRNA'ya göre düşük bolluk nedeniyle, AWF ve LSW RNA'lara kıyasla toplam hücresel RNA örnekleri için 80 nt'den daha küçük fragmanlar görmüyoruz. AWF ve LSW'de daha küçük bantların varlığı, bitkilerin hücre dışı bölmesinde RNA'nın salgılanmasından sonra doğal olarak meydana gelen bol miktarda rRNA'ların ve tRNA'ların bozunmasından kaynaklanır ve dizileme ve kuzey leke analizi ile onaylandığı gibi bitkilerin toplanması ve işlenmesi sırasında ortaya çıkan bir artefakt değildir6.

Yaprak yüzeyi yıkama izolasyon yöntemimiz, çok çeşitli araştırma uygulamaları için önemli potansiyele sahip çok yönlü bir araçtır. Bitkiler ve mikroplar arasındaki etkileşimleri anlamak için merkezi olabilecek RNA, proteinler ve diğer metabolitler gibi biyomoleküllerin yaprak yüzeyinden izole edilmesini sağlamalıdır. AWF ve LSW'de bulunan mikropların tanımlanması isteniyorsa, bu, 0,22 μm filtreden filtrasyonu ortadan kaldırarak gerçekleştirilebilir.

Bitkiler, yüzeylerinde karmaşık topluluklar oluşturan bakteriler, mantarlar ve virüsler dahil olmak üzere çok çeşitli mikroplarla etkileşime girer1. Bu mikrobiyal toplulukların bitki büyümesi, hastalık direnci ve besin alımı üzerinde derin etkileri olabilir 2,3,4. Araştırmacılar, bu yöntemi kullanarak yaprak yüzeyi yıkamasını izole ederek ve analiz ederek, exRNA'yı, mikrobiyal metabolitleri izole edebilir, yaprak yüzeyinde bulunan mikrobiyal toplulukları tanımlayabilir ve bu toplulukların moleküler düzeyde nasıl düzenlendiğini araştırabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilim Vakfı'ndan iki hibe ile desteklenmiştir.

IOS-2243531 ve IOS-2141969'dan RWI'ye

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
14-30 nt ssRNA merdiven işaretleyiciTakara3416
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriVWR20170-038
10 mL iğnesiz şırıngaBD303347
15 mL şahin tüpleriVWR89039-668
%15 Mini-PROTEAN TBE-Urea Jel, 10 kuyucuk/12 kuyucuk, 30 &mikro; L/20 &mikro; LBiyo-Rad4566053 / 4566055
36 hücreli tepsi ekleriGerçek Yaprak Pazarı
%40 akrilamid ve bis-akrilamid çözeltisi, 37,5:1Biyo-Rad1610148
4 inçlik yuvarlak kaplarGerçek Yaprak Pazarı
50 mL şahin tüpleriVWR89039-656
50 mL iğnesiz şırıngaBD309653
96 Kuyucuklu Plaka Siyah AltGrenier655090
Acrodisc 0.22 μ m şırınga filtresiPolat4192
Acrodisc 0.45 μ m şırınga filtresiPolat4454
Amonyum persülfat (APS) Sigma-AldrichA3678 Serisi
Kalsiyum klorür Sigma-AldrichC1016 Serisi
Kloroform (RNaz içermez)Macron İnce KimyasallarMK444110
Şeffaf plastik kubbelerHummert Uluslararası11 3348Bitkileri örtmek ve nemi korumak için herhangi bir plastik kubbe kullanılabilir
Pamuk uçlu çubuk tıbbi sınıfÜlinS-21102
Etanol (Rnaz içermez)Decon Laboratuvarları, Inc.2716GEA
French Press kahve makinesi, 24 fl ozKar ZirvesiCS-111 Serisi
Deliksiz yetiştirme tepsisi 10 x 20Gerçek Yaprak Pazarı
Buz kovası Schuett-Biyoteknoloji, Sünger3-680 052
İzopropanolTermo Bilimsel149320050
JA-14 sabit açılı rotorBeckman Coulter; modeli: JA-14339247
KimmendilKCWW, Kimberly-Clark34120
Düşük menzilli ssRNA laderNEBN0364S
MES hidratSigma-AldrichM8250 Serisi
Mikroplaka okuyucuBioTek  Sinerji H1
Mucize-GroMucize-Gro24-8-16Çok amaçlı bir bitki besinidir. Bitkileri yetiştirmek için kullanılan toprak kaynağına bağlı olarak uygulama ayarlanabilir.
Nalgene santifuge şişesi 250 mL (kapaksız)Nalgen3120
Kağıt havlular
ParaFilm  M Laboratuvar FilmiParafilmS-25929
Plastik beher (500 mL)ÜlinS-21658
RNaz içermeyen glikojen (20 mg/mL)Termo BilimselR0561 Serisi
RootShield Plus WP Biyolojik Mantar İlacıBiyo İşler68539-9
Makas
Silwet L-77Bitki teknolojisi laboratuvarlarıS7777 SerisiHerhangi bir marka Silwet L-77 kullanılabilir. Ancak Silwet zamanla etkinliğini kaybeder. Yılda bir kez değiştirilmesi idealdir.
Sodyum klorürSigma-AldrichS7653 Serisi
Yumuşak naylon saç boya fırçasıABD. Sanat Kaynağı6 numara
Sprey şişesiÜlinS-7272Herhangi bir sprey şişesi kullanılabilir ancak sprey ayarları duşta olmalıdır.
Sungro Profesyonel Yetiştirme KarışımıSungro
Sungro Çoğaltma KarışımıSungro
SYBR Altın Nükleik Asit Jel Boyası (DMSO'da 10.000x konsantre)Termo BilimselS11494
TEMEDTermo Bilimsel17919
TRIzol reaktifiDavetli15596026
Ultra saf Dnase/Rnase içermeyen suDavetli10977015
ÜreSigma-AldrichU5378 Serisi
Vakum odası, 0.20 Cu. Ft.SP Scienceware - Bel-Art Ürünleri - H-B EnstrümanF42031-0000
Vakum pompası, 3,5 CFMİdeal Vakum ÜrünleriP101532
Tartı ölçeğiEscaliWBB480535Bu sadece bir örnek. Herhangi bir tartı kullanılabilir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
  2. Ritpitakphong, U., Falquet, L., Vimoltust, A., Berger, A., M'etraux, J., L'Haridon, F. The microbiome of the leaf surface of Arabidopsis protects against a fungal pathogen. New Phytol. 210 (3), 1033-1043 (2016).
  3. Chaudhry, V., Runge, P., Sengupta, P., Doehlemann, G., Parker, J. E., Kemen, E. Shaping the leaf microbiota: plant-microbe-microbe interactions. J Exp Bot. 72 (1), 36-56 (2021).
  4. Vacher, C., Hampe, A., Port'e, A. J., Sauer, U., Compant, S., Morris, C. E. The phyllosphere: microbial jungle at the plant-climate interface. Ann Rev Ecol Evol Syst. 47, 1-24 (2016).
  5. Mahmoudi, M., Almario, J., Lutap, K., Nieselt, K., Kemen, E. Microbial communities living inside plant leaves or on the leaf surface are differently shaped by environmental cues. ISME Commun. 4 (1), ycae103(2024).
  6. Borniego, M. L., et al. Diverse plant RNAs coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  7. Ren, B., Wang, X., Duan, J., Ma, J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 365 (6456), 919-922 (2019).
  8. Chery, M., Drouard, L. Plant tRNA functions beyond their major role in translation. J Exp Bot. 74 (7), 2352-2363 (2022).
  9. Panstruga, R., Spanu, P. Transfer RNA and ribosomal RNA fragments-Emerging players in plant-microbe interactions. New Phytol. 241 (2), 567-577 (2024).
  10. Baldrich, P., Rutter, B. D., Karimi, H. Z., Podicheti, R., Meyers, B. C., Innes, R. W. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "Tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  11. Rutter, B. D., Rutter, K. L., Innes, R. W. Isolation and quantification of plant extracellular vesicles. Bio Protoc. 7 (17), e2533(2017).
  12. Zhang, Z., et al. OsHSD1, a hydroxysteroid dehydrogenase, is involved in cuticle formation and lipid homeostasis in rice. Plant Sci. 249, 35-45 (2016).
  13. Zhou, L., Ni, E., Yang, J., Zhou, H., Liang, H., Li, J., Jiang, D., Wang, Z., Liu, Z., Zhuang, C. Rice OsGL1-6 is involved in leaf cuticular wax accumulation and drought resistance. PLoS One. 8 (5), e65139(2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Leaf Surface RNAApoplastic RNAArabidopsis RosettesExtracellular RNARNA IsolationLeaf Surface WashApoplastic Wash FluidRNA Gel ElectrophoresisImageJ AnalysisPlant Microbe Interactions

İlgili makaleler